CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Plumeria rubra L. à uma planta laticÃfera pertencente à famÃlia Apocynaceae popularmente conhecida como Jasmim. Por apresentar flores vistosas e perfumadas, essa Ãrvore à comumente vista ornamentando praÃas e jardins residenciais dos grandes centros urbanos. Plantas laticÃferas sÃo assim denominadas por que produzem endogenamente um fluido de aspecto geralmente leitoso - o lÃtex - que à exsudado da planta quando esta sofre algum tipo de ferimento, seja por dano mecÃnico ou por ataque de predadores. O lÃtex à um material vegetal que tem sido alvo de estudos bioquÃmicos e farmacolÃgicos que mostram ser ele uma fonte promissora de compostos com potencial aplicaÃÃo biotecnolÃgica. No presente trabalho o lÃtex de P. rubra foi alvo de investigaÃÃes bioquÃmicas e biolÃgicas com Ãnfase na pesquisa de proteÃnas que pudessem apresentar alguma aÃÃo deletÃria contra insetos pragas agrÃcolas. Procedimentos laboratoriais que empregam centrifugaÃÃes e diÃlises permitiram o fracionamento do lÃtex em trÃs componentes distintos: borracha (BL), proteÃnas (PLPr) e molÃculas de baixa massa molecular (DL). A fraÃÃo PLPr foi alvo de caracterizaÃÃo bioquÃmica e enzimÃtica e foi utilizada em bioensaios com o caruncho do feijÃo-de-corda, Callosobruchus maculatus e com a mosca-das-frutas, Ceratitis capitata. O lÃtex Ãntegro e suas fraÃÃes foram utilizados em ensaios de repelÃncia da ovoposiÃÃo de C. maculatus e Zabrotes subfasciatus. A fraÃÃo BL à o componente majoritÃrio do lÃtex, 70 %, enquanto as fraÃÃes PLPr e DL constituem cerca de 15 % cada uma. O teor de proteÃnas solÃveis na fraÃÃo PLPr foi de 0,33 mg/mL. AnÃlises eletroforÃtica e espectromÃtricas revelaram a presenÃa de proteÃnas com massas moleculares que variaram de 12 a 117 kDa, com um mÃximo de proteÃnas com 26 kDa e pI<6,0. A caracterizaÃÃo enzimÃtica mostrou que as enzimas antioxidantes superÃxido dismutase e peroxidase foram detectadas na fraÃÃo protÃica, assim como, uma atividade quitinÃsica. As proteÃnas do lÃtex foram capazes de degradar azocaseÃna (substrato inespecÃfico) e BANA (substrato especÃfico para proteases cisteÃnicas). As enzimas proteolÃticas detectadas foram principalmente do tipo cisteÃnica, e em menor proporÃÃo, serÃnica. O pH e a temperatura Ãtimos para esta atividade foram 6,0 e 37 ÂC, respectivamente, onde valores de temperatura superiores anulam a atividade. Utilizando experimentos de dieta artificial pÃde-se observar que a fraÃÃo protÃica do lÃtex a 0,4 % foi capaz de diminuir em 50 % a sobrevivÃncia, e a 0,1 %, diminuir 50 % do ganho de massa das larvas de C. maculatus. Quando essas proteÃnas foram desnaturadas por aquecimento o desenvolvimento larval foi igual ao controle, sugerindo que a manutenÃÃo da estrutura protÃica à essencial para o efeito observado. As proteÃnas do lÃtex nÃo foram digeridas pelas proteases endÃgenas do trato digestÃrio das larvas, sugerindo que as mesmas ficariam livres para causar o efeito deletÃrio. Nenhum efeito no desenvolvimento das larvas de C. capitata foi observado quando as proteÃnas foram adicionadas à dieta, mesmo na concentraÃÃo de 4 %. O lÃtex Ãntegro, quando adsorvido em sementes de feijÃo, apresentou atividade inibitÃria do tipo repelente sobre a ovoposiÃÃo de ambos os bruquÃdeos testados, sendo mais evidente em Z. subfasciatus. A aÃÃo repelente observada foi dose e tempo dependente. O lÃtex nÃo foi capaz de afetar a viabilidade dos ovos e nem o desenvolvimento larval. As fraÃÃes PLPr e DL nÃo apresentaram atividade repelente, mostrando que nem proteÃnas nem molÃculas de baixa massa molecular estÃo envolvidas nessa aÃÃo. Os insetos, quando expostos diretamente ao lÃtex por longo perÃodo de tempo nÃo tiveram sua fecundidade nem ovoposiÃÃo afetados, sugerindo que o efeito observado nÃo altera a fisiologia do animal / Plumeria rubra L. is a laticÃfera plant belonging to the family Apocynaceae popularly known as Jasmim. For spicy and fragrant flowers make this tree is commonly seen ornate squares and gardens of residential urban centers. LaticÃfer plants are well known for producing a fluid endogenously generally milky in appearance - latex - that exudates from the plant when it undergoes some type of injury, either by mechanical damage or attack by predators. Latex is a material that has been the subject of biochemical and pharmacological studies show that it is a promising source of compounds with potential biotechnological application. In this study the latex of P. rubra was the subject of biochemical and biological research with emphasis on the search for proteins that could make any deleterious action against agricultural insect pests. Laboratory procedures that employ centrifugation and dialysis allowed the fractionation of latex into three distinct components: rubber (BL), proteins (PLPr) and low molecular weight molecules (DL). The PLPr fraction was subject to biochemical and enzymatic characterization and was used in bioassays with the bean weevil-of-rope, Callosobruchus maculatus and the fruit fly, Ceratitis capitata. The full latex and its fractions were used in testing the repellency of oviposition of C. maculatus and Zabrotes subfasciatus. The BL fraction is the major component of latex, 70 %, while PLPr and DL fractions are about 15 % each one. The content of soluble protein in PLPr fraction was 0.33 mg / mL. Espectrometric and electrophoretic analysis revealed the presence of proteins with molecular weights ranging from 12 to 117 kDa, with a maximum of protein with 26 kDa and pI <6.0. The characterization showed that the enzyme antioxidativas enzymes superoxide dismutase and peroxidase were detected in the protein fraction, as well as activity chitinases. Proteins of latex were able to degrade azocasein (nonspecific substrate) and BANA (specific substrate for cysteine proteases). The proteolytic enzymes were detected mainly of type cysteine and to a lesser extent, serine proteases. The pH and temperature optimum for this activity was 6.0 and 37 ÂC respectively, where higher values of temperature cancel the activity. Through experiments with artificial diet can be observed that the protein fraction of latex in 0.4 % was able to reduce by 50 % the survival and, in 0.1 %, reduce the by 50 % the weight gain of larvae of C. maculatus. When these proteins were denatured by heating the larval development was similar to the control, suggesting that the maintenance of protein structure is essential for the observed effect. Proteins of latex were not digested by endogenous proteases of the digestive tract of larvae, suggesting that they would be free to cause deleterious effects. No effect on the development of the larvae of C. capitata was observed when the proteins were added to the diet, even at a concentration of 4 %. Whole latex when adsorbed in bean seeds, showed repellent activity on oviposition of both bruchid, being more evident in Z. subfasciatus. The repellent activity was observed time and dose dependent. The latex was unable to affect the viability of eggs or larval development. The PLPr and DL fractions showed no repellent activity, showing that neither protein nor molecules with low molecular weight are involved in this action. The insects, when exposed directly to the latex for a long period of time had not affected their fecundity or oviposition.

Orientadores: Gabriela Alves Macedo, Ana Paula Badan Ribeiro / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-25T18:56:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Speranza_Paula_D.pdf: 7220198 bytes, checksum: 8b6f66b900cc6f1b3afb59b799b23584 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: Este trabalho teve como objetivos produzir, caracterizar e avaliar as propriedades antimicrobianas de bases lipídicas interesterificadas produzidas com óleos e gorduras da Amazônia utilizando diferentes lipases. No trabalho foram utilizadas duas misturas de óleo e gordura da Amazônia para a produção das bases lipídicas, sendo a primeira delas composta pelo óleo de buriti e a gordura de murumuru e a segunda composta pelo óleo de patauá e a estearina de palma. As reações de interesterificação foram catalizadas por duas lipases em três sistemas enzimáticos diferentes: lipase comercial Lipozyme TL-IM (Novozymes), lipase do micro-organismo Rhizopus sp. e a mistura de ambas as enzimas (comercial + Rhizopus sp.). Em ambas as misturas, os lipídios produzidos apresentaram diferentes características dependendo da enzima utilizada. Na mistura buriti: murumuru, a lipase de Rhizopus sp., além de ser específica pelas posições sn-1,3 do triacilglicerol, foi específica para o tipo de ácido graxo (insaturado). A lipase comercial foi específica apenas pelo tipo de ácido graxo (insaturado), enquanto que a utilização de ambas as enzimas não apresentou efeito sinérgico nesta mistura, os resultados obtidos foram intermediários aos obtidos com as enzimas individualmente. Na mistura patauá: estearina de palma, a lipase de Rhizopus sp. foi específica para o tipo de ácido graxo (insaturados), enquanto que a lipase comercial não demonstrou específicidade para esta mistura. No sistema catalisado por ambas as enzimas também não foi observado efeito sinérgico; os resultdos obtidos foram similiares aos obtidos com a enzima de Rhizopus sp. Para ambas as misturas, com os três sistemas enzimáticos, houve redução nos triacilglceróis trisaturados e tri-insaturados após as reações, com a formação de bases lipídicas predominantemente mono e di-insaturados. Estes lipídios formados mantiveram a concentração elevada de tocoferóis, carotenos e fenóis, indicando que a reação não influenciou na concentração dos compostos minoritários. Na avaliação antimicrobiana, as misturas antes e após a interesterificação foram emulsificadas, produzindo diferentes respostas. Emulsões produzidas com os lipídios interesterificados apresentaram menor tamanho de partícula e maior potencial antimicrobiano, exibindo efeito bactericida; emulsões produzidas com as misturas não-interesterificadas, apresentaram maior tamanho de partícula e menor potencial antimicrobiano, exibindo efeito bacteriostático. Portanto, as lipases foram capazes de catalisar as reações de interesterificação entre os óleos da Amazônia, indicando o potencial destes catalisadores nestas reações. As frações lipídicas obtidas apresentaram atividade antimicrobiana, o que abre precedentes para que estudos biológicos mais aprofundados sejam realizados / Abstract: This study aimed to produce, characterize and evaluate the antimicrobial properties of interesterified Amazonian oils produced by different lipases. Two blends of Amazonian oils were subjected to enzymatic interesterification: the first one was composed by buriti oil and murumuru fat and the second one was composed by patauá oil and palm stearin. The interesterification reactions were catalyzed by two microbial lipases in three different enzymatic systems: one with a commercial lipase Lipozyme-TL-IM (Novozymes); a second with a lipase from the microorganism Rhizopus sp.; and the third with a mixture of both lipases (commercial and Rhizopus sp.). In both blends, depending on the enzyme used, the lipids produced presented different characteristics. In the buriti: murumuru blend, the lipase from Rhizopus sp. besides being specific for the sn-1,3 positions of triacylglycerol was specific for the type of fatty acids (unsaturated). The commercial lipase was specific only for the type of fatty acids (unsaturated), while the use of both enzymes showed no synergistic effect in this blend; the results were intermediate to those obtained with the individual enzymes. In the patauá: palm stearin blend, the lipase from Rhizopus sp. is specific for the type of fatty acid (unsaturated), while commercial lipase showed no specificity to this blend. In the system with both enzymes no synergistic effect was also observed; the results obtained were similiar to those obtained using only the enzyme from Rhizopus sp. In both blends, with the three enzymatic systems, there was a reduction in the proportions of triacylglycerols of the types trisaturated and tri-unsaturated after the reactions, with the formation of predominantly mono -and di- unsaturated lipids. These lipids produced maintained the high concentration of tocopherols, carotenoids and phenolics, indicating that the reaction did not influence the concentration of minor compounds. In the antimicrobial evaluation, the blends before and after interesterification were emulsified, producing different responses. Emulsions produced with interesterified lipids showed lower droplet size and higher antimicrobial activity (bactericidal effect); emulsions produced with non-interesterified blends showed larger droplet size and lower antimicrobial activity (bacteriostatic effect). Therefore, lipases were able to catalyze the interesterification reactions between Amazonian oils, indicating the potential of these catalysts in these reactions. Lipids obtained showed antimicrobial activity, which encourages more detailed biological studies / Doutorado / Ciência de Alimentos / Doutora em Ciência de Alimentos

Não consta resumo na publicação. / Pectinesterase (E C 3.1.1.11) was extracted from papaya (Carica papaya L.) tissue and purified 4,48 fold by fractionated ammonium sulphate precipitation, dialysis and chromatography on DEAE-celulose and Sephadex G-100. Extraction conditions of enzyme were studied and their properties characterized. The increase on the activity of pectinesterase was practically followed by increase on the content of soluble pectin, during ripening. The molecular weight of the enzyme eluted in one peak of activity was 53.000 daltons. The pectinesterase has its maximum activity at pH 8,0 and at 0,2 M of NaCl. Optimum temperature for the enzyme assay was 60°C. The enzymatic reaction was linear with the time and protein concentration. With citric pectin as substrate, pectinesterase had a Km of 0,012% and was inhibited competitively by polygalacturonic acid with a Ki of 0,007%. Papaya pectinesterase was inhibited by sucrose, glucose and glicerol.

Não consta resumo na publicação. / Pectinesterase (E C 3.1.1.11) was extracted from papaya (Carica papaya L.) tissue and purified 4,48 fold by fractionated ammonium sulphate precipitation, dialysis and chromatography on DEAE-celulose and Sephadex G-100. Extraction conditions of enzyme were studied and their properties characterized. The increase on the activity of pectinesterase was practically followed by increase on the content of soluble pectin, during ripening. The molecular weight of the enzyme eluted in one peak of activity was 53.000 daltons. The pectinesterase has its maximum activity at pH 8,0 and at 0,2 M of NaCl. Optimum temperature for the enzyme assay was 60°C. The enzymatic reaction was linear with the time and protein concentration. With citric pectin as substrate, pectinesterase had a Km of 0,012% and was inhibited competitively by polygalacturonic acid with a Ki of 0,007%. Papaya pectinesterase was inhibited by sucrose, glucose and glicerol.

Realizamos uma caracterização estrutural e eletrônica dos inibidores enzimáticos E-64 e CA030 utilizando técnicas de química quântica. Otimizações de geometria são realizadas em nível ab initio com os métodos Hartree-Fock e Teoria do Funcional da Densidade e estas estruturas são então comparadas com os resultados cristalográficos obtidos do Protein Data Bank. O cálculo do espectro de vibração infravermelho foi realizado para assegurar que as estruturas eram pontos de mínimo. Nós também fizemos a atribuição das freqüências vibracionais aos grupos funcionais das moléculas. A caracterização eletrônica é obtida com o cálculo do espectro de absorção ultravioleta-visível. Efeitos de solvente são contabilizados através da teoria de Campo de Reação Auto-Consistente. Uma análise detalhada das excitações do espectro calculado do E-64 e do CA030 é realizada e nós estudamos particularmente as transições características em torno de 200 nm. Tanto para o E-64 como para o CA030 nós identificamos o cromóforo responsável pela transição característica dos inibidores. Adicionalmente, nós levamos em consideração a influência da interação do CA030 com a catepsina B através do cálculo do espectro ultravioleta-visível do inibidor com o aminoácido cisteína. / We have made a structural and electronic characterization of the enzyme inhibitors E-64 and CA030 using quantum chemistry techniques. Geometry optimizations are performed in the ab initio level with the Hartree-Fock and Density Functional Theory methods and these structures are then compared with crystallographic results obtained from the Protein Data Bank. The infrared vibration spectrum calculation has been carried out to assure that the theoretical structures are true minima. We also have made an assignment of the vibrational frequencies to the functional groups of the molecules. The electronic characterization is performed with the calculation of the ultraviolet-visible absorption spectrum. Solvent effects are taken into account the Self Consistent Reaction Field theory. A detailed analysis of the calculated spectra of E-64 and CA030 excitations is given and we have particularly studied the characteristic transitions around 200 nm. For both the E-64 and the CA030 we have identified the chromophore responsible for the characteristic transition of the inhibitors. In addition, we have considered the influence of the interaction of the CA030 with the enzyme cathepsin B by calculating the ultraviolet-visible spectrum of the inhibitor with the cysteine amino acid.

A tuberculose (TB) é uma das maiores causas de morte por infecção no mundo, sendo que, em 2015, registraram-se 10,4 milhões de novos casos. O agente etiológico da doença, o Mycobacterium tuberculosis (Mtb), apresenta altos níveis de resistência frente aos quimioterápicos disponíveis para o tratamento da TB. Além disso, a terapia atual da doença explora poucos alvos essenciais ao Mtb. Neste sentido, explorar novos alvos, essenciais ao crescimento e sobrevivência da micobactéria é de grande interesse e poderia gerar fármacos mais efetivos, eficazes contra cepas resistentes e a forma latente da TB. Para este fim, o presente trabalho propôs o desenvolvimento de inibidores da enzima fosfopanteteína adenililtransferase (PPAT), a qual possui caráter regulatório na via de biossíntese da Coenzima A (CoA) da micobactéria. Inicialmente, propuseram-se 50 estruturas de potenciais inibidores da PPAT de M. tuberculosis (MtPPAT), baseando-se na estrutura de seu substrato, a fosfopanteteína, e na estrutura do sítio ativo da enzima. Em seguida, propuseram-se outros 28 ligantes. A fim de se prever as potenciais complementaridades entre os 78 inibidores propostos e o sítio ativo da MtPPAT, empregou-se a estratégia de docking. Posteriormente, realizaram-se cálculos semi-empíricos, com os complexos dos ligantes que se mostraram mais interessantes nas simulações de docking, a fim de se obter informações sobre a entalpia de interação dos ligantes com o sítio ativo da MtPPAT. A partir dos resultados obtidos nos estudos computacionais, selecionaram-se os inibidores que se mostraram mais promissores. A síntese destes ligantes e a de seus fragmentos foi realizada. Avaliaram-se a atividade microbiológica in vitro, bem como a citotoxicidade dos ligantes sintetizados. Alguns dos compostos sintetizados apresentaram atividade frente às cepas sensíveis e resistentes do Mtb na casa de micromolar. Todos os compostos ativos não foram considerados citotóxicos. A fim de validar o planejamento e o alvo dos possíveis inibidores, verificando a atividade inibitória desses frente à enzima MtPPAT, realizou-se a produção e purificação da enzima. Por fim, realizaram-se ensaios de inibição enzimática frente à MtPPAT, os quais permitiram a identificação dos primeiros inibidores da enzima já descritos, com atividade na casa de micromolar, validando-se o alvo em questão. / Tuberculosis is one of the major causes of death by infection worldwide. In 2015, 10.4 thousand new cases of the disease were registered. The tuberculosis\' causing agent Mycobacterium tuberculosis presents high levels of resistance for the available chemotherapy. Thereof, exploit new M. tuberculosis targets is of utmost importance to overcome drug resistant tuberculosis. In this sense, the enzyme phosphopantetheine adenylyltransferase (PPAT) generates scientific interest since it displays a regulatory role in the M. tuberculosis coenzyme A (CoA) biosynthesis. Therefore, the purpose of the present study was the development of M. tuberculosis PPAT (MtPPAT) inhibitors. Initially, 50 potentially MtPPAT inhibitors were designed based on MtPPAT\'s substrate and the enzyme\'s active site. After preliminary results, more 28 compounds were designed. Docking simulations were performed with the 78 compounds synthesized, leading to the prediction of the interaction between the proposed inhibitors and MtPPAT active site. Latelly, semi-empirical calculations were performed with the most promising compounds. These calculations were carried out to obtain information about the enthalpy interactions between compounds and MtPPAT active site. Computational studies led to the selection of the most promising inhibitors. Those compounds and some of their fragments were synthesized, purified, and characterized. The synthesized compounds had their in vitro microbiological activity and cytotoxicity evaluated. Some of the synthesized compounds showed activity against the Mtb sensitive and resistant strains in micromolar range. Besides that, the active compounds were not considered cytotoxic. To validate the potential inhibitors\' design and evaluate their capacity to inhibit MtPPAT, the enzyme was produced and purified. MtPPAT inhibitory assays were performed, leading to the first inhibitors of the enzyme, with activity in micromolar range, validating the target.

Realizamos uma caracterização estrutural e eletrônica dos inibidores enzimáticos E-64 e CA030 utilizando técnicas de química quântica. Otimizações de geometria são realizadas em nível ab initio com os métodos Hartree-Fock e Teoria do Funcional da Densidade e estas estruturas são então comparadas com os resultados cristalográficos obtidos do Protein Data Bank. O cálculo do espectro de vibração infravermelho foi realizado para assegurar que as estruturas eram pontos de mínimo. Nós também fizemos a atribuição das freqüências vibracionais aos grupos funcionais das moléculas. A caracterização eletrônica é obtida com o cálculo do espectro de absorção ultravioleta-visível. Efeitos de solvente são contabilizados através da teoria de Campo de Reação Auto-Consistente. Uma análise detalhada das excitações do espectro calculado do E-64 e do CA030 é realizada e nós estudamos particularmente as transições características em torno de 200 nm. Tanto para o E-64 como para o CA030 nós identificamos o cromóforo responsável pela transição característica dos inibidores. Adicionalmente, nós levamos em consideração a influência da interação do CA030 com a catepsina B através do cálculo do espectro ultravioleta-visível do inibidor com o aminoácido cisteína. / We have made a structural and electronic characterization of the enzyme inhibitors E-64 and CA030 using quantum chemistry techniques. Geometry optimizations are performed in the ab initio level with the Hartree-Fock and Density Functional Theory methods and these structures are then compared with crystallographic results obtained from the Protein Data Bank. The infrared vibration spectrum calculation has been carried out to assure that the theoretical structures are true minima. We also have made an assignment of the vibrational frequencies to the functional groups of the molecules. The electronic characterization is performed with the calculation of the ultraviolet-visible absorption spectrum. Solvent effects are taken into account the Self Consistent Reaction Field theory. A detailed analysis of the calculated spectra of E-64 and CA030 excitations is given and we have particularly studied the characteristic transitions around 200 nm. For both the E-64 and the CA030 we have identified the chromophore responsible for the characteristic transition of the inhibitors. In addition, we have considered the influence of the interaction of the CA030 with the enzyme cathepsin B by calculating the ultraviolet-visible spectrum of the inhibitor with the cysteine amino acid.

A tuberculose (TB) é uma das maiores causas de morte por infecção no mundo, sendo que, em 2015, registraram-se 10,4 milhões de novos casos. O agente etiológico da doença, o Mycobacterium tuberculosis (Mtb), apresenta altos níveis de resistência frente aos quimioterápicos disponíveis para o tratamento da TB. Além disso, a terapia atual da doença explora poucos alvos essenciais ao Mtb. Neste sentido, explorar novos alvos, essenciais ao crescimento e sobrevivência da micobactéria é de grande interesse e poderia gerar fármacos mais efetivos, eficazes contra cepas resistentes e a forma latente da TB. Para este fim, o presente trabalho propôs o desenvolvimento de inibidores da enzima fosfopanteteína adenililtransferase (PPAT), a qual possui caráter regulatório na via de biossíntese da Coenzima A (CoA) da micobactéria. Inicialmente, propuseram-se 50 estruturas de potenciais inibidores da PPAT de M. tuberculosis (MtPPAT), baseando-se na estrutura de seu substrato, a fosfopanteteína, e na estrutura do sítio ativo da enzima. Em seguida, propuseram-se outros 28 ligantes. A fim de se prever as potenciais complementaridades entre os 78 inibidores propostos e o sítio ativo da MtPPAT, empregou-se a estratégia de docking. Posteriormente, realizaram-se cálculos semi-empíricos, com os complexos dos ligantes que se mostraram mais interessantes nas simulações de docking, a fim de se obter informações sobre a entalpia de interação dos ligantes com o sítio ativo da MtPPAT. A partir dos resultados obtidos nos estudos computacionais, selecionaram-se os inibidores que se mostraram mais promissores. A síntese destes ligantes e a de seus fragmentos foi realizada. Avaliaram-se a atividade microbiológica in vitro, bem como a citotoxicidade dos ligantes sintetizados. Alguns dos compostos sintetizados apresentaram atividade frente às cepas sensíveis e resistentes do Mtb na casa de micromolar. Todos os compostos ativos não foram considerados citotóxicos. A fim de validar o planejamento e o alvo dos possíveis inibidores, verificando a atividade inibitória desses frente à enzima MtPPAT, realizou-se a produção e purificação da enzima. Por fim, realizaram-se ensaios de inibição enzimática frente à MtPPAT, os quais permitiram a identificação dos primeiros inibidores da enzima já descritos, com atividade na casa de micromolar, validando-se o alvo em questão. / Tuberculosis is one of the major causes of death by infection worldwide. In 2015, 10.4 thousand new cases of the disease were registered. The tuberculosis\' causing agent Mycobacterium tuberculosis presents high levels of resistance for the available chemotherapy. Thereof, exploit new M. tuberculosis targets is of utmost importance to overcome drug resistant tuberculosis. In this sense, the enzyme phosphopantetheine adenylyltransferase (PPAT) generates scientific interest since it displays a regulatory role in the M. tuberculosis coenzyme A (CoA) biosynthesis. Therefore, the purpose of the present study was the development of M. tuberculosis PPAT (MtPPAT) inhibitors. Initially, 50 potentially MtPPAT inhibitors were designed based on MtPPAT\'s substrate and the enzyme\'s active site. After preliminary results, more 28 compounds were designed. Docking simulations were performed with the 78 compounds synthesized, leading to the prediction of the interaction between the proposed inhibitors and MtPPAT active site. Latelly, semi-empirical calculations were performed with the most promising compounds. These calculations were carried out to obtain information about the enthalpy interactions between compounds and MtPPAT active site. Computational studies led to the selection of the most promising inhibitors. Those compounds and some of their fragments were synthesized, purified, and characterized. The synthesized compounds had their in vitro microbiological activity and cytotoxicity evaluated. Some of the synthesized compounds showed activity against the Mtb sensitive and resistant strains in micromolar range. Besides that, the active compounds were not considered cytotoxic. To validate the potential inhibitors\' design and evaluate their capacity to inhibit MtPPAT, the enzyme was produced and purified. MtPPAT inhibitory assays were performed, leading to the first inhibitors of the enzyme, with activity in micromolar range, validating the target.

Submitted by (edna.saturno@ufrpe.br) on 2016-07-27T13:41:38Z No. of bitstreams: 1 Maria Rafaella da Fonseca Pimentel.pdf: 507313 bytes, checksum: 55535a872766309fc506921e00b76d82 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-27T13:41:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Maria Rafaella da Fonseca Pimentel.pdf: 507313 bytes, checksum: 55535a872766309fc506921e00b76d82 (MD5) Previous issue date: 2012-09-04 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Considering the recent commercial interest of exotic fruit and the need to obtain data for consumers and producers, this study aimed to characterize the fruits of achachairu (Garcinia humilis) from commercial plantation located in Bonança, district of Moreno-PE. Ripe fruits were used for physical measurements, proximate composition, fiber, sugars, minerals, ascorbic acid, soluble solids, titratable acidity and pH. Hydroacetonic and hydromethanolic extracts, both at 80%, of the skin, pulp and seed were submitted to quantification of total phenolic compounds and determination of free radical ABTS+● scavenging activity. The enzymatic activity of the different parts of the fruit was also assessed using solvents such as water, phosphate buffer and sodium chloride. With respect to physical characteristics, the pulp yield of achachairu was 31.8%. Regarding to the proximate composition, the seed stood out with higher content of ash, protein, lipid and carbohydrates; the pulp with the values of total sugars and non-reducing sugars, while the skin with the reducing sugars and potassium content. There were statistical differences between the analyzed parts of the fruit for pH, titrable acidity, soluble solids and ascorbic acid. The total phenolic content of skin in methanol statistically differed from the others, and showed the highest level of this phytochemical (EAG 4,137.03 mg 100g-1). Among the solvents, the phenols extraction of the skin was more efficient with methanol, on the pulp, was acetone, whereas on the seed, both solvent exhibited statistically similar (p>0.05) extraction capacity. The antioxidant activity of skin in acetone against the radical ABTS●+ was higher than the other solvents extractors and parts of the fruit, and the pulp in methanol was the less effective combination. For the enzymatic activity, the values obtained showed wide variation between enzymes, extraction solutions and parts of the fruit. Thus, the consumption of achachairu can contribute with nutrients to the human diet, and its skin and seed can be an alternative to obtain natural antioxidant. / Diante do recente interesse comercial das frutíferas exóticas e da necessidade de obtenção de dados para os consumidores e produtores, este estudo objetivou caracterizar os frutos de achachairu (Garcinia humilis) provenientes de plantio comercial localizado em Bonança, distrito de Moreno-PE. Frutos maduros foram utilizados para determinações físicas, composição centesimal, fibras, açúcares, minerais, ácido ascórbico, sólidos solúveis, acidez titulável e pH. Extratos hidroacetônicos e hidrometanólicos, ambos a 80%, da casca, polpa e semente foram submetidos à quantificação de compostos fenólicos totais e determinação da capacidade de sequestro do radical livre ABTS●+. A atividade enzimática das diferentes partes do fruto também foi avaliada utilizando como solventes a água, tampão fosfato e cloreto de sódio. Com relação às características físicas, o achachairu apresentou rendimento em polpa de 31,8%. Quanto à composição química, a semente apresentou destaque nos teores de cinzas, proteínas, lipídeos e carboidratos; a polpa nos valores de açúcares totais e não redutores, enquanto a casca, no conteúdo de açúcares redutores e potássio. Houve diferença estatística entre as partes do fruto analisadas quanto aos valores de pH, acidez total, sólidos solúveis, e ácido ascórbico. O teor de fenólicos totais da casca em metanol diferiu estatisticamente dos demais, tendo apresentado o maior teor deste fitoquímico (4.137,03mg de EAG 100g-1). Dentre os solventes, a extração dos fenólicos presentes na casca foi mais eficiente com o uso do metanol e, os presentes na polpa, como uso da acetona; enquanto que na semente, ambos os solventes apresentaram capacidade de extração estatisticamente igual (p>0,05). A ação antioxidante da casca em acetona frente ao radical ABTS●+ foi superior aos demais solventes extratores e as partes do fruto, sendo a polpa em metanol a combinação menos efetiva. Quanto à atividade enzimática, os valores obtidos demonstraram grande variação entre as enzimas, soluções extratoras e as partes do fruto. Desta forma, o consumo do achachairu pode contribuir com nutrientes necessários à dieta humana e, sua casca e semente, podem ser uma alternativa para obtenção de antioxidante natural.

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