Orientador: Roberto da Silva / Banca: Mirna Lucia Gigante / Banca: Elza Iouko Ida / Banca: Hamilton Cabral / Banca: Arni Raghuvir Krishnaswamy / Resumo: Proteases coagulantes microbianas catalisam a coagulação do leite, podendo substituir o coalho de bezerro. O objetivo deste trabalho foi estudar a protease do extrato enzimático do fungo Thermomucor indicae-seudaticae N31, obtido por fermentação em estado sólido (FES), e avaliar sua aplicação na fabricação de queijo maturado. Para avaliar a biomassa do fungo T. indicae-seudaticae N31 na FES foi utilizado o ergosterol como biomarcador. A biomassa, variou de 21,92 a 48,63 mg/g meio sólido na fermentação com farelo de trigo e de 30,18 a 81,67 mg/g meio sólido na fermentação com farelo de trigo e caseína. A condição de FES que resultou num extrato enzimático com alta atividade coagulante (AC) e baixa atividade proteolítica (AP) foi em 24 horas utilizando farelo de trigo como substrato. A AC deste extrato foi máxima em pH 5,7 e a 70°C; permaneceu estável na faixa de pH de 3,5 a 4,5 e foi termoestável até 45°C por 1 hora. A AP foi máxima em pH 5,5 e a 65°C, manteve aproximadamente 70% de estabilidade na faixa de pH de 5,0 a 7,0 e foi termoestável até 45°C por 1 hora. Dentre os inibidores de protease, o composto que mais afetou as atividades foi Pepstatin A. O extrato enzimático bruto foi concentrado por precipitação com álcool e foi cromatografado em resinas de filtração em gel (Sephadex G75) e troca iônica (Q Sepharose). AC e AP foram purificadas 43 e 16 vezes e exibiram recuperação de 1,3 e 0,5% das atividades iniciais, respectivamente. A AC da enzima purificada foi máxima em pH 5,3 e a 75°C, permaneceu estável na faixa de pH de 3,5 a 4,5 e foi termoestável até 60°C por 1 hora. Os íons cobre e níquel causaram maior perda de AC com 40 e 65% de inibição, respectivamente. As atividades foram novamente mais afetadas pela Pepstatin A. A AP da enzima purificada foi máxima... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Microbial coagulant proteases catalyze milk clotting, and so they can substitute rennet. The aim of this work was to study the proteolytic activity of the enzymatic extract from the fungus Thermomucor indicae-seudaticae N31, obtained through solid state fermentation (SSF), and evaluate its application in the production of ripened cheese. To evaluate microbial biomass in SSF ergosterol was used as a biomarker. Biomass of the fungus T. indicaeseudaticae N31, varied between 21.92 to 48.63 mg/g solid medium in fermentation with wheat bran and between 30.18 to 81.67 mg/g solid medium in fermentation with wheat bran and casein. The condition for FES that resulted in an enzymatic extract with high milkclotting activity (MCA) and low proteolytic activity (PA) was in 24 hours using wheat bran as substrate. MCA in this extract was maximum at pH 5.7, at 70°C, remained stable in pH range of 3.5 to 4.5, was thermostable up to 45°C for 1 hour. PA was maximum at pH 5.5 and at 65°C, kept approximately 70% of stability in the pH range of 5.0 to 7.0 and was thermostable up to 45°C for 1 hour. Among the protease inhibitors tested, the one that most affected the activities was Pepstatin A. The crude enzymatic extract was purified through precipitation with alcohol followed by gel filtration (Sephadex G75) and ion exchange (Q Sepharose) cromatographies. MCA and PA were purified 43 and 16-fold and exhibited 1.3 and 0.5% recovery of initial activities, respectively. MCA of the purified enzyme was maximum at pH 5.3 and at 75°C, remained stable in pH range of 3.5 to 4.5 and revealed high thermostability up to 60°C for 1 hour. Ions copper and nickel caused most loss of MCA with 40 and 65% of inhibition, respectively. The activities were again most affected by Pepstatin A. PA of purified enzyme was maximum at pH 5.5 and at 65°C... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Resumo: Clicar acesso eletrônico abaixo / Abstract: Click electronic access below / Orientador: João Cláudio Thoméo / Coorientador: Eleni Gomes / Banca: Teresa Cristina Zangiorolami / Banca: Beatriz Vahan Kilikian / Banca: Roberta da Silva / Banca: Vanildo Luiz Del Bianchi / Doutor

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:28Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-02-23Bitstream added on 2014-06-13T18:50:37Z : No. of bitstreams: 1 merheb_cw_me_sjrp.pdf: 779308 bytes, checksum: 56b2af8c47fcea8212c7f1e3701d897d (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Proteases constituem um dos grupos mais importantes de enzimas industriais, sendo o setor alimentício um dos que mais as utilizam, pois atuam sobre proteínas. Este trabalho teve como objetivo produzir, purificar e caracterizar a protease do fungo termofílico Thermoascus aurantiacus. A produção foi em fermentação em estado sólido e o extrato enzimático bruto foi caracterizado. A atividade de protease, no extrato enzimático bruto, foi inibida por ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) (60,61%) e por fluoreto fenimetilsulfonil (PMSF) (56,37%) e foi levemente estimulada por Ca2+. Seu padrão de ação hidrolítico sobre a caseína foi estudado por UREA-PAGE, mostrando diferença significativa em relação a uma renina microbiana recombinante. O extrato enzimático bruto foi purificado através de precipitação com álcool a 72% seguido de cromatografias em resinas Sephadex G75 e Sephacryl S100. Apresentou rendimento de 0,4% e um fator de purificação de 80 vezes. A massa molecular de 24,5 KDa foi estimada por SDS-PAGE. A protease pura apresentou inibição somente por EDTA (96,70%) e ativação por sulfato ferroso, revelando-se uma metaloprotease ativada por ferro. O pH ótimo foi 5,5; a temperatura ótima foi 75°C e foi termoestável a 65°C por 1 hora retendo mais de 70% de atividade original. Apresentou aumento de 151,0% de atividade na presença de Tween-20 e, através dos estudos de cinética enzimática, hidrolisou melhor a caseína do que a azocaseína. / Proteases are a very important group of industrial enzymes, and are most employed in the food segment due to their action on proteins. This work had the aim to produce, purify and characterize the protease from the thermophilic Thermoascus aurantiacus. The production was carried out in solid state fermentation and the crude enzymatic extract was characterized. The proteolytic activity, in the crude extract, was inhibited by ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) (60.61%) and by phenylmethylsulphonyl fluoride (PMSF) (56.37%) and was slightly stimulated by Ca2+. Its hydrolytic action profile on casein was studied by UREA-PAGE, showing significant difference when compared to a recombinant microbial rennet. The crude enzymatic extract was purified through precipitation with ethanol at 72% followed by cromatographies in columns of Sephadex G75 and Sephacryl S100. It was purified 80-fold and exhibited recovery of total activity of 0.4%. SDS-PAGE analysis indicated an estimated molecular mass of 24.5 KDa. The purified protease was only inhibited by EDTA (96.70%) and stimulated by Fe2+ revealing to be a metalloprotease activated by iron. The optimum pH was 5.5, optimum temperature was 75°C and it was thermostable at 65°C for 1 hour maintaining more then 70% of original activity. It showed increase of 151.0% in activity in the presence of Tween-20 and, through enzyme kinetics studies, better hydrolyzed casein than azocasein.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:55Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-03-04Bitstream added on 2014-06-13T20:04:38Z : No. of bitstreams: 1 carvalho_afa_dr_rcla.pdf: 997227 bytes, checksum: 92775cbd61cca9ee00b5f1a54feef2bf (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / As α-glicosidases (EC 3.2.1.20) são exoamilases que atuam nas ligações glicosídicas α-1,4 da extremidade nãoredutora, preferencialmente em pequenos oligossacarídeos para liberar α-glicose. Os objetivos desse trabalho foram purificar a α-glicosidase produzida, em fermentação submersa, pelo fungo Thermoascus aurantiacus CBMAI 756; caracterizar a enzima purificada; avaliar a ação sobre os derivados de amido e substratos sintéticos e construir um biblioteca de cDNA de Thermoascus aurantiacus para isolar o gene codificando para esta característica. As estratégias adotadas para isolar a α-glicosidase foram: a) concentração do extrato enzimático bruto usando uma membrana de ultrafiltração, b) por precipitação com sulfatodeamônio, c) cromatografias detroca aniônica (Q-Sepharose)e a filtração em gel(Sephacryl S-200 e Superose 12). Após o último passo, filtração em gel na coluna Superose 12, obteve-se uma atividade específica final de 404 (U/mg proteína) e um fator de purificação de 173 vezes. A eletroforese em SDS-PAGE usando amostra semi-desnaturada possibilitou aobservação de uma única banda protéica, a qual correspondeu à banda observada em gel de atividade e no gel específico para glicoproteína. A aparente massa molecular da enzima em SDS-PAGE foi83 kDa. Essa enzima apresentou 42% de carboidrato ligado à estrutura protéica. A atividade máxima foi observada em pH 4,5 e a 70°C. A enzima mostrou-se estável nas faixas de pH 3,0-9,0 e perdeu 40% da atividade original nas temperaturas de 40, 50 e 60°C, incubadas por 1hora. Na presença dos íons Na+, Ba2+, Co2+,Ni2+, Mg2+, Mn2+,Al3+, Zn2+ e Ca2+ a enzima manteve 90-105% da atividade máxima e foi inibida por Cr3+, Ag+ eHg2+. Baseados no cálculo do IC50, a hidrólise da maltose foi mais sensível a castanospermina (0,015 mM) do que a acarbose (0,11 mM) e voglibose (0,06 mM). OKm foi 0,07 μM e o Vmax... / α-Glucosidase (EC 3.2.1.20) are exoamylase that act on α-1,4 bonds from nonreducing end, preferentially short oligosaccharides to release α-glucose. The objective of this work was to purify the -glucosidase produced in submerged fermentation, with the fungus Thermoascus aurantiacus CBMAI 756, characterize the purified enzyme and to evaluate its action on starch derivatives and synthetic substrates, and construction of cDNA library of Thermoascus aurantiacus. The strategies adopted to isolate the -glucosidase were: a) concentration of crude enzyme using a membrane ultra filtration b) by ammonium sulphate precipitation, c) anion exchange chromatography (Q-Sepharose) and gel filtration (Sephacryl S-200 and Superose). After the last step, gel filtration on Superose 12 column, it was obtained a final specific activity of 404 (U/mg protein) and 173-fold enzyme purification. The electrophoresis in SDS-PAGE using semi-denatured sample allowed the observation of a single protein band, which corresponded to the bands obtained in gel of -glucosidase activity and in a specific gel for glycoprotein. The apparent molecular mass of the enzyme in SDSPAGE was 83 kDa. This enzyme exhibited a carbohydrate content of 42%. Maximum activity was observed at pH 4.5 and at 70°C. It was stable in the pH range 3.0-9.0 and the enzyme lost 40% of its initial activity at 40, 50 and 60 °C, incubated for 1 h. In the presence of ions Na+, Ba2+, Co2+, Ni2+, Mg2+, Mn2+, Al3+, Zn2+, Ca2+ the enzyme maintained 90-105% of its maximum activity and was inhibited by Cr3+, Ag+ and Hg2+. Based on IC50 values, hydrolysis of maltose was more sensitive to castanospermine (0.015 mM) than acarbose (0.11 mM) and voglibose (0.06 mM). The Km was 0.07 μM, and the Vmax was 318.0 μmol/min/mg. The - glucosidase showed a transglycosylation property, by the release of oligosaccharides after 3h of incubation with maltose... (Complete abstract click electronic access below)

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:55Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-07-12Bitstream added on 2014-06-13T21:05:13Z : No. of bitstreams: 1 blanco_kc_dr_rcla_parcial.pdf: 165788 bytes, checksum: 441eba3e7f81a4045fd71fd169810c38 (MD5) Bitstreams deleted on 2015-06-03T11:42:26Z: blanco_kc_dr_rcla_parcial.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2015-06-03T11:43:59Z : No. of bitstreams: 1 000722980_20150710.pdf: 153337 bytes, checksum: ef6f673ca2880afc3824d702fd97308c (MD5) Bitstreams deleted on 2015-08-03T12:21:09Z: 000722980_20150710.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2015-08-03T12:22:22Z : No. of bitstreams: 1 000722980.pdf: 702124 bytes, checksum: 076acfb344282eec1bfa2c15d2efa0a1 (MD5) / As ciclodextrinas (CDs) resultam da degradação do amido por ciclodextrina glicosiltransferase (CGTases) produzidas principalmente pelo gênero Bacillus. As CDs são oligossacarídeos cíclicos capazes de formar complexos de inclusão com uma grande variedade de moléculas modificando suas características indesejadas sendo assim muito utilizadas em vários setores industriais. A linhagem bacteriana Gram-positiva e formadora de esporos nomeada como CGII foi isolada de águas residuárias de uma fábrica de farinha de mandioca em Ribeirão Bonito, São Paulo, Brasil e submetidos a estudos filogenéticos e testes bioquímicos. O planejamento composto central foi então utilizado para optimizar a composição do meio e as condições de cultivo para a produção da enzima ciclodextrina glicosiltransferase (CGTase) em frascos agitados e em biorreatores. As características físico-químicas e bioquímicas da CGTase como pH e temperatura óptima; estabilidade em temperatura e pH; a influência de substâncias; cinética enzimática e produção de ciclodextrina foram avaliadas após purificação em cromatografia de afinidade usando a β-CD como ligante. Neste trabalho também foram investigadas novas aplicações da ciclodextrina produzida pela CGTase de B. lehensis: A síntese de fases sólidas de nanopartículas de óxido de ferro magnético (Fe4O3), óxido de cobre (CuO) e prata metálica (Ago) a partir de CDs por síntese hidrotérmica, usando CDs. As nanopartículas foram caracterizadas por difração de raios-x, espectroscopia de infravermelho e microscopia eletrônica de varredura. A enzima CGTase também foi imobilizada por ligação covalente no suporte magnetita síntetizada anteriormente, a qual foi silinalizado com 3-aminopropiltrimetilsilano e ativada com glutaraldeido. A sequência do gene 16S rRNA apresentou maior grau de similaridade com... / Cyclodextrins (CDs) are obtained from starch degradation by enzyme cyclodextrin glycosyltransferase (CGTases) produced mainly by Bacillus genus. The CDs are cyclic oligosaccharides capable of forming inclusion complexes with a wide variety of molecules, modifying their unwanted characteristics and, therefore are widely used in various industrial sectors. The bacterial strain Gram-positive and spore-forming named CGII was isolated from wastewater from a cassava mill in São Paulo, Brazil and subjected to phylogenetic studies and biochemical tests. A central composite design was then used to optimize the medium composition and culture conditions for the production of the enzyme cyclodextrin glycosyltransferase (CGTase) in bioreactors. The physicochemical and biochemical proprieties of CGTase as pH and temperature optimum, stability to pH and temperature, the influence of substances, enzyme kinetics and production of cyclodextrin were evaluated after purification by affinity chromatography using β-CD as a ligand. In this work new applications of cyclodextrin produced by CGTase from B. lehensis were also investigated. The solid phase synthesis of nanoparticles magnetic iron oxide (Fe4O3), copper oxide (CuO) and metallic silver (Ag) by hydrothermal synthesis using CDs were characterized by x-ray, infrared, and scanning electron microscopy. The enzyme CGTase was also immobilized on the support by covalent bond to the synthesized magnetite, which has been silylazed with 3- aminopropil-trimetilsilano and activated with glutaraldehyde. The 16S rRNA gene sequence indicated the highest degree of similarity to strains of Bacillus genomic MLB2 lehensis (100%). The response surface methodology showed that the model for the optimization of CGTase of B. lehensis reached a good level of agreement with experimental... (Complete abstract click electronic access below)

Publicación a texto completo no autorizada por el autor / Se purifica y caracteriza proteasas extracelulares de una cepa de Pseudomonas sp. aislada de muestras de suelos de los aguajales de Tambopata en Madre de Dios. Las proteasas son purificadas mediante cromatografía de intercambio aniónico en un sistema FPLC, utilizando la columna CaptoTM Q, seguida por precipitación con sulfato de amonio al 70 %. Se purifican tres proteasas extracelulares denominadas EI, EII y EIII; siendo EI la que presenta mayor porcentaje de recuperación y factor de purificación de 80,1 % y 5,7. Los pesos moleculares de EI, EII y EIII son de 35, 40 y 55 kDa respectivamente. Las enzimas EI y EIII son clasificadas como serínmetaloproteasas, en tanto EII como metaloproteasa. El pH óptimo de EI y EII es 8, mientras que de EIII es 11. La temperatura óptima de las tres enzimas fue 60 °C. Las proteasas EI y EII incrementan su actividad en presencia de Mn+2, sin embargo, estas fueron inhibidas por Zn+2. En tanto, la proteasa EIII incrementa su actividad en presencia de Mg+2, Ca+2 y Zn+2. Según las características bioquímicas de las tres proteasas extracelulares purificadas de Pseudomonas sp. se puede indicar que son alcalinas y termoestables, principalmente la enzima EIII, por lo cual presentan gran potencial biotecnológico para su aplicación en diversos bioprocesos. / Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (Perú). Fondo Nacional de Desarrollo Científico y Tecnológico (Fondecyt) / Tesis

FONTENELE, Nila Maria Bezerril. Efeitos do chumbo em cultivares de Vigna unguiculata L. Walp: abordagem bioquímica, fisiológica e molecular. 2015. 145 f. Tese (Doutorado em Bioquímica)-Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2015. / Submitted by Vitor Campos (vitband@gmail.com) on 2016-09-05T22:49:26Z No. of bitstreams: 1 tese 2015_nmbfontenele.pdf: 4606779 bytes, checksum: a19b496a61d578d6b98514df50b5a010 (MD5) / Approved for entry into archive by Jairo Viana (jairo@ufc.br) on 2016-09-06T11:24:01Z (GMT) No. of bitstreams: 1 tese 2015_nmbfontenele.pdf: 4606779 bytes, checksum: a19b496a61d578d6b98514df50b5a010 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-06T11:24:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese 2015_nmbfontenele.pdf: 4606779 bytes, checksum: a19b496a61d578d6b98514df50b5a010 (MD5) Previous issue date: 2015 / Lead (Pb) is one of the most toxic anthropogenic pollutants of widespread occurrence in both terrestrial and aquatic ecosystems. The phytotoxicity of lead is a complex phenomenon that involves changes in development as well as in physiological, biochemical and molecular mechanisms according to different plant survival strategies. It is well known that heavy metals accelerate the production of reactive oxygen species (ROS) which can lead to changes in the concentration of antioxidant enzymes. The aim of this study was to investigate the effect of Pb on growth, physiology, absorption and translocation of Pb, activity and gene expression of antioxidant enzymes in "Sempre Verde" (SV) and "Setentão" (SET), Vigna unguiculata cultivars. The seeds were germinated in vermiculite and, after seven days, the seedlings were transferred to Hoagland solution. After seven days in a hydroponic system the plants were supplemented with EDTA-Pb 0.5 mM. Physiological parameters were measured using an infrared gas analyzer. The Pb content in roots and shoots was measured by ICP OES. The activities of catalase (CAT, EC 1.11.1.6), ascorbate peroxidase (APX, EC 1.11.1.1) and superoxide dismutase (SOD, EC 1.15.1.1) was determined. The expression of the CAT gene (VuCAT 1 and 2), the APX (VuAPX 1 to 6) and SOD (VuSOD Cu / Zn 1 to 3, VuSODMn1, VuSODCu / chap1, VuSODFe 1 to 3) was evaluated by RT- qPCR using specific primers. Total RNA was extracted from the roots and leaves of control plants and treated. The results showed that the leaf areas were reduced by 60 (SV) and 88% (SET). The inhibition of net photosynthesis was 40 (SV) and 72% (SET). The cultivars showed differences in the accumulation and distribution of Pb, as well as in enzyme activity. SV had more Pb in roots than in leaves unlike SET that accumulates more Pb in leaves than in roots. The activity of the antioxidant enzymes CAT, APX and SOD was enhanced in SET, regardless of the tissue. In SV roots, on the other hand, the CAT activity was not modified whereas in SV leaves the SOD activity underwent an inhibition. All the remaining antioxidant activities in SV were stimulated. The CAT 1 and 2 genes were differently expressed in leaves and roots of SV and SET. The relative expression of the APX multigene family in leaves and roots in these cultivars was partially distinct. Likewise genes SOD in leaves showed a partially distinct profile in the two cultivars. Rather, the relative expression of SOD genes in the roots and SV SET is completely different. Taken together, the two Vigna unguiculata cultivars showed a different behavior towards tolerance, accumulation and detoxification of Pb. These results suggest that Pb induces oxidative stress in SV and SET cultivars and that the high activity of antioxidant enzymes could serve as an important component of defense against the damage caused by Pb, and SV more tolerant to stress than SET. / O chumbo (Pb) é um dos poluentes antropogênicos mais tóxicos de ocorrência generalizada em ambos os ecossistemas terrestres e aquáticos. A fitotoxicidade do chumbo é um fenômeno complexo que envolve mudanças no desenvolvimento, bem como nos mecanismos fisiológicos, bioquímicos e moleculares, de acordo com as diferentes estratégias de sobrevivência das plantas. É bem conhecido que os metais pesados aceleram a produção de espécies reativas de oxigénio (EROs) e que podem provocar mudanças na concentração das enzimas antioxidantes. O objetivo desse trabalho foi investigar o efeito do Pb no crescimento, fisiologia, absorção e translocação de Pb, a atividade e expressão gênica das enzimas antioxidantes em "Sempre Verde" (SV) e "Setentão" (SET), cultivares de Vigna unguiculata. As sementes foram germinadas em vermiculita e, após sete dias, as plântulas foram transferidas para solução de Hoagland. Depois de sete dias em um sistema hidropônico as plantas foram suplementadas ou não com EDTA-Pb 0,5 mM. Os parâmetros fisiológicos foram medidos através de um analisador de gás infravermelho. O conteúdo de Pb nas raízes e na parte aérea foi medido por ICP OES. As atividades das enzimas catalase (CAT, EC 1.11.1.6), ascorbato peroxidase (APX, EC 1.11.1.1) e superóxido dismutase (SOD, EC 1.15.1.1) foram determinadas. A expressão dos genes da CAT (VuCAT 1 e 2), da APX (VuAPX 1 a 6) e da SOD (VuSOD Cu/Zn 1 a 3, VuSODMn1, VuSODCu/Chap1, VuSODFe 1 a 3), foi avaliada por RTqPCR utilizando iniciadores específicos. O RNA total foi extraído a partir das raízes e das folhas nas plantas controle e tratadas. Os resultados revelaram que as áreas foliares diminuíram 60 (SV) e 88% (SET). A inibição da fotossíntese líquida foi 40 (SV) e 72% (SET). Os cultivares apresentaram diferenças na acumulação e distribuição de Pb, bem como nas atividades enzimáticas. SV apresentou mais Pb nas raízes do que nas folhas ao contrário de SET que acumula mais Pb nas folhas do que nas raízes. A atividade das enzimas antioxidantes CAT, APX e SOD foram estimuladas no cultivar SET independentemente do tecido. No entanto, a atividade da CAT em raízes do cultivar SV não sofreu modificação e a atividade da SOD em folhas, do mesmo cultivar, foi inibida, sendo as demais atividades em SV estimuladas. O aumento das atividades das enzimas em raízes e folhas de SV e SET estão de acordo com suas expressões gênicas. Os genes CAT 1 e 2 foram diferentemente expressos nas folhas e nas raízes de SV e SET. A expressão relativa da família multigênica da APX em raízes e folhas nesses cultivares foi parcialmente distinta. Da mesma forma os genes da SOD em folhas apresentaram um perfil parcialmente distinto nos dois cultivares. Ao contrário, a expressão relativa dos genes da SOD nas raízes de SV e de SET foi completamente diferente. Analisados em conjunto, os dois cultivares de Vigna unguiculata apresentaram um comportamento diferente em relação a tolerância, acumulação, e desintoxicação do Pb. Estes resultados sugerem que o Pb induz estresse oxidativo nos cultivares SV e SET e que a elevada atividade das enzimas antioxidantes poderia servir como um importante componente de defesa contra os danos provocados pelo Pb, sendo SV mais tolerante a esse estresse do que SET.

Made available in DSpace on 2016-06-21T13:43:17Z (GMT). No. of bitstreams: 2 16.pdf: 1288159 bytes, checksum: 2cc2211b7c112d6211913cb143210291 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2014 / Made available in DSpace on 2016-07-05T22:16:57Z (GMT). No. of bitstreams: 3 16.pdf.txt: 147563 bytes, checksum: bd0b620aa6e12c62ec7b8d6d41de5c7b (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) 16.pdf: 1288159 bytes, checksum: 2cc2211b7c112d6211913cb143210291 (MD5) Previous issue date: 2014 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães. Recife, PE, Brasil / Em Cabo Verde, arquipélago situado na Costa Ocidental Africana, os primeiros casos de dengue ocorreram em 2009, com a notificação de mais de 21.000 casos, a maioria desses registrados na Ilha de Santiago. O mosquito Aedes aegypti foi identificado como vetor, e ações para seu controle, usando os inseticidas temephos (larvicida) e a deltametrina (adulticida), têm sido implementadas. Objetiva-se com esse trabalho avaliar o atual status de suscetibilidade a inseticidas e caracterizar os mecanismos de resistência nessa população. Amostras de A. aegypti da ilha de Santiago foram coletadas através de armadilhas de oviposição, para o estabelecimento de uma população a ser analisada. Foram realizados bioensaios do tipo dose diagnóstica, usando garrafas impregnadas com doses únicas dos adulticidas malathion (organofosforado), deltametrina (piretróide) e cipermetrina (piretróide), e bioensaios do tipo dose resposta, usando múltiplas concentrações dos inseticidas temephos (organofosforado), Bacillus thuringiensis sorovariedade israelensis (bactéria entomopatogênica) e diflubenzuron (inibidor de síntese de quitina). Para a investigação dos mecanismos de resistências, foram realizados testes bioquímicos com substratos específicos para quantificar a atividade das enzimas glutationa S-transferases, esterases (alfa, beta e PNPA) e oxidases de função mista, ligadas a detoxificação de xenobióticos, e a taxa de inibição da acetilcolinesterase ligada a insensibilidade do sítio alvo. Pesquisou-se também a presença de mutaçõeso do tipo kdr (knock-down resistance) associadas à resistência a piretróides, pela análise da sequência dos exons 20 e 21 no gene do canal de sódio. Nos resultados dos bioensaios constatou-se que a população de A. aegypti investigada apresenta resistência aos piretróides deltametrina e cipermetrina (mortalidade 80 por cento) e ao organofosforado temephos (RR90=4), mas é suscetível ao malathion (mortalidade maior ou igual a 98 por cento), Bacillus thuringiensis sorovariedade israelensis (RR90=0.8) e ao diflubenzuron (RR90=2,2). Em relação a atividade das enzimas ligadas ao processo de detoxificação, foram detectadas alterações nas glutationa S-transferases (25 por cento), oxidases de função mista (18 por cento), esterase-alfa (19 por cento) e esterase-beta (17 por cento). A taxa de inibição da acetilcolinesterase (6 por cento) e a atividade da esterase-PNPA (7 por cento) mostraram que estas estão inalteradas. Nenhuma das mutações do tipo kdr pesquisadas foi detectada. Estes resultados permitem concluir que a população de A. aegypti da ilha de Santiago, Cabo Verde, é suscetível aos inseticidas, excetuando os piretróides testados e o temephos, usados no seu controle; e que ela apresenta alterações em enzimas detoxificadoras que poderão estar implicadas na resistência a esses compostos.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:31:39Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-08-26Bitstream added on 2014-06-13T20:02:38Z : No. of bitstreams: 1 umszaguez_ma_dr_sjrp.pdf: 902792 bytes, checksum: b0f717f2c2e97d5d325e55a97eb71c85 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Clicar acesso eletrônico abaixo / Click electronic access below

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:34:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 5327.pdf: 3614226 bytes, checksum: 2b258357050da3177584310ef5f5ac3a (MD5) Previous issue date: 2013-05-03 / Universidade Federal de Sao Carlos / The development of ligand screening assays plays a very important role in the discovery of biologically active compounds. In this context, the use of immobilized capillary reactors has been adopted as a new technique for high throughput screening assays, which furnishes high selectivity, reproducibility. This work describes the covalent immobilization of electric fish (Electrophorus electricus) and human acetylcholinesterases (AChE) on fused silica capillaries and magnetic beads. The selected enzyme acts on the central nervous system and is a validated target for the treatment of Alzheimer s disease as for new insecticides. Zonal chromatography with the acetylcholinesterase capillary bioreactors was employed to determine kinetics constants, to a ligand screening assay of 79 compounds, and to inhibition mechanisms determination of the 05 identified ligands. A new approach to the screening of natural product extracts was developed based on ligand fishing experiments and zonal chromatography. For that, the magnetic beads were used for the ligand fishing experiments and capillary bioreactors for the activity assays. The later was employed also under nonlinear condition to determine the affinity constant of the fished ligand. This work reports also the identification by a solution assay of a new acetylcholinesterase substrate and, the studies by zonal bioaffinity chromatography to identify the bi-substrate mechanism. / O desenvolvimento de ensaios para a triagem de ligantes é de grande importância para a descoberta de compostos biologicamente ativos. Neste contexto, o emprego de biorreatores enzimáticos tem sido adotado em ensaios em massa para triagem de ligantes, uma vez que possuem elevada seletividade com alta reprodutibilidade e produtividade. Este trabalho descreve a imobilização covalente da acetilcolinesterase de peixe-elétrico (Electrophorus electricus) e humana em capilares de sílica fundida e partículas magnéticas. A enzima selecionada justifica-se uma vez que atua no sistema nervoso central e é um alvo validado para o tratamento da doença de Alzheimer e desenvolvimento de inseticidas. Os biorreatores capilares de acetilcolinesterase foram empregados por cromatografia zonal para determinação das constantes cinéticas, e também para a triagem de 79 compostos com determinação do mecanismo de ação dos 05 ligantes identificados. Um novo modelo de triagem de extratos de produtos naturais foi desenvolvido usando os biorreatores de partículas magnéticas para pescar ligantes e os biorreatores capilares para determinar o percentual de atividade. O uso dos biorreatores capilares em cromatografia zonal não-linear permitiu caracterizar a afinidade do ligante selecionado. Este trabalho reporta também, um novo substrato identificado através de ensaios em solução para a acetilcolinesterase e, os estudos por cromatografia zonal de bioafinidade, para o mecanismo bi-substrato.