Se determinó los niveles de actividad de las enzimas antioxidantes: Superóxido dismutasa (SOD) y catalasa (CAT); y la concentración de malondialdehído (MDA) como un indicador de la peroxidación lipídica, en eritrocitos de 48 personas aparentemente sanas: 24 residentes de Nueva Cajamarca (Región San Martín) y 24 residentes de Lima. En los sujetos de Nueva Cajamarca se encontró mayores niveles de actividad de las enzimas: catalasa (0,61  0,10 k CAT / g Hb) en relación con los de Lima (0,57  0,16 k CAT / g Hb), (p < 0,025) y superóxido dismutasa (2142,00  2685,07 U SOD / g Hb) que en los de Lima (1536,62  594,18 U SOD / g Hb), (p = NS) y mayor concentración de malondialdehído (11,55  4,68 ηmol MDA / g Hb) que los obtenidos en Lima (11,11  3,99 ηmol MDA / g Hb), (p = NS). -- Palabras clave: superóxido dismutasa (SOD), catalasa (CAT), alondialdehído (MDA), peroxidación lipídica. / -- It was determined the activity levels of antioxidant enzymes: Superoxide dismutase (SOD) and catalase (CAT), and the concentration of malondialdehyde (MDA) as an indicator of lipid peroxidation in erythrocytes of 48 apparently healthy people: 24 residents of Nueva Cajamarca (Region San Martin, 856 m above sea level) and 24 residents of Lima (150 m above sea level). In Nueva Cajamarca subjects found higher levels of activity of the enzymes: catalase (0.61  0.10 k CAT / g Hb) in relation to those of Lima (0.57  0.16 k CAT / g Hb), (p <0.025) and superoxide dismutase (2142.00  2685.07 U SOD / g Hb) than in Lima (1536.62  594.18 U SOD / g Hb) (p = NS) and higher concentration of malondialdehyde (11.55  4.68 ηmol MDA / g Hb) than those obtained in Lima (11.11  3.99 ηmol MDA / g Hb) (p = NS) -- Key words: superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), malondialdehyde (MDA), lipid peroxidation.

Para evaluar su uso como predictor de daño miocárdico en insuficiencia cardíaca se determinaron los niveles séricos de las enzimas Asparto aminotransferasa (AST), Creatina fosfokinasa (CK), isoenzima Creatina fosfokinasa – MB (CK-MB) y Lactato Deshidrogenasa (LDH) en perros adultos con enfermedad cardiovascular (ECV) y aparentemente sanos. Fueron estudiados 25 animales sin distinción de sexo y raza, Los cuales se dividieron en 2 grupos: 10 animales aparentemente sanos (G1) y 15 animales con enfermedad Cardiovascular (G2). Se muestrearon sueros de ambos grupos y se analizaron por espectrofotometría. Los valores obtenidos fueron procesados mediante la prueba estadística “el Test de la t de student para comparar dos muestras independientes”. Los resultados indican que los niveles séricos de la Isoenzima CK-MB tuvieron diferencia estadística significativa (p menor a 0.05) a favor de los animales con ECV; y el resto de enzimas (AST, CK Y LDH) no obtuvieron diferencia estadística significativa. Se concluye que la CK-MB puede servir como predictor de daño miocárdico progresivo en la insuficiencia cardíaca canina. Palabras Clave: Asparto aminotransferasa (AST), Creatina fosfokinasa (CK), isoenzima Creatina fosfokinasa – MB (CK-MB), Lactato Deshidrogenasa (LDH), Enfermedad cardiovascular, Perros adultos. / --- Serum levels of the enzymes Asparte amino transferase ( AST ), Creatine kinase ( CK ), the MB fraction of Creatine kinase ( CK - MB ) and Lactate Dehydrogenase ( LDH ) were measured in adult dogs with cardiovascular illness and apparently healthy; they could evaluate their use as predictor of myocardial damage in heart failure. 25 animals irrespective of sex and race were studied, them as they split in 2 groups: 10 apparently healthy animals (G1) and 15 animals with illness Cardiovascular (G2). We sampled serums in the 2 groups and they were examined for spectrophotometry. The obtained values were analyzed by means of the statistical test the Test of student's t to compare two independent samples. The results indicate than levels of CK-MB had statistical significant difference (p menor a 0.05) in favor to dogs with cardiovascular illness. The rest of enzymes (AST, CK and LDH) did not obtain statistical significant difference. We Conclude than CK- MB can serve as predictor of progressive myocardial damage in the heart failure. Key Words: Asparte amino transferase (AST), Creatine kinase (CK), the MB fraction of Creatine kinase (CK - MB) and Lactate Dehydrogenase (LDH), cardiovascular illness, Adult dog.

El estrés oxidativo ocasionado por la exposición de sujetos nativos a mediana altura por acción de los radicales libres de oxígeno, fue evaluado por la actividad de enzimas antioxidantes eritrocitarias. Se determinaron las actividades de las enzimas antioxidantes: Glutatión Peroxidasa (GPx), Superóxido Dismutasa (SOD) y Catalasa (CAT); y la concentración de Malondialdehído (MDA) como un indicador de la peroxidación lipídica, en eritrocitos de 60 personas aparentemente sanas: 30 residentes de mediana altura (Huaraz, 3050 msnm) y 30 residentes de nivel del mar (Lima, 154 msnm). Se encontró diferencia estadísticamente significativa entre la actividad de Superóxido dismutasa (SOD) de los nativos de mediana altura (938.4 ± 239.5 U /g Hb) y los de nivel del mar (769.3 ± 279.9 U /g Hb), (p<0,05); así como la actividad de la Catalasa (CAT) a mediana altura (110.7 ± 42.5 kU /g Hb) y los del nivel de mar (83.7 ± 40.4 kU /g Hb), (p<0.05). No se encontró diferencia estadísticamente significativa entre la actividad de la Glutatión peroxidasa (GPx) a mediana altura y nivel del mar (65.1 ± 25.7 U /g Hb vs. 56.4 ± 14.6 U /g Hb), respectivamente. La concentración de Malondialdehído en los nativos de mediana altura no mostraron diferencia estadística significativa (35.1 ± 21.7 μmoles /g Hb) con los de nivel del mar (27.1 ± 6.3 μmoles /g Hb), (p>0,05). La exposición a la mediana altura influye en la actividad de enzimas antioxidantes eritrocitarias, especialmente en la SOD y CAT que juegan un rol importante en la detoxificación de especies reactivas de oxigeno, lo que explicaría el incremento de su actividad a mediana altura. Palabras clave: Superóxido dismutasa, glutatión peroxidasa, catalasa, malondialdehído, peroxidación lipídica, hipoxia y estrés oxidativo en la altura. / --- The effect of oxidative stress by exposure to medium altitude native subjects by the action of oxygen free radicals was assessed by the activity of erythrocyte antioxidant enzymes. It was determined the levels of the antioxidants enzymes: Glutathione Peroxidase (GPx), Superoxide Dismutase (SOD) and Catalase (CAT); and the concentration of Malondialdehyde (MDA) like an indicator of the lipid peroxidation in erythrocytes of 60 seemingly healthy people: 30 residents at the medium altitude (Huaraz, 3050 m above sea level) and 30 residents at sea level (Lima, 154 m above sea level). It was found significant difference stadistic between the activity of Superoxide dismutase higher in the native of medium altitude (938.4 ± 239.5 U/g Hb) and people living at sea level (769.3 ± 279.9 U/g Hb), (p<0,05). The activity of catalase at medium altitude (110.7 ± 42.5 kU/g Hb) and people living at sea level (83.7 ± 40.4 kU/g Hb), (p<0.05). It was not found significant difference stadistic between the activity obtained of Glutathione Peroxidase at medium altitude and sea level (65.1 ± 25.7 U/g Hb vs. 56.4 ± 14.6 U/g Hb), respectively. The levels of Malondialdehyde in the native of medium altitude not significant diference (35.1 ± 21.7 μmoles/g Hb) that sea level obtained (27.1 ± 6.3 μmoles/g Hb), (p>0,05). Exposure to medium altitude influences the activity of erythrocyte antioxidant enzymes, especially SOD and CAT play an important role in the detoxification of reactive oxygen species, which may explain the increased activity at a medium altitude. Keys word: Superoxide dismutase, glutathione peroxidase, catalase, malondialdehyde, lipid peroxidation, hypoxia and oxidative stress at high altitude. Keys word: Superoxide dismutase, glutathione peroxidase, catalase, malondialdehyde, lipid peroxidation, hypoxia and oxidative stress at high altitude. / Tesis

Para evaluar su uso como predictor de daño miocárdico en insuficiencia cardíaca se determinaron los niveles séricos de las enzimas Asparto aminotransferasa (AST), Creatina fosfokinasa (CK), isoenzima Creatina fosfokinasa – MB (CK-MB) y Lactato Deshidrogenasa (LDH) en perros adultos con enfermedad cardiovascular (ECV) y aparentemente sanos. Fueron estudiados 25 animales sin distinción de sexo y raza, Los cuales se dividieron en 2 grupos: 10 animales aparentemente sanos (G1) y 15 animales con enfermedad Cardiovascular (G2). Se muestrearon sueros de ambos grupos y se analizaron por espectrofotometría. Los valores obtenidos fueron procesados mediante la prueba estadística “el Test de la t de student para comparar dos muestras independientes”. Los resultados indican que los niveles séricos de la Isoenzima CK-MB tuvieron diferencia estadística significativa (p menor a 0.05) a favor de los animales con ECV; y el resto de enzimas (AST, CK Y LDH) no obtuvieron diferencia estadística significativa. Se concluye que la CK-MB puede servir como predictor de daño miocárdico progresivo en la insuficiencia cardíaca canina. Palabras Clave: Asparto aminotransferasa (AST), Creatina fosfokinasa (CK), isoenzima Creatina fosfokinasa – MB (CK-MB), Lactato Deshidrogenasa (LDH), Enfermedad cardiovascular, Perros adultos. / Serum levels of the enzymes Asparte amino transferase ( AST ), Creatine kinase ( CK ), the MB fraction of Creatine kinase ( CK - MB ) and Lactate Dehydrogenase ( LDH ) were measured in adult dogs with cardiovascular illness and apparently healthy; they could evaluate their use as predictor of myocardial damage in heart failure. 25 animals irrespective of sex and race were studied, them as they split in 2 groups: 10 apparently healthy animals (G1) and 15 animals with illness Cardiovascular (G2). We sampled serums in the 2 groups and they were examined for spectrophotometry. The obtained values were analyzed by means of the statistical test the Test of student's t to compare two independent samples. The results indicate than levels of CK-MB had statistical significant difference (p menor a 0.05) in favor to dogs with cardiovascular illness. The rest of enzymes (AST, CK and LDH) did not obtain statistical significant difference. We Conclude than CK- MB can serve as predictor of progressive myocardial damage in the heart failure. Key Words: Asparte amino transferase (AST), Creatine kinase (CK), the MB fraction of Creatine kinase (CK - MB) and Lactate Dehydrogenase (LDH), cardiovascular illness, Adult dog.

Se determinó los niveles de las enzimas antioxidantes: Glutation Peroxidasa (GPx), Superóxido Dismutasa (SOD) y Catalasa (CAT); y la concentración de Malondialdehído (MDA) como un indicador de la peroxidación lipídica, en eritrocitos de 60 personas aparentemente sanas: 30 residentes de la altura (Cerro de Pasco, 4340 m.s.n.m.) y 30 residentes de nivel del mar (Lima, 150 m.s.n.m.). Se encontró diferencia estadísticamente significativa entre los niveles eritrocitarios de Glutation peroxidasa de los nativos de altura (66,86 ± 8,97 U GPx / g Hb) y los de nivel del mar (37,78 ± 8,87 U GPx / g Hb), (p < 0,001). No se encontró diferencia estadísticamente significativa entre los valores obtenidos para la Superóxido dismutasa de la altura y de nivel del mar: 4140,56 ± 1147,69 U SOD / g Hb vs. 4104,35 ± 1917,9 U SOD / g Hb, respectivamente. La actividad de la enzima Catalasa fue menor en los sujetos de altura (275,27 ± 44,21 k CAT / g Hb) en relación con los de nivel del mar (414,29 ± 81,07 k CAT / g Hb), siendo esta diferencia estadísticamente significativa (p < 0,001). Los niveles de Malondialdehído en los nativos de altura también fueron menores (8,60 ± 1,91 nMol MDA / g Hb) que los obtenidos a nivel del mar (11,16 ± 1,55 nMol MDA / g Hb), (p < 0,001). / It was determined the levels of the antioxidants enzymes: Glutathione Peroxidase (GPx), Superoxide Dismutase (SOD) and Catalase (CAT); and the concentration of Malondialdehyde (MDA) like an indicator of the lipid peroxidation in erythrocytes of 60 seemingly healthy people: 30 residents at the high altitude (Cerro de Pasco, 4340 m above sea level) and 30 residents at sea level (Lima, 150 m above sea level). It was found significant difference stadistic between erythrocyte levels of Glutathione peroxidase higher in the native of high altitude (66,86 ± 8,97 U GPx / g Hb) and people living at sea level (37,78 ± 8,87 U GPx / g Hb), (p < 0,001). It was not found significant difference stadistic between the values obtained of Superoxide dismutase at high altitude and sea level: 4140,56 ± 1147,69 U SOD / g Hb vs. 4104,35 ± 1917,9 U SOD / g Hb, respectively. The Catalase enzyme activity was smaller in subjects of high altitude (275,27 ± 44,21 k CAT / g Hb) that in subjects at sea level (414,29 ± 81,07 k CAT / g Hb), this difference was significant (p < 0,001). The levels of Malondialdehyde in the native of high altitude were also smaller (8,60 ± 1,91 nMol MDA / g Hb) that in those obtained at sea level (11,16 ± 1,55 nMol MDA / g Hb), (p < 0,001).

Se determinó los niveles de las enzimas antioxidantes: Glutation Peroxidasa (GPx), Superóxido Dismutasa (SOD) y Catalasa (CAT); y la concentración de Malondialdehído (MDA) como un indicador de la peroxidación lipídica, en eritrocitos de 60 personas aparentemente sanas: 30 residentes de la altura (Cerro de Pasco, 4340 m.s.n.m.) y 30 residentes de nivel del mar (Lima, 150 m.s.n.m.). Se encontró diferencia estadísticamente significativa entre los niveles eritrocitarios de Glutation peroxidasa de los nativos de altura (66,86 ± 8,97 U GPx / g Hb) y los de nivel del mar (37,78 ± 8,87 U GPx / g Hb), (p < 0,001). No se encontró diferencia estadísticamente significativa entre los valores obtenidos para la Superóxido dismutasa de la altura y de nivel del mar: 4140,56 ± 1147,69 U SOD / g Hb vs. 4104,35 ± 1917,9 U SOD / g Hb, respectivamente. La actividad de la enzima Catalasa fue menor en los sujetos de altura (275,27 ± 44,21 k CAT / g Hb) en relación con los de nivel del mar (414,29 ± 81,07 k CAT / g Hb), siendo esta diferencia estadísticamente significativa (p < 0,001). Los niveles de Malondialdehído en los nativos de altura también fueron menores (8,60 ± 1,91 nMol MDA / g Hb) que los obtenidos a nivel del mar (11,16 ± 1,55 nMol MDA / g Hb), (p < 0,001). / It was determined the levels of the antioxidants enzymes: Glutathione Peroxidase (GPx), Superoxide Dismutase (SOD) and Catalase (CAT); and the concentration of Malondialdehyde (MDA) like an indicator of the lipid peroxidation in erythrocytes of 60 seemingly healthy people: 30 residents at the high altitude (Cerro de Pasco, 4340 m above sea level) and 30 residents at sea level (Lima, 150 m above sea level). It was found significant difference stadistic between erythrocyte levels of Glutathione peroxidase higher in the native of high altitude (66,86 ± 8,97 U GPx / g Hb) and people living at sea level (37,78 ± 8,87 U GPx / g Hb), (p < 0,001). It was not found significant difference stadistic between the values obtained of Superoxide dismutase at high altitude and sea level: 4140,56 ± 1147,69 U SOD / g Hb vs. 4104,35 ± 1917,9 U SOD / g Hb, respectively. The Catalase enzyme activity was smaller in subjects of high altitude (275,27 ± 44,21 k CAT / g Hb) that in subjects at sea level (414,29 ± 81,07 k CAT / g Hb), this difference was significant (p < 0,001). The levels of Malondialdehyde in the native of high altitude were also smaller (8,60 ± 1,91 nMol MDA / g Hb) that in those obtained at sea level (11,16 ± 1,55 nMol MDA / g Hb), (p < 0,001). / Tesis

ATP-difosfohidrolases, comumente denominadas de apirases, descritas pela primeira vez à cerca de quarenta anos atrás, são enzimas que hidrolisam nucleosídeos di ou trifosfatados por um mecanismo que parece ser sequencial, mas sem a formação de um intermediário energético, e de funções metabólicas ainda desconhecidas. Elas tem sido encontradas nas células dos mais diversos pró- e eucariotos investigados e também em tumores. A vasta abundância dessas enzimas e a sua alta atividade enzimática sugerem que as mesmas estariam envolvidas em importantes funções do metabolismo celular. No presente trabalho, identificamos e caracterizamos a presença de uma nova enzima em Trypanosoma cruzi, o agente causador da doença de Chagas, uma apirase, com características semelliantes à outras apirases já descritas em diversos organismos. Diversos ensaios enzimáticos foram feitos mostrando uma atividade enzimática que não foi anulada pelos inibidores clássicos de ATPases tipo-P, tipo-F ou tipo-V. Esta enzima mostrou depende~n·cla para Mg2+, na~o acontecendo o mesmo para Ca2+. Experimentos usando soros imunes contra apirases de outras fontes, reveleram não apenas reação cruzada, mas também sugeriram que a massa molecular dessa enzima no T cruzi, estaria em tomo de 57,5 kDa. Ensaios citoquímicos (imunoflorescência) com o soro imune anti- NTPase de Toxoxplasma gondii, apresentou fluorescência contra diferentes estágios desse protozoa. No entanto, a localização subcelular dessa enzima no T cruzi não ficou muito clara, tomando-se necessário uma microscopia eletrônica para resolver esse problema. Um dado interessante e particular nesse traballio, foi a presença dessa enzima nos diversos estágios do ciclo de vida do parasita, com atividades enzimáticas diferentes para esses mesmos estágios. / ATP-diphosphohydrolases which are generally called apyrases were described for the first time some forty years ago. These are enzymes which hydrolyze di- and triphosphate nucleosides through a mechanism which seems to be sequential, without forming a high-energy enzyme intermediate. Their metabolic function is yet unknown. ATP-diphosphohydrolases have been found in a number of pro- and eucariotic cells and also in tumor cells. The vast abundance ofthese enzymes and their high enzymatic activity suggest that they are involved in important functions in the cell metabolism. In the present work we have identified and characterized the presence of a new enzyme in Trypanosoma cruzi, the agent of Chagas disease, namely an apyrase with characteristics which are similar to other apyrases already described in different organisms. A number of enzymatic assays showed that the enzyme is not inhibited by the classical inhibitors of P-type, F-type or V-type ATPases. The enzyme exhibited a marked dependence on Mg2+ and not on Ca2+. Experiments using immune sera against apyrases of other sources showed cross- reactivity and suggested that the molecular mass of the enzyme in cruzi is around 57.5 kDa. Immunofluorescence cytochemistry using antiToxoplasma gondii NTPase antibodies showed that fluorescence was present in different stages of the protozoa. However, the exact sub-cellular localization of the enzyme in T cruzi was not clear and electron microscopy will be necessary to answer this question. An interesting result of our work is the identification of the enzyme in different stages of the life cycle of the parasite, with different enzymatic activities among the stages.

ATP-difosfohidrolases, comumente denominadas de apirases, descritas pela primeira vez à cerca de quarenta anos atrás, são enzimas que hidrolisam nucleosídeos di ou trifosfatados por um mecanismo que parece ser sequencial, mas sem a formação de um intermediário energético, e de funções metabólicas ainda desconhecidas. Elas tem sido encontradas nas células dos mais diversos pró- e eucariotos investigados e também em tumores. A vasta abundância dessas enzimas e a sua alta atividade enzimática sugerem que as mesmas estariam envolvidas em importantes funções do metabolismo celular. No presente trabalho, identificamos e caracterizamos a presença de uma nova enzima em Trypanosoma cruzi, o agente causador da doença de Chagas, uma apirase, com características semelliantes à outras apirases já descritas em diversos organismos. Diversos ensaios enzimáticos foram feitos mostrando uma atividade enzimática que não foi anulada pelos inibidores clássicos de ATPases tipo-P, tipo-F ou tipo-V. Esta enzima mostrou depende~n·cla para Mg2+, na~o acontecendo o mesmo para Ca2+. Experimentos usando soros imunes contra apirases de outras fontes, reveleram não apenas reação cruzada, mas também sugeriram que a massa molecular dessa enzima no T cruzi, estaria em tomo de 57,5 kDa. Ensaios citoquímicos (imunoflorescência) com o soro imune anti- NTPase de Toxoxplasma gondii, apresentou fluorescência contra diferentes estágios desse protozoa. No entanto, a localização subcelular dessa enzima no T cruzi não ficou muito clara, tomando-se necessário uma microscopia eletrônica para resolver esse problema. Um dado interessante e particular nesse traballio, foi a presença dessa enzima nos diversos estágios do ciclo de vida do parasita, com atividades enzimáticas diferentes para esses mesmos estágios. / ATP-diphosphohydrolases which are generally called apyrases were described for the first time some forty years ago. These are enzymes which hydrolyze di- and triphosphate nucleosides through a mechanism which seems to be sequential, without forming a high-energy enzyme intermediate. Their metabolic function is yet unknown. ATP-diphosphohydrolases have been found in a number of pro- and eucariotic cells and also in tumor cells. The vast abundance ofthese enzymes and their high enzymatic activity suggest that they are involved in important functions in the cell metabolism. In the present work we have identified and characterized the presence of a new enzyme in Trypanosoma cruzi, the agent of Chagas disease, namely an apyrase with characteristics which are similar to other apyrases already described in different organisms. A number of enzymatic assays showed that the enzyme is not inhibited by the classical inhibitors of P-type, F-type or V-type ATPases. The enzyme exhibited a marked dependence on Mg2+ and not on Ca2+. Experiments using immune sera against apyrases of other sources showed cross- reactivity and suggested that the molecular mass of the enzyme in cruzi is around 57.5 kDa. Immunofluorescence cytochemistry using antiToxoplasma gondii NTPase antibodies showed that fluorescence was present in different stages of the protozoa. However, the exact sub-cellular localization of the enzyme in T cruzi was not clear and electron microscopy will be necessary to answer this question. An interesting result of our work is the identification of the enzyme in different stages of the life cycle of the parasite, with different enzymatic activities among the stages.

A alga marinha Gracilaria tenuistipitata var. liui Zhang et Xia (Gracilariales, Rhodophyta) tem grande importância econômica por ser a principal fonte para a produção de ficocolóides. Esta linhagem tem sido extensivamente cultivada em tanques ou diretamente no mar na China e Taiwan por exibir grande tolerância a variação de fatores ambientais. A maior fonte de nitrogênio no oceano está na forma de nitrato que é o principal fator limitante no crescimento das macroalgas. A assimilação de nitrogênio é um processo que ocorre em duas etapas catalisadas sequencialmente pelas enzimas nitrato redutase (NR) e nitrito redutase (NiR), respectivamente. A NR catalisa a redução de nitrato a nitrito usando NAD(P)H como fonte doadora de elétrons. O nitrito é reduzido a amônio (pela NiR) e é imediatamente assimilado em compostos orgânicos nitrogenados, como aminoácidos e bases nitrogenadas. A NR é considerada o primeiro passo regulador no processo de assimilação de nitrato. Neste trabalho descrevemos a oscilação circadiana da atividade da NR bem como do seu conteúdo protéico em G. tenuistipitata. A atividade da NR e os níveis da proteína NR apresentam um pico no meio do dia em algas mantidas sob regime de claro:escuro (12:12h). A atividade de NR é 30 vezes maior durante o período de claro em algas crescendo sob condições de luz:escuro, e o nível protéico de NR é cerca de 40 vezes maior em extratos do período de claro. A oscilação observada está sob controle do relógio biológico uma vez que a flutuação da atividade da NR persiste após 10 dias sob condições de claro constante. Nenhuma oscilação na atividade de NR foi encontrada quando a alga foi mantida sob escuro constante, demonstrando que a luz é um fator de grande importância no controle desta enzima. Experimentos de absorção de nitrato do meio realizados em culturas de algas crescendo sob condições de claro:escuro mostrou que a absorção de nitrato ocorre preferencialmente no período noturno, ocorrendo o pico máximo de absorção no meio da noite. Daí concluirmos que os processos de assimilação de nitrato e tomada do mesmo do meio estejam ocorrendo de maneira independente. A NR de G. tenuistipitata pertence a classe das NRs específicas para o NADH, com constante de Michaelis-Menten aparente de 95 &#181;M. O KM aparente para o nitrato foi estimado em 197 &#181;M, valor esse razoável com os descritos para outras algas. A focalização isoelétrica revelou que a NR é uma proteína básica com pI de 8,66. A NR desta espécie foi purificada em 4 etapas: cromatografia de troca iônica, precipitação com sulfato de amônio, filtração em gel e cromatografia de afinidade em resina Affigel-blue. A proteína não desnaturada apresenta massa molecular de aproximadamente 420 kDa, e 4 subunidades idênticas de 110 kDa, baseado em SDS-PAGE. A localização intracelular da NR de G. tenuistipitata foi examinada utilizando técnicas de imunofluorescência e \"immuno-gold\" e revelaram que a NR está associada com os cloroplastos. / The marine red alga Gracilaria tenuistipitata var. liui Zhang et Xia) is economically important, being the main source for the production of phycocolloids. This strain is extensively cultivated in ponds in southern China and Taiwan and exhibits a wide tolerance to environmental factors. The major source of nitrogen in the ocean is in the form of nitrate being the main limiting macroalgal production. The nitrogen assimilation process occurs in a two-step reaction catalyzed by 2 enzymes working sequentially, nitrate reductase (NR) and nitrite reductase (NiR). NR catalyzes the reduction of nitrate to nitrite using NAD(P)H as electron donor. Nitrite is reduced to ammonium (by NiR) and it is immediately assimilated in organic nitrogen compounds, such as amino acids and bases. NR is considered the first and regulatory step in this assimilating process. We report the circadian oscillation of NR activity as well as NR protein content in G. tenuistipitata. Both NR activity and NR protein levels peaks at midday in algae maintained under light:dark cycle (12:12h). Toe NR activity is 30 fold higher in light period for alga growing under light-dark conditions, and the NR protein level is about 40 fold higher in extracts from the light period. The oscillation observed is under biological clock control since the fluctuation of NR activity persists after 10 days under constant light conditions. No oscillation in the NR activity is found when the algae were maintained under constant dark condition. The experiments on nitrate uptake carried out in algae growing under light:dark conditions had shown that the absorption peaks at the middle of the dark periods. So we can conclude that the process of nitrate assimilation and nitrate uptake is occurring in such an independent ways. NR from G. tenuistipitata is a NADH specific enzyme with Michaelis-Menten apparent constant of 95 &#181;M. Toe apparent KM for nitrate was estimated to be 197 &#181;M, which is reasonable with the values described to another algae. The isoeletric focusing revealed NR is a basic protein with pi of 8.66. The NR from was purified in four steps: ion exchange chromatography, ammonium sulfate precipitation, gel filtration chromatography, and Affigel-blue affinity column. Non-denaturated protein shows a molecular mass of about 420 kDa, and 4 identical subunits of 110 kDa, based on SDS-PAGE. Toe intracellular localization of NR in G. tenuistipitata was examined by applying both immunofluorescence and immunogold methods revealing NR associated with chloroplasts.

Nas células do ceco anterior de A.flavolineata, a secreção de enzimas digestivas parece ser mediada por vesículas de secreção e é influenciada pelo tempo decorrido após a refeição. Fracionamentos subcelulares das células do ceco anterior realizados 3h após a refeição indicaram que a amilase, maltase, pN&#934;&#946;glu hidrolase e aminopeptidase estão enriquecidas nas frações que contém os grânulos de secreção. &#947; glutamil transferase, aminopeptidase e dipeptidase apresentaram uma forma solúvel e outra ligada a membrana. No conteúdo do intestino de A. flavolineata foi possível detectar a presença de 3 &#946;-glucosidases: 1, uma celobiase-aril &#946;-glucosidase termoestável; 2, uma aril &#946;-glucosidase termoinstável ativa sobre pN&#934;&#946;glu; 3, uma alquil &#946;-glucosidase. A celobiase-aril &#946;-glucosidase hidrolisa celobiose e aril &#946;-glucosídeos em sítios diferentes e é mais ativa sobre celobiose e laminaribiose que sobre aril &#946;-glucosídeos sintéticos ou naturais. Moléculas anfipáticas ativam a alquil &#946;-glucosidase, tornando esta enzima efetivamente ativa apenas na digestão de membranas. Esta enzima hidrolisa alquil &#946;-glucosídeos com 6 a 11 carbonos no radical alquil. A celobiase-aril P-glucosidase e a alquil &#946;-glucosidase são provavelmente responsáveis pela digestão \"in vivo\" de &#946;-1,4; &#946;-1,3; &#946;-1,3-1,4 glucanas e glucosilceramidas, respectivamente. / The secretion of digestive enzymes in the anterior caecal cells of A. flavolineata seems to be mediated by secretory vesicles and influenced by the period of time after a meal. Subcellular fractions of anterior caecal cells were obtained by differential centrifugation of homogenates prepared 3 hours after a meal. Amylase, maltase, pN&#934;&#946;glu hidrolase and aminopeptidase are found with high activities in fractions that correspond to the contents of secretory vesicles. &#947; glutamil transferase, aminopeptidase and dipeptidase presented soluble and membrane-bound forms. In A. flavolineata midgut contents we found 3 &#946;-glucosidases: 1, a heat-stable cellobiase-aryl &#946;-glucosidase; 2, a heat-unstable activity against pN&#934; &#946; glu (aryl &#946;-glucosidase); 3, a alkyl &#946;-glucosidase. The cellobiase-aryl &#946;-glucosidase hydrolyzes cellobiose and aryl &#946;-glucosides at different active sites and is more active on cellobiose and laminaribiose than on aryl &#946;-glucosides. Amphipatic molecules activate the alkyl &#946;-glucosidase, making the enzyme very active only during membrane digestion. This enzyme hydrolyzes alkyl &#946;-glucosides with 6 to 11 carbons in alkyl moiety. The cellobiase-aryl &#946;-glucosidase and alkyl &#946;-glucosidase are probably responsible for in vivo digestion of &#946;-1,4; &#946;-1,3; &#946;-1,3-1,4 glucans and glucosylceramides, respectively.