Made available in DSpace on 2015-05-14T16:52:53Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-04-24Bitstream added on 2015-05-14T16:59:44Z : No. of bitstreams: 1 000828601.pdf: 2257163 bytes, checksum: 0339aef0ed41dca2009f6cdc4a972bc0 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / O interesse por micro-organismos, em especial os fungos derivados de ambientes poucos explorados como a Antártica, tem crescido nas últimas décadas. Os ecossistemas da Antártica por serem caracterizados por extremos de temperatura, salinidade ou valores de pH, inviabilizam o desenvolvimento de muitas formas de vida, sendo os micro-organismos os mais adaptados para se proliferar nos substratos deste continente. Os micro-organismos que se desenvolvem nos ecossistemas Antárticos são capazes de produzir enzimas adaptadas ao frio, as quais possuem potencial aplicação em diversos setores de importância econômica. O presente projeto é parte do Projeto Fapesp 2010/17033-0 intitulado “Exploração biotecnológica de fungos derivados da Antártica” coordenado pela Profa. Dra. Lara Sette e teve como objetivo conhecer a biodiversidade, selecionar fungos filamentosos com potencial ligninocelulolítico e avaliar a produção dessas enzimas a médias e baixas temperaturas. Para tanto, foram utilizados 160 isolados recuperados de amostras marinhas e terrestres do continente Antártico que se encontram mantidos na coleção de pesquisa da DRM (CPQBA/UNICAMP) e na Central de Recursos Microbianos da UNESP (CRM-UNESP). Após a triagem inicial (em meio sólido e em meio líquido) dois fungos ligninolíticos foram selecionados para os experimentos subsequentes, um de origem marinha (P1) e outro de origem terrestre (M7), os quais foram identificados como Cadophora luteo-olivacea e Cadophora malorum, respectivamente. Os ensaios referentes à avaliação de diferentes fatores na produção de ligninases permitiu identificar os efeitos de cada uma das variáveis na atividade enzimática. Entretanto, a otimização da produção de lacase para o fungo C. luteo-olivacea P1 não foi eficiente, tendo em vista a baixa atividade desta enzima nas condições estudadas. Em substratos lignocelulósicos o fungo C. malorum M7 se destacou frente à atividade de... / The interest in microorganisms, especially fungi derived from underexplored environments such as Antarctica has increased in recent decades. Antarctica ecosystems have characteristics of extreme temperature, salinity or pH which prevents the development of many forms of life, being the micro-organisms the best adapted to proliferate in substrates of this continent. Microorganisms that grow in Antarctic ecosystems are able to produce cold adapted enzymes, which have potential application in many sectors of economic importance. This project is associated with the FAPESP Project 2010/17033-0 entitled “Biotechnological Exploitation of fungi derived from Antarctica, coordinated by Prof. Dr. Lara Sette and aims to know the biodiversity, to select filamentous fungi with lignocellulolytic potential and to evaluate the production of these enzymes at low and medium temperatures. For this purpose, we used 160 isolates recovered from marine and terrestrial samples of the Antarctic continent that have been maintained in the research collection of DRM (CPQBA/UNICAMP) and in the Microbial Resource Center of UNESP (CRM-UNESP). After the first screening (on solid medium and in liquid medium), two fungi were selected for subsequent experiments, one from marine sample (P1) and another one from terrestrial sample (M7), which were identified as Cadophora luteo-olivacea and Cadophora malorum, respectively. The assays regarding the evaluation of different factors in the production of ligninases allowed the identification of the effects of each variable on the enzyme activity. However, the optimization of laccase production by Cadophora luteo olivacea P1 was not efficient because the low activity of this enzyme under the conditions studied. In lignocellulosic substrates the fungus C. malorum M7 presents the best xylanase activity when grown on sugarcane bagasse and corn cobs. Among the 160 filamentous fungi studied, 76 were taxonomically characterized...

Made available in DSpace on 2015-09-17T15:24:38Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-12-03. Added 1 bitstream(s) on 2015-09-17T15:47:31Z : No. of bitstreams: 1 000843898.pdf: 1360987 bytes, checksum: eeb1170ea817515b2c839bf006aca6f0 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Este trabalho visou à produção de fitases por fungos termofílicos em cultivo em estado sólido (CES), utilizando resíduos agroindustriais como substratos, e secá-las, juntamente com xilanases, por spray drying. Após a secagem, os pós foram armazenados e a redução da atividade enzimática com o tempo de armazenamento foi avaliada. Para a produção das fitases foram testados 13 fungos pertencentes do Laboratório de Bioquímica dos Processos e Microbiologia Aplicada do IBILCE/UNESP, sendo o termotolerante Lichtheimia ramosa escolhido para seguir com os experimentos. A xilanase foi metabolizada pelo fungo Myceliophtora thermophila I-1D3b. O fungo L. ramosa foi cultivado em bagaço de cana de açúcar, bagaço de laranja e farelo de trigo, enquanto que M. thermophila foi cultivado em bagaço de cana de açúcar e farelo de trigo, ambos a 45 oC. Os ensaios de secagem foram divididos entre discriminação do adjuvante que proporcionasse maior proteção às enzimas, otimização das condições de secagem e armazenamento dos pós secos. Para os ensaios de discriminação de adjuvante, foram escolhidas como variáveis o adjuvante e a temperatura de saída do ar do spray dryer, Os adjuvantes empregados foram farelo de trigo, farelo de milho e farelo de soja, sendo que este último forneceu os melhores resultados. A temperatura não foi um fator significativo na análise de variância. Para os ensaios de otimização das condições de secagem foi empregada a técnica de superfície de resposta, sendo usadas variáveis preditoras a temperatura de saída do ar, a vazão de alimentação de suspensão e a concentração de sólidos. Os resultados indicaram a vazão e concentração de sólidos como variáveis significativas. A suspensão na condição ótima de secagem continha 7,5% e a vazão foi de 3 mL/min, sendo a temperatura escolhida de 83 oC. O ensaio realizado nestas condições proporcionou retenção 83% de atividade de fitase e de 85%... / This work aimed to produce phytases by thermophilic molds in solid state cultivation, using solid agro-industrial by-products as substrates, and dry the enzymes, along with xylanases, by spray-drying. Following the drying, the powders were storage and the reduction of the enzyme activities was evaluated. For the phytase production, 13 fungi were tested, and Lichthemia ramose was chosen. Xylanase was metabolized by Myceliophtora thermophila I-1D3b. All tested microorganisms belonged to the Laboratório de Bioquímica dos Processos e Microbiologia Aplicada. L. ramose was cultivated in sugar cane bagasse, Orange pulp and peel and wheat bran, while M. thermophila was cultivated in sugar cane bagasse and wheat bran, both at 45 oC. Drying experiments were done to discriminate the adjuvant able to provide the best protection to the enzymes. The tested variables were the adjuvants (brans of wheat, corn and soybean) and the air temperature at the spray dryer outlet. The temperature was not a statistically significant factor and soybean bran provided the best protection. Experiments to optimize the drying conditions for soybean bran were carried out following a response surface approach, having the outlet air temperature, the suspension flow rate and the total solid concentration as the controlled variables. The results showed that the flow rate and the solid concentration were the significant variables. The estimated optimum condition had 7,5% of solids and the flow rate was 3 mL/min. The experiment carried at this condition, at 83 oC showed 83% of retention for phytase and 85%...

Made available in DSpace on 2015-09-17T15:24:57Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015. Added 1 bitstream(s) on 2015-09-17T15:46:55Z : No. of bitstreams: 1 000844224_20160601.pdf: 362616 bytes, checksum: a0311183aabff0045355f750351c75a5 (MD5) Bitstreams deleted on 2016-06-02T14:22:30Z: 000844224_20160601.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2016-06-02T14:23:10Z : No. of bitstreams: 1 000844224.pdf: 4065201 bytes, checksum: e54a6ae6edaf5bf99bd00ffc782a6ac7 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / O objetivo do presente trabalho foi avaliar a cinética de crescimento do fungo termófilo Myceliophthora thermophila M.7.7 em cultivo sólido. A aplicação imediata desta cinética é empregá-la a modelos de previsão de transferência de calor e massa em biorreatores; em horizonte mais amplo, a cinética poderá ser relacionada à secreção de metabólitos pelo microrganismo. O meio de cultivo foi composto por bagaço de cana de açúcar e farelo de trigo (proporção 7:3) e as determinações indiretas das concentrações de biomassa foram realizadas através de metodologias químicas analíticas e de análise de imagens. Os métodos analíticos se basearam nas quantificações de N-acetil-D-glicosamina e atividade de CMCase, α amilases, xilanases, proteases e teor de proteínas solúveis. A análise de imagens foi feita empregando-se o software Lenseye e a partir de fotografias digitalizadas, onde a quantificação do crescimento foi feita através da quantificação da área superficial ocupada pelo micélio fúngico e através de técnicas de Microscopia Ótica (MO) e Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV). A técnica de análise do teor de N-acetil-D-glicosamina mostrou ser um bom indicativo de crescimento microbiano, com bom ajuste ao modelo logístico, resultando em um coeficiente R2 igual a 0,98, tendo permitido estimar os parâmetros cinéticos de crescimento, onde o Xmáx foi de 1,889 mg de glicosamina/g de fermentado. Além disso, foi possível observar com clareza as fases de crescimento acelerado, estacionária e de declínio, apesar de apresentar algumas incertezas na fase lag, provavelmente devido à heterogeneidade do meio de cultivo interferir na análise. A análise da cinética de secreção das enzimas estudadas foi um bom indicador das atividades metabólicas do fungo, mas não de seu crescimento. A determinação do teor de proteínas solúveis através da técnica de Lowry... / This work aimed to evaluate the growth kinetics of the thermophilic fungus Myceliophthora thermophila M.7.7 during solid-state cultivation (SEC). The immediate application of this kinetics is in heat and mass transfer modeling in SEC bioreactors; however, through the kinetics, the metabolic secretion could be understood and forecasted. The cultivation medium was composed by sugar cane bagasse and wheat bran in the proportion 7:3 and the indirect determination of biomass where done using analytical chemical techniques, as well as through image analysis. The analytical methods were based on the quantification of N-acetylglucosamine, extracellular enzyme activities, and soluble proteins. The digital analysis were performed using a specific software, and the growth quantification was correlated to the superficial area occupied by the microorganism and and through Optical Microscopy (LOM) and Scanning Electron Microscopy (SEM).The glucosamine analysis is considered an adequate method to quantify the microbial growth, since it aloud to clearly identify the phases of fast growing, stationary and decreasing, even though the lag phase identification was uncertain due to the interference of the cultivation medium on the analytical method. The analysis of CMCase, amylases, xylanases and proteases were good indicators of the fungal metabolic activities, but not of the fungal growth. The determination of the content of soluble proteins by Lowry technique presented uncertainties and do not represent faithfully all the microorganism development phases. The growth analysis by SEM possible to describe the morphological characteristics of the fungus, as the presence of conidia and hyphae propagation on fibrils branched from sugar cane bagasse. The digital image processing was well correlated to the analytical methods, but was also discarded as an adequate growth indicator. Nevertheless, this technique is promising ...

Made available in DSpace on 2015-09-17T15:25:34Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-03-06. Added 1 bitstream(s) on 2015-09-17T15:48:36Z : No. of bitstreams: 1 000844646.pdf: 1641467 bytes, checksum: f99255de843f4bbb0ac75bab37944e11 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / As pectinases são um grupo de enzimas capazes de degradar polissacarídeos pécticos (pectinas). Estas enzimas são utilizadas na indústria de produção de sucos de frutas, vinhos, têxtil, papel, chá, óleos e etc. O presente trabalho teve por objetivo produzir, purificar e caracterizar a pectinase exo-poligacturonase (exo-PG - EC 3.2.1.67) do fun-go termofílico Rhizomucor pusillus. A enzima foi produzida por cultivo submerso e puri-ficada por salting-out e cromatografia. Este método se revelou como o mais adequado empregando 95 % de sulfato de amônio, sendo que com esta técnica foi possível obter a enzima quase livre de contaminantes e com um rendimento de aproximadamente 74 %. Um passo subsequente de cromatografia de interação hidrofóbica é capaz de re-mover os contaminantes remanescentes. A enzima pura possui massa molecular ao redor de 43,5-47 kDa, pH ótimo de 4,0, temperatura ótima de 61 °C, é estável a uma faixa de pH que varia de 3,5 a 6,5, possui estabilidade térmica de 30 até 60 °C e é ati-vada na presença de Ca+2. O ponto isoelétrico da exo-PG é 6,2 e estudos termodinâ-micos mostraram se tratar de uma enzima termofílica, destacando seu tempo de meia-vida t1/2 de 2.310 min., a 50 °C. O perfil da hidrólise foi analisado por eletroforese capi-lar e os estudos indicam que a enzima em estudo apresenta um padrão de hidrólise sequencial (exo). A identificação dos aminoácidos por espectrometria de massa do tipo MALDI-TOF e a comparação com bancos de dados revelou a maior identidade dos fragmentos sequenciados da exo-PG de R. pusillus com a enzima correspondente de Aspergillus fumigatus. Os testes de aplicação das enzimas do extrato bruto mostraram um aumento da extração de suco e um auxílio no processo de hidrólise, sendo que este não foi observado com a enzima pura / Pectinases are a group of enzymes capable of degrading pectic polysaccharides (pec-tin). These enzymes are used in the industry for production of fruit juices, wines, tex-tiles, paper, tea, oils, etc. This study aimed to produce, purify and characterize an exo-poligacturonase (exo-PG - EC 3.2.1.67) from the thermophilic fungus Rhizomucor pu-sillus. The enzyme was produced by submerged cultivation and purified by chromatog-raphy and salting out. This has proved to be the most appropriate using 95 % ammoni-um sulfate, and with this technique it was possible to obtain the enzyme almost free of contaminants and with a yield of approximately 74 %. A subsequent step of hydropho-bic interaction chromatography is able to remove the remaining contaminants. The pure enzyme has molecular mass around 43.5-47 kDa, optimum pH of 4.0, optimum tem-perature of 61 °C, is stable at a pH range between 3.5 and 6.5, presents thermal stability from 30 to 60 °C and is activated in the presence Ca2+. The isoelectric point of the exo-PG is 6.2 and thermodynamic studies have shown that it is a thermophilic enzyme, highlighting its half-life t1/2 of 2,310 minutes at 50 °C. The profile of hydrolysis was ana-lyzed by capillary electrophoresis and studies indicate that the enzyme in this study has a pattern of sequential hydrolysis (exo). The identification of amino acids by mass spec-trometry MALDI-TOF and a comparison with data banks showed the highest identity of the sequenced fragments of exo-PG from R. pusillus with the corresponding enzyme from Aspergillus fumigatus. The application tests of the enzymes of the crude extract showed increased extra juice extraction and a higher yield in the hydrolysis process, but this was not observed with the pure enzyme

Orientador: João Cláudio Thoméo / Coorientador: Eleni Gomes / Banca: Gustavo Orlando Bonilla Rodriguez / Banca: Michel Brienzo / Resumo: O objetivo do presente trabalho foi avaliar a cinética de crescimento do fungo termófilo Myceliophthora thermophila M.7.7 em cultivo sólido. A aplicação imediata desta cinética é empregá-la a modelos de previsão de transferência de calor e massa em biorreatores; em horizonte mais amplo, a cinética poderá ser relacionada à secreção de metabólitos pelo microrganismo. O meio de cultivo foi composto por bagaço de cana de açúcar e farelo de trigo (proporção 7:3) e as determinações indiretas das concentrações de biomassa foram realizadas através de metodologias químicas analíticas e de análise de imagens. Os métodos analíticos se basearam nas quantificações de N-acetil-D-glicosamina e atividade de CMCase, α amilases, xilanases, proteases e teor de proteínas solúveis. A análise de imagens foi feita empregando-se o software Lenseye e a partir de fotografias digitalizadas, onde a quantificação do crescimento foi feita através da quantificação da área superficial ocupada pelo micélio fúngico e através de técnicas de Microscopia Ótica (MO) e Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV). A técnica de análise do teor de N-acetil-D-glicosamina mostrou ser um bom indicativo de crescimento microbiano, com bom ajuste ao modelo logístico, resultando em um coeficiente R2 igual a 0,98, tendo permitido estimar os parâmetros cinéticos de crescimento, onde o Xmáx foi de 1,889 mg de glicosamina/g de fermentado. Além disso, foi possível observar com clareza as fases de crescimento acelerado, estacionária e de declínio, apesar de apresentar algumas incertezas na fase lag, provavelmente devido à heterogeneidade do meio de cultivo interferir na análise. A análise da cinética de secreção das enzimas estudadas foi um bom indicador das atividades metabólicas do fungo, mas não de seu crescimento. A determinação do teor de proteínas solúveis através da técnica de Lowry... / Abstract: This work aimed to evaluate the growth kinetics of the thermophilic fungus Myceliophthora thermophila M.7.7 during solid-state cultivation (SEC). The immediate application of this kinetics is in heat and mass transfer modeling in SEC bioreactors; however, through the kinetics, the metabolic secretion could be understood and forecasted. The cultivation medium was composed by sugar cane bagasse and wheat bran in the proportion 7:3 and the indirect determination of biomass where done using analytical chemical techniques, as well as through image analysis. The analytical methods were based on the quantification of N-acetylglucosamine, extracellular enzyme activities, and soluble proteins. The digital analysis were performed using a specific software, and the growth quantification was correlated to the superficial area occupied by the microorganism and and through Optical Microscopy (LOM) and Scanning Electron Microscopy (SEM).The glucosamine analysis is considered an adequate method to quantify the microbial growth, since it aloud to clearly identify the phases of fast growing, stationary and decreasing, even though the lag phase identification was uncertain due to the interference of the cultivation medium on the analytical method. The analysis of CMCase, amylases, xylanases and proteases were good indicators of the fungal metabolic activities, but not of the fungal growth. The determination of the content of soluble proteins by Lowry technique presented uncertainties and do not represent faithfully all the microorganism development phases. The growth analysis by SEM possible to describe the morphological characteristics of the fungus, as the presence of conidia and hyphae propagation on fibrils branched from sugar cane bagasse. The digital image processing was well correlated to the analytical methods, but was also discarded as an adequate growth indicator. Nevertheless, this technique is promising ... / Mestre

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:21Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-03-05Bitstream added on 2014-06-13T19:35:19Z : No. of bitstreams: 1 pirota_rdpb_me_sjrp.pdf: 578843 bytes, checksum: cdb9880602dbf9a622dd6735c9072440 (MD5) / Muitos fungos decompositores de materiais lignocelulósicos vêm sendo utilizados como produtores de enzimas em processos fermentativos nos quais são utilizados substratos de baixo valor comercial, como os resíduos agrícolas e agroindustriais. No entanto, apenas uma pequena parte destes resíduos são utilizados na alimentação de animais de produção. O presente trabalho visou: 1) a obtenção de preparado enzimático termoestável, com alta atividade de xilanase, pectinase e celulases, a partir do cultivo de fungos filamentosos termofílicos por fermentação em estado sólido; 2) uso de suplemento mineral comercial como meio de cultivo para os fungos na fermentação sólida; 3) avaliar a estabilidade das enzimas frente às características do rúmen; 4) hidrólise enzimática. Os fungos Thermomyces lanuginosus, Thermomucor indicae-seudaticae e Rhizomucor pussilus escolhidos para essa finalidade, foram cultivadas a 45°C por 360 horas em fermentação em estado sólido (FES), utilizando-se como substratos, suplemento comercial (B) (Bellpeso SV* - composto de sais minerais, farelo de algodão e polpa cítrica e para efeitos de comparação farelo de algodão e polpa cítrica (35% e 65%) (A). A amostra foi retirada em 24h e todas as outras de 48h em 48h. A produção máxima de pectinase produzida pelo fungo T. indicae-seudaticae foi obtida em 168h (421,31U/g) no substrato A, e a máxima atividade de xilanase produzida pelo T. lanuginosus TO-03 e ROB foram de 644,30Ug e 865,15 U/g em 168h, respectivemente. A amilase foi produzida por todos os fungos, porém CMCase e Avicelase tiveram uma baixa produção e ligninases não foram detectadas. A temperatura e pH ótimo de pectinase produzida pelo fungo T. indicae-seudaticae foi de 55ºC e pH 4,5 e para xilanase produzida pelas duas linhagens de T. lanuginosus, em ambos os substratos foram 70ºC e pH ótimo 6,5, com exceção... / Many rot fungi of lignocellulosics material are being utilized as producers of enzymes in fermentation processes, in which, substrates of very little commercial value such as agricultural and agroindustrial residues are used. However, only a small portion of these residues are utilized in the production of animal feed. The present project proposes: 1) the attainment of prepared enzymatic thermostable, with high activity of xylanase, pectinase and cellulases, from the cultivation of filamentous thermophylic fungi from solid state fermentation; 2) the use of commercial mineral supplementation as medium of cultivation for the fungi in solid fermentation; 3) to evaluate the enzymes stability when facing the characteristics of the rumen; 4) enzymatic hydrolysis. Thermomyces lanuginosus, Thermomucor indicae-seudaticae and Rhizomucor pusillus fungi chosen for this purpose, were cultivated at 45°C, for 360 hours in solid state fermentation (SSF), utilizing as substrates, commercial supplement (Bellpeso SV* - composed of mineral salt, cotton meal and citrus pulp) (B) and for comparison purpose cotton meal and citrus pulp at 35% and 65% (A). The first sample was taken in 24hrs and all the others every 48hrs. The maximum production of pectinase produced by the fungus T. indicae-seudaticae was obtained in 168hrs (421.31U/g) in the commercial substrate A, and to maximum activity of xylanase produced by the T. lanuginosus TO-03 and ROB was of 644.30 U/g and 865.15 U/g in 168hrs, respectively. Amylase was produced by all of the fungi, however CMCase and Avycelase had a low production and ligninases was not detected. The optimun temperature and pH of pectinase produced by the fungus T. indicae-seudaticae were of 55ºC and pH 4.5 and for xylanase produced by the two lineages of T. lanuginosus, in both substrates were 70ºC and optimun pH 6.5, with the exception to ROB in the substrate B that presented... (Complete abstract click electronic access below)

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:25Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-06-13Bitstream added on 2014-06-13T19:35:31Z : No. of bitstreams: 1 terrone_cc_me_rcla.pdf: 584857 bytes, checksum: 408998a4825fecaa42568d1c9e8cc2a3 (MD5) / Neste trabalho, uma linhagem de Penicillium chrysogenum foi utilizada para produzir xilanases utilizando um resíduo agroindustrial como substrato. O principal objetivo foi melhorar a produção da xilanase, verificando a influência de diferentes substratos, agitação, pH e temperatura de cultivo. A linhagem foi cultivada em meio líquido de Vogel suplementado com diversos substratos puros como a xilose, glicose, xilano de aveia, Avicel e carboximetilcelulose (CMC), e complexos como farelo de trigo, farelo de aveia, bagaço de cana-de-açúcar, bagaço de cevada, casca de laranja e sabugo de milho. Testes granulométricos com bagaço de cana-de-açúcar e bagaço de cevada foram realizados para avaliar a influência dessa característica sobre a produção de xilanase. A melhor produção foi obtida com bagaço de cana-de-açúcar a 1% (m/v) com granulometria entre 2-1 mm. Nos ensaios cinéticos a melhor produção foi obtida em cultivos estáticos, por 8 dias, sendo produzida quantidade duas vezes maior de enzima do que em cultivos agitados. O melhor pH de cultivo para a produção de xilanases foi de 5,0 e a temperatura de 20 ºC. A enzima foi purificada por uma estratégia de duas etapas, sendo uma cromatografia de troca iônica e outra de filtração em gel, apresentando ao final uma recuperação de 18,8% com um fator de purificação de 24,9. As propriedades da enzima bruta e da purificada foram pH ótimo de 6,0 e 6,5, respectivamente, e a temperatura ótima para ambas de foi a 45 ºC. As meias vidas a 40, 45, 50, 55 e 60 ºC, para a xilanase bruta foram de 37, 28, 16, 2, e 1 minuto e para a xilanase purificada foram de 35, 31, 10, 3 e 2 minutos, respectivamente. A maior estabilidade ao pH da enzima bruta ocorreu em pH 6,0 e também se mostrou estável na região alcalina, entre 8,0 e 10,0; já a enzima purificada apresentou maior estabilidade na... / In this work, a strain of Penicillium chrysogenum has been used to produce xylanases using agroindustrial waste as substrate. The main objective was to improve the production of xylanase, by checking the influence of substrate, agitation, pH and temperature of cultivation. The strain was cultivated in liquid Vogel’s medium supplemented with various substrates as pure xylose, glucose, oat xylan, Avicel and carboxymethylcelullose (CMC), and complexes such as wheat bran, oat bran, sugar cane bagasse, brewers spent grain, orange peel and corncob. Granulometric tests with crushed sugar cane bagasse and brewers spent grain were conducted to evaluate the influence of this characteristic on production of xylanase. The best production was obtained with crushed sugar cane bagasse to 1% (w/v) with particle size between 2-1 mm. In kinetic experiments, the best production was obtained in static cultivation for 8 days, which is produced twice as much enzyme in agitated cultures. The bets pH cultivation for the production of xylanase was pH 5.0 and temperature of 20 °C. The enzyme was purified by a two-step strategy, being a ion exchange chromatography and a gel filtration, presenting the ultimate recovery of 18,8% with a purification factor of 24,9. The properties of the crude enzyme and purified were optimum pH of 6,0 and pH 6.5, respectively, and the temperature was great for both of 45 ºC. The half of 40, 45, 50, 55 and 60 ° C for xylanase crude were 37, 28, 16, 2, 1 minutes and for the xylanase purified were 35, 31, 10, 3 and 2 minutes, respectively. The increased stability at the pH of the crude enzyme was at pH 6,0 and also stable in the alkaline region, between 8.0 and 10.0, whereas the purified enzyme was most stable in the range of 4.5 to 10.0. The xylanase activity present in crude filtrate and purified enzyme, suffered inhibition... (Complete abstract click electronic access below)

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:55:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TeseCMAG.pdf: 44716096 bytes, checksum: e3e312b192d857e9515643f716291ed1 (MD5) Previous issue date: 2004-11-30 / Universidade Federal de Minas Gerais / This work is part of a global project whose aim is the production of a cheese whey proteins hydrolysate with controlled composition. The process is composed by sequential hydrolysis of the whey proteins using trypsin, chymotrypsin and carboxipeptidase A (CPA). The phenylalanine (Phe) and the other aromatic amino acids released after action of CPA may be removed from the product, providing an adequate source of proteins for phenylketonurics patients and a final product with more pleasant flavor. After its separation, a final step of hydrolysis using the non-specific protease AlcalaseÒ produces a mixture of small peptides with better properties than a mixture of free amino acids. However, the use of enzymes in industrial processes requests its immobilization and stabilization. We have studied in this work the first two hydrolysis stages aiming to reach the following general objectives: to prepare derivatives of trypsin (on sepabeads, chitosan and agarose) and chymotrypsin (just on agarose), to study the sequential hydrolysis of the cheese whey proteins with trypsin and chymotrypsin immobilized on glyoxyl-agarose gel and to investigate the kinetic of the hydrolysis of these proteins with immobilized chymotrypsin. Trypsin-sepabeads derivatives were prepared on resins modified with iminodiacetic acid (IDA) or modified with IDA and copper. Yield of immobilization of approximately 100% and complete recovery of the enzyme on supports were obtained. Factors of stabilization in relation to the soluble enzyme from 90 times (Sepabeads- IDA-Cu2+) to 138 times (Sepabeads-IDA), at 55ºC, were reached and the trypsin- (Sepabeads-IDA) derivative showed to be more efficient in the casein hydrolysis than the trypsin-glyoxyl-agarose one. Trypsin-chitosan derivatives were prepared on coagulated matrices in NaOH solution (0.1 or 1N) and activated with glutaraldehyde (pH 7 or 10) or glycydol. Chitosan derivatives whose matrices were activated with glutaraldehyde reached 100% of yield of immobilization, while the ones activated with glycydol reached just 60%. In all the studied cases it was possible to recover completelly the enzyme on supports until the enzymatic load of 20mgEnz./gGel. Derivatives prepared on coagulated matrices in NaOH 0.1 or 1N and activated at pH 7 resulted in 100% of yield of immobilization and complete recovery of the enzyme on gel until the enzymatic load of 40mgEnz./gGel. At 40ºC, the glutaraldehyde-chitosan derivatives were approximately 460 times more stable than the soluble enzyme; at 70ºC, the glyoxyl-chitosan derivative showed to be approximately 13 times more stable than the glutaraldehyde-chitosan derivative. The trypsin-chitosan derivatives presented the highest hydrolysis activity at 50ºC and pH 9 (40ºC and pH 9 for the soluble enzyme). The best trypsin-chitosan derivative (coagulated in NaOH 0.1M and activated at pH 7) showed similar performance to the soluble enzyme in the hydrolysis of the cheese whey proteins (hydrolysis degree (DH) of 12%). Trypsin and chymotrypsin derivatives immobilized on glyoxyl-agarose gel were prepared following a protocol available in the literature (agarose activated with glycydol and oxidized with NaIO4 to obtain 75µmoles of aldehyde/mL of gel, at 25oC and pH 10.05). The factors of stabilization obtained for trypsin (3920 times) and chymotrypsin (14535 times) are according with results already published and were confirmed through acid hydrolysis of the soluble enzymes and stabilized derivatives. These experiments showed that 64.76% and 72.15% of the lysines present in the trypsin and chymotrypsin, respectively, were involved in the enzyme-support attachment. In consequence of this stabilization, the derivatives showed maximum hydrolysis activity of synthetic substrates in temperatures and pH higher than the obtained for the soluble enzymes (trypsin - 85ºC and pH 11; chymotrypsin - 70ºC and pH 10.5). Hydrolysis of the cheese whey proteins assays using trypsin were developed varing the DH from 0 to 12%. After that, the obtained mixtures were hydrolysates with chymotrypsin and carboxipeptidase A, sequentially, using long times and high enzymes concentrations. The results showed that removal of Phe of approximately 100% was obtained in the following conditions: DHtrypsin of 0%, DHchymotrypsin of 12.4% (3.05mgEnz./mL of solution - 10 hours) and 10 hours of reaction with CPA (200UHPHE/ gProtein), producing 15.5% of peptides with molecular mass (MM) lower than 1046Da. The kinetic of the hydrolysis of the whey proteins was studied and the apparent kinetic parameters of the Michaelis-Menten model taking into account competitive inhibition by the substrate ( app max V , app m K and app S K ) were calculated by initial rates method using a derivative with high enzymatic load - 40mgEnz./gGel. In this work, the substrate concentration was defined in terms of peptides bonds that could be cleaved by chymotrypsin. The effectiveness factor found for reactions developed in presence of difusional effects was 0.78. The long-term assays (10 hours) were perfectly fitted by a model where the first five minutes were described by the first order kinetic (V=kN) and times higher than five minutes were represented by a function of P/No (V=f(P/No)). / Obs.:Devido a restrições dos caracteres especias, verifcar resumo em texto completo para download.Este trabalho está inserido em um projeto global que visa a produção de um hidrolisado de proteínas do soro de queijo com composição controlada. O processo prevê ação seqüencial de tripsina, quimotripsina e carboxipeptidase A (CPA), remoção de fenilalanina (Phe) e demais aminoácidos aromáticos liberados após ação da CPA e hidrólise final com AlcalaseÒ, para obtenção de di e tripeptídeos. A mistura de pequenos peptídeos resultante possui propriedades melhores do que as de uma mistura de aminoácidos livres. A remoção da Phe e demais aminoácidos hidrofóbicos desses hidrolisados viabiliza sua utilização por pacientes portadores de fenilcetonúria, além de proporcionar sabor mais agradável ao produto final, pois estes têm sabor amargo. O uso de enzimas em processos industriais requer, contudo, a imobilização e a estabilização destas. Neste trabalho foram enfocadas as duas primeiras etapas de hidrólise visando cumprimento dos seguintes objetivos gerais: preparação de derivados de tripsina (sobre sepabeads, quitosana e agarose) e quimotripsina (apenas sobre agarose), estudo da hidrólise seqüencial das proteínas do soro com tripsina e quimotripsina imobilizadas sobre gel glioxil- agarose e investigação da cinética da hidrólise dessas proteínas com quimotripsina imobilizada sobre agarose. Derivados tripsina-sepabeads foram preparados usando-se resina modificada apenas com ácido iminodiacético (IDA) ou modificada com IDA e posteriormente reagida com cobre. Foram obtidos rendimentos de imobilização de aproximadamente 100% e completa recuperação da enzima nos suportes utilizados, com fatores de estabilização em relação à enzima solúvel variando de 90 (derivados Sepabeads-IDACu2+) a 138 vezes (derivados Sepabeads-IDA), a 55ºC. Estudo do desempenho do derivado tripsina-(Sepabeads-IDA) no fracionamento da caseína mostrou sua maior eficiência frente ao derivado tripsina-glioxil-agarose. Derivados estabilizados tripsina-quitosana foram preparados sobre matrizes coaguladas em solução de NaOH (0,1 ou 1N) e ativadas com glutaraldeído (pH 7 ou 10) ou glicidol. Para todos os derivados tripsina-quitosana ativados com glutaraldeído obteve-se 100% de rendimento de imobilização, enquanto que o alcançado pelo derivado cuja matriz foi ativada com glicidol foi de apenas 60%. Recuperação da enzima nos géis de 100% foi obtida para todos os suportes estudados até carga de 20mgEnz./gGel. Derivados preparados sobre matrizes ativadas a pH 7, independentemente da concentração da solução coagulante (NaOH 0,1 ou 1N), resultaram em 100% de rendimento e total recuperação da enzima no gel até carga enzimática de 40mgEnz./gGel. Fatores de estabilização em torno de 460 vezes foram obtidos para derivados tripsina-quitosana-glutaraldeído em relação à enzima solúvel, a 40ºC. A 70ºC, o derivado tripsina-quitosana-glioxil mostrou-se aproximadamente 13 vezes mais estável que derivados tripsina-quitosana-glutaraldeído. Temperatura de 50ºC e pH 9 foram condições nas quais derivados tripsina-quitosana apresentaram maior atividade de hidrólise (para a enzima solúvel 40ºC e também pH 9). O melhor derivado tripsina-quitosana preparado (coagulação em NaOH 0,1N e ativação a pH 7) mostrou desempenho similar ao da enzima solúvel na hidrólise das proteínas do soro (grau de hidrólise (GH) de 12%). Derivados de tripsina e quimotripsina sobre gel glioxil-agarose foram preparados utilizando-se protocolo disponível na literatura (agarose ativada com glicidol e oxidada com NaIO4 para obtenção de 75mmoles de aldeído/mL de gel, a 25oC e pH 10,05). Os fatores de estabilização aqui obtidos para tripsina (3920 vezes) e quimotripsina (14535 vezes) estão em concordância com resultados já publicados. Estes altos índices de estabilização se devem à formação de ligações multipontuais entre as enzimas e o suporte, o que pôde ser confirmado pelos resultados obtidos através de hidrólises ácidas das enzimas solúveis e derivados estabilizados. Esses experimentos mostraram que 64,76% e 72,15% do total de lisinas presentes na tripsina e na quimotripsina, respectivamente, estavam envolvidas nas multiligações enzima-suporte. Em conseqüência disso, os derivados de tripsina e quimotripsina expressaram máxima atividade de hidrólise dos substratos sintéticos em temperaturas e pHs mais elevados que os observados para as enzimas solúveis (85oC e pH 11 para tripsina e 70oC e pH 10,5 para quimotripsina). Estudo da hidrólise seqüencial das proteínas do soro foi realizado variando-se o grau de hidrólise com tripsina de 0 a 12% e submetendo-se em seguida estes hidrolisados à ação seqüencial de quimotripsina e CPA, empregando-se nessas duas últimas etapas tempo reacional prolongado e alta concentração enzimática. Os resultados obtidos mostraram que conversão em Phe próxima de 100% foi obtida quando as proteínas do soro foram diretamente hidrolisadas pela quimotripsina, atingindo-se grau de hidrólise de 12,4% com esta protease (concentração enzimática de 3,05mgEnz./mL de solução - 10 horas) e utilizando-se 200UH-PHE/gProteína nas 10 horas de reação com CPA, o que conduziu à formação de 15,5% de peptídeos com massa molecular (MM) inferior a 1046Da. O estudo das velocidades iniciais da hidrólise das proteínas do soro catalisada pela quimotripsina (derivado com alta carga enzimática 40mgEnz./gGel) forneceu os parâmetros cinéticos aparentes ap máx V , ap m K e ap S K do modelo de Michaelis-Menten com inibição pelo substrato, representado em termos de ligações peptídicas hidrolisáveis por esta enzima. O fator de efetividade determinado para reações na presença de efeitos difusionais (ensaios realizados com derivado contendo 40mgEnz./gGel) foi de 0,78 e os dados experimentais de bateladas de longa duração (10 horas) foram perfeitamente ajustados por um modelo composto onde os cinco primeiros minutos de reação foram descritos por uma cinética de primeira ordem (equação do tipo kN V = ), uma vez que neste período as proteínas ainda apresentavam elevada massa molecular e o sistema estava possivelmente sendo controlado pela difusão externa, e tempos superiores a 5 minutos por uma função de o N P , ou seja, uma equação do tipo ) N P ( f V o = . Esta última abordagem resultou em excelentes ajustes aos dados experimentais para todo o período reacional ensaiado, o que é bastante relevante dada a complexidade do sistema em questão.

Orientador: Lara Durães Sette / Coorientador: André Rodrigues / Banca: Eleonora Cano Carmona / Banca: Rafaella Costa Bonugli Santos / Resumo: O interesse por micro-organismos, em especial os fungos derivados de ambientes poucos explorados como a Antártica, tem crescido nas últimas décadas. Os ecossistemas da Antártica por serem caracterizados por extremos de temperatura, salinidade ou valores de pH, inviabilizam o desenvolvimento de muitas formas de vida, sendo os micro-organismos os mais adaptados para se proliferar nos substratos deste continente. Os micro-organismos que se desenvolvem nos ecossistemas Antárticos são capazes de produzir enzimas adaptadas ao frio, as quais possuem potencial aplicação em diversos setores de importância econômica. O presente projeto é parte do Projeto Fapesp 2010/17033-0 intitulado "Exploração biotecnológica de fungos derivados da Antártica" coordenado pela Profa. Dra. Lara Sette e teve como objetivo conhecer a biodiversidade, selecionar fungos filamentosos com potencial ligninocelulolítico e avaliar a produção dessas enzimas a médias e baixas temperaturas. Para tanto, foram utilizados 160 isolados recuperados de amostras marinhas e terrestres do continente Antártico que se encontram mantidos na coleção de pesquisa da DRM (CPQBA/UNICAMP) e na Central de Recursos Microbianos da UNESP (CRM-UNESP). Após a triagem inicial (em meio sólido e em meio líquido) dois fungos ligninolíticos foram selecionados para os experimentos subsequentes, um de origem marinha (P1) e outro de origem terrestre (M7), os quais foram identificados como Cadophora luteo-olivacea e Cadophora malorum, respectivamente. Os ensaios referentes à avaliação de diferentes fatores na produção de ligninases permitiu identificar os efeitos de cada uma das variáveis na atividade enzimática. Entretanto, a otimização da produção de lacase para o fungo C. luteo-olivacea P1 não foi eficiente, tendo em vista a baixa atividade desta enzima nas condições estudadas. Em substratos lignocelulósicos o fungo C. malorum M7 se destacou frente à atividade de... / Abstract: The interest in microorganisms, especially fungi derived from underexplored environments such as Antarctica has increased in recent decades. Antarctica ecosystems have characteristics of extreme temperature, salinity or pH which prevents the development of many forms of life, being the micro-organisms the best adapted to proliferate in substrates of this continent. Microorganisms that grow in Antarctic ecosystems are able to produce cold adapted enzymes, which have potential application in many sectors of economic importance. This project is associated with the FAPESP Project 2010/17033-0 entitled "Biotechnological Exploitation of fungi derived from Antarctica", coordinated by Prof. Dr. Lara Sette and aims to know the biodiversity, to select filamentous fungi with lignocellulolytic potential and to evaluate the production of these enzymes at low and medium temperatures. For this purpose, we used 160 isolates recovered from marine and terrestrial samples of the Antarctic continent that have been maintained in the research collection of DRM (CPQBA/UNICAMP) and in the Microbial Resource Center of UNESP (CRM-UNESP). After the first screening (on solid medium and in liquid medium), two fungi were selected for subsequent experiments, one from marine sample (P1) and another one from terrestrial sample (M7), which were identified as Cadophora luteo-olivacea and Cadophora malorum, respectively. The assays regarding the evaluation of different factors in the production of ligninases allowed the identification of the effects of each variable on the enzyme activity. However, the optimization of laccase production by Cadophora luteo olivacea P1 was not efficient because the low activity of this enzyme under the conditions studied. In lignocellulosic substrates the fungus C. malorum M7 presents the best xylanase activity when grown on sugarcane bagasse and corn cobs. Among the 160 filamentous fungi studied, 76 were taxonomically characterized... / Mestre

Orientador: Eleonora Cano Carmona / Banca: Hamilton Cabral / Banca: Márcia Regina Brochetto / Resumo: Neste trabalho, uma linhagem de Penicillium chrysogenum foi utilizada para produzir xilanases utilizando um resíduo agroindustrial como substrato. O principal objetivo foi melhorar a produção da xilanase, verificando a influência de diferentes substratos, agitação, pH e temperatura de cultivo. A linhagem foi cultivada em meio líquido de Vogel suplementado com diversos substratos puros como a xilose, glicose, xilano de aveia, Avicel e carboximetilcelulose (CMC), e complexos como farelo de trigo, farelo de aveia, bagaço de cana-de-açúcar, bagaço de cevada, casca de laranja e sabugo de milho. Testes granulométricos com bagaço de cana-de-açúcar e bagaço de cevada foram realizados para avaliar a influência dessa característica sobre a produção de xilanase. A melhor produção foi obtida com bagaço de cana-de-açúcar a 1% (m/v) com granulometria entre 2-1 mm. Nos ensaios cinéticos a melhor produção foi obtida em cultivos estáticos, por 8 dias, sendo produzida quantidade duas vezes maior de enzima do que em cultivos agitados. O melhor pH de cultivo para a produção de xilanases foi de 5,0 e a temperatura de 20 ºC. A enzima foi purificada por uma estratégia de duas etapas, sendo uma cromatografia de troca iônica e outra de filtração em gel, apresentando ao final uma recuperação de 18,8% com um fator de purificação de 24,9. As propriedades da enzima bruta e da purificada foram pH ótimo de 6,0 e 6,5, respectivamente, e a temperatura ótima para ambas de foi a 45 ºC. As meias vidas a 40, 45, 50, 55 e 60 ºC, para a xilanase bruta foram de 37, 28, 16, 2, e 1 minuto e para a xilanase purificada foram de 35, 31, 10, 3 e 2 minutos, respectivamente. A maior estabilidade ao pH da enzima bruta ocorreu em pH 6,0 e também se mostrou estável na região alcalina, entre 8,0 e 10,0; já a enzima purificada apresentou maior estabilidade na... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: In this work, a strain of Penicillium chrysogenum has been used to produce xylanases using agroindustrial waste as substrate. The main objective was to improve the production of xylanase, by checking the influence of substrate, agitation, pH and temperature of cultivation. The strain was cultivated in liquid Vogel's medium supplemented with various substrates as pure xylose, glucose, oat xylan, Avicel and carboxymethylcelullose (CMC), and complexes such as wheat bran, oat bran, sugar cane bagasse, brewers spent grain, orange peel and corncob. Granulometric tests with crushed sugar cane bagasse and brewers spent grain were conducted to evaluate the influence of this characteristic on production of xylanase. The best production was obtained with crushed sugar cane bagasse to 1% (w/v) with particle size between 2-1 mm. In kinetic experiments, the best production was obtained in static cultivation for 8 days, which is produced twice as much enzyme in agitated cultures. The bets pH cultivation for the production of xylanase was pH 5.0 and temperature of 20 °C. The enzyme was purified by a two-step strategy, being a ion exchange chromatography and a gel filtration, presenting the ultimate recovery of 18,8% with a purification factor of 24,9. The properties of the crude enzyme and purified were optimum pH of 6,0 and pH 6.5, respectively, and the temperature was great for both of 45 ºC. The half of 40, 45, 50, 55 and 60 ° C for xylanase crude were 37, 28, 16, 2, 1 minutes and for the xylanase purified were 35, 31, 10, 3 and 2 minutes, respectively. The increased stability at the pH of the crude enzyme was at pH 6,0 and also stable in the alkaline region, between 8.0 and 10.0, whereas the purified enzyme was most stable in the range of 4.5 to 10.0. The xylanase activity present in crude filtrate and purified enzyme, suffered inhibition... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre