O cultivo de Aspergillus oryzae IPT-301 em meio líquido foi estudado para avaliar a influência do pH e do suprimento de oxigênio sobre o crescimento fúngico e a formação de pectinases. Definiuse um meio limitante para o crescimento com as seguintes concentrações: farelo de trigo em extrato aquoso, 40g/L; glicose, 5g/L; sulfato de amônio, 5g/L; pectina cítrica (indutor), 20g/L. O indutor foi estudado quanto ao momento de adição ao meio. Com adição em 24h de cultivo, a máxima concentração de biomassa foi atingida em cerca de 70h, quase 48h depois do observado no ensaio controle. A atividade enzimática máxima (27U/mL) foi semelhante à condição de referência (24U/mL), mas a ausência da pectina no início do processo facilitou a mistura e o controle do pH e do oxigênio dissolvido. No caso, reduziram-se a máxima frequência dos agitadores do biorreator (650 para 600rpm) e o período de tempo em que este nível de agitação precisou ser mantido para possibilitar a oxigenação do meio (30h para 12h), o que favoreceria a preservação do micélio. Valores constantes e variáveis de pH do meio foram comparados em ensaios com adição de pectina em 24h e sem controle de oxigênio dissolvido. Verificou-se que o pH constante de 4,0 favoreceu o crescimento, que atingiu 4,5g/L, porém a atividade enzimática foi insignificante (1,4U/mL). Quando o pH decresceu naturalmente até o mínimo de 2,7, foram atingidos concentração de biomassa de 4,0g/L e atividade de pectinases de 24U/mL; na sequência, porém, a atividade baixou para 2U/mL, acompanhando o aumento do pH após 96h de processo. Entretanto, em cultivo em que o pH foi controlado em 2,7 nas horas finais do processo, a atividade enzimática foi preservada. Estes resultados, juntamente com os de ensaios enzimáticos, demonstraram que as pectinases de A. oryzae perdem a estabilidade à medida que o pH aumenta. O ensaio com pH constante em 2,7 foi o único em que a atividade pectinolítica foi superior quando a pectina esteve presente desde o início do cultivo. Possivelmente, a limitação do crescimento celular (máximo de 3,5g/L) favoreceu os mecanismos de transferência e mistura, prolongando a viabilidade celular. Cultivos com pH controlado em 4,0 no período de intenso crescimento celular e em 2,7 para a produção de pectinases (Ensaios T5 e T10) resultaram em elevadas atividades enzimáticas, especialmente quando a pectina foi adicionada em 24h (43U/mL). No caso, as mais efetivas condições de transferência de oxigênio e mistura, aliadas ao pH adequado ao crescimento, permitiram que a biomassa atingisse 6,3g/L e, após a redução do pH a 2,7, a atividade pectinolítica foi incrementada. Ensaios com oxigênio dissolvido em mínimo de 30% da saturação foram conduzidos em duas condições: Ensaio B5 - pH inicial 4,0 e controlado em 2,7 após atingir este valor; Ensaio B6 - pH constante em 4,0 até 24h, seguido de redução para 2,7 e controle neste valor. As concentrações celulares atingidas em B5 (6,0g/L) e em B6 (6,8g/L) foram semelhantes à de T10, mas suas máximas atividades pectinolíticas – 106 e 120U/mL, respectivamente – foram as maiores deste estudo. Estes resultados se deveram, provavelmente, à intensificação do metabolismo fúngico associado à disponibilidade ilimitada de oxigênio. Apesar de o tempo para atingir os picos de biomassa e atividade enzimática ter sido aumentado, a produtividade do Ensaio B6 foi 3,7 vezes maior que a do controle. Os resultados deste trabalho confirmaram que o pH e o suprimento de oxigênio em cultivos de A. oryzae afetam decisivamente tanto o crescimento quanto a produção de pectinases. As condições operacionais definidas possibilitaram a redução do crescimento celular – permitindo, entretanto, a obtenção de atividades enzimáticas elevadas – e, em decorrência, um controle eficiente dos parâmetros estudados. / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The cultivation of Aspergillus oryzae IPT-301 in liquid medium was studied to assess the influence of pH and oxygen supply on the fungal growth and the formation of pectinases. A growthlimiting medium was defined with the following concentrations: wheat bran in aqueous extract, 40g/L; glucose, 5g/L; ammonium sulphate, 5g/L; citric pectin (inducer), 20g/L. The inducer was evaluated with respect to the time of addition to the medium. With the addition in 24h of cultivation, maximum biomass concentration was achieved in 70h, almost 48h after reaching the cell growth peak of the control experiment. The maximum enzyme activity (27U/mL) was similar to that of the reference run (24U/mL), but the absence of pectin at the beginning of the process favoured mixing and the control of pH and dissolved oxygen concentration. In this case, the maximum impeller speed in the bioreactor (650 to 600rpm) and the time period that this level of agitation was maintained to provide the best possible medium oxygenation were reduced (30 to 12h), a condition that could favour the preservation of mycelium. Constant and varied medium pH values were evaluated in experiments with the addition of pectin in 24h and without dissolved oxygen concentration control. It was found that a constant pH of 4.0 favoured biomass growth, but the enzyme activity was insignificant (1.4U/mL). When the pH naturally decreased up to a minimum of 2.7, biomass concentration of 4.0g/L and pectinase activity of 24U/mL were attained; in the sequence, however, the activity fell to 2U/mL following the increase of pH observed after 96h. Nevertheless, in the cultivation in which the pH 2.7 was maintained though the final hours of process, the enzyme activity was preserved. These results together with those from enzymatic tests have shown that A. oryzae pectinases loose stability as pH rises. The experiment with constant pH at 2.7 was the only that results in superior pectinase activity with pectin present in the medium from the beginning of the cultivation. Possibly, cell growth limitation (maximum of 3.5g/L) favoured mass transfer and mixing mechanisms and the biomass viability was extended. Cultivations with the pH controlled at 4.0 when the cell growth was more intense and, afterwards, at 2.7 for pectinase production (Experiments T5 and T10) result in high enzyme activities, especially when pectin was added in 24h (43U/mL). In the case, the more effective conditions of oxygen transfer and mixing, allied to the adequate pH for cell growth, allowed that biomass concentration achieved 6.3g/L and, after reducing the pH to 2.7, pectinolytic activity as increased. Experiments with dissolved oxygen concentration at a minimum of 30% of saturation were carried out at two conditions: Experiment B5 - initial pH 4.0 and controlled at 2.7 after reaching this value; Experiment B6 – constant pH up to 24h, followed by reduction to 2.7 and control at this value. The cell concentrations achieved in B5 (6.0g/L) and in B6 (6.8g/L) were similar to that of T10, but their maximum pectinase activities – 106 and 120U/mL, respectively – were the largest in this study. Such results were probably due to the raising fungal metabolism which is associated to the unlimited oxygen availability. Although the time to reach the peaks of biomass and enzyme activity has been increased, the productivity of Experiment B6 was 3.7 times larger than that of the control run. The results of this work have confirmed that, in cultivations of A. oryzae, the pH and the oxygen supply decisively affect both cell growth and pectinase production. The defined operational conditions provided the reduction of cell growth – allowing, however, the achievement of high enzyme activities – and, consequently, an efficient control of the studied parameters.

Na presença de lactose e frutose, ácido lactobiônico e sorbitol são formados equimolarmente em reações catalisadas por glicose-frutose oxidorredutase (GFOR) e glicono--lactonase (GL), enzimas periplasmáticas de Zymomonas mobilis. O ácido lactobiônico tem alto valor comercial e, como o sorbitol, importantes aplicações industriais. Este trabalho objetivou estudar a cinética de produção de ácido lactobiônico e sorbitol por células de Z. mobilis permeabilizadas com brometo de cetil trimetil amônio, livres ou imobilizadas em alginato de cálcio. As constantes de saturação de Michaelis-Menten de GFOR/GL para lactose e frutose foram estimadas em 0,39 e 0,050mol/L, respectivamente, e Vmáx em 7,69 unidades de GFOR/GL por grama de células secas (U/g), em que U corresponde a mmol de produto formado por hora. A imobilização de Z. mobilis foi avaliada com suspensões celulares de 30, 50 e 70g/L, observando-se redução do fluxo de massa dos solutos através das esferas de alginato de cálcio com maiores massas de células. Como na bioconversão de lactose/frutose em ácido lactobiônico/sorbitol, um considerável volume do reator é ocupado pelas esferas, o uso da suspensão celular de 70g/L para a imobilização se mostrou favorável devido à menor quantidade do suporte para ter-se a concentração de células/enzimas desejada para o processo. Assim, os problemas operacionais associados à mistura e ao controle de pH foram minimizados. No processo de bioconversão, concentrações de biocatalisador, livre ou imobilizado, entre 5 a 20g/L resultaram em teores de ácido lactobiônico semelhantes, em torno de 170g/L, com rendimento de cerca de 70% e produtividades proporcionalmente crescentes. A velocidade específica de formação de produto calculada nas primeiras horas de processo com células imobilizadas ( 0,76g/g/h) foi menor que a medida com células livres (  2,0g/g/h) em razão de o suporte de imobilização atuar como uma barreira física para o transporte de massa. Na sequência, porém, constatou-se uma maior estabilidade do sistema imobilizado e, em consequência, produtividades semelhantes ( 7,1g/L/h) foram alcançadas em ambas as condições. Para avaliar-se possibilidade de reutilização das células imobilizadas, foram realizadas oito bioconversões seguidas – 193h de operação –, constatando-se a preservação de 85% da atividade inicial. Na bioconversão, o pH foi controlado em 6,4 com NaOH, sendo formado lactobionato de sódio. Este sal foi precipitado com etanol e, em seguida, convertido à forma ácida – ácido lactobiônico por cromatografia de troca iônica. O produto purificado apresentou características físico-químicas semelhantes às da substância padrão comercial. / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Na presença de lactose e frutose, ácido lactobiônico e sorbitol são formados equimolarmente em reações catalisadas por glicose-frutose oxidorredutase (GFOR) e glicono--lactonase (GL), enzimas periplasmáticas de Zymomonas mobilis. O ácido lactobiônico tem alto valor comercial e, como o sorbitol, importantes aplicações industriais. Este trabalho objetivou estudar a cinética de produção de ácido lactobiônico e sorbitol por células de Z. mobilis permeabilizadas com brometo de cetil trimetil amônio, livres ou imobilizadas em alginato de cálcio. As constantes de saturação de Michaelis-Menten de GFOR/GL para lactose e frutose foram estimadas em 0,39 e 0,050mol/L, respectivamente, e Vmáx em 7,69 unidades de GFOR/GL por grama de células secas (U/g), em que U corresponde a mmol de produto formado por hora. A imobilização de Z. mobilis foi avaliada com suspensões celulares de 30, 50 e 70g/L, observando-se redução do fluxo de massa dos solutos através das esferas de alginato de cálcio com maiores massas de células. Como na bioconversão de lactose/frutose em ácido lactobiônico/sorbitol, um considerável volume do reator é ocupado pelas esferas, o uso da suspensão celular de 70g/L para a imobilização se mostrou favorável devido à menor quantidade do suporte para ter-se a concentração de células/enzimas desejada para o processo. Assim, os problemas operacionais associados à mistura e ao controle de pH foram minimizados. No processo de bioconversão, concentrações de biocatalisador, livre ou imobilizado, entre 5 a 20g/L resultaram em teores de ácido lactobiônico semelhantes, em torno de 170g/L, com rendimento de cerca de 70% e produtividades proporcionalmente crescentes. A velocidade específica de formação de produto calculada nas primeiras horas de processo com células imobilizadas ( 0,76g/g/h) foi menor que a medida com células livres (  2,0g/g/h) em razão de o suporte de imobilização atuar como uma barreira física para o transporte de massa. Na sequência, porém, constatou-se uma maior estabilidade do sistema imobilizado e, em consequência, produtividades semelhantes ( 7,1g/L/h) foram alcançadas em ambas as condições. Para avaliar-se possibilidade de reutilização das células imobilizadas, foram realizadas oito bioconversões seguidas – 193h de operação –, constatando-se a preservação de 85% da atividade inicial. Na bioconversão, o pH foi controlado em 6,4 com NaOH, sendo formado lactobionato de sódio. Este sal foi precipitado com etanol e, em seguida, convertido à forma ácida – ácido lactobiônico por cromatografia de troca iônica. O produto purificado apresentou características físico-químicas semelhantes às da substância padrão comercial.

Orientador: Maria Isabel Rodrigues / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-06T16:00:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Mendes_GuilhermeLopes_M.pdf: 1683620 bytes, checksum: 61fa8e0621ddee5d8253c384bb74286f (MD5) Previous issue date: 2006 / Mestrado / Mestre em Engenharia de Alimentos

Orientador: Sara T. O. Saad / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-07-20T23:31:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Penna_SocratesCalvoso_M.pdf: 1533281 bytes, checksum: cdfffc6e3a39d75a7ea87e1312700fae (MD5) Previous issue date: 1995 / Resumo: O Mercúrio (Hg) é empregado em diversas atividades humanas. A exposição primária ao metal ocorre através da alimentação contaminada e da liberação de mercúrio pelo amálgama dentário. A exposição ocupacional ao vapor de mercúrio, substância inodora e incolor, é hoje a via mais freqüente de intoxicação. O Hg associa-se fortemente aos grupamentos sulfidrilas (SH) presentes nas proteínas da membrana plasmática, enzimas, substâncias de baixo peso molecular, como a cisteína e glutationa, também pode formar ligações covalentes com o enxofre. Quando se liga aos eritrócitos, atua como um agente oxidante. O presente estudo teve o objetivo de avaliar o sistema antioxidativo eritrocitário através da medida da atividade da Superóxido Dismutase, Catalase e Glicose-6-Fosfato-Desidrogenase e da concentração da Glutationa Reduzida nos seguintes grupos de trabalhadores: Grupo 1 (Expostos) - 16 trabalhadores, sendo 14 do sexo masculino e 2 do feminino, expostos ao vapor de Hg por um período variá~el de 0.5 a 8 anos (3.37 :I: 2.40) na faixa etária de 18 a 48 anos (32:1: 8.86), e que apresentaram concentração urinária de Hg de 1.6 a 35 (10.73:1: 9.88) 1l9/g creatinima. Grupo 2 (Afastados) - 7 trabalhadores do sexo masculino(M) trabalhadores com idade variando de 42 a 61 (46.42:1: 8.61) anos afastados da exposição ocupacional há pelo menos 6 meses e que ficaram expostos ao metal por um período de 4 a 10 anos, apresentaram uma concentração urinária do metal 5.0 -19.1 1l9/g creatinima. Grupo 3 (controle Normais) - constituídos de 8 técnicos e alunos (6 do sexo masculino e 2 do sexo feminino) do Departamento de Hematologia e Farmacologia da FCM-UNICAMP, com idade variando de 22 a 45 anos, possuidores de próteses dentárias conténdo Hg , não expostos ocupacionalmente ao metal. Nestes indivíduos não foi avaliada a concentração urinária do Hg. Em todos os grupos foi realizado hemograma completo e no G1 também levamos a efeito a análise da presença de corpos de Heinz. Nossos resultados demonstram que a atividade da SOD do G1 e G2 apresentou-se igual à do grupo G3. Por outro lado, a atividade da Catalase do G1 está aumentada sigmificativamente quando comparada ao G2 e teve uma forte tendência de aumento quando comparada ao G3. Já os níveis de GSH estiveram reduzidos significativamente no grup? G1, mas normal no G2, quando comparados ao G3. Assim os resultados apresentados neste trabalho indicam que níveis urinários de mercúrio dentro do Limite de Tolerância Biológica podem comprometer o sistema antioxidante eritrocitário / Abstract: Mercury (Hg) is used in different human activities. The primary exposition to this metal has its origin from the ingestion of contaminated food and odontologic amalgam. The occupational exposure is the most frequent via in cantamination. Mercury tightly binds to sulfidric groups (SH) presenting cell membrane proteins, enzymes, and low molecular weight substances such as cistein and gluthation. It can form cavalent bonds with sulphur and acts as an oxidant agent when it binds to erythrocytes. The purpose of this study is to investigate the erythrocyte antioxidative system by measurement of Catalase, Superoxide Dismutase (SOD) , Gluthation (GSH) and Glicose-6-Phosphate Dehydrogenase activities in the following groups: Group 1 (EXPOSED)- 16 workers, 14 men and 2 women, exposed to mercury vapors over a period of 0.5 - 8 (3.37 :t 2.40) years. These individuais had 18-48 (32 :t 8.86) years and presented urinary concentrations of mercury lower than the Limit of Biological Tolerance (LBT) 35 - 1.6 (10.73 :t 9.88) ~g/g creatinin. Group 2 (No-EXPOSED)- 7 (M) workers with 42 - 61 ( 46.42 :t 8.61) years without occupational exposed ave r a period of 6 months. They were previously exposed to Hg for 4 to 10 years and presented urinary concentration of mercury of 5.0-19.1 ~g/g creatinin.' Group.3 (Normal controls)- composed by technicians and students, 6 men and 2 women, from the Department of Hematology and Pharmacalogy of the State University of Campinas, with 22 - 45 years. They had dental prothesis containing Hg and were not occupationally exposed to this metal. There were no urinary concentrations of mercury in these individuais. Hematologic analysis was carried out in ali the previous groups besides the detection of Heinz bodies. Our results demonstrate that the activity of SOD in exposed and non-exposed individuais presented the same values of the contrai group. Conversely the Catalase activity demonstrated an increasement in group 1 when compared with group 3 and a significantly augmented when compared to group 2. The levels of GSH were significantly reduced in group 1 and normal in group 2. We conclude that the urinary levels of mercury inside the Limit of Biological Tolerance can affect the erytrocyte antioxidant system / Mestrado / Mestre em Farmacologia

Orientador: Lucia Regina Durrant / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-07-22T01:35:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Sette_LaraDuraes_M.pdf: 5310744 bytes, checksum: 6b0cd9eb702de9b3eebf535684b8e7a8 (MD5) Previous issue date: 1997 / Resumo: O sistema ligninolítico produzido por fungos apresenta grande interesse nos dias de hoje, por possuir diferentes aplicações, com mínima agressividade ambiental. As enzimas ligninolíticas podem ser utilizadas para o tratamento de resíduos lignocelulósicos, biopolpação, tratamento de efluentes, etc, além de poderem degradar uma variedade de poluentes orgânicos. No presente trabalho foi realizado o estudo do sistema ligninolítico de cinco linhagens de fungos, capazes de produzir enzimas que participam da degradação da lignina, em diferentes condições de oxigenação. A seleção dos microrganismos foi efetivada a partir dos resultados de produção enzimática de dez linhagens iniciais, crescidas em meio contendo papel de filtro como fonte de carbono, sob condições aeróbica com agitação, aeróbica sem agitação e sob condição microaerofílica. Os resultados de produção de enzimas celulolíticas pelas linhagens iniciais também foram levados em consideração na seleção. Quatro linhagens de fungos filamentosos LH5 (deuteromiceto), 20 (deuteromiceto), Q10 {Trichocladium canadense), H2 (basidiomiceto), e uma linhagem de levedura LD {Geotrichum sp) foram selecionadas. Após a seleção os cinco microrganismos foram cultivados sob condição de baixa oxigenação em seis diferentes meios de cultura contendo como fontes de carbono: álcool veratrílico (0,4 mM); ácido lignosulfônico (0,5%); ácido lignosulfônico dialisado (0,5%); xilana (0,5%); serragem (0,5%) e bagaço de cana (0,5%). Os resultados de produção das enzimas lignina peroxidase (LiP), manganês peroxidase (MnP), lacase, peroxidases e álcool veratrílico oxidase (AVO) revelaram que em meios contendo álcool veratrílico, xilana, serragem e bagaço de cana, houve melhor produção da enzima MnP, enquanto que para os meios onde o ácido lignosulfônico e o ácido lignosulfônico dialisado foram utilizados como fontes de carbono, a melhor produção foi para as enzimas LiP e AVO. Os microrganismos cultivados sob condição aeróbica com agitação em meios contendo papel de filtro, serragem e bagaço de cana apresentaram, de maneira geral, melhor produção de MnP. Os microrganismos também foram crescidos nesses três meios, primeiramente sob condição de agitação sendo posteriormente colocados sob condição microaerofilica, onde foi observado um aumento de produção das enzimas LiP e AVO. A verificação da degradação do ácido lignosulfônico utilizado como substrato, e da presença de etanol nos caldos enzimáticos obtidos dos microrganismos crescidos em serragem e em bagaço de cana, foram monitorados por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE). Os cromatogramas dos caldos de cultivo apresentaram melhores resultados de degradação para o ácido lignosulfônico dialisado do que para o ácido lignosulfônico não dialisado. A detecção do etanol nos sobrenadantes das culturas variou com a fonte de carbono, serragem ou bagasso de cana, e com as condições de crescimento utilizadas / Abstract: The ligninolytic system produced by fungi is currently of great interest because it has many environmental applications. Ligninolytic enzymes can be used for the treatment lignocellulosic wastes, biopulping, effluent treatment, etc., and one able to degrade a variety of organic pollutants. In the present work a study was made of the ligninolytic system of five fungal strains, capable of producing enzymes that participate in lignin degradation, under different conditions of oxygenation. The screening of microorganisms was made considering the results of enzymatic production in ten strains, grown in a medium containing ground Whatman n° 1 paper as the carbon source, under aerobic conditions with or without shaking and also under microaerophilic conditions. The production of celullolytic enzymes by the initial strains were also considered in the screening. Four strains of filamentous fungi LH5 (deuteromycete), 20 (deuteromycete), Q10 {Trichocladium canadense), H2 (basidiomycete) and one yeast strain LD (Geotrichum sp) were selected. These five microorganisms were grown under low oxygenation conditions in six different culture media containing as carbon sources: veratryl alcohol (0,4mM); lignosulfonic acid (0,5%); dialised lignosulfonic acid (0,5%); xylan (0,5%); sawdust (0,5%) and sugar-cane bagasse (0,5%). The production of the enzymes lignin peroxidase (LiP); manganese peroxidase (MnP); laccase; peroxidases and veratryl alcohol oxidase (VAO) revealed that in media containing veratryl alcohol, xylan, sawdust and sugar-cane bagasse, there was a better production of MnP, while in media where the lignosulfonic acid and dialysed lignosulfonic acid were used as carbon sources, the greatest production was of LiP and VAO. The microorganisms that were grown on ground Whatman n°l paper, sawdust and sugar-cane bagasse under shaking showed better production, in general, of MnP. The strains were also grown in these media primarily under shaking conditions, subsequently being under microaerophylic conditions, where an increase in the production of the enzymes LiP and VAO was observed. The demonstration of lignosulfonic acid degradation and the presence of ethanol in the enzymatic supernatant of the microorganisms grown in sawdust and in sugar-cane bagasse, were monitored by HPLC. Dialysis of the lignosulfonic acid resulted in higher degradation levels after growth of the fungi, whem compared to the non-dialysed one. The ethanol appearence in the cultures broth varied with the carbon sources sawdust or sugar-cane bagasse and also with the growth conditions used / Mestrado / Mestre em Ciência de Alimentos

Orientadores: Graciliano de Oliveira Neto, Lauro Tatsuo Kubota / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Quimica / Made available in DSpace on 2018-07-22T09:50:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Garcia_CarlosAlexandreBorges_D.pdf: 7078173 bytes, checksum: 45d5cc4cb0e9016b67f2a92522b4137f (MD5) Previous issue date: 1997 / Doutorado

Orientador: Flavia Maria Netto / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-07-22T15:29:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Henn_RuthLiane_M.pdf: 5191604 bytes, checksum: c6426c51553d184bf65dc2b208ae534f (MD5) Previous issue date: 1997 / Resumo: Este trabalho objetivou caracterizar diferentes isolados protéicos de soja comerciais (IPSs), bem como analisar seu comportamento quando submetidos à hidrólise enzimática para a obtenção de peptídeos de baixo peso molecular. Para cada isolado determinou-se o teor de proteína, lipídio, cinzas, umidade, fitato, inibidor de tripsina (IT), índice de dispersibilidade da proteína (IDP) e composição em aminoácidos totais. Além disso, realizou-se extração das proteínas dos IPSs com água destilada e a fração solúvel foi submetida à eletroforese em gel de poliacrilamida, na presença de dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE) e análise densitométrica dos géis. Os IPSs foram hidrolisados com pancreatina nas seguintes condições: em água deionizada, 5,5% de substrato (p/p), relação enzima/substrato = 1:15 (p/p), temperatura = 40°C e pH = 8,0 mantido pela adição de NaOH 4,93N. A reação foi interrompida quando atingiu 21,5% de grau de hidrólise (GH). Os hidrolisados obtidos foram analisados para o índice de solubilidade em ácido tricloroacético (TCA) 10%, conteúdo de aminoácidos livres (AAL) , cromatografia de exclusão molecular e eletroforese em gel de poliacrilamida, na presença de dodecil sulfato de. sódio (SDS-PAGE). Os resultados obtidos na caracterização dos 13 IPSs demonstraram diferenças quanto ao conteúdo de: proteína (87,8-94,1%), lipídio (3,0-4,7%), cinzas (3,5-5,0%), umidade (4,1-9,5%), fitato (7,41-15,62 mg/g proteína), IT (5,17-94,72 UTl/mg de proteína) e IDP (11,7-88,7%). Quanto à composição em aminoácidos, a variabilidade entre os IPSs, para 13 dos 18 aminoácidos analisados, ficou dentro do erro experimental (+-8%). Entretanto, os isolados apresentaram variabilidade > 8% para os aminoácidos Trp (11%), His (12%), Cys (14%), Met (16%) e Tyr (10%). A composição relativa das subunidades-7S e polipeptídeos-11S presentes na fração solúvel dos 13 IPSs foi: ? a' (0-100%); a (0¬26%); ß (0-44%); polipeptídeo ácido (50-100%); polipeptídeo básico (0-50%). O tempo de hidrólise necessário para atingir 21,5% de GH diferiu para os 13 IPSs (48 a 252 min) e foi maior para os isolados que continham todas as subunidades-7S e polipeptídeos-11 S, valores mais altos de iDP, e com maior conteúdo de IT. A solubilidade em TCA 10% dos hidrolisados variou de 61,5 a 100,0%. O total de AAL ficou entre 7,5 e 31,0%, sendo que os aminoácidos Arg, Lys, Trp, Tyr, Phe, Met, Vai, Leu e lIe encontravam-se em maior quantidade. Deste grupo, os básicos foram os aminoácidos liberados em menor proporção. A cromatografia de exclusão molecular sugeriu diferenças no perfil de peso molecular dos hidrolisados. Estas diferenças foram confirmadas pela eletroforese uma vez que alguns hidrolisados apresentaram bandas bem definidas na faixa de PM entre 14400 e 31000, enquanto outras amostras apresentaram somente bandas difusas na região de PM < 6500. Os resultados obtidos com o presente trabalho sugerem que os 13 IPSs analisados são fisicamente diferentes e comportam-se como substratos distintos quando submetidos às mesmas condições de hidrolise / Abstract: The purpose of this study was to characterize different commercial soy protein isolates (SPI's) and to analyse their behaviour when they were submitted to an enzymatic hydrolysis to obtain low-molecular weight hydrolysates. Protein, lipid, ash, moisture, phytate, trypsin inhibitor (TI) content, protein dispersibility index (PDI), and total-amino acid composition were determined for each SPI. SDS-PAGE electrophoresis and densitometric analysis of the gels were performed in the soluble SPI protein extracted with destilled water. The SPI's were hydrolysed with pancreatin under the following conditions: deionized water, 5.5% substrate concentration (w/w), enzyme-substrate ratio = 1: 15 (w/w), temperature = 40°C and pH = 8.0 which was maintained constant by addition of 4.93N NaOH. The reaction was stopped when the degree of hydrolysis (DH) reached 21.5%. The hydrolysates obtained were evaluated according to their solubility in 10% trichloroacetic acid (TCA), free-amino acid content (FAA), molecular exclusion chromatography and SDS-PAGE electrophoresis. The characteristics of the 13 SPI's showed differences in the contents of protein (87.8-94.1 %), lipid (3.0-4.7%), ash (3.5-5.0%), moisture (4.1-9.5%), phytate (7.41-15.62 mg/g protein), TI (5.17-94.72 TIU/mg protein) and PDI (11.7-88.7%). In terms of the amino-acid composition, the variability among the SPI's was within the experimental error (:t8%) for the most amino-acids analysed. However the SPI's showed variability > 8% for the amino-acids Trp (11%), His (12%), Cys (14%), Met (16%), and Tyr (10%). The relative composition of the 78¬subunits and 11S-polipeptides presented in the soluble fraction was: a' (0-100%), a (0-26%), ß (0-61%), acid polipeptide (50-100%) and basic polipeptide (0-50%). The time the SPI's consumed to reach the same DH (21.5%) was different (48-252 min.), being longer for isolates containing all the 7S-subunits and 11S-polipeptides, higher PDI values, and higher TI contents. The hydrolysates' solubility in 10% TCA was in the range of 61.5 to 100.0%. The free-amino acids varied from 7.5 to 31.0%, consisting mainly of Arg, Lys, Trp, Tyr, Phe, Mel, Val, Leu and Ile. It was noticed, however, that basic amino acids were released in smaller proportion. Molecular exclusion chromatography pointed out differences in the molecular-weight profiles of the hydrolysates. These differences were confirmed by electrophoresis, which showed for some of the hydrolysates well defined zones in the region between 14400 and 31000, while the other samples showed only scattered zones in the MW < 6500 region. These results suggest that the 13 SPI's analysed are physically different and behave as distinct substrates when submitted to the same hydrolysis conditions / Mestrado / Mestre em Ciência da Nutrição

Orientador: Pedro Luis Onofrio Volpe / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Quimica / Made available in DSpace on 2018-07-23T14:30:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Granjeiro_JoseMauro_D.pdf: 4816887 bytes, checksum: 0c6babce668c64888f2439a267c14a09 (MD5) Previous issue date: 1998 / Doutorado

Orientador: Maricilda Palandi de Mello / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-26T06:06:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Lau_IvyFreitas_M.pdf: 6541042 bytes, checksum: dce5fa2949eadea9991df6afa662f0ad (MD5) Previous issue date: 1999 / Mestrado

Orientador: Stephen Hyslo / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-07-27T02:04:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Matthiesen_AlcyrJose_M.pdf: 2439730 bytes, checksum: 195b3aef1010687757fea8a898b4bb9c (MD5) Previous issue date: 2000 / Resumo: A difusão de toxinas do sítio de inoculação de veneno é atribuída à ação de enzimas como colagenases, elastases, hemorraginas e hialuronidases que degradam os componentes da lâmina basal e da matriz extracelular. Neste trabalho avaliamos a atividade hialuronidásica de vários venenos animais e investigamos algumas propriedades da enzima encontrada no veneno da cascavel sul americana Crota/us durissus terrificus. A atividade hialuronidásica foi medida por um método turbidimétrico usando-se ácido hialurônico como substrato e também por detecção in situ após SDS PAGE. A hialuronidase foi parcialmente purificada por gel filtração em coluna de Sephacryl S200 HR. O perfil de eluição foi monitorado a 280nm e as frações foram testadas para atividade enzimática. A capacidade de antisoros em neutralizar a enzima foi avaliada medindo-se a atividade residual após co-incubação durante 30 min à 37°C. De modo geral, os venenos investigados possuíam atividade hialuronidásica, com níveis mais altos em venenos de artrópodes [15.3+-4.7 ¿ 166+-19.2 unidades (TRU ou "turbidity reducing units")/mg] do que em serpentes (O - 7.0+-1.7 TRU/mg; média+-E.P.M.; n=3-6). Houve variação dentro e entre espécies e subespécies, conforme observado com os venenos botrópicos e crotálicos, respectivamente. Assim, a atividade hialuronidásica de diferentes amostras de veneno de C. d. terrificus variou de 4.5:tO.5 à 13.2:t4.8 unidades TRU/mg, (n=3-6), enquanto a de C. d. cascavella e C. d. collilineatus era de 25.7:t1.2 e 6.8:t1.1 TRU/mg, respectivamente. A hialuronidase mostrou pH ótimo de 4,0, e atividade máxima na presença de 50-100 mM de NaCI. A enzima perdeu atividade acima de 37°C, e também perdeu 50% de atividade durante as primeiras 6 h em solução (acetato de sódio 0,1 M, pH 6,0, contendo 0,15 NaCI), mas depois se manteve relativamente constante até 24 h, independente da temperatura de incubação (4°C, 25°C, 37°C). A cromatografia do veneno de C. d. terrificus por gel filtração resultou em um pico de atividade hialuronidásica com peso molecular >30.000, o que foi confirmado por eletroforese (SDS-PAGE) seguido por detecção de atividade in situo Com esta técnica, apenas uma banda de atividade foi observada com os diferentes lotes de veneno e o peso molecular foi estimado em -75.000. A atividade da enzima foi inibida de forma dose-dependente por antisoros comerciais (anti-botrópico, anti-crotálico, anti-elapídico e anti-escorpiônico), sendo o anti-escorpiônico o menos eficaz; em altas doses, todos inibiram a atividade em >90%. Estes resultados indicam que há variação nos ní.veis de atividade hialuronidásica no veneno de C. d. terrificus, mas que existe apenas uma isoforma. As propriedades desta enzima se assemelharam às de outras hialuronidases de venenos. A neutralização da atividade enzimática por diferentes antisoros comerciais indicou que há identidade imunológica entre hialuronidases de diferentes venenos / Abstract: Animal venoms contain enzymes capable of degrading basement membrane and extracellular matrix components. We examined the collagenase, elastase and hyaluronidase activities of several venoms and some of the properties of hyaluronidase in Crotalus durissus terrificus (South American rattlesnake) venom. Collagenase and elastase were assayed colorimetrically. Hyaluronidase activity was measured turbidimetrically and by in situ detection following SDS-PAGE. The enzyme was also partially purified by gel filtration on Sephacryl S200 HR. Neutralization of hyaluronidase by antisera was tested by measuring the residual activity afier co-incubation. Arthropod and snake venoms showed similar levels of collagenase; elastase activity varied from O - O.713 ~nm/mg/24 h. The hyaluronidase content of arthropod venoms [15.3+-4.7 to 166:!:19.2 units/mg; mean +-SEM] was higher than in snake venoms (<7.0+-1.7 units/mg; n=3-6). In C. d. terrificus venoms, hyaluronidase activity varied from 4.5+-0.5 to 13.2+-4.8 units/mg (n=3-6). C. d. terrificus hyaluronidase eluted as a single peak afier gel filtration and migrated as a single band (~75 kDa) based on in situ detection afie r SDS-PAGE. The pH optimum was 4.0, with maximum activity in 0.05-0.1 M NaCI. The enzyme lost activity at >37°C and after 6 h in solution (-50% reduction) at 4°C, 25°C and 37°C. Commercial antisera neutralized the enzyme. These propertiesof C. d. terrificus hyaluronidase were similar to those of other venom hyaluronidases / Mestrado / Mestre em Farmacologia