Os fungos entomopatogênicos do gênero Metarhizium e Beauveria compreendem um importante grupo de patógenos de artrópodes-praga. A seleção de isolados de fungos promissores é a primeira e uma das mais importantes etapas no desenvolvimento de um biopesticida, pois alguns isolados podem apresentar alta virulência e não necessariamente boa produção em substrato e vice-versa, sendo interessante a combinação desses dois parâmetros para a viabilidade comercial de um produto. A dificuldade de criação ou manutenção de algumas espécies de pragas em laboratório é um limitante para a condução de testes de virulência, tornando-se interessante a utilização de espécies modelo, de fácil criação, nas etapas preliminares de seleção. Nesse sentido, este estudo objetivou selecionar isolados com alta produção de conídios e virulência, comparando a eficiência de controle de M. anisopliae e B. bassiana às pragas alvo Mahanarva fimbriolata e Bemisia tabaci Biótipo B, respectivamente, com a mortalidade em Tenebrio molitor. Inicialmente, foram selecionados 50 isolados a partir de 100 isolados de cada gênero, baseado em avaliações visuais do crescimento e esporulação em meio de cultivo em placas de Petri. Estes isolados selecionados foram cultivados em arroz parboilizado para quantificação do rendimento produtivo de conídios. Os 25 isolados mais produtivos de cada espécie de fungo foram utilizados nos bioensaios com T. molitor. Posteriormente, os cinco isolados que causaram maior e menor mortalidade de cada gênero, foram utilizados nos bioensaios com as respectivas pragas-alvo. A variação no rendimento de conídios de Beauveria spp., foi de 0,3 a 7,7 x 109 conídios.grama de arroz-1 e de Metarhizium spp. foi de 0,1 a 2,5 x 109 conídios.grama de arroz-1. A mortalidade confirmada de larvas de T. molitor por Beauveria spp., variou de 5,5 a 96,4% e por M. anisopliae variou de 29,1 a 89,1%. Alguns isolados causaram mortalidade elevada tanto no inseto modelo quanto na praga-alvo, porém, não foi verificada uma relação entre a virulência para as duas espécies. Da mesma forma, não foi observada associação entre os parâmetros produção de conídios e virulência. O isolado ESALQ 4958 de B. bassiana se destacou nos dois bioensaios apresentando mortalidades elevadas de ninfas de B. tabaci Biótipo B. Nos bioensaios utilizando ninfas de M. fimbriolata, ESALQ 1641 foi o isolado que apresentou os maiores percentuais de mortalidade nos dois bioensaios. Analisando conjuntamente as variáveis produção de conídios e virulência a T. molitor e a espécie alvo, os isolados ESALQ 540 (B. bassiana) e ESALQ 1116 (M. anisopliae) se destacaram por apresentarem valores elevados para todas as variáveis de interesse. Os resultados reforçam a necessidade de uma análise conjunta destas variáveis com um peso diferenciado para cada variável na seleção de isolados para utilização em produtos microbianos para o controle de pragas. / The genus Metarhizium spp. and Beauveria spp. are important entomopathogenic fungi used to control arthropod pests. The selection of promising fungal isolates is the first and one of the most important steps on the development of a biopesticide, since some isolates may present high virulence and not necessarily good production in substrate and vice-versa, being the combination of these two parameters important for the commercial viability. Difficulties of rearing or maintaining some species of pests in laboratory are limitations for the conduction of virulence tests, justifying the use of easy to breed model species on the preliminary steps of selection. Therefore, this study aimed to select isolates with high conidia production and virulence, comparing the control efficiency of M. anisopliae and B. bassiana to the target pests, Mahanarva fimbriolata and Bemisia tabaci biotype B, respectively, with mortality in Tenebrio molitor. At first, 50 isolates were selected from 100 isolates of each genus, based on growth and sporulation in culture medium on Petri dishes. These isolates were grown in parboiled rice to quantify the yield of conidia. The 25 most productive isolates of each fungus species were used in the bioassays with T. molitor. After, the five isolates that caused higher and lower mortality of each genus were used in the bioassays with the respective target pests. Beauveria spp. conidia yield ranged from 0.3 to 7.7 x 109 conidia.grams of rice-1 and Metarhizium spp. from 0.1 to 2.5 x 109 conidia.gram of rice-1. The confirmed mortality of T. molitor larvae by Beauveria spp. varied from 5.5 to 96.4% and M. anisopliae varied from 29.1 to 89.1%. Some isolates caused high mortality in both, model insect and the target pest; however, no relationship between the virulence of both species was observed. Similarly, there was no association between the parameters conidia production and virulence. The B. bassiana isolate ESALQ 4958 in both bioassays presented high mortalities of B. tabaci Biotype B. In bioassays using M. fimbriolata nymphs, ESALQ 1641 was the isolate that presented the highest mortalities in both bioassays. Analyzing the variables, conidia production and virulence to T. molitor and the target species, the isolates ESALQ 540 (B. bassiana) and ESALQ 1116 (M. anisopliae) showed high values for all variables of interest. The results reinforce the necessity of a joint analysis of these variables with different weight for each one in the selection of isolates, aiming to use them in microbial products for pest control.

A cultura dos citros é considerada de muita importância para a economia brasileira. Atualmente, o inseto Diaphorina citri tem sido considerado como o principal problema dessa cultura, por ser vetor da bactéria Candidatus Liberibacter asiaticus (?-Proteobacteria) causadora da doença conhecida como Greening. Além de D. citri, a cultura dos citros apresenta inúmeras espécies de insetos e ácaros pragas que reduzem a qualidade e a produção dos frutos e requerem medidas de controle. O controle das espécies pragas tem sido realizado quase exclusivamente por aplicações frequentes de pesticidas químicos. Recentemente, isolados dos fungos entomopatogênicos Isaria fumosorosea e Beauveria bassiana foram selecionados para o controle de D. citri. Nesse estudo investigou-se a patogenicidade destes isolados associados a adjuvantes no controle de ninfas e adultos dos insetos Diaphorina citri, Toxoptera citricida, Aleurocanthus woglumi, Praelongorthezia praelonga e adultos dos ácaros Brevipalpus phoenicis e Panonychus citri em condições de laboratório. Notou-se que os fungos estudados foram patogênicos para quase todas as espécies de pragas, com a execção do fungo B. bassiana para ninfas e adultos de P. praelonga. As maiores mortalidade provocadas pelos fungos entomopatogênicos foram obtidas para ninfas e adultos de D. citri (>86% e 55,7%, respectivamente) e T. citricida (>90% e 90,8%, respectivamente), onde também foi encontrado o maior nível de esporulação por indivíduo. Essas duas espécies pragas foram selecionadas para os ensaios de transmissão horizontal, onde foi avaliada a transferência de conídios dos fungos entomopatogênicos entre indivíduos esporulados e não infectados. Nos experimentos de laboratório foi observado que I. fumosorosea e B. basssiana apresentaram transmissão horizontal entre cadáveres e adultos não infectados de D. citri (intra-específica) e adultos de T. citricida para D. citri (inter-específica). Os mesmos resultados foram obtidos nos experimentos em semi-campo com adultos de D. citri. Podemos concluir que os fungos entomopatogênicos I. fumosorosea e B. bassiana apresentam potencial como agentes de controle de D. citri, T. citricida, A. woglumi, B. phoenicis, P. citri. A transmissão horizontal dos fungos apartir de T. citricida e D. citri infectados para adultos sadios de D. citri pode contribuir para o controle desta praga em campo. / The citrus crops are considered of great importance to the Brazilian economy. Currently, the insect Diaphorina citri is considered as the major pest of this crop, as a vector of the bacterium Candidatus Liberibacter asiaticus (? - Proteobacteria) causing the disease known as Greening. Besides D. citri, the orange crop has numerous species of insect and mites pests that reduce the quality and yield of fruits and require control. The control of pest species is carried out almost exclusively by frequent applications of chemical pesticides. Recently, isolates of the entomopathogenic fungi Isaria fumosorosea and Beauveria bassiana were selected for the control of D. citri. This study investigated the pathogenicity of the entomopathogenic fungi Beauveria bassiana and Isaria fumosorosea associated adjuvants on nymphs and adults of the insects Diaphorina citri, Toxoptera citricida, Aleurocanthus woglumi, Praelongorthezia praelonga and adult mites and B. phoenicis, Panonychus citri in laboratory conditions. The fungi studied were pathogenic to almost all pests species, with exception of the fungus B. bassiana against nymphs and adults of P. praelonga. The highest mortality caused by the entomopathogenic fungi were obtained for nymphs and adults of D. citri (> 86% and 55.7%, respectively) and T. citricida (> 90% and 90.8%, respectively), where we also found the highest level of sporulation per individual. These two pest species were selected to test horizontal transmission, which evaluated the transmission of disease between sporulated and healthy individuals. In the laboratory experiments, we observed that I. fumosorosea and B. basssiana showed horizontal transmission between cadavers and healthy adults of D. citri (intraspecific) and adults of T. citricida to D. citri (interspecific). Similar results were obtained in experiments in semi-field conditions with adults of D. citri. The results show that the potential of the entomopathogenic fungi I. fumosorosea and B. bassiana to control D. citri, T. citricida, A. woglumi, B. phoenicis, P. citri. Horizontal transmission of the disease from infected T. citricida and D. citri to health adults of D. citri may improve the control of D. citri in fields.

The coleoptera Rhynchophorus palmarum (L.), vulgarly known as palm weevil is considered on of mainly pest of several palm trees of economic importance. In coconut tree their larvae destroy the plant culms and their adults act like a vector of nematode Bursaphelenchus cocophilus that cause the red ring disease. With the objective of subside the practices of biological control of R. palmarum already utilized it was carried out tests aiming to determine the flight activity of the insect in coconut fields; to validate the technique of autoinoculation of adults of R. palmarum using traps like vegetal traps bait inoculated with the Beauveria bassiana enthomopatogenic fungi; and to characterize genetically isolates of the fungi by molecular makers of RAPD, microsatellites and ITS-DNAr. To determine the flight activity of the insect it was installed, around the commercial field, traps of capture/monitoring for population of R. palmarum adult’s insect, containing attractive feed (culms of sugar cane) added with pheromone of aggregation. For the autoinoculation tests it was used the randomized statistical design, in a factorial scheme 3x4 (3 spores concentration of the fungi and 4 periods of autoinoculation), using four replications constituted by 5 pairs of males and females. The insects were separated, cleaned with distilled water and transfer to buckets with sugar cane culms inoculated with B. bassiana on concentrations 107, 108 and 109 spores/mL of suspension), keeping in contact with the inoculums for 45min.; 90min.; 3h00 and 6h00. After this period of exposition the insects were individualized being the mortality/infection evaluated for 20 days. For genetic characterization it was used 11 isolates obtained from monospores cultures that posterior were inoculated in a liquid medium at 25ºC±1ºC under constant shaking in dark conditions. After seven days the mycelium were filtered, lyophilized and after DNA extracted in SDS buffer at 10%. It was tested 20 decamer primers of arbitrary sequence of IDT Company. The amplifications were carried out in termocycler (Biometra/Unisciense) programmed for initial temperature of 94°C for 5min. and 45 cycles of: 94°C for 1min., 36°C for 2min. and 72°C for 1min.. For microsatellites analyses it was used four pairs of primers. The amplification reactions were carried out using a volume of 25µL. The amplifications consisted by one initial cycle of 94ºC and 30 cycles of 94ºC for 1min.; 50ºC for 1min. and 72ºC for 2min., and a end cycle of 72ºC for 7min.. The amplified fragments were separated by electrophoresis in agarose gel using TBE buffer, and the gel stained with ethidium bromete (0.5µg/mL) after visualized under UV light. The insect initiates flight activity at 5h00 am through 6h00 pm o’clock occurring the population maximum at 9h00 am to11h00 am. It was verified the mortality increase of adults of R. palmarum in accord to fungi concentration and period of exposition of the inoculums. The higest index of mortality (53%) occurred nine days after the autoinoculation by B. bassiana. The RAPD analysis generated 138 polymorphic and 14 monomorphic bands being the patterns used to calculate the genetic similarity that varies of 2% to 77%. The 57.99 (Betume2-SE) and 53.96 (Mojú-PA) isolates presented high similarity (77%), followed by 64.99 (Egypt) and 53.96 (Mojú-PA), with similarity of 73% by RAPD test. For microssatellite the BC.05 and 32.91 isolates presented genetic similarity of 82%, followed by 64.99 and 57.99 with genetic similarity of 80%. It was not observed amplifications variations using ITS regions for B. bassiana isolates. / Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Alagoas / O coleóptero Rhynchophorus palmarum (L.), vulgarmente conhecido como broca-doolho-do-coqueiro é considerado uma das principais pragas de palmeiras de importância econômica. Suas larvas destroem a estipe da planta e os adultos atuam como vetores do nematóide Bursaphelenchus cocophilus causador da doença “anel vermelho”. Com o objetivo de subsidiar as práticas de controle biológico do R. palmarum já empregadas, foram realizados testes visando: determinar a atividade de vôo do inseto em plantios de coco; validar a técnica de autoinoculação de adultos de R. palmarum usando armadilhas com iscas vegetais inoculadas com o fungo entomopatogênico Beauveria bassiana e caracterizar geneticamente isolados do fungo por meio de marcadores moleculares do tipo RAPD, microssatélite e ITS-DNA. Para determinar a atividade de vôo do inseto foram instaladas, na periferia de pomares comerciais de coco, armadilhas de captura/monitoramento da população de adultos de R. palmarum, contendo atrativo alimentar (colmos de cana-de-açúcar) mais feromônio de agregação. Nos testes de autoinoculação utilizou-se o delineamento experimental inteiramente casualizado, em esquema fatorial 3x4 (3 concentrações do fungo e 4 tempos de autoinoculação), com 4 repetições de 5 casais. Os insetos foram separados, limpos em água destilada e transferidos para baldes contendo cana-de-açúcar inoculada com B. bassiana nas concentrações padronizadas (107, 108 e 109 esporos/mL de suspensão), permanecendo em contato com o inóculo por 45min.; 90min.; 3h00 e 6h00. Após o período de exposição ao fungo, os insetos foram individualizados, sendo a mortalidade/infecção avaliada por 20 dias. Na caracterização genética foram utilizados 11 isolados, para os quais foram obtidas culturas monospóricas que posteriormente foram repicadas, em meio líquido a 25ºC±1ºC, em agitação constante e no escuro. Após sete dias os micélios foram filtrados, liofilizados e em seguida seu DNA genômico extraído em tampão de extração SDS 10%. Foram testados 20 primers decâmeros de seqüência arbitrária da marca IDT. As amplificações foram realizadas em termociclador (Biometra/Unisciense) programado com temperatura inicial de 94°C por 5min. e 45 ciclos a 94°C por 1min., 36°C por 2min. e 72°C por 1min.. Para as análises de microssatélites foram empregados quatro pares de primers. As reações de amplificação foram feitas em um volume de 25µL. As amplificações consistiram de um ciclo inicial de 94ºC e 30 ciclos de: 94ºC por 1min.; 50ºC por 1min. e 72ºC por 2min., ao final 1 ciclo de 72ºC por 7min. Os fragmentos amplificados foram separados em gel de agarose, submetidos à eletroforese em tampão TBE, corados com brometo de etídio (0,5 µg/mL) e visualizados sob luz UV. Observou-se que o inseto inicia sua atividade de vôo as 5h00 até às 18h00, ocorrendo um pico populacional máximo das 9h00 às 11h00. Verificou-se uma mortalidade crescente de adultos de R. palmarum em função do aumento da concentração do fungo e dos tempos de exposição ao inóculo. O maior índice de mortalidade (53%) ocorreu nove dias após a autoinoculação do inseto. As análises de RAPD geraram 138 bandas polimórficas e 14 monomórficas, sendo os padrões empregados para o cálculo das similaridades genéticas que variaram de 2% a 77%. Os isolados 57.99 (Betume2-SE) e 53.96 (Moju-PA) apresentaram maior similaridade (77%), seguidos de 64.99 (Egito) e 53.96 (Moju-PA), com uma similaridade de 73% pelo teste de RAPD. Enquanto que para o microssatélite os isolados BC.05 e 32.91 apresentaram maior similaridade genética (82%), seguidos de 64.99 e 57.99 com similaridade genética de 80%. Não foram observadas variações na amplificação das regiões ITS de DNAr para os isolados de B. bassiana.

Avaliou-se a patogenicidade de diversas espécies de fungos entomopatogênicos a ninfas de 2º a 4º ínstares do psilídeo Diaphorina citri. Assim foram feitos bioensaios com Beauveria bassiana, Metarhizium anisopliae, Lecanicillium muscarum, L. longisporum, Paecilomyces fumosoroseus, P. farinosus, Syngliocladium sp. na concentração de 5x107 conídios/mL para cada patógeno, com exceção de Hirsutella thompsonii que foi aplicado na concentração de 2,8x107 conídios/mL. Utilizou-se mudas de murta, Murraya paniculata, infestadas com ninfas do inseto que foram pulverizadas com as suspensões conidiais. Os fungos B. bassiana, M. anisopliae, H. thompsonii, L. muscarum e P. fumosorosus foram patogênicos para as ninfas do psilídeo. O isolado mais promissor foi o Esalq-PL63, de B. bassiana, que causou mortalidade de aproximadamente 72% das ninfas, sete dias após a inoculação. Esse fungo também afetou o processo de metamorfose das ninfas. A concentração letal média (CL50) foi calculada em 2,3 x 107 conídios/mL. O ciclo de infecção de B. bassiana sobre as ninfas do psilídeo foi estudado pulverizando-se a suspensão de 3x108 conídios/mL do fungo e, em seguida, observado em microscopia de luz e microscopia eletrônica de varredura, nos intervalos de tempo de 0, 24, 48, 72 e 168 horas após a inoculação. Constatou-se que o referido patógeno não conseguiu completar o desenvolvimento no corpo do hospedeiro, uma vez que a fase de conidiogênese é inibida, provavelmente, pela presença no interior do inseto de bactérias antagônicas ao seu desenvolvimento. O isolado Esalq-PL63 é um promissor agente de controle microbiano de ninfas de D. citri por afetar sua fisiologia e causar em altos índices de mortalidade. / It was evalueted the patogenicity of several species of entomopathogenic fungi against 2nd to 4th instar of Diaphorina citri. For the bioassays with Beauveria bassiana, Metarhizium anisopliae, Lecanicillium muscarum, L. longisporum, Paecilomyces fumosoroseus, P. farinosus, Syngliocladium sp. a concentration of 5x107 conidia.mL-1 was used. For the Hirsutella thompsonii strain the concentration used was 2.8x107 conidia.mL-1. Seedlings of orange jasmine, Murraya paniculata, infested with nymphs of the insect were sprayed with the conidia suspensions. The fungi B. bassiana, M. anisopliae, H. thompsonii, L. longisporum and P. fumosoroseus were pathogenic to nymphs. The strain of B. bassiana (Esalq-PL63) was the most pathogenic causing 72% mortality after seven days of inoculation. This fungus also affected the process of nymph molting. The letal concentration (LC50) calculated was 2.3x107 conidia.mL-1. To prove mortality the pathogen was reisolated in media culture (AN, MC and BDA) and besides, observed under microscope examination. The infection cycle of B. bassiana in nymphs was studied after inoculation of 3x108 conidia.mL-1. This process were evaluated with the use of a light microscope and an electron scan microscope, after 0, 24, 48, 72 and 168 hours of conidia sprayed. This strain did not complete the development in the host because the conidiogenesis was inhibited, probably because it was found antagonistic bacteria into the host. However, this isolate is a potencial microbial control agent of nymphs of D. citri, affecting its physiology and causing high mortality.

Este trabalho teve o objetivo de avaliar, em condições de laboratório, a influência da temperatura e do tempo de exposição na viabilidade e virulência dos fungos Beauveria bassiana e Metarhizium anisopliae em suspensões preparadas com produtos à base de Conídios puros, Arroz+fungo e nas formulações Pó molhável e Suspensão concentrada em óleo emulsionável. Inicialmente foi necessário o desenvolvimento de um método eficiente e econômico para avaliação da viabilidade, especialmente para produtos formulados em óleo emulsionável misturados em água (suspensão de aplicação). Durante o desenvolvimento do método de avaliação foram definidos parâmetros e condições adequadas para cada formulação, como o meio de cultura, e também a influência de antibióticos e fungistáticos. O protocolo estabelecido baseiase resumidamente no plaqueamento de 150 µL de uma suspensão contendo entre 0,7 e 1×106 conídios/mL em placas tipo Rodac® com 5 mL de meio de cultura Batata-Dextrose-Ágar + 5 mg/L de Pentabiótico® e 10 µL/L de Derosal® (Carbendazim), efetuando-se posteriormente a contagem dos conídios germinados. Este método foi comparado com outra técnica de viabilidade direta (VD) e com as técnicas de Unidade Formadoras de Colônia (UFC) e viabilidade por fluorescência, confrontando-se a precisão obtida pelo coeficiente de variação (CV) das análises de cada método. Os resultados demonstraram que além da facilidade de execução, o método desenvolvido apresentou maior precisão que as demais técnicas (com CV até 7 vezes menor em relação à VD, e até 32 vezes menor que UFC). Foi constatado que a técnica de UFC não é adequada para avaliações de produtos formulados, visto que em relação à quantificação inicial subestimou a concentração viável na maioria das formas dos fungos testadas, sendo que nos produtos em óleo emulsionável estes valores foram 54% menores para B. bassiana, e 73% menores para M. anisopliae. A técnica para avaliação da viabilidade da suspensão preparada com produtos formulados em óleo se mostrou eficaz, após a retirada do óleo da suspensão e outras adaptações. Suspensões de produtos e formulações a base de B. bassiana e M. anisopliae foram mantidas a 26°C, 36°C e 46°C por 1h, 4h e 6h e os efeito destes tratamentos foram medidos na viabilidade e virulência dos fungos contra lagartas de Diatraea saccharalis. Verificou-se que quanto maior o tempo de exposição e maior a temperatura, maior é a influência negativa nos parâmetros dos fungos. Entretanto, a formulação em óleo emulsionável foi a que apresentou melhor proteção aos efeitos detrimentais da temperatura. Mesmo após 6h de exposição a temperatura de 36°C a viabilidade se manteve acima dos 85% para ambos os fungos avaliados. Esta formulação também apresentou os melhores resultados de mortalidade dos insetos, e mesmo após 4h de exposição a 46°C atingiu 39% e 50% de eficiência para B. bassiana e M. anisopliae, respectivamente, sendo recomendável para o controle de D. saccharalis. O protocolo para avaliação da viabilidade de conídios de fungos entomopatogênicos proposto constitui-se como uma ferramenta importante para estudos da influência de fatores bióticos e abióticos durante o período de pré-aplicação na eficiência de micoinseticidas. / This study aimed to evaluate, under laboratory conditions, the influence of temperature and exposure time on the viability and virulence of Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae in suspensions prepared with pure conidia, rice plus fungus and in formulations of wettable powder and concentrated suspension in emulsifiable oil. Initially, an efficient and economical methodology was developed to evaluate conidia viability for each formulation, especially for products formulated in emulsifiable oil mixed in water (suspension of application). During the development of the methodology, the influence of culture media, antibiotics and fungistatics and appropriate conditions were defined for each formulation. Briefly, the established protocol was based on plating 150 L of suspensions containing between 0.7 and 1×106 conidia/mL on a plate type Rodac® with 5 ml of Potato Dextrose Agar culture medium plus 5 mg/L pentabiotic® and 10mg/L and 10 µL/L Derosal® (Carbendazim) and the subsequent counting of germinated conidia. This method was compared to a direct counting (DC) technique, the technique of colony-forming unit (CFU) and viability through fluorescence. The precision of each methodology was measured by their coefficient of variability (CV). Besides its easiness of execution, the new developed methodology was the most precise of all methods (with CV up to 7 times lower compared to the DC, and up to 32 times lower than the UFC). Our results showed that the technique of UFC is not appropriate for evaluation of formulated products, as compared to the conidial quantification by hemacytometer, this technique underestimated the viable concentration in most forms of fungi tested, and for the products in emulsifiable oil these values were 54% lower for B. bassiana, and up to 73% lower for M. anisopliae. The technique for assessing the viability of the suspension prepared with products formulated in emulsifiable oil was effective, after the removal of oil from the suspension and others adaptations. The effect of temperature and period of time on conidia viability of B. bassiana and M. anisopliae-based products and formulations and their virulence against larvae of Diatraea saccharalis was measured at 26°C, 36°C and 46°C for 1h, 4h and 6h. The longer the time of heat exposure and the higher the temperature, the greater the negative influence on vital parameters of the fungi. However, the emulsifiable oil formulation was the least affected by the detrimental effects of heat for both fungi. Even after 6 hours of exposure to temperature of 36°C, the viability remained above 85% for both species evaluated. This formulation also showed the best results of insect mortality, and even after 4h of exposure to 46°C the efficiency was 39% (for B. bassiana) and 50% (for M. anisopliae), and therefore can be useful for control of D. saccharalis. The proposed protocol of evaluation of entomopathogenic fungi viability is a valuable tool for studies of biotic and abiotic factors effect on efficiency of micoinsecticides during the pre-application period.

Wireworms are the subterranean larval stage of click beetles (Coleoptera: Elateridae), generalist herbivores that feed on a wide range of crops and cause serious damage. Wireworm management is challenging due to their long life cycle, subterranean habitat, wide range of host plants, and lack of effective chemical approach in most crops. Thus, developing an effective alternative control approach is an urgent need. The overall aim of this research study was to evaluate alternative [to insecticides] tactics that could be used as components of effective IPM strategies against wireworms. In Chapter 1 we provide an overview of wireworm's biology and management practices. In Chapter 2 we focused on biological control to evaluate the efficacy of entomopathogenic nematodes and fungi as single and mixed application against Limonius californicus and L. infuscatus in organic vegetable farms. The results showed the higher efficacy of commercial EPN, Steinernema feltiae, against Limonius species than entomopathogenic fungi. In Chapter 3, we focused on cultural control as a component of integrated pest management for wireworm control. We evaluated the efficacy of brown and yellow mustard and their byproducts, including defatted seed meal and seed meal concentrated extract against Limonius spp. Our finding indicated the effectiveness of brown mustard concentrated extract on reducing the wireworm population. However, it has a negative impact on the field-residing entomopathogenic nematodes. In Chapter 4, in the component of cultural control, we evaluated the wireworm, L. californicus, preference to three different crops, pea, bean, and wheat, for identifying an effective trap crop. We also quantified CO2 and organic volatile compounds released from each plant's root and evaluated the wireworm response toward the synthetic volatiles. Detailed results are provided in chapter 4. Finally, we looked at the novel new technology of RNA interference to find the effective target genes in wireworms for application as bioinsecticides and/or transgenic plants to control wireworms. In the concluding chapter, Chapter 6, we summarized our findings on the efficacy of different management tactics, biological, cultural, and molecular, to control Limonius species in cereals and organic production systems. / Doctor of Philosophy / Wireworms, the larval stage of click beetles (Coleoptera: Elateridae), are belowground pests that feed on a wide range of crops such as potatoes, cereals, vegetables, and sugar beet and can cause serious economic damage. Wireworm management is challenging because they live for long periods in the soil and feed on almost all crops. Moreover, most insecticides available for wireworm control, such as neonicotinoids, are not effective in reducing wireworm populations and just serve as feeding deterrents. Thus, developing an effective alternative control approach is an urgent need. The overall aim of this research study was to evaluate alternative [to insecticides] tactics that could be used as components of effective IPM strategies against wireworms. In Chapter 1 we provide an overview of wireworm's biology and management practices. In Chapter 2 we focused on biological control to evaluate the efficacy of entomopathogenic nematodes and fungi when applied individually and in combination with each other against sugar beet wireworm in organic vegetable farms. The results showed the commercial nematode, Steinernema feltiae was more effective in reducing sugar beet wireworm than fungi. In Chapter 3, we focused on cultural control as a component of integrated pest management for wireworm control. We evaluated the efficacy of brown and yellow mustard and their byproducts including defatted seed meal and seed meal concentrated extract against sugar beet wireworms in spring wheat. Our finding indicated the effectiveness of brown mustard concentrated extract in reducing the wireworm population. In Chapter 4, in the component of cultural control, we evaluated the sugar beet wireworm preference for three different crops, pea, bean, and wheat, for identifying an effective trap crop. We also quantified CO2 and organic volaille compounds released from each plant's root and evaluated the wireworm response toward the synthetic volatiles. Detailed results are provided in chapter 4. Finally, we looked at the novel new technology of RNA interference to find the effective target genes in wireworms for application as bioinsecticides and/or transgenic plants to control wireworms. In the concluding chapter, Chapter 6, we summarized our findings on the efficacy of different management tactics, biological, cultural, and molecular, to control wireworm species in cereals and organic production systems.

White grubs (Coleoptera: Scarabaeidae) are important turfgrass pests in Virginia. Insecticides such as the neonicotinoid imidacloprid are commonly applied to turfgrass in order to control these pests. As an alternative to synthetic insecticides, entomopathogenic fungi (EPF), including Metarhizium brunneum (Petch) and Beauveria bassiana (Balsamo) Vuillemin may also be used for white grub control. The interaction of combining these two control tactics for white grubs in Virginia merits further investigation as does their effects on other soil organisms such as earthworms, which cohabitate with white grubs in turfgrass soil ecosystems. Herein, I investigate the following: 1) the efficacy of combined applications of the EPF, M. brunneum and B. bassiana with lower rates of imidacloprid or the diamide insecticide, chlorantraniliprole against white grubs; 2) interactions of earthworms with white grubs and EPF; and 3) the effect of white grub control products on earthworms. In the laboratory, a combined application of one half the recommended rate of chlorantraniliprole plus the full recommended rate of B. bassiana caused significantly higher mortality of third instar Cyclocephala spp. grubs than the untreated control. In the field, imidacloprid applied at lower rates as a single treatment or as part of a combined treatment with EPF resulted in significantly fewer grubs when applications were made in June. In the greenhouse, Japanese beetle, Popillia japonica Newman females laid a significantly reduced number of eggs in turf treated with lower rate of imidacloprid either applied as a single treatment or as part of a combined treatment compared with untreated control. In an earthworm-white grub interaction study, the earthworms Eisenia fetida (Savingy) and E. hortenis (Michaelsen) were shown to transfer B. bassiana spores from fungus-infected soil to uninfected soil in the laboratory. However, the presence of earthworms in fungal infected soil did not enhance the mortality of Cyclocephala spp. grubs. In bioassays conducted in the laboratory, only two neonicotinoids, dinotefuran and imidacloprid, caused significantly higher mortality to adult Lumbricus terrestris L. earthworms than untreated control consistently. When applied as a drench to turfgrass in spring, summer, and fall, none of the insecticides significantly reduced the earthworm densities compared with a water control. / Ph. D. / White grubs cause serious damage to turfgrass in Virginia and as a part of turf management programs, insecticides such as the neonicotinoid imidacloprid are routinely applied to eliminate these pests. However, there are environmental concerns over the excessive use of neonicotinoids. In addition, these insecticides are typically only effective when they are applied in the summer to target small grubs. Herein, I investigated if combining reduced rates of imidacloprid or another insecticide, chlorantraniliprole, with commercially-available insect-killing fungi <i>Beauveria bassiana</i> or <i>Metarhizium brunneum</i>, could enhance white grub control. Neither the insecticides alone, nor the aforementioned fungal biopesticides provided effective control of larger white grubs in lab bioassays and field experiments. Additional research was aimed at understanding the interactions of insecticides and fungi on both white grubs and earthworms, which cohabitate frequently with white grubs in turfgrass soil ecosystems. In a greenhouse experiment, Japanese beetle females laid fewer eggs in turf treated with imidacloprid, but that chlorantraniliprole or the insect disease causing fungi did not affect beetle egg laying. In another experiment, earthworms were shown to transfer insect disease causing fungi in the soil in the laboratory. However, the presence of earthworms did not increase white grub fungal infection in fungi-infested soil in the lab. Additional experiments showed that two neonicotinoids, dinotefuran and imidacloprid, killed more earthworms than other insecticides when applied to soil in the lab. However, when applied as a drench to turfgrass in spring, summer, or fall, neither of these insecticides nor several others registered for use on turfgrass resulted in fewer earthworms compared with a water control. The complex interactions between turf-damaging white grubs, the insecticides used to control them, insect disease-causing fungi in the soil and non-target beneficial organisms such as earthworms warrant further investigation to help us move toward more sustainable pest management approaches in the future.

O controle de Hypothenemus hampei é realizado basicamente com uso de inseticidas químicos, especialmente aqueles a base de endossulfan, cuja comercialização será proibida no Brasil a partir de julho de 2013. Diante disso, outras estratégias devem ser integradas buscando-se o controle desta praga com menor impacto ao ambiente. Nesse contexto, o fungo Beauveria bassiana destacase como um dos agentes de controle biológicos mais promissores. Neste estudo, buscou-se a associação da técnica de impregnação de tecido têxtil com B. bassiana associado à armadilha contendo a mistura de alcoóis metanol: etanol (1:1 v/v) como atraentes químicos para H. hampei, visando a auto-inoculação e disseminação do fungo pelo inseto, visando o seu controle. Inicialmente foi determinado em laboratório, a virulência de nove isolados de B. bassiana, através da pulverização de suspensões de 107 conídios.mL-1, diretamente sobre adultos de H. hampei. Todos os isolados apresentaram baixa virulência ao inseto, com mortalidade máxima de 38,5%. O isolado ESALQ-PL63 foi escolhido para dar continuidade aos estudos por possuir registro de comercialização. Posteriormente, sete tecidos têxteis sintéticos foram avaliados quanto à produção do isolado selecionado sobre sua superfície em duas condições de luz (fotofase de 0 e 12 horas). O tecido sintético Lã \"Sherpa\" foi selecionado por permitir uma maior produção de conídios nas duas condições testadas, atingindo até 5,44 × 108 conídios.cm-2. A exposição de H. hampei ao tecido com o fungo por apenas 5 segundos foi suficiente para causar 88,5% de mortalidade dos insetos. Em área de café sombreado foram conduzidos dois experimentos para avaliar uma armadilha de auto-inoculação contendo o patógeno produzido sobre o tecido. Foram usadas duas armadilhas controle, sendo uma armadilha de autoinoculação sem fungo e uma armadilha de eficiência reconhecida (modelo IAPAR). A eficiência de coleta da armadilha de auto-inoculação com o fungo foi menor do que a armadilha IAPAR, mas esta se mostrou eficiente na contaminação e mortalidade dos insetos pelo fungo. No primeiro experimento, a mortalidade confirmada pelo patógeno no último dia de avaliação (151 dias) foi de 64,7%. A viabilidade dos conídios passou de 98,3%, logo após a montagem das armadilhas, para 86,9% após 65 dias. Após160 dias a viabilidade reduziu para 44,0%. No segundo experimento, a última avaliação foi realizada após 40 dias, sendo nesta data observada mortalidade confirmada de 89,9% e viabilidade dos conídios de 78,1%. Em ambos os experimentos a concentração de conídios reduziu-se ao longo do tempo. O sistema de auto-inoculação apresentou resultados promissores, mas sendo necessárias alterações na armadilha para aumentar a captura de insetos e estudos epizootiológicos para avaliar a capacidade de disseminação da doença no campo pelos insetos que passaram pela armadilha. / The control of Hypothenemus hampei is accomplished primarily with the use of chemical insecticides, mainly endossulfan, whose commercialization will be prohibited in Brazil in July 2013. Therefore, other strategies must be integrated seeking control of this pest with less impact on the environment. In this context, the fungus Beauveria bassiana stands out as one of the most promising biological control agents. In this study, we associated the technique of fabric impregnated with B. bassiana with a trap containing a mixture methanol: ethanol (1:1 v/v) as an attractive chemical for H. hampei, aiming the self-inoculation and fungus dissemination by the insect, therefore their control. Initially, we determined in the laboratory, the virulence of nine isolates of B. bassiana using a spray suspension of 107 conidia.mL-1 directly on adults of H. hampei. All isolates showed low virulence to insects, with maximum mortality of 38.5%. The isolate ESALQ-PL63 was chosen to continue the studies for having a market register. Subsequently, seven synthetic fabrics were evaluated for the production of the selected isolate on its surface under two light conditions (photofase of 0 and 12 hours). The synthetic fabric Lã \"Sherpa\" was selected because it allows greater conidia production under the two conditions tested, reaching 5.44 × 108 conidia.cm-2. Exposure of H. hampei to the fabric impregnated with the fungus for only 5 seconds was enough to cause 88.5% of insect mortality. In an area of shaded coffee, two experiments were conducted to evaluate a self-inoculation trap containing the pathogen. We used two control traps without fungus: one self-inoculation trap without the fungus and a widely recognized efficient trap (IAPAR model). The collection efficiency of the self-inoculation trap with the fungus was lower than that of the IAPAR trap, however, it proved effective in contamination and insect mortality caused by the fungus. In the first experiment, mortality caused by the pathogen at the last evaluation day (151 days) was 64.7%. The viability of the conidia surpassed 98.3% after the assembly of the traps and 86.9%, after 65 days. After 160 days, the viability decreased to 44.0%. In the second experiment, the last evaluation was performed after 40 days, when we observed mortality of 89.9% and conidia viability of 78.1%. In both experiments, the conidia concentration reduced over time. The self-inoculation system showed promising results, but changes are needed to increase insect catches and further epizootiological studies to assess the possibility of disease spread in the field by insects that crossed the trap.

Os estudos da epizootiologia foram realizados em Pindorama-SP e em Itiquira-MT durante dois anos. No primeiro local, constatou-se em agosto de 1998 uma epizootia de Sporothrix sp. em ninfas do percevejo. Em Itiquira, quando a infestação atingiu 56 ninfas e 18 adultos/folha, verificou-se a ocorrência natural de Sporothrix sp., reduzindo significativamente a população. Na seleção de fungos entomopatogênicos, testou-se sessenta isolados obtidos de diferentes hospedeiros e localidades sobre ninfas do 4º ínstar. Os melhores isolados foram B. bassiana (619 e 1196) com 56 e 84% de mortalidade com 3 dias após a inoculação, M. anisopliae (1144 e 1104) ambos com 90%, S. insectorum (1229) com 92% e P. fumosoroseus (1200) com 100%. Trichoderma sp., após quatro dias da inoculação causou 78% de mortalidade. Na avaliação de campo, as concentrações superiores a 10 12 e 10 13 conídios/ha foram eficientes para controle do percevejo sendo que os fungos P. fumosoroseus (1200), B. bassiana (447) e M. anisopliae (1175 e 1144) foram eficientes para controle de L. heveae. Nos estudos de toxicidade, as formulações Decis e Nuvacron foram compatíveis com B. brongniartii (619). A maioria das combinações, com exceção da formulação de Decis foi compatível com V. lecanii (972). M. anisopliae (1144) foi muito sensível para todas as formulações. Nuvacron e Stron foram compatíveis com B. bassiana (1196), P. fumosoroseus (1200) e S. insectorum (1229). Marshal foi compatível com B. bassiana (1196) e S. insectorum (1229) e Dipterex foi compatível com P. fumosoroseus (1200). Avaliou-se dois métodos de produção e dois meios de cultura para os fungos B. bassiana (1196), M. anisopliae (1189), Sporothrix insectorum (1229), Paecilomyces fumosoroseus (1200) e Verticillium lecanii (1200). Os fungos P. fumosoroseus e B. bassiana foram os que mais produziram pelo método da caixa. No método da bandeja, B. bassiana foi o fungo mais produtivo. Entre os métodos de produção testados V. lecanii produziu mais no método de bandeja e P. fumosoroseus no método da caixa. Em observações em Microscópio Eletrônico de Varredura LEO 435VP (MEV) verificou-se que em geral, todos os hifomicetos apresentaram ciclos biológicos semelhantes sobre L. heveae, tendo um período de adesão, germinação e início da penetração de 24 h, crescimento vegetativo entre 48 e 72 h, e a extrusão e conidiogênse dos patógenos em 96 h. / Studies on epizootiology were carried out in Pindorama-SP and Itiquira-MT, Brazil during two years. In Pindorama, in August 1998 an epizootic of Sporothrix sp. was observed in lacebug nymphs. In Itiquira, when the infestation reached 56 nymphs and 18 adults/leaf, a natural occurrence of Sporothrix sp. was observed, reducing significantly the pest population. Entomopathogenic fungi for use in lacebug control were selected from sixty isolates obtained from different hosts and applied to 4th instar nymphs. The best isolates were Beauveria bassiana (619 and 1196) with 56 and 84% mortality 3 days after the inoculation, Metarhizium anisopliae (1144 and 1104) both with 90%, S. insectorum (1229) with 92%, and Paecilomyces fumosoroseus (1200) with 100%. Trichoderma sp. caused 78% of mortality four days after inoculation. In field evaluations, the concentrations above 10 12 conidia/ha were efficient for control of the lacebug and the fungal isolates P. fumosoroseus (1200), B. bassiana (447) and M. anisopliae (1175 and 1144) were efficient for control of L. heveae. In the toxicity studies, the formulations Decis and Nuvacron were compatible with B. brongniartii (619). Most of the combinations, except for Decis, were compatible with Verticillium lecanii (972). M. anisopliae (1144) was very sensitive to all the formulations. Nuvacron and Stron were compatible with B. bassiana (1196), P. fumosoroseus (1200) and S. insectorum (1229). Marshal was compatible with B. bassiana (1196) and S. insectorum (1229), and Dipterex was compatible with P. fumosoroseus (1200). Two production methods and two culture media were evaluated for production of the fungi B. bassiana (1196), M. anisopliae (1189), S. insectorum (1229), P. fumosoroseus (1200) and V. lecanii (1200). The fungi P. fumosoroseus and B. bassiana were the most productive using the box method. In the tray method, B. bassiana was the most productive fungus. Between the production methods tested, V. lecanii was more productive in the tray method and P. fumosoroseus in the box method. Observations in Scanning Electronic Microscope LEO 435VP (SEM) revealed that, in general, all of the hyphomycetes had similar biological cycles on L. heveae, with adhesion, germination and beginning of the penetration within 24 h, vegetative growth between 48 and 72 h, and the extrusion and conidiogenesis of the pathogens by 96 h.

Microrganismos formam associações com a maioria das espécies animais e um exemplo fascinante são as múltiplas interações nas colônias de formigas-cortadeiras. Os efeitos dessas interações (positivos e negativos) se manifestam na sanidade e desenvolvimento das colônias. Sendo assim, a compreensão das interações que ocorrem entre os microrganismos das colônias de formigas-cortadeiras A. sexdens é importante para fundamentar o controle biológico desta praga. Esse presente trabalho foi dividido em três capítulos. O primeiro capítulo objetivou comparar o desenvolvimento de colônias de Atta sexdens (Linnaeus) em contato com dois solos: (i) de área com ninhos e (ii) de área sem ninhos de formigas-cortadeiras. Foram conduzidos dois experimentos em laboratório. No experimento I, fêmeas recémfecundadas fundaram a colônia em pote com gesso e, após 106 dias, entraram em contato com solo. No experimento II, as fêmeas recém-fecundadas fundaram suas colônias diretamente no solo. A taxa de mortalidade de colônias, após 106 dias da revoada e se desenvolvendo em pote com gesso, foi de 28,6%. Quando se desenvolveram desde o início em contato com o solo, a taxa de mortalidade elevouse a 67,2 %. Os resultados confirmam que as colônias incipientes de A. sexdens sofrem forte pressão seletiva de microrganismos do solo no momento da fundação. No entanto, após o surgimento da força operária, mecanismos de defesa imune social, provavelmente, garantem o desenvolvimento da colônia a despeito da presença de microrganismos patogênicos no solo dos ninhos. O segundo capítulo objetivou isolar e identificar actinobactérias de solos de câmaras de jardim de fungos de A. sexdens e avaliar o efeito inibitório desses isolados sobre fungos associados às colônias de formigas-cortadeiras. Foram sequenciados o gene 16S rRNA de nove actinobactérias, sendo seis do gênero Streptomyces, duas do gênero Nocardia e uma do gênero Kitasatospora. Foi verificado que dois isolados de Streptomyces e um de Kitasatospora inibiram não só o fungo Escovopsis sp., como também o fungo entomopatogênico Metarhizium anisopliae e o fungo antagonista do cultivar simbionte de cortadeiras Trichoderma aff. strigosellum. Uma vez que não existem evidências de cultivo de actinobactérias na cutícula de operárias do gênero Atta, é possível hipotetizar que essas operárias estabeleçam simbiose temporária adaptativa com microrganismos do solo produtores de substâncias antifúngicas e antibióticas e que vivem em alguma parte de seu ninho ou mesmo no interior do seu corpo. Além disso, 10 os fungos patogênicos para colônias de formigas-cortadeiras presentes no solo adjacente ao ninho, apesar de constituírem um risco, podem ser controlados pelas secreções produzidas pelas operárias, bem como pelos metabólitos de algumas actinobactérias. O terceiro capítulo teve como objetivo verificar a aceitação e incorporação de iscas contendo micélio de Escovopsis sp. em colônias jovens de Atta sexdens. Verificou-se o transporte de iscas em todas as colônias do teste. Houve redução no peso do jardim de fungos das colônias que receberam iscas com Escovopsis sp., e aumento no peso do jardim de fungos de colônias que receberam tratamento controle. Conclui-se que a utilização de iscas com micélio de Escovopsis sp. foi satisfatória para introduzir o fungo parasita no jardim de fungos de colônias de Atta sexdens. / Microorganisms form associations with most animal species, and a fascinating example is the multiple interactions in the colonies of leaf-cutting ants. The effects of these interactions (positive and negative) are exhibited in the health and development of the colonies. Therefore, the understanding of the interactions that occur among the microorganisms into leaf-cutting ants colonies is important to support of biological control of this pest. This work was divided into three chapters. The first chapter aimed to compare the development of colonies of Atta sexdens (Linnaeus) in contact with two types of soil: (i) from an area used for nesting and (ii) from an area not used for nesting of leaf-cutting ants. Two experiments were conducted in the laboratory. In experiment I, newly fertilized females founded the colony in a plastic pot with gypsum and, after 106 days were transferred to a plastic pot with soil. In experiment II, newly fertilized females founded their colonies directly on the soil. Colony mortality rate 106 days after nuptial flight and founding in a plastic pot with gypsum was 28.6%. When they developed directly in contact with the soil, mortality rate increased to 67.2%. The results support that incipient colonies of A. sexdens undergo strong selective pressure from soil microorganisms at the time of foundation. However, after the emergence of the worker force, social immune defense mechanisms likely guarantee the development of the colony, despite the presence of pathogenic microorganisms in the soil of the nests. The second chapter aimed to isolate and identify actinobacteria from soils of fungi garden chambers of A. sexdens and to evaluate the inhibitory effect of these isolates on fungi associated with leaf-cutting colonies. To identify the isolates, the 16S rRNA gene was sequenced from nine actinobacteria: six of Streptomyces genus, two of Nocardia genus and one of Kitasatospora genus. Two Streptomyces and one Kitasatospora isolates inhibited not only the fungus Escovopsis sp., but also the entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae and the antagonistic fungus of the cultivar symbiont of leaf-cutting ant Trichoderma aff. strigosellum. Since there is no evidence of cultivation of actinobacteria on the Atta worker cuticle, it is possible that these workers establish temporary adaptive symbiosis with soil microorganisms producing antifungal and antibiotic substances and living in some part of their nest or even in the interior of their body. It can be hypothesized that pathogenic fungi present in the soil adjacent to the leaf-cutting ant nest, despite the risk they represent, are controlled by the secretions produced by the workers, as well as by the metabolites of some actinobacteria. The third chapter had the objective of verifying the acceptance and incorporation of baits containing mycelium of Escovopsis sp. by young colonies of A. sexdens. We verified the transport of baits in all tested colonies. There was a reduction in the weight of the fungus garden of the colonies that received baits with Escovopsis sp., and an increase in the weight of the fungus garden of colonies that received control treatment. It is concluded that the use of baits with mycelium of Escovopsis sp. was satisfactory to introduce the fungus parasite in the fungus garden of A. sexdens colonies.