Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, 2009. / Submitted by Larissa Ferreira dos Angelos (ferreirangelos@gmail.com) on 2010-04-14T20:22:26Z No. of bitstreams: 1 2009_PenhaCristinaZaidanAlves.pdf: 890016 bytes, checksum: 7ca157433c8395959f0765b44a782f73 (MD5) / Approved for entry into archive by Lucila Saraiva(lucilasaraiva1@gmail.com) on 2010-05-18T04:47:35Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2009_PenhaCristinaZaidanAlves.pdf: 890016 bytes, checksum: 7ca157433c8395959f0765b44a782f73 (MD5) / Made available in DSpace on 2010-05-18T04:47:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2009_PenhaCristinaZaidanAlves.pdf: 890016 bytes, checksum: 7ca157433c8395959f0765b44a782f73 (MD5) Previous issue date: 2009 / Organismos aeróbicos estão sujeitos aos intermediários reativos gerados durante a respiração celular. Esses são caracterizados como EROS (Espécies Reativas ao Oxigênio) responsável pelo aumento do estresse oxidativo e conseqüentes danos ao DNA. O organismo desenvolveu um mecanismo de detoxificação no qual as enzimas antioxidantes endógenas, catalase, superóxido dismutase, glutationa peroxidase, e haptoglobina agem sobre os EROS reduzindo possíveis danos no DNA. Diversos estudos associam o polimorfismo dessas enzimas ao risco do desenvolvimento de patologias. O presente estudo observou se a variabilidade genética da região promotora da catalase (21A/T), hGPX1 (Pro198Leu), SOD2(Val-9Ala) e haptoglobina confere diferença na proteção ao estresse oxidativo promovido pelo peróxido de hidrogênio nas concentrações de 250μM e 1mM em indivíduos jovens e saudáveis de Brasília. A variação das enzimas antioxidantes endógenas avaliadas, sugere conferir diferentes graus de proteção ao DNA contra o estresse oxidativo, induzido in vitro pelo peróxido de hidrogênio em indivíduos jovens e saudáveis da população de Brasília. _______________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Aerobic organisms are subjected to reactive intermediaries that are generated during cell breathing. They are characterized as ROS (Reactive Oxygen Species), which are responsible for oxidative stress increase and damages to DNA. T h e organism developed a detoxification mechanism in which the endogenous anti-oxidant enzymes catalase, superoxide dismutase, glutathione peroxidase and haptoglobin act on ROS reducing possible damages to DNA. Many studies have associated these enzyme polymorphisms and the development of pathologies. T he present study observed if the genetic variability of the promoting catalase region (21A/T), hGPX1 (Pro/Leu), SOD2 ( Val/9Ala) and haptoglobin concede difference in the protection of oxidative stress, by H2O2 within concentrations of 250μM and 1mM in healthy, young subjects from Brasilia. T he variation by endogenous anti-oxidants enzymes avaliated in this study, suggest confer levels differents the DNA protection to oxidative stress, in vitro, by H2O2.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2010. / Submitted by Washington da Silva Chagas (washington@bce.unb.br) on 2011-04-02T00:08:35Z No. of bitstreams: 1 2010_KarenRAppPy-Daniel.pdf: 4698704 bytes, checksum: e7479d5b6a5bf184c151cead9d638a69 (MD5) / Approved for entry into archive by Marília Freitas(marilia@bce.unb.br) on 2011-04-04T15:56:17Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2010_KarenRAppPy-Daniel.pdf: 4698704 bytes, checksum: e7479d5b6a5bf184c151cead9d638a69 (MD5) / Made available in DSpace on 2011-04-04T15:56:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2010_KarenRAppPy-Daniel.pdf: 4698704 bytes, checksum: e7479d5b6a5bf184c151cead9d638a69 (MD5) / As amilases são enzimas que degradam o amido e encontram diversas aplicações nas indústrias de alimentos, de bebidas, de detergentes, têxteis e de papel. Esta enzima é produzida por diversos organismos incluindo a microbiota do solo. O solo tem sido uma excelente fonte para o isolamento de microrganismos produtores de novas biomoléculas, entretanto, estima-se que menos de 1% da microbiota do planeta é cultivável em laboratório. Técnicas recentes permitem a extração de DNA total de uma amostra ambiental, seguida da sua clonagem em microrganismos cultiváveis. O Cerrado é o segundo maior bioma da América do Sul sendo que sua biodiversidade é considerada a mais rica dentre regiões similares no mundo. Duas bibliotecas metagenômicas foram construídas a partir da microbiota do solo do Cerrado: uma de grandes insertos (~30 kb) e a segunda contendo pequenos insertos (~7 kb). O objetivo do presente trabalho foi realizar a análise de clones amilolíticos obtidos a partir destas bibliotecas e identificar os genes responsáveis por atividades detectadas em placas. Foi realizada a extração de plasmídio de clones previamente identificados nas duas bibliotecas metagenômicas citadas e estes foram utilizados para realizar a retransformação da célula em que a biblioteca foi construída, para confirmação de fenótipo. Foi realizado ensaio para detecção de atividade dextrinizante em meio líquido com os clones que apresentaram o perfil amilolítico em placa. Os fragmentos de interesse foram diretamente sequenciados ou subclonados para posterior sequenciamento. Foi realizada a montagem e análise das sequências e estas foram comparadas com sequências depositadas no GenBank e submetidas a alinhamentos e análises filogenéticas. Identificou-se em um clone ORF relacionada com a superfamília das α-amilases, com domínios da família Glicosil hidrolase e com similaridade a sequências depositadas do gênero Acidobacterium. O sequenciamento parcial de um segundo clone identificou ORFs que indicam uma relação com o gênero Burkholderia. A utilização de ferramentas metagenômicas permitiu acessar enzimas hidrolíticas presentes na microbiota do solo do Cerrado contornarndo a necessidade do cultivo dos microrganismos para explorar o potencial que este ambiente possui. Portanto, estas ferramentas podem e devem ser utilizadas como forma de identificarmos genes que dificilmente seriam descobertos de outra forma. O presente estudo identificou o gene de uma glicosil hidrolase. Para confirmar a aplicabilidade desta enzima em processos biotecnológicos, será realizada a clonagem do gene de interesse em vetor de expressão apropriado e realização de caracterização bioquímica. _________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Amylases are starch-degrading enzymes which encounter several applications in the food, beverage, detergent, textile and paper industries. This enzyme is produced by several organisms including the soil microbiote. The soil has been used as an excellent source of new microorganism that produce novel biomolecules, however, current estimates indicate that less the 1% of the planet’s microorganisms are culturable in laboratory conditions. Recent techniques permit the extraction of total DNA from an environmental sample followed by cloning of its DNA in culturable microorganisms. Cerrado is South America’s second biggest biome and is considered to be the most biodiverse amongst similar regions in the world. Two metagenomic libraries were built from Cerrado’s soil microbiome: one of large inserts, (~30 kb) and another comprising small inserts (~7 kb). The goal of this work was to analyze amylolytic clones detected in these libraries and identify genes responsible for amylytic activity detected on plates. Plasmid extraction from positively identified clones from both libraries was accomplished and plasmids were utilized for retransformation of cells used in library constructions to confirm phenotypes. Liquid dextrinizing assays were performed of clones with positive activity on plates for detection of amylolytic profile. Cloned fragments of interest were either directly sequenced or subcloned and then sequenced. Contigs were assembled, analyzed and compared with sequences in GenBank database as well as used in alignments and phylogenetic analysis. An ORF was identified with similarities to sequences of the amylase superfamily with domains of glycosyl hydrolase family similar to sequences of Acidobacterium. Parcial sequencing of second clone identified ORFs with similarities to sequences of Burkholderia. The use of metagenomic techniques permitted access to hydrolytic enzymes present in Cerrado’s microbiome soil dispensing culturing of microorganisms to explore the potential this environment possesses. Therefore, these techniques can and should be used as a form of identification of novel genes that would difficultly be accessed in another manner. This work identified a glycosyl hydrolase gene. To confirm the applicability of this enzyme in biotechnological processes, cloning of gene in appropriate expression vector and biochemical characterizations will be carried out.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2010. / Submitted by Jaqueline Ferreira de Souza (jaquefs.braz@gmail.com) on 2011-04-17T00:58:06Z No. of bitstreams: 1 2010_RicardoCamargo.pdf: 1814504 bytes, checksum: 918ee0ed7e332fdfa90c63a3936aa5f5 (MD5) / Approved for entry into archive by Jaqueline Ferreira de Souza(jaquefs.braz@gmail.com) on 2011-04-17T00:58:38Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2010_RicardoCamargo.pdf: 1814504 bytes, checksum: 918ee0ed7e332fdfa90c63a3936aa5f5 (MD5) / Made available in DSpace on 2011-04-17T00:58:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2010_RicardoCamargo.pdf: 1814504 bytes, checksum: 918ee0ed7e332fdfa90c63a3936aa5f5 (MD5) / A proteína citoplasmática de ligação à cauda poli(A) dos RNAs mensageiros eucariotos (PABPC) desempenha papéis fundamentais em várias etapas da expressão gênica. A PABPC atua na biogênese, exportação nuclear, localização citoplasmática, tradução e meia-vida (turnover) dos mRNAs. A sua versatilidade encontra-se fundamentada em uma complexa rede de associações simultâneas entre proteínas e o mensageiro, mantidas por essa única cadeia polipeptídica. A PABPC foi identificada em todos os organismos eucariotos estudados e apresenta elevado nível de conservação da sua sequencia primária, desde levedura até mamíferos. Uma PABPC típica tem uma massa molecular de aproximadamente 70 kDa e até composta por duas regiões estruturalmente bem definidas, N e C-terminal, conectadas por uma sequencia peptídica não-estruturada rica em resíduos de prolina e glutamina. O N-terminal até formado por quatro domínios consecutivos de interação com o RNA (RBD - RNA binding domain), contendo cerca de 90 aminoácidos cada. O domínio C-terminal da PABPC é uma região composta por aproximadamente 75 aminoácidos, bastante estruturada e altamente conservada. Neste trabalho, não investigamos os aspectos estruturais e moleculares envolvidos na interação da proteína citoplasmática de ligação ao poli(A) em uma associação do tipo PABPC-PABPC, tanto na ausência como na presença de um trato de poliadenosinas. Portanto, mostramos pela primeira vez que essa proteína se comporta como um homodímero em solução privada de poli(A). Observamos por experimentos de Pull-down que a interação entre PABPCs independente de poli(A) ocorre entre os seus RBDs (com no mínimo os RBDs 1 e 2) e a sua região intermediária, que compreende o quarto domínio e a região poliprolina. Além disso, também notamos que somente o RBD 4 juntamente com a sequência poliprolina são suficientes para que ocorra a associação PABPC-PABPC em ausência de poli(A). Curiosamente, a interação entre o N-terminal da PABPC e a sua região rica em prolinas foi incrementada na presença de poli(A). Baseados nestes resultados, propormos um modelo teórico no qual a interação PABPC-PABPC é um mecanismo hipotético de inibição a associação precoce de fatores de regulação e iniciação da tradução que utilizem a PABPC como arcabouço. _________________________________________________________________________________ ABSTRACT / The cytoplasmatic poly(A) binding protein (PABPC) plays fundamental roles in several steps of gene expression in eukaryotes. The PABPC operates in biogenesis, nuclear export, localization, translation and turnover of mRNAs. Its versatility is anchored in a complex network of simultaneous associations between proteins and the messenger, maintained by this unique polypeptidic chain. PABPC has been identified in all eukaryotes organisms studied showing high level of primary sequence conservation, from yeast until mammals. A typical PABPC has a molecular weight of approximately 70 kDa and It is composed of two well-defined regions, N and C-terminal, connected by an unstructured proline and glutamine-rich linker. The N-terminal is formed by four consecutive RNA binding domains (RBD), each containing approximately 90 amino acids. The C-terminal domain of PABPC is a region comprising approximately 75 amino acids, structured and highly conserved. In this work, we investigated molecular and structural aspects involved in the PABPC-PABPC association, in absence and presence of a poly(A) tract. Therefore, for the first time we showed that this protein behaves as a homodimer in privation of poly(A). We observed by pull-down experiments that the interaction between PABPCs independently of poly(A) occurs between their RBDs (with at least the RBDs 1 and 2) and its intermediary region, which comprises the fourth domain and the proline rich sequence. In addition, we also noted that the RBD 4 together with the polyproline region are sufficient to PABPC-PABPC association in absence of poly(A). Interestingly, the interaction between the N-terminal of PABPC and its proline rich sequence was increased in the presence of poly(A). Based in these results, we proposed a theoretical model that PABPC-PABPC interaction is a hypothetical inhibition mechanism that prevents early association of regulation and translation initiation factors that use PABPC as a scaffold.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, 2011. / Submitted by Jaqueline Ferreira de Souza (jaquefs.braz@gmail.com) on 2011-10-03T12:10:36Z No. of bitstreams: 1 2011_PaulaMonteirodeSouza.pdf: 1924009 bytes, checksum: 86febe9ef6271ab875953e99e0080c17 (MD5) / Approved for entry into archive by Jaqueline Ferreira de Souza(jaquefs.braz@gmail.com) on 2011-10-03T12:11:25Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2011_PaulaMonteirodeSouza.pdf: 1924009 bytes, checksum: 86febe9ef6271ab875953e99e0080c17 (MD5) / Made available in DSpace on 2011-10-03T12:11:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2011_PaulaMonteirodeSouza.pdf: 1924009 bytes, checksum: 86febe9ef6271ab875953e99e0080c17 (MD5) / A pesquisa por substâncias ativas presentes em plantas que possam inibir uma enzima chave em um determinado processo metabólico, de forma que sua ação seja a mais seletiva possível e com menores efeitos indesejáveis, tem sido o alvo das pesquisas na área de medicamentos. O Brasil está entre os países de maior biodiversidade mundial, abrigando cerca de 55 mil espécies de plantas superiores (aproximadamente 22% do total mundial). No entanto, o Cerrado que é o segundo maior bioma brasileiro com uma enorme variedade de espécies vegetais apresenta até então poucos estudos quanto a seus efeitos terapêuticos, principalmente como inibidores enzimáticos. Nessa direção, este projeto propôs avaliar espécies vegetais presentes no bioma Cerrado quanto à atividade de inibição das enzimas α-amilase, α-glicosidase, tirosinase e acetilcolinesterase. Os inibidores de α-amilase e de α- glicosidase, são utilizados no tratamento da diabetes por inibirem a hidrólise de carboidratos no trato digestivo diminuindo a absorção de glicose pelo organismo. A tirosinase está envolvida na formação da melanina, por isso seus inibidores são clinicamente importantes para o tratamento de doenças relacionadas a hiperpigmentação. O principal papel da acetilcolinesterase é hidrolisar rapidamente a acetilcolina na fenda sináptica das transmissões colinérgicas, sendo alvo para o tratamento de doenças como Alzheimer. Para atingir o objetivo proposto, foram investigados 39 extratos de 14 espécies oriundas de 9 famílias do bioma Cerrado sobre a atividade das enzimas. Os extratos com potencial atividade de inibição sobre a α-amilase foram os extratos aquosos das folhas de Pouteria torta, Pouteria caimito, Pouteria ramiflora e Eugenia dysenterica, além do extrato etanólico da casca do caule de Stryphnodendron adstringens. Sobre a atividade da α-glicosidase, os extratos das espécies do gênero Pouteria, S. adstringens e E. dysenterica demonstraram um elevado potencial de inibição. Os extratos que apresentaram potencial de inibição sobre a enzima tirosinase pertencem às espécies Morus nigra, S. Adstringens, E. dysenterica, P. caimito e P. torta. Porém, nenhum extrato testado, foi capaz de influenciar na atividade enzimática da acetilcolinesterase. _____________________________________________________________________________ ABSTRACT / The search for active in plants that inhibit a key enzyme in a particular metabolic process, so that its action is more selective as possible and with less side effects, has been the focus of research in medicine. Brazil is the one of greatest biodiversity in the world, gathering around 55.000 species of higher plants (about 22% of world total). Cerrado is the second largest biome of Brazil with a widw variety of plant species, so far has been poorly studied to evaluate the efficacy and therapeutic effects of crude extracts or isolated compounds, mainly as enzyme inhibitors. The aim of the present study was to investigate the inhibitory activity of Cerrado plant extracts against α-amylase, α-glucosidase, tyrosinase and acetylcholinesterase. α- Amylase and α-glucosidase inhibitors delay the digestion of carbohydrates, producing a reduction in the rate of glucose absorption and consequently reduction of the postprandial plasma glucose. Tyrosinase is involved in formation of melanin, so their inhibitors are clinically important for treatment of dermatological disorders related to melanin hyperpigmentation. The main role of acetylcholinesterase is rapidly hydrolyzes the neurotransmitter acetylcholine at brain cholinergic synapses as well as at neuromuscular junctions, thus acetylcholinesterase inhibitors become targets for the treatment of Alzheimer’s disease. This study was designed to establish the inhibitory activity of 39 extracts prepared from 14 species from 9 families of Cerrado against α-amylase, α-glucosidase, tyrosinase and acethylcolinesterase. The plant extracts which demonstrated a significant capability to inhibit α-amylase were the leaves of Pouteria torta, Pouteria caimito, Pouteria ramiflora and Eugenia dysenterica aqueous extratcs, and the stem bark of Stryphnodendron adstringens ethanolic extract. On the activity of α-glucosidase, the extracts of the genus Pouteria, S. adstringens and E. dysenterica demonstrated a high potential of inhibition. The extracts that showed potential for inhibition of tyrosinase belonging to the species Morus nigra, S. adstringens, E. dysenterica, P. caimito and P. torta. However no extract was able to influence the enzymatic activity of acetylcholinesterase.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2013. / Submitted by Alaíde Gonçalves dos Santos (alaide@unb.br) on 2013-10-15T11:14:04Z No. of bitstreams: 1 2013_MarinaFirminodaSilva.pdf: 1446801 bytes, checksum: c661becf28c2d1ce39c45b876e5cdb3e (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2013-10-15T12:13:00Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_MarinaFirminodaSilva.pdf: 1446801 bytes, checksum: c661becf28c2d1ce39c45b876e5cdb3e (MD5) / Made available in DSpace on 2013-10-15T12:13:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_MarinaFirminodaSilva.pdf: 1446801 bytes, checksum: c661becf28c2d1ce39c45b876e5cdb3e (MD5) / A febre é definida como o aumento da temperatura corporal que ocorre como parte da resposta de fase aguda desencadeada após a invasão de um organismo por agentes estranhos. O LPS (lipopolissacarídeo) é um potente indutor de febre, frequentemente utilizado em estudos sobre respostas inflamatórias e febris. Alguns trabalhos têm sugerido o envolvimento de vias de sinalização dependentes de proteína quinase A (PKA) e proteína quinase C (PKC) no desenvolvimento da febre. Neste estudo, investigamos o efeito de inibidores de PKA (H-89) e PKC (celeritrina) sobre a resposta febril induzida por LPS. Analisamos ainda alterações da expressão e atividade destas quinases em resposta aos diferentes tratamentos, 3 e 6 h após a injeção do estímulo pirogênico. Os resultados demonstraram que celeritrina (3 μg/rato) e H-89 (10 μg/rato) reduziram a resposta febril induzida pela injeção iv de LPS (5 μg/Kg) em 36 % e 33,1 %, respectivamente. A administração conjunta de celeritrina e H-89 também reduziu a resposta febril induzida por LPS; entretanto, o efeito inibitório verificado (31,2 %) não foi maior do que o observado após a administração isolada de cada droga. Após os experimentos farmacológicos, os animais foram eutanasiados e tiveram seus hipotálamos dissecados para as análises de expressão e atividade. A análise por western blotting não foi capaz de detectar alterações da expressão de PKCε 3 h após a injeção do LPS, tampouco de PKA nos dois tempos analisados. A expressão de PKCε 6 h após a injeção do estímulo pirogênico apresentou-se aumentada nos animais tratados com H-89, sugerindo que, na ausência da ativação de PKA, vias dependentes de PKCε sejam ativadas como mecanismo compensatório. A análise da atividade foi realizada por meio de kits comerciais de ELISA para medir a fosforilação de um substrato realizada por quinases. Não foram encontradas mudanças significativas nos padrões de atividade para nenhuma das proteínas testadas, o que pode ser devido à baixa especificidade do método, visto que o substrato utilizado no ensaio pode ser fosforilado por todas as isoformas de PKA e PKC. Os dados desse trabalho sugerem que vias de sinalização dependentes de PKA e PKC estejam envolvidas na resposta febril induzida por LPS, porém, métodos mais específicos para análise destas enzimas são necessários para elucidar os mecanismos moleculares envolvidos. _______________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Fever is defined as the increase in body temperature that occurs as a component of the acute phase response triggered after invasion of pathogens in the body. Lipopolysaccharide (LPS) is a potent inducer of fever, often used in studies assessing the inflammatory and febrile responses. Some studies have suggested the involvement of protein kinase A (PKA) and protein kinase C (PKC)-dependent signaling pathways in the development of fever. We investigated the effect of PKA and PKC inhibitors, H-89 and celeritrin respectively, on the febrile response induced by LPS. We also analyzed changes in the expression and activity of these kinases in response to different treatments, 3 and 6 h after the pyrogenic stimulus injection. The results showed that celeritrin (3 mg/rat) and H-89 (10 mg/rat) reduced the febrile response induced by LPS (5 mg/kg, iv) in 36% and 33.1%, respectively. Co-administration of celeritrin and H-89 also reduced the LPS-induced febrile response; however, the inhibitory effect observed (31.2%) was not more effective than that observed after administration of each drug separately. After pharmacological experiments, animals were euthanized, and their hypothalami were dissected for kinases expression and activity analyses. Western blot analyses did not exhibit changes in neither PKCε expression 3 h after LPS injection nor PKA levels in both periods investigated. The expression of PKCε 6 h after injection of pyrogenic stimulus was increased in H-89 treated animals, suggesting that PKCε-dependent pathways are activated as a compensatory mechanism in the absence of PKA activation. The enzymatic activity analysis was performed using commercial ELISA kits specific for measuring substrate phosphorylation mediated by kinases. There were no significant changes in the patterns of activity for any tested enzymes, which may be due to low specificity of the method since the substrates employed in the assays can be phosphorylated by all PKC or PKA isoforms. Data from the present study suggest that PKA and PKC-dependent signaling pathways may be involved in the febrile response induced by LPS, although more specific methods are needed to analyze such enzimes in order to elucidate their involvement in fever molecular mechanisms.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, 2014. / Submitted by Alaíde Gonçalves dos Santos (alaide@unb.br) on 2014-04-29T10:48:27Z No. of bitstreams: 1 2014_FabielleMelissaZorzin.pdf: 3291894 bytes, checksum: e68710f246a1c0d84ed0dd7988cf4255 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2014-04-29T12:57:25Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_FabielleMelissaZorzin.pdf: 3291894 bytes, checksum: e68710f246a1c0d84ed0dd7988cf4255 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-04-29T12:57:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_FabielleMelissaZorzin.pdf: 3291894 bytes, checksum: e68710f246a1c0d84ed0dd7988cf4255 (MD5) / O Diabetes Mellitus é uma doença metabólica crônica, de etiologia múltipla, caracterizada por hiperglicemia resultando na deficiência da secreção ou incapacidade da insulina exercer seus efeitos adequadamente, provocando alterações no metabolismo de carboidrados, lipídios e proteínas. A procura por substância ativa presente em plantas que possa inibir a enzima α-amilase, chave neste processo metabólico, com ação mais seletiva e menos efeitos indesejáveis, tem sido o alvo de pesquisas. O Brasil ocupa o topo dos países mais ricos em biodiversidade do mundo, possui cerca de 20% do total das espécies do planeta e pelo menos metade destas espécies possuem alguma propriedade terapêutica. No entanto, menos de 1% desta diversidade tem sido alvo de estudos apropriados, principalmente como inibidores enzimáticos, o que inclui as espécies vegetais do Cerrado, segundo maior bioma brasileiro. Assim, este projeto propôs avaliar a espécie vegetal Eugenia dysenterica, presente no bioma Cerrado, quanto à atividade de inibição da enzima α-amilase, padronizar e caracterizar o extrato bruto aquoso das folhas desta planta. Para atingir o objetivo proposto, o extrato aquoso bruto foi padronizado de acordo com a presença do marcador químico catequina, fracionado e avaliado quanto a sua ação inibitória sobre a atividade da α-amilase. O extrato aquoso bruto apresentou 47,51 mg de catequina por grama de extrato. As frações com potencial atividade de inibição sobre a α-amilase foram as frações isopropanólica e suas subfrações I8, I16, I17, I20 e I21, além do extrato aquoso bruto. Foi identificado a presença de ácido elágico na subfração com maior potencial inibitório (I8). Os valores de IC50 do extrato bruto e da fração isopropanólica (14,92, e 8,06 μg/mL), respectivamente, foram próximos ao IC50 do controle positivo de inibição Acarbose (5,58 μg/mL). As subfrações apresentaram valores de IC50 maiores que o controle. Não foi observada citotoxicidade para o extrato aquoso bruto e fração isopropanólica em concentrações próximas aos valores de IC50 para α- amilase. Foi desenvolvido um método cromatográfico rápido e confiável para determinação do flavonóide catequina no extrato bruto, pois foi observada ampla faixa de linearidade e excelente precisão. Além disso, o método foi robusto e exato informando corretamente seu limite de detecção e quantificação. _______________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Diabetes Mellitus is a chronic metabolic disorder of multiple aetiology characterized by hyperglycemia resulting in deficiency of insulin secretion or inability to exert its effects properly, causing changes in the metabolism of carbohydrates, lipids and proteins. The search for active substance in plants that can inhibit the enzyme α- amylase, key in this metabolic process, with more selective action and less side effects, has been the target of research. Brazil topped the richest countries in biodiversity in the world, has about 20% of the planet's species and at least half of these species have some therapeutic properties. However, less than 1% of this diversity has been the subject of appropriate studies, primarily as enzyme inhibitors, which includes the plant species of the Savanna, second largest brazilian biome. This project proposed to evaluate the plant species Eugenia dysenterica, present in the Savanna biome, as for the inhibitory activity of the enzyme α-amylase, standardize and characterize the crude aqueous extract of the leaves of this plant. To achieve the proposed goal, the crude aqueous extract was standardized according to the presence of the chemical marker catechin, fractionated and evaluated for its inhibitory effect on the activity of α-amylase. The crude aqueous extract showed 47.51 mg of catechin per gram of extract. The fractions with potential inhibitory activity on α-amylase were isopropanolic fractions and its subfractions I8 , I16 , I17 , I20 and I21, besides the crude aqueous extract. The presence of ellagic acid in the subfraction with highest inhibitory potential (I8) was identified. The IC50 values of crude extract and isopropanolic fraction (14.92 and 8.06 μg/mL, respectively), were close to the IC50 inhibition positive control acarbose (5.58 μg/mL). The subfractions showed IC50 values greater than control. No cytotoxicity was observed for the crude aqueous extract and isopropanolic fraction in concentrations near the IC50 values for α-amylase. A fast and reliable chromatographic method for determination of flavonoid catechin in the crude extract was developed because wide range of linearity and excellent accuracy were observed. Moreover, the method was robust and accurate, properly informing its limit of detection and quantification.

Os linfócitos humanos apresentam na sua superfície a enzima NTPDase1 (ecto-apirase, ecto-difosfoidrolase; CD39; EC 3.6.1.5), responsável pela hidrólise do ATP e ADP extracelular e/ou outros nucleotídeos di ou tri fosfatados. A determinação da atividade da enzima foi padronizada através de método colorimétrico, o qual quantifica o fosfato livre liberado durante a reação. A NTPDase1 foi caracterizada através da demonstração de condições ótimas de incubação, como dependência de cálcio, pH, tempo de incubação e temperatura ótimos, além da obtenção de parâmetros cinéticos. Os resultados obtidos foram confirmados por uma baixa expressão de CD39 nos linfócitos humanos, verificada por análise citométrica, com utilização de anticorpo monoclonal correspondente. Este fato indica um baixo estado de ativação dos linfócitos, uma vez que o CD39 é considerado um marcador de ativação destas células. Posteriormente, foi determinada a atividade da NTPDase1 em linfócitos de pacientes imunodeprimidos pela infecção causada pelo HIV, os quais são acompanhados pelo monitoramento de sua carga viral no plasma e contagem de células T CD4+. A infecção pelo HIV resulta em alterações nas células imunes e na secreção de citocinas importantes na resposta patógenos. Nesta situação pode haver alterações bioquímicas na resposta imune, como por exemplo, alterações na hidrólise de nucleotídeos, ou seja, na atividade das enzimas que degradam nucleotídeos extracelulares. Os linfócitos encontram-se em estado de ativação crônica, o que faz com que até mesmo células não-infectadas pelo vírus, possam sofrer apoptose por ativação de caspases efetoras. Através da determinação da atividade da NTPDase nos linfócitos imunodeprimidos, verificou-se um aumento de sua atividade, acompanhado por uma maior expressão de CD39 na superfície destas células. Estes resultados sugerem que a NTPDase1 é importante para a manutenção da resposta imune, mantendo concentrações adequadas de ATP extracelular, o qual é essencial para certas funções imunes, mas também pode ser prejudicial no momento que induz apoptose nos linfócitos, o que poderia aumentar o estado de imunodepressão. Devido ao fato de que muitos dos pacientes HIV-positivos recebem terapia anti-retroviral, foi necessário verificar in vitro possíveis efeitos destas drogas sobre a atividade da NTPDase1. Neste caso, observou-se que as concentrações terapêuticas destas drogas não afetaram a atividade da enzima. Sendo assim, a atividade aumentada da NTPDase1 nestes pacientes, não é devida à interferência da terapia anti-retroviral.

A sepse é uma síndrome inflamatória sistêmica decorrente de uma infecção que pode causar sérios danos a todos os órgãos do paciente, podendo levá-lo à morte. Dados epidemiológicos norte americanos estimam que 750.000 pacientes são acometidos a cada ano por sepse. A taxa de mortalidade varia de 20 a 60%, dependendo da severidade, sendo semelhante para o Brasil. A terapia utilizada é o tratamento com antibióticos, manutenção de pressão sanguínea e ventilação mecânica, que apesar de extremamente caros ainda se mostram com baixa eficiência, tornando a morte por sepse em UTI mais relevante que mortes por câncer de mama ou AIDS, nos EUA. Tratamentos que demandam grande soma de recursos tendem a ser um grande problema para países como o Brasil, que através do Sistema Único de Saúde, supre o paciente com a terapêutica disponível. Por isso, a compreensão da doença e o desenvolvimento de terapias alternativas mais eficazes e mais barata são de extrema importância. Neste sentido, diversas terapias alternativas têm sido propostas (insulinoterapia, administração de proteína C ativada - Drotrecogina alfa®, antioxidantes ou anticorpos anti-citoquinas). Radicais livres são fisiologicamente produzidos pela mitocôndria e por outras enzimas, como a NADPH oxidase e xantina oxidase. Os organismos contam com defesas antioxidantes enzimáticas e não-enzimáticas para não sofrer danos causados pela própria produção de radicais livres e assim, manter a homeostase celular. Na sepse, a primeira linha de defesa do organismo é o seu sistema imunológico inato mediado por fagócitos que possuem sistemas bactericidas compostos por enzimas produtoras de radicais livres e espécies reativas de oxigênio. Quando a resposta inflamatória à infecção é exagerada e a homeostase é perdida, verificam-se danos a biomoléculas dos tecidos do hospedeiro devido à própria produção de radicais livres. Estes danos podem levar a um comprometimento celular que pode progredir para disfunção orgânica e colaborar para a morte do indivíduo. Devido à importância dos radicais livres no estabelecimento e na progressão da sepse, nós formulamos a hipótese de que o balanço entre as enzimas superóxido dismutase (SOD) e catalase (CAT), bem como os produtos de dano às biomoléculas (carbonilas e substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico - TBARS), podem ser importantes marcadores de severidade e de prognóstico da sepse. Nossos resultados demonstram que há um aumento na atividade da SOD sem um aumento compensatório da CAT em todos os órgãos analisados (pulmão, diafragma, coração, fígado, rim), retirados de ratos submetidos a sepse. Este desequilíbrio resulta em dano a biomoléculas (lipídeos e proteínas). Os dados sugerem que os níveis de proteínas carboniladas, mas não de TBARS, estão correlacionados com a severidade da sepse. A conseqüência do aumento de carbonilas na resposta imunológica é discutida. Apesar da importância das proteínas carboniladas na progressão da sepse, nós demonstramos uma forte correlação positiva entre a relação SOD/CAT (pulmão e rim) vs. marcadores de falência desses órgãos bem como entre TBARS vs. marcadores de falência, em ratos submetidos a CLP. Estas correlações foram revertidas com a associação de tratamento antioxidante nesses animais. Estes dados sugerem que o equilíbrio entre a SOD e a CAT é muito importante para a manutenção da homeostase redox e que a suplementação antioxidante reverte o desequilíbrio visto na sepse, os níveis de TBARS bem como protege dano renal e respiratório. / Sepsis is a systemic inflammatory syndrome secondary to an infectious process that can progress to multiple organic failure and death. Epidemiological studies estimate that 750,000 cases of severe sepsis occurs per year in United States with mortality rate ranging between 20 and 60%, and these rates reflect the Brazilian reality. Sepsis is classically treated with antibiotics, pressure support and mechanic ventilation. However these treatments have little impact on mortality rate, which is higher for sepsis than for breast cancer or HIV. Thus, a better understanding of sepsis and the development of new therapeutic approaches are extremely important and several researches have been developed in this way (e.g. insulin-therapy, activated-protein C - Drotrecogin alfa®, antioxidants and anti-cytokine antibodies). Free radicals are released normally in cell physiology. Organisms have enzymatic antioxidant defenses as well as non-enzymatic antioxidant defenses to counteract the harmful effects of free radicals and to maintain cellular homeostasis. In the onset of an infectious process like sepsis, the innate immune system is the first defense against pathogen and is carried out by macrophages and neutrophils. These cells are potent phagocytes and their bactericidal compounds include free radicals and reactive oxygen species. When the response to infection is exacerbated the homeostasis is lost and oxidative damage takes place. This damage could compromise cell function and lead the organ dysfunction and death. Considering the importance of free radicals in the onset and progression of sepsis we hypothesized that balance between superoxide dismutase (SOD) and catalase (CAT), as well as molecular damage (carbonyl and thiobarbituric acid reactive species - TBARS), could be important markers of severity and prognosis in sepsis. We show an increase in SOD activity without a compensatory increase in catalase in the lung, diaphragm, heart, kidney and liver from rat submitted to sepsis. This imbalance contributes to oxidative damage in lipids and proteins. The data suggests that carbonyl levels but not TBARS levels are linked to sepsis severity and the implication of carbonyl upon immune response is discussed. In spite of the relevance of carbonyl in sepsis progression we found a positive correlation between SOD/CAT ratio (in kidney and lung) and organ failure markers, as well as between TBARS and organ failure markers, in rats submitted to CLP. These are prevented treating animal with antioxidants. These data suggest the importance of a coupled enzymatic activity of SOD and CAT to maintain redox homeostasis. Moreover, the antioxidant treatment reversed the SOD/CAT imbalance, TBARS levels and organ impairment.

Enzimas microbianas, quando produzidas a um custo acessível e preservadas suas propriedades catalíticas, são ferramentas determinantes para a sustentabilidade das indústrias química e energética. Buscando aprimorar a produção de lipases pela cepa de Staphylococcus warneri EX17, diferentes estratégias de cultivo em biorreatores submersos foram aplicadas para analisar a influência de algumas variáveis na produção da enzima e então foi proposto o cultivo em batelada alimentada. Paralelamente, lipases de S. warneri EX17 (SWL) foram imobilizadas por adsorção hidrofóbica em Octyl-Sepharose, Immobead 150 e MCI GEL CHP20P. Os resultados indicaram que a interação entre enzima e suporte interfere nas propriedades da enzima imobilizada. Os preparados Octyl-SWL e MCI-SWL preservaram sua atividade lipolítica quando expostos a 50 % (v/v) de Butanol, Etanol, n-Hexano, Isopropanol e Metanol. Na síntese do éster aromático butirato de etila, Octyl-SWL e MCI-SWL exibiram desempenho promissor, alcançando em 24 h de reação 28 % e 35,6 % de rendimento, respectivamente. Lipases de S. warneri EX17 purificadas e imobilizadas em suportes hidrofóbicos preservaram propriedades que apontam seu potencial como biocatalisador industrial. / Microbial enzymes, when produced at affordable costs and preserving their catalytic properties, are crucial tools for sustainable chemical and energy industries. To enhance lipase production by Staphylococcus warneri EX17 strain, different cultivation strategies were applied to investigate the influence of some variables on enzyme production and then fed-batch cultivation was proposed. Additionally, three hydrophobic supports, Octyl-Sepharose, Immobead 150 and MCI GEL CHP20P have been assayed to purify and immobilize the lipase from S. warneri EX17 (SWL) via interfacial adsorption. Results indicated that the intensity of the interaction between the lipase and the support surface interferes in properties of the immobilized enzyme. The immobilized preparations Octyl-SWL and MCI-SWL preserved their lipolytic activity in the presence of 50 % (v/v) Butanol, Ethanol, n-Hexane, Isopropanol and Methanol. Octyl-SWL and MCI-SWL catalyzed the ester synthesis reaction giving 28 % and 35.6 % of conversion in 24 h. These enzyme preparations may be promising alternatives as industrial biocatalysts.

Enzimas industriais movimentam um mercado mundial estimado em sete bilhões de dólares anualmente. Entre essas enzimas, incluem-se as queratinases, enzimas capazes de catalisar a hidrólise de queratina e com aplicação potencial na indústria coureira. A queratinase KerS14, produzida pelo Bacillus subtilis S14 é capaz de depilar o couro sem causar danos ao colágeno. Embora tenha esta capacidade de grande interesse biotecnológico, sua baixa termoestabilidade a 50 °C é uma característica desvantajosa para a aplicação industrial da enzima. Visando aumentar a produção de queratinases pelo B. subtilis S14 e a termoestabilidade da KerS14, duas estratégias foram adotadas: mudanças nas condições de cultura do microrganismo selvagem e obtenção de enzimas mutantes recombinantes. Na primeira estratégia, B. subtilis S14 foi cultivado em meio farinha de pena 1,5% e CaCl2 1%. O sobrenadante da cultura foi caracterizado e 60% da atividade queratinolítica permaneceu depois de armazenada por nove dias a temperatura de 50 °C. Em paralelo, a ORF que codifica a KerS14 foi amplificada e clonada em vetor de expressão. Os resíduos de aminoácidos G61, S98 e P239 da KerS14 foram modificados por mutagênese sítio dirigida , as enzimas mutantes foram expressas in Escherichia coli e purificadas. A enzima recombinante (rKerS14) foi mais termoestável do que a enzima selvagem. Além disso, foi verificado que o fibrinogênio e fibrina são hidrolisados pela rKerS14, mostrando que a enzima também tem potencial para desenvolver drogas para o tratamento de doenças cardiovasculares. / Industrial enzymes have a world market of more than seven billion dollars per year. Keratinases are among these enzymes. They have a potential for use in tannery. The keratinase KerS14, produced by Bacillus subtilis S14, differ from other keratinases because it can depilate leather without damaging collagen. Despite this great biotechnological potential, its low thermal stability at 50 °C is an undesirable property for industrial application. In order to increase keratinases production by B. subtilis S14 and KerS14 thermal stability, two strategies were adopted: changes in wild–type microorganism growth conditions and producing recombinant mutant enzymes. In first strategy, B. subtilis S14 were grown in feather meal 1.5% and CaCl2 1 %. The supernatant obtained after fermentation was characterized and its keratinolytic activity remained in 60% after nine days of storage at 50 °C. In parallel, the KerS14 ORF was amplified and cloned into an expression vector. The KerS14 amino acid residues G61, S98 and P239 were modified and mutant enzymes were expressed in Escherichia coli and purified. It was verified that recombinant enzyme (rKerS14) is more thermal stable than the wild–type enzyme. In addition, it is able to hydrolyze fibrinogen and fibrin which is useful to develop drugs for the treatment of cardiovascular diseases.