O Brasil é o país líder no uso do fungo entomopatogênico Metarhizium anisopliae para o controle pragas agrícolas. Pouco se conhece sobre a diversidade e o impacto dos micovírus em M. anisopliae sensu stricto. Este trabalho mostra a riqueza dos micovírus associados a isolados de M. anisopliae da coleção de entomopatógenos da Universidade de São Paulo, usinas sucroalcooleiras e produtos microbianos à base do entomopatógeno. RNAfd foram encontrados em 55% dos 36 isolados de Metarhizium e apresentaram 16 diferentes padrões eletroforéticos consistindo de 3 a 18 bandas de RNAfd em gel de poliacrilamida. RNAfd não foram detectados em nenhum dos produtos comerciais utilizados no presente estudo. Os diferentes padrões de vírus encontrados nos isolados aqui estudados, aparentemente, não têm relação com os locais onde foram coletados. O inibidor de síntese protéica ciclohexamida não foi eficiente na eliminação dos vírus de RNAfd em nenhum dos isolados de fungos testados. Colônias dos isolados de M. anisopliae ESALQ 866, M. anisopliae ESALQ 1256 e M. anisopliae CTC F8 foram curadas por meio do cultivo monoconidial ou isolamento de ponta de hifas. Alguns segmentos do isolado M. anisopliae PL26 foram perdidos após o subcultivo de ponta das hifas. Colônias de M. anisopliae ESALQ PL26 obtidas por meio do cultivo monoconidial ou subcultivo de ponta de hifas apresentaram grande variabilidade morfológica, no entanto, essa variação não foi correlacionada com a presença de micovírus. Colônias isogênicas de M. anisopliae ESALQ 1256 mostraram diferenças no crescimento, na produção de conídios e na virulência, no entanto, essas diferenças não foram associadas à presença de RNAfd. Não foram observadas diferenças na tolerância aos raios ultravioleta e ao calor entre as colônias de M. anisopliae ESALQ 1256, com e sem vírus de RNAfd. Colônias oriundas de setores formados no isolado M. anisopliae PL26 produziram menor quantidade de conídios e apresentaram menor quantidade de vírus RNAfd em comparação com as colônias oriundas de outras regiões da colônias originais com características normais. A repicagem sucessiva dos isolados de M. anisopliae ESALQ PL26, ESALQ 1256, CTC F8 e CTC F15, infectados por diferentes vírus de RNAfd, nos meios de cultura BDA, SDAY e meio de arroz, bem como a passagem dos fungos em larvas de Tenebrio molitor, em geral, não afetaram a replicação dos micovírus. / Brazil is the leading country in the use of the entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae against agricultural pests. Little is known about the diversity and the impact of mycovirus in M. anisopliae sensu stricto. This study shows the richness of mycovirus associated with M. anisopliae isolates from the collections of entomopathogens of the University of São Paulo, from sugar-alcohol factories and microbial based products. dsRNA were found in 55% of the 36 Metarhizium isolates and showed 16 different electrophoretic patterns consisting of 3 to 18 dsRNA bands in polyacrylamide gels. dsRNA was not detected in any of the commercial products used in this study. The different viral patterns found in the isolates studied here apparently have no relation to the locations where they were collected. The inhibitor of protein synthesis cycloheximide culture was efficient in eradicating dsRNA virus from fungi. Colonies of isolates of M. anisopliae ESALQ 866, M. anisopliae ESALQ 1256 and M. anisopliae F8 were cured by monoconidial or by hyphal tip isolation of. Some segments of the M. anisopliae PL26 isolate were lost following hyphal tip subculture. Colonies both from monoconidial culture and hyphal tip subculture of M. anisopliae ESALQ PL26 showed great morphological variability; however, this variation was not correlated with the presence of mycoviruses. Isogenic colonies of M. anisopliae ESALQ 1256 showed differences in growth, conidia production and virulence; however, these differences were not associated to the presence of the dsRNA. No difference was observed regarding tolerance to ultraviolet rays and heat among the colonies of M. anisopliae ESALQ 1256, with and without the dsRNA virus. Sectors formed in the isolate M. anisopliae PL26 produced a smaller number of conidia and fewer dsRNA virus in comparison to the original colonies with normal characteristics. The repeated subculture of isolates of M. anisopliae ESALQ PL26, ESALQ 1256, CTC F8 and CTC F15, infected by different virus of dsRNA, in the PDA, SDAY culture media and in rice, as well as the fungi passage in larvae of Tenebrio molitor, in general, did not affect the replication of the mycovirus.

Os estudos da epizootiologia foram realizados em Pindorama-SP e em Itiquira-MT durante dois anos. No primeiro local, constatou-se em agosto de 1998 uma epizootia de Sporothrix sp. em ninfas do percevejo. Em Itiquira, quando a infestação atingiu 56 ninfas e 18 adultos/folha, verificou-se a ocorrência natural de Sporothrix sp., reduzindo significativamente a população. Na seleção de fungos entomopatogênicos, testou-se sessenta isolados obtidos de diferentes hospedeiros e localidades sobre ninfas do 4º ínstar. Os melhores isolados foram B. bassiana (619 e 1196) com 56 e 84% de mortalidade com 3 dias após a inoculação, M. anisopliae (1144 e 1104) ambos com 90%, S. insectorum (1229) com 92% e P. fumosoroseus (1200) com 100%. Trichoderma sp., após quatro dias da inoculação causou 78% de mortalidade. Na avaliação de campo, as concentrações superiores a 10 12 e 10 13 conídios/ha foram eficientes para controle do percevejo sendo que os fungos P. fumosoroseus (1200), B. bassiana (447) e M. anisopliae (1175 e 1144) foram eficientes para controle de L. heveae. Nos estudos de toxicidade, as formulações Decis e Nuvacron foram compatíveis com B. brongniartii (619). A maioria das combinações, com exceção da formulação de Decis foi compatível com V. lecanii (972). M. anisopliae (1144) foi muito sensível para todas as formulações. Nuvacron e Stron foram compatíveis com B. bassiana (1196), P. fumosoroseus (1200) e S. insectorum (1229). Marshal foi compatível com B. bassiana (1196) e S. insectorum (1229) e Dipterex foi compatível com P. fumosoroseus (1200). Avaliou-se dois métodos de produção e dois meios de cultura para os fungos B. bassiana (1196), M. anisopliae (1189), Sporothrix insectorum (1229), Paecilomyces fumosoroseus (1200) e Verticillium lecanii (1200). Os fungos P. fumosoroseus e B. bassiana foram os que mais produziram pelo método da caixa. No método da bandeja, B. bassiana foi o fungo mais produtivo. Entre os métodos de produção testados V. lecanii produziu mais no método de bandeja e P. fumosoroseus no método da caixa. Em observações em Microscópio Eletrônico de Varredura LEO 435VP (MEV) verificou-se que em geral, todos os hifomicetos apresentaram ciclos biológicos semelhantes sobre L. heveae, tendo um período de adesão, germinação e início da penetração de 24 h, crescimento vegetativo entre 48 e 72 h, e a extrusão e conidiogênse dos patógenos em 96 h. / Studies on epizootiology were carried out in Pindorama-SP and Itiquira-MT, Brazil during two years. In Pindorama, in August 1998 an epizootic of Sporothrix sp. was observed in lacebug nymphs. In Itiquira, when the infestation reached 56 nymphs and 18 adults/leaf, a natural occurrence of Sporothrix sp. was observed, reducing significantly the pest population. Entomopathogenic fungi for use in lacebug control were selected from sixty isolates obtained from different hosts and applied to 4th instar nymphs. The best isolates were Beauveria bassiana (619 and 1196) with 56 and 84% mortality 3 days after the inoculation, Metarhizium anisopliae (1144 and 1104) both with 90%, S. insectorum (1229) with 92%, and Paecilomyces fumosoroseus (1200) with 100%. Trichoderma sp. caused 78% of mortality four days after inoculation. In field evaluations, the concentrations above 10 12 conidia/ha were efficient for control of the lacebug and the fungal isolates P. fumosoroseus (1200), B. bassiana (447) and M. anisopliae (1175 and 1144) were efficient for control of L. heveae. In the toxicity studies, the formulations Decis and Nuvacron were compatible with B. brongniartii (619). Most of the combinations, except for Decis, were compatible with Verticillium lecanii (972). M. anisopliae (1144) was very sensitive to all the formulations. Nuvacron and Stron were compatible with B. bassiana (1196), P. fumosoroseus (1200) and S. insectorum (1229). Marshal was compatible with B. bassiana (1196) and S. insectorum (1229), and Dipterex was compatible with P. fumosoroseus (1200). Two production methods and two culture media were evaluated for production of the fungi B. bassiana (1196), M. anisopliae (1189), S. insectorum (1229), P. fumosoroseus (1200) and V. lecanii (1200). The fungi P. fumosoroseus and B. bassiana were the most productive using the box method. In the tray method, B. bassiana was the most productive fungus. Between the production methods tested, V. lecanii was more productive in the tray method and P. fumosoroseus in the box method. Observations in Scanning Electronic Microscope LEO 435VP (SEM) revealed that, in general, all of the hyphomycetes had similar biological cycles on L. heveae, with adhesion, germination and beginning of the penetration within 24 h, vegetative growth between 48 and 72 h, and the extrusion and conidiogenesis of the pathogens by 96 h.

Thesis (PhD (Agric))--University of Stellenbosch, 2004. / ENGLISH ABSTRACT: Biological control studies were conducted with isolates of entomopathogenic fungi Beauveria bassiana and Metarrhizium anisopliae from Ethiopia and South Africa against the spotted stem borer Chilo partellus. The study was conducted from April 2002 to April 2003, at the department of Entomology and Nematology, University of Stellenbosch, South Africa. The objectives were to screen these isolates for pathogenicity and to determine the susceptibility of different larval instars; to study the effect of temperature on fungal development and virulence; to investigate food consumption of fungus treated larvae; to determine compatibility of fungal isolates with insecticides; to study the effect of exposure methods and diets on larval mortality; and to evaluate promising isolates under greenhouse conditions using artificially infested maize plants. Four isolates of B. bassiana and six isolates of M. anisopliae were tested against second instar larvae. Of these isolates, B. bassiana (BB-01) and M. anisopliae (PPRC-4, PPRC-19, PPRC-61 and EE-01) were found to be highly pathogenic inducing 90 to 100 % mortality seven days after treatment. In subsequent assays, the fungal isolates were tested against third, fourth, fifth and sixth instar larvae. Second and sixth instar larvae were more susceptible to these isolates than third, fourth and fifth instar larvae. Conidial germination, radial growth and sporulation of the isolates PPRC-4, PPRC-19, PPRC-61, EE-01 and BB-01 were retarded at 15 and 35 0C. A suitable temperature range for the isolates was from 20 - 30 0C. At 25 and 30 0C the isolates induced 100 % mortality to second instar larvae within four to six days. Second and third instar C. partellus larvae were treated with the isolates PPRC-4 and BB-01, and daily consumption of maize leaf was measured. Treatment with the fungi was associated with a reduction in mean daily food consumption. In in-vitro studies, five concentrations (0.1 ppm, 1 ppm, 5 ppm, 10 ppm, and 100 ppm active ingredients) of the insecticides benfuracarb and endosulfan were tested with the isolates PPRC-4, PPRC-19, PPRC-16, EE-01 and BB-01. Increasing the concentration of the insecticides adversely affected germination, radial growth and sporulation of the isolates. In in-vivo studies combining the fungi, PPRC-4 and BB-01,with low concentrations (1 and 5 ppm a.i.), of the insecticides increased the mortality of third instar larvae from 65 to 100 %. Larvae sprayed directly with conidia, exposed to conidia treated leaves and dipped into conidial suspensions suffered high mortality of 98 to 100 %. Larvae exposed to treated leaves and larvae sprayed directly with conidia produced high numbers mycoses in cadavers. Exposure of larvae to treated leaves yielded high sporulation. At a low conidial concentration (1.25x107 conidia/ml), mycosis and sporulation were high. The optimum temperature was 20 0C for mycosis and 15 0C for sporulation. In greenhouse trails, a conidial suspension of 2 x 108 conidia/ml of the pathogenic isolates was sprayed on 3 to 4 week-old maize plants infested with 20 second instar larvae per plant. This resulted in suppression of foliar damage. Treatment with the fungi also reduced stem tunneling and deadheart. In addition, fungal treatment increased mean plant fresh and dry biomass compared to untreated control plants. In general, results from laboratory and greenhouse studies indicated that there was good potential for the use of these fungal isolates for controlling C. partellus larvae. / AFRIKAANSE OPSOMMING: Biologiese beheerstudies is uitgevoer met isolate van die insekpatogeniese swamme, Beauvaria bassiana en Metarrhizium anisopliae teen die gespikkelde stamboorder, Chilo partellus. Die doelwitte was om hierdie isolate te evalueer vir patogenesiteit; die vatbaarheid van verskillende larvale instars teenoor hulle te bepaal; die invloed van temperatuur op swamontwikkeling en virulensie te bepaal; die voedsel inname van swambehandelde larwes te ondersoek; die verenigbaarheid van die swamisolate met insektedoders te bepaal; die invloed van blootstellingsmetodes en diëte op larvale mortaliteit; en om belowende isolate in glashuisproewe te evalueer met gebruik van kunsmatig besmette mielieplante. Vier isolate van B. bassiana en ses isolate van M. anisopliae is teen tweede instar larwes getoets. Uit dié isolate is B. bassiana (BB-01) en M. anisopliae (PPRC-4, PPRC- 19, PPRC-16 en EE-01) as hoogs patogenies bevind. Hulle het 90 tot 100 % mortaliteit na sewe dae veroorsaak. In daaropvolgende essays, is die swamisolate teen derde, vierde, vyfde en sesde instar larwes getoets. Tweede en sesde instar larwes was gevoeliger vir die isolate as die derde, vierde en vyfde instar larwes. Spoorkeming, radiale groei en sporulasie van die isolate PPRC-4, PPRC-19, PPRC-61, EE-01 en BB-01, is by 15 en 35 0C vertraag. ‘n Aanvaarbare temperatuurreeks vir die isolate is vanaf 20 tot 30 0C. By 25 en 30 0C het die isolate 100 % mortaliteit teen tweede instar larwes binne vier tot ses dae geïndusseer. Tweede en derde instar C. partellus larwes is met die isolate PPRC-4 en BB-01 behandel en die daaglikse inname van mielieblare gemeet. Behandeling met die swamme is met ‘n afname in die gemiddelde voedselinname geassosieer In in-vitro studies is vyf konsentrasies (0.1 dpm, 1 dpm, 5 dpm, 10 dpm en 100 dpm aktiewe bestandele) van die insekdoders, benfuracarb en endosulfan getoets saam met die isolate PPRC-4, PPRC-19, PPRC-16, EE-01 en BB-01. ‘n Toename in die konsentrasie van die insekdoders het ontkieming, radiale groei en sporulasie van die isolate benadeel. In in-vitro studies het die kombinering van die die swamme, PPRC-4 en BB-01, met lae konsentrasies (1 en 5 dpm a.b.) van die insekdoders mortaliteit van derde instar larwes vanaf 65 tot 100 % laat toeneem. Larwes wat direk met spore gespuit is, aan behandelde blare blootgestel is en in spoorsuspensies gedoop is het tot hoë mortaliteit gelei, (98 tot 100 %). Blootstelling aan behandelde blare saam met ‘n lae konidiakonsentrasie, 1.25x106 spore/ml) en ‘n temperatuur van 15 tot 20 0C het tot hoë swammikose en sporulasie in kadawers gelei. In glashuisproewe, is ‘n spoorsuspensies van 2 x 108 spores/ml van die patogeniese isolate op 3 tot 4 weekoud mielieplante wat met 20 tweede instar larwes per plant besmet is gespuit. Dit het blaarskade onderdruk. Behandeling met die swamme het ook stamtonnels en dooiehart verminder. Boonop het swambehandeling die vars- en droë plantbiomassa laat toeneem in vergelyking met die onbehandelde kontrole plante. Oor die algemeen het resultate van laboratorium- en glashuisproewe getoon dat daar goeie potensiaal is vir die gebruik van hierdie swamisolate vir die beheer van C. partellus larwes.

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A broca da cana-de-açúcar, Diatraea saccharalis (Fabricius, 1794) (Lepidoptera: Crambidae) é naturalmente infectada por diversos patógenos, sendo os mais importantes Metarhizium anisopliae (Metsch.) (Ascomycota: Clavicipitaceae), Beauveria bassiana (Bals.) (Ascomycota: Cordycipitaceae) e vírus da granulose. Esses microrganismos podem co-infectar um mesmo indivíduo em condições de campo, mas os resultados das interações desses patógenos não são conhecidos. O presente trabalho objetivou determinar a virulência desses patógenos aplicados de forma isolada e em infecções mistas na fase larval de D. saccharalis em condições de laboratório sobre dieta artificial e em plantas de milho. A maioria das combinações resultou em efeito aditivo na mortalidade dos insetos (M. anisopliae + B. bassiana, M. anisopliae + DsGV e M. anisopliae + B. bassiana + DsGV), entretanto ficou evidenciado antagonismo entre B. bassiana e o granulovírus. Todos os cadáveres oriundos das aplicações associadas apresentaram sintomas de apenas um dos patógenos envolvidos na infecção. A produção de conídios de uma espécie de fungo nos cadáveres submetidos à co-infecção foi semelhante à produção de conídios da mesma espécie na infecção isolada. Na infecção mista, os dois fungos se desenvolveram na hemolinfa do hospedeiro, entretanto em um estágio tardio do processo infectivo ocorreu a exclusão de um dos patógenos. A infecção por B. bassiana diminuiu drasticamente a densidade de hemócitos circulantes na hemolinfa das lagartas, efeito não observado para M. anisopliae. Duas populações de laboratório de D. saccharalis, uma oriunda de Piracicaba-SP e outra de Araras-SP, foram testadas quanto à suscetibilidade aos fungos M. anisopliae e B. bassiana. A população de insetos de Piracicaba foi menos suscetível em 2009 do que a mesma população em 2008 e também em relação à população de Araras. Dessa forma, foi realizado um bioensaio comparando a suscetibilidade de insetos das duas populações e da progênie (F1) dos cruzamentos diretos entre elas, criadas nas mesmas condições bióticas e abióticas, para determinar se a suscetibilidade diferencial estaria relacionada a fatores genéticos. Não foram observadas diferenças significativas na suscetibilidade das duas populações e dos cruzamentos aos fungos. A suscetibilidade diferencial observada nos dois primeiros bioensaios provavelmente esteja relacionada às variações no sistema de criação, em componentes nutricionais e antimicrobianos da dieta e não a variações entre as populações dos hospedeiros. / The sugarcane borer, Diatraea saccharalis (Fabricius, 1794) (Lepidoptera: Crambidae) is naturally infected by various pathogens, the most important are Metarhizium anisopliae (Metsch) (Ascomycota: Clavicipitaceae), Beauveria bassiana (Bals.) (Ascomycota: Cordycipitaceae) and granulovirus. These microorganisms may coinfect the same host under field conditions, but the result of these pathogens interactions is not known. This study investigated the virulence of these pathogens applied separately and together on larvae of D. saccharalis in the laboratory on artificial diet and on corn plants. Most combinations resulted in additive effect on insect mortalities (M. anisopliae + B. bassiana, M. anisopliae + DsGV and M. anisopliae + B. bassiana + DsGV), however it became apparent antagonism between B. bassiana and the granulovírus. In all cadavers resulted from mixed applications, only one pathogen sporulated or externalized their symptoms in the host. Production of conidia of one fungal species on the cadavers subjected to co-infection was similar to the production of conidia of the same species in a single infection. In mixed infection, the two fungi have developed in the hemolymph of the host, and the exclusion of one pathogen occurred at a later stage of the infective process. Infection with B. bassiana has drastically reduced the density of circulating hemocytes in the hemolymph of the larvae, which was not observed for M. anisopliae. Two laboratory populations of D. saccharalis, one coming from Piracicaba-SP and other from Araras-SP, were tested for susceptibility to M. anisopliae and B. bassiana. The insect population from Piracicaba was less susceptible to application of fungi in 2009 compared to the same population in 2008 and compared to the Araras population. Therefore, a bioassay was performed comparing the susceptibility of the two populations and the progeny (F1) of direct crossings between them, using insects reared in the same conditions. This assay was performed to determine if the differential susceptibility would be related to genetic factors. No significant differences were observed in the susceptibility of insect populations and crossings to both fungi. The differential susceptibility observed in the first two assays was probably related to variations in the rearing system and nutritional and antimicrobial components in the diet and not due to variations among host populations.

Formulações a base de dispersões oleosas de conídios aéreos de fungos entomopatogênicos apresentam diversas vantagens em comparação à aplicação de produtos não formulados; entretanto, a complexidade e a falta de compreensão dos fatores que influenciam a persistência desse tipo de formulação fazem com que ainda seja pouco utilizada. O efeito de diferentes níveis de secagem de conídios, tipo de óleo, métodos de extração, estabilidade de blastosporos, compatibilidade de surfactantes e adição de aditivos foram avaliados para o desenvolvimento de micopesticidas formulados em óleo. Os melhores resultados obtidos com os conídios em óleo foram avaliados quanto à proteção conferida à radiação UV e a eficiência das formulações na mortalidade de Tenebrio molitor. Zeolita foi a argila mais eficiente na manutenção da viabilidade de blastosporos de M. anisopliae e B. bassiana, e apesar de resultados promissores a estabilidade desses propágulos foi muito inferior a de conídios aéreos. Vinte surfactantes foram avaliados quanto a inocuidade aos conídios, em dois ensaios, culminando com a seleção dos quatro mais compatíveis, dois deles E5 e E7, avaliados nos experimentos posteriores demonstraram bom potencial para compor a formulação como agentes emulsionantes. Dois aditivos foram avaliados na formulação e respostas distintas foram observadas. O A1 foi altamente incompatível, enquanto diferentes concentrações de A2 (1, 3 e 5%) incrementaram a sobrevivência dos conídios em até sete vezes. As vantagens da presença do A2 ficaram evidentes também em combinações de óleo com os quatro emulsionantes selecionados. As dispersões oleosas proporcionaram sobrevivência até sete vezes superior para conídios expostos a radiação UV em relação a conídios não formulados e dois experimentos comprovaram que as formulações oleosas testadas foram mais eficientes no controle de insetos, com reduções de até 2,3 vezes no tempo de sobrevivência de insetos. Os 12 bioensaios com mais de 20.000 leituras de viabilidade descritos neste trabalho permitiram um melhor entendimento dos fatores críticos que afetam a vida de prateleira de conídios, e indicam procedimentos que podem ser utilizados para melhorar a estabilidade de micopesticidas formulados em óleo. / Oil-based formulations of aerial conidia of entomopatogenic fungi have several advantages compared to the use of unformulated products; however, the complexity and lack of understanding of the factors that influence the persistence of this type of formulation make it still not widely used. The effect of different levels of drying conidia, oil type, extraction methods, blastospores stability, compatibility of surfactants and addition of additives were evaluated for the development of a mycopesticide oil formulation. The best results obtained with aerial conidia were evaluated regarding the protection against UV radiation and the efficacy of the formulations to control Tenebrio molitor. Zeolita was the most compatible clay in maintaining the viability of blastospores of M. anisopliae and B. bassiana, and despite promising results in the stability, the shelf life of these propagules was much lower than aerial conidia. Twenty surfactants were evaluated for safety to conidia in two trials resulting in the selection of the four most compatible, two of them E5 and E8, were evaluated in subsequent experiments demonstrating good potential as emulsifiers in oil-based formulations. Two additives were evaluated in the formulation and distinct responses were observed. A1 was highly toxic to the fungi, while different concentrations of A2 increased the survival of the conidia up to seven times. The advantages of A2 were evident also in combinations of oil with the four selected emulsifiers. Oil-based formulation provided survival up to seven times higher for conidia exposed to simulated UV radiation compared to unformulated conidia, and two experiments showed that oil formulations were more efficient in the insect control, with reductions of up to 2.3 times on the survival time of insects. Twelve bioassays and over 20.000 viability readings described in this work, allowed a better understanding of the critical factors that affect the shelf-life of conidia, and indicate methods that can be used to improve the stability of mycopesticides in oil-based formulations.

Avaliou-se o efeito de Hirsutella thompsonii ao ácaro da leprose dos citros (Brevipalpus phoenicis). Em laboratório, adultos foram mantidos em arenas sobre folhas de citros em placas contendo ágar-água solidificado. Foram avaliadas a patogenicidade e virulência do fungo ao ácaro, bem como sua persistência e compatibilidade com acaricidas. No campo, os ácaros foram confinados em arenas sobre frutos de laranja pré-infestados com adultos, sendo estes mantidos em plantas de citros. O isolado Esalq-1269 de H. thompsonii foi inoculado em populações do ácaro provenientes de diversas regiões do Estado de São Paulo. Para se verificar o efeito combinado da temperatura e umidade relativa do ar, o patógeno foi aplicado e os ácaros mantidos em condições controladas. A eficiência de Esalq-1269 foi comparada com isolados do banco de patógenos do Cenargen/Embrapa, os quais foram identificados. Além destes testes, determinou-se o efeito de Esalq-1269 em ovos de B. phoenicis. As avaliações da virulência e persistência foram realizadas a partir do patógeno produzido em meio de cultura completo e sólido (MC-S); meio completo e líquido (MC-L); arroz pré-cozido (APC) e arroz pré-cozido seco e moído (APC-SM). Nos bioensaios com os acaricidas, determinou-se a compatibilidade com agrotóxicos registrados para B. phoenicis phoenicis em citros. O efeito de sub-concentrações de H. thompsonii e de Propargite (Omite 720 SC) foram avaliadas, isoladamente e em mistura, para o ácaro. Em todos os bioensaios, as suspensões contendo propágulos do fungo foram preparadas em diferentes concentrações e após a pulverização avaliou-se a mortalidade durante quatro dias. No experimento de campo o patógeno foi aplicado em diferentes concentrações. O primeiro experimento constou da testemunha e H. thompsonii produzida em APC (6kg/ha). O segundo experimento constou: testemunha, H. thompsonii produzida em APC (20kg/ha e 10kg/ha) e H. thompsonii produzida em MC-L (5L/ha). As avaliações foram realizadas após 10 e 20 dias das aplicações, verificando a sobrevivência de adultos e o número de ovos e ninfas. Esalq-1269 foi patogênico a adultos de B. phoenicis provenientes de todas as regiões do Estado avaliadas, porém com diferenças quanto suscetibilidade. Todos os isolados testados foram patogênicos a B. phoenicis, sendo Esalq-1269 o mais virulento. Nos testes de temperatura x umidade, observou-se que Esalq-1269 apresentou alta atividade a 30°C, independentemente da umidade relativa. Porém, baixas temperaturas prejudicaram o desenvolvimento da doença. O patógeno não apresentou efeito em ovos do ácaro. Nos testes de virulência, a menor CL25 obtida foi para o fungo produzido em MC-S (1,9x105con/mL), já as CL25 para o patógeno produzido em APC e APCSM foram semelhantes. O fungo produzido em MC-L foi o que apresentou maior persistência em relação aos demais, sendo capaz de causar mortalidade devido ao efeito indireto. Quanto à toxicidade, a exceção de Dicofol e Cihexatina, todos os acaricidas foram compatíveis com o fungo. Observou-se efeito sinérgico entre a mistura patógeno x propargite, com alta mortalidade de B. phoenicis em sub-concentrações. Em campo, houve diferenças dos tratamentos com o fungo em relação à testemunha, havendo redução no número de adultos e de ovos. / This study aimed to evaluate the effect of Hirsutella thompsonii on the false spider mite (Brevipalpus phoenicis). In laboratory bioassays, adults were confined to arenas prepared with citrus leaves in acrylic dishes containing water-agar. The pathogenicity and virulence of the fungus against B. phoenicis adults, the persistence in citrus leaves and the compatibility with acaricides were studied. Adults were maintained in arenas prepared with fruits which were placed in plants in the field. The H. thompsonii isolate Esalq-1269 was inoculated on mite populations from different regions of São Paulo state. Also, the combined effect of temperature and humidity was measured on the fungus performance when mites were maintained in controlled conditions. The efficiency of Esalq-1269 was compared to isolates from Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia. Besides these bioassays, the effect of Esalq-1269 isolate in eggs of B. phoenicis was determined. The virulence and persistence tests were conducted using the fungi produced on complete solid culture medium (MC-S); complete liquid culture medium (MC-L); rice (APC) and rice powder (APC-SM). Compatibility of acaricides registered for B. phoenicis control with Esalq-1269 was evaluated and the combined effect of Propagite (Omite 720 SC) with sub-doses of H. thompsonii was determined. Mortality of mites was observed during four days after application of conidial suspensions. In field tests, the pathogen was applied in different concentrations. In the first assay, fungi were produced in APC (6kg/ha). In the second test, three treatments were applied: H. thompsonii cultured on rice (APC) at two concentrations (20Kg/ha and 10 Kg/ha) and H. thompsonii produced by liquid fermentation (MC-L) (5L/ha). Observations were performed after 10 and 20 days after application and adult survival, number of eggs and nymphs per fruit were observed. The isolate Esalq-1269 caused high mortality in all populations of B. phoenicis tested. Also, this strain was the most virulent against the mite and it was negatively affected by low temperatures. At 30°C, high mortality of adults was observed regardless of humidity levels. B. phoenicis was not pathogenic to eggs of B. phoencis . The lowest LC25 value calculated was from pathogen produced in MC-S (1,9x105 conidia/mL). The LC25 values calculated to APC and ACP-SM did not differ statistically. The pathogen produced by liquid fermentation was the most persistent in citrus leaves, causing higher levels of adult mortality. The acaricides Dicofol and Cyhexatin were toxic to Esalq-1269. Synergism between Propargite and H. thompsonii was observed resulting in high adult mortality under low concentrations. In field, results showed differences on concentration and time to death between treatments and control. Field applications resulted in reduction of adult and eggs.

O método empregado na produção de fungos entomopatogênicos teve poucas alterações em mais de 40 anos de utilização no Brasil. A produção adotada nas biofábricas em larga escala é basicamente através da fermentação sólida em arroz com elevado uso de mão de obra e longo tempo de produção. Assim, o presente estudo consistiu em desenvolver estratégias que possam ser implementadas nas diferentes etapas do sistema de produção de Metarhizium anisopliae ESALQ1037, como adição ao arroz de materiais inertes (bagaço de cana-de-açúcar, maravalha, esponja vegetal e palha de arroz) e outros substratos (milheto, flocos de arroz e sagu) para separação dos grãos de arroz e aumento da aeração, uso de blastosporos como inóculo em sistemas bifásicos tendo como substrato sólido o arroz ou mistura de farelos (trigo, milho, aveia, arroz, soja e algodão) ou suportes de crescimento e esporulação (bagaço de cana-de-açúcar, vermiculita, tecido de lã, palha de arroz e maravalha). Foi testado o uso da esterilização por fervura em substituição à autoclavagem e recuperação de conídios por extração em água como substituto ao peneiramento, além de armazenamento em condições de alta e baixa temperatura e umidade: 97%UR e 22ºC; 97%UR e 4ºC; 0%UR e 22ºC; 0%UR e 4ºC. O meio líquido M11 (a base de 45g L-1 glicose e 36g L-1 extrato de levedura) foi o mais adequado para produção de blastosporos (3,0 x 108 blastosporos/mL) e biomassa. A inoculação de blastosporos em arroz resultou em produção maior e mais rápida de conídios (4,51 x 108 conídios/g) em 7 dias de crescimento fúngico. O farelo de trigo inoculado com blastosporos produzidos em meio M11 resultou em maior produção de conídios (1,2 x 109 conídios/g) quando comparado aos farelos e arroz inoculados com suspensão de conídios (máximo de 7,8 x 108 conídios/g). O bagaço de cana-de-açúcar autoclavado seco foi o suporte que resultou em maior produção do fungo quando associado ao meio líquido. A adição ao arroz de bagaço de cana-de-açúcar umedecido, maravalha e esponja vegetal não umedecidas promoveu incremento na produção de conídios (> 3,3 x 109 conídios/g) quando comparado ao arroz somente (1,00 x 109 conídios/g). A exposição do arroz à fervura por 10 e 15 minutos resultou em produção de conídios semelhante à produção em arroz autoclavado, sem a presença de contaminantes. Farelo de trigo foi o substrato mais promissor para produção do fungo especialmente quando misturado ao farelo de arroz (1,75 x 109 conídios/g) na fermentação sólida. Conídios extraídos do arroz por peneiramento ou lavagem em água e recuperados com ou sem a adição de argilas, terra de diatomácea e caulim apresentaram viabilidade superior a 92% após armazenamento por 60 dias a 22°C e 97% UR. A 22°C e 0% UR, somente os conídios extraídos do arroz por peneiramento e os extraídos em água e recuperados com a adição de argila preta e caulim apresentaram viabilidade superior a 92% após armazenamento por 60 dias. Estratégias testadas neste estudo para produção e extração de conídios de M. anisopliae são alternativas viáveis para serem incorporadas na produção em larga escala e reduzir o tempo de fermentação e mão de obra, aumentando a eficiência de conversão de substrato em conídios. / The method used in the production of entomopathogenic fungi had few changes in more than 40 years of use in Brasil. The production of large-scale biofactories is basically through solid fermentation in rice with high labor and long production time. Thus, the present study consisted in developing strategies that could be implemented in the different stages of the production system of Metarhizium anisopliae ESALQ1037, as addition to rice of inert materials (sugarcane bagasse, shavings, vegetable sponge, rice straw) and other substrates (millet, rice flakes and sago) for separation of rice grains and increased aeration, use of blastospores as inoculum in biphasic systems having as a solid substrate the rice or mixture of bran (wheat, corn, oats, rice, soybean and cotton) or growth and sporulation supports (sugarcane bagasse, vermiculite, wool, rice straw and shavings). The use of boiling sterilization to replace autoclaving and recovery of conidia by water extraction as a substitute for sieving was tested, as well as storage under high and low temperature and humidity conditions: 97% RH and 22 ºC; 97% RH and 4°C; 0% RH and 22°C; 0% RH and 4°C. The M11 liquid medium (the base of 45g L-1 glucose and 36g L-1 yeast extract) was the most suitable for the production of blastospores (3.0 x 108 blastospores / mL) and biomass. The inoculation of blastospores in rice resulted in larger and faster production of conidia (4.51 x 108 conidia / g) in 7 days of fungal growth. The wheat bran inoculated with blastospores produced in M11 medium resulted in higher conidia production (1.2 x 109 conidia / g) when compared to the bran and rice inoculated with conidial suspension (maximum of 7.8 x 108 conidia / g). The dried autoclaved sugarcane bagasse was the carrier that resulted in higher fungus production when associated with the liquid medium. The addition of moistened sugarcane bagasse and non-moistened shavings and vegetable sponges promoted increase in the production of conidia (> 3.3 x 109 conidia / g) when compared to rice only (1.0 x 109 conidia / g). Exposure of the boil rice for 10 and 15 minutes resulted in conidial production similar to the production in autoclaved rice without the presence of contaminants. Wheat bran was the most promising substrate for the fungus production especially when mixed with rice bran (1.75 x 109 conidia / g) in solid fermentation. Conidia extracted from rice by sieving or washing in water and recovered with or without the addition of clays, diatomaceous earth and kaolin showed viability higher than 92% after storage for 60 days at 22 °C and 97% RH. At 22 °C and 0% RH, only the conidia extracted from the rice by sieving and those extracted in water and recovered with the addition of black clays and kaolin had viability higher than 92% after storage for 60 days. Strategies tested in this study for the production and extraction of conidia of M. anisopliae are viable alternatives to be incorporated in the large scale production and to reduce the time of fermentation and manpower, to increasing the efficiency of conversion of substrate in conidia.

La lutte biologique à l’aide de champignons entomopathogènes est une des alternatives aux insecticides de synthèse. La thèse étudie la spécificité, la persistance et la dispersion de souches du genre Beauveria ainsi que le potentiel d’une stratégie d’utilisation innovante. À l’aide de tests de pathogénicité, un premier volet décrit le spectre d’hôtes physiologique de trois souches commerciales de B. bassiana et B. hoplocheli. Ces travaux révèlent des différences significatives entre souches. Néanmoins, elles possèdent toutes un large spectre d’hôtes, qui permet notamment d’envisager une extension d’usage pour lutter contre les mouches des fruits. Le second volet explore le potentiel d’une stratégie de lutte biologique ciblant spécifiquement les femelles de la mouche du melon, basée sur l’auto-dissémination de champignons entomopathogènes en utilisant les mâles comme vecteurs de spores. À l’aide d’un dispositif expérimental original, nous démontrons que la transmission de spores des mâles aux femelles lors de l’accouplement augmente significativement la mortalité des femelles. À la Réunion, depuis 30 ans, un programme de lutte contre un ver blanc de la canne à sucre est basé sur l’utilisation de B. hoplocheli. Le troisième volet étudie, à l’aide de marqueurs microsatellites, la diversité génétique de B. hoplocheli dans un réseau de parcelles de canne à sucre sur trois ans. La diversité génétique se relève très faible et nous identifions des génotypes de souches introduites dans les années 1980. Ces résultats suggèrent que les souches introduites au début de la lutte se sont maintenues et répandues dans l’agro-système réunionnais. / Biological control using entomopathogenic fungi is one of the alternatives to chemical insecticides. The thesis studies the specificity, persistence and dispersion of Beauveria strains and the potential of an innovative use strategy. Using pathogenicity tests, a first chapter describes the host range of three commercial strains of B. bassiana and B. hoplocheli. These studies reveal significant differences between strains. Nevertheless, they all have a broad host range, which allows considering extending their use against fruit flies. The second chapter explores the potential of a biocontrol strategy specifically targeting females of the melon fruit fly, based on the auto-dissemination of entomopathogenic fungi using males as spore vectors. Using an original experimental design, we demonstrate that spore transmission from male to female during mating significantly increases female mortality. In Reunion, for 30 years, a biocontrol program for a sugarcane white grub has been based on the use of B. hoplocheli. The third chapter investigates the genetic diversity of B. hoplocheli strains using microsatellite markers in a three years survey in sugarcane fields. We reveal a very low genetic diversity and identify genotypes of strains introduced in the 1980s. These results suggest that the strains introduced at the beginning of the biological control persisted and spread in the Reunion agro-ecosystem.

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The present study evaluated the pathogenicity of nineteen fungal species of the Hypocreales order against A. aegypti adults, and investigated new methods for fungal application to control these mosquitoes and for detection and isolation of fungi and oomycetes from A. aegypti larvae and adults. The results clearly showed the potential of fungi, especially form the Metarhizium genus, for the combat of eggs and adult mosquitoes. The present study proposes a new pratical method for the detection and isolation of entomopathogenic fungi from infected mosquitoes collected in the field.</dcvalue><dcvalue element="description" qualifier="abstract" language="eng">Aedes aegypti is the main vector of dengue fever in tropical and subtropical countries in the world. Due to the absence of a vaccine for dengue fever, the vector´s combat is fundamental fot the disease control. The spread of mosquito populations resistant to chemical insecticides shows the necessity to establish integrate vector control programs. Entomopathogenic fungi have potential for biological control of A. aegypti; however, only tow fungal species. Metarhizium anisopliae and Beauveria bassiana, have been stutied more intensely for this purpose. The present study evaluated the pathogenicity of nineteen fungal species of the Hypocreales order against A. aegypti adults, and investigated new methods for fungal application to control these mosquitoes and for detection and isolation of fungi and oomycetes from A. aegypti larvae and adults. The results clearly showed the potential of fungi, especially form the Metarhizium genus, for the combat of eggs and adult mosquitoes. The present study proposes a new pratical method for the detection and isolation of entomopathogenic fungi from infected mosquitoes collected in the field. / O interesse em fungos entomopatogênicos para controle integrado de mosquitos é grande. Entretanto pouco se sabe sobre o efeito de fungos em adultos e transmissão de micoses em Aedes aegypti. No presente trabalho, estudaram-se, em condições de laboratório, a atividade adulticida e a propagação da infecção para ovos postos por fêmeas tratadas com três isolados de Paecilomyces spp, dois Isaria spp, um Penicillium sp e um Metarhizium anisopliae. Foram realizados dois experimentos: Com conídios secos de M. anisopliae IP 46 a 5x104 conídios/cm3 (Teste 1) e com conídios dos outros fungos formulados em óleo-água, a 10% do óleo, a 106 conídios/cm2 (Teste 2). As fêmeas foram alimentadas com sangue de camundongo em dias alternados e, para ambos os sexos, solução açucarada (5%) foi ofertada ad libitum. Os adultos foram mantidos a 25ºC, umidade relativa (UR) de 70% e fotofase de 12 h até 10 d póstratamento (p.t.). Indivíduos mortos e ovos postos foram retirados, contados e incubados em UR > 98% e 25ºC por 15 d. Os ovos foram em seguida submersos em água e a eclosão de larvas avaliada diariamente até 5 d para todos os testes. Primeiros ovos postos foram encontrados em até 48 horas após a primeira hematofagia das fêmeas. O número médio de ovos/fêmea/dia (o/f/d) no teste 1 foi de 2,5 e no teste 2 variou entre 0,15 (Paecilomyces carneus CG 525) e 1,3 o/f/d (Isaria fumoserosea CG 325). Apenas IP 46 formou hifas e novos conídios sobre ovos e reduziu significativamente a eclosão quantitativa de larvas (39,2%), comparado com o grupo controle (68,6%; t = 2,3; P = 0,04). Nos demais testes a eclosão foi acima de 40%. Primeiros adultos geralmente morreram a partir de 48 h p.t. e o maior número de mortos foi encontrado 2 a 4 d depois, independentemente do teste realizado. A maior mortalidade, 10 d p.t. foi 39% (IP 46), seguido por 28% (Isaria farinosa CG 195), 16,4% (Paecilomyces marquandii CG 190), 8% (Penicillium sp IP 182), 6,8% (P. carneus CG 525), 4,7% (Paecilomyces lilacinus CG 362) e 4,6% (I. fumoserosea CG 325). A mortalidade encontrada para os controles foi ≤ 12% no mesmo momento. Mosquitos tratados com CG 195, CG 525, IP 46, CG 325 e CG 190 tiveram desenvolvimento de fungo em cadáveres. Mosquitos mortos pertencentes aos grupos tratados com os isolados IP 182, CG362 e controle não tiveram desenvolvimento de micélio. Os resultados mostraram que, de acordo com o tipo de aplicação utilizada, fêmeas de A. aegypti contaminaram ovos e assim propagaram a micose. Tratamento com conídios secos levou a uma maior contaminação das fêmeas e assim também dos ovos postos, comparada com a aplicação indireta utilizada para os demais fungos, no qual provavelmente a contaminação ficou restrita às partes do corpo em contato com a superfície tratada. A mortalidade reduzida encontrada para todos os fungos e para ambas técnicas pode estar relacionada à umidade subotima na qual foram mantidos os mosquitos e também ao tempo curto de observação dos adultos póstratamento. Os fungos testados têm atividade reduzida em adultos de A. aegypti e fêmeas desse mosquito podem transmitir a micose durante a oviposição. Mais estudos precisam ser feitos para selecionar linhagens mais virulentas e entender melhor mecanismos de infecção e transmissão horizontal de fungos em A. aegypti.</dcvalue><dcvalue element="description" qualifier="resumo" language="por">O interesse em fungos entomopatogênicos para controle integrado de mosquitos é grande. Entretanto pouco se sabe sobre o efeito de fungos em adultos e transmissão de micoses em Aedes aegypti. No presente trabalho, estudaram-se, em condições de laboratório, a atividade adulticida e a propagação da infecção para ovos postos por fêmeas tratadas com três isolados de Paecilomyces spp, dois Isaria spp, um Penicillium sp e um Metarhizium anisopliae. Foram realizados dois experimentos: Com conídios secos de M. anisopliae IP 46 a 5x104 conídios/cm3 (Teste 1) e com conídios dos outros fungos formulados em óleo-água, a 10% do óleo, a 106 conídios/cm2 (Teste 2). As fêmeas foram alimentadas com sangue de camundongo em dias alternados e, para ambos os sexos, solução açucarada (5%) foi ofertada ad libitum. Os adultos foram mantidos a 25ºC, umidade relativa (UR) de 70% e fotofase de 12 h até 10 d póstratamento (p.t.). Indivíduos mortos e ovos postos foram retirados, contados e incubados em UR > 98% e 25ºC por 15 d. Os ovos foram em seguida submersos em água e a eclosão de larvas avaliada diariamente até 5 d para todos os testes. Primeiros ovos postos foram encontrados em até 48 horas após a primeira hematofagia das fêmeas. O número médio de ovos/fêmea/dia (o/f/d) no teste 1 foi de 2,5 e no teste 2 variou entre 0,15 (Paecilomyces carneus CG 525) e 1,3 o/f/d (Isaria fumoserosea CG 325). Apenas IP 46 formou hifas e novos conídios sobre ovos e reduziu significativamente a eclosão quantitativa de larvas (39,2%), comparado com o grupo controle (68,6%; t = 2,3; P = 0,04). Nos demais testes a eclosão foi acima de 40%. Primeiros adultos geralmente morreram a partir de 48 h p.t. e o maior número de mortos foi encontrado 2 a 4 d depois, independentemente do teste realizado. A maior mortalidade, 10 d p.t. foi 39% (IP 46), seguido por 28% (Isaria farinosa CG 195), 16,4% (Paecilomyces marquandii CG 190), 8% (Penicillium sp IP 182), 6,8% (P. carneus CG 525), 4,7% (Paecilomyces lilacinus CG 362) e 4,6% (I. fumoserosea CG 325). A mortalidade encontrada para os controles foi ≤ 12% no mesmo momento. Mosquitos tratados com CG 195, CG 525, IP 46, CG 325 e CG 190 tiveram desenvolvimento de fungo em cadáveres. Mosquitos mortos pertencentes aos grupos tratados com os isolados IP 182, CG362 e controle não tiveram desenvolvimento de micélio. Os resultados mostraram que, de acordo com o tipo de aplicação utilizada, fêmeas de A. aegypti contaminaram ovos e assim propagaram a micose. Tratamento com conídios secos levou a uma maior contaminação das fêmeas e assim também dos ovos postos, comparada com a aplicação indireta utilizada para os demais fungos, no qual provavelmente a contaminação ficou restrita às partes do corpo em contato com a superfície tratada. A mortalidade reduzida encontrada para todos os fungos e para ambas técnicas pode estar relacionada à umidade subotima na qual foram mantidos os mosquitos e também ao tempo curto de observação dos adultos póstratamento. Os fungos testados têm atividade reduzida em adultos de A. aegypti e fêmeas desse mosquito podem transmitir a micose durante a oviposição. Mais estudos precisam ser feitos para selecionar linhagens mais virulentas e entender melhor mecanismos de infecção e transmissão horizontal de fungos em A. aegypti