Orientador: Carmen Silvia Bertuzzo / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-11T03:13:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Rossanese_LillianBarbosadeQueiroz_M.pdf: 1133308 bytes, checksum: 4ba5139d2469cc3760a205f431d4a222 (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: O Câncer colorretal (CCR) refere-se a uma neoplasia que atinge o cólon e o reto, apesar das diferenças epidemiológicas e biológicas entre o câncer do cólon e reto, as duas condições são combinadas, pois não se faz uma separação clara dos dois locais anatômicos; assim, o câncer do colón e/ou do reto é classificado como câncer colorretal. Dados epidemiológicos atestam a importância de fatores ambientais na patologia do CCR Esporádico. Os polimorfismos de P450 e a suscetibilidade ao câncer podem estar associados ainda, pelo fato dessas isoenzimas participarem também de transformação de compostos endógenos relevantes durante o processo de diferenciação da célula transformada, até o estágio maligno. O objetivo deste trabalho foi avaliar a prevalência dos polimorfismos m1 e m2 no gene CYP1A1, 2C9*2 e 2C9*3 no gene CYP2C9 e o 1B1*3 no CYP1B1 e correlacionar a presença desses polimorfismos com o hábito tabagista e o estadiamento clínico da doença. A análise dos polimorfismos foi realizada por meio da Reação em Cadeia da Polimerase associada a digestões enzimáticas específicas. Foram avaliados 102 pacientes com CCR esporádico e 230 portadores de sangue sem história familial de CCR. Nossos resultados indicaram que indivíduos sem os alelos M1 e M2 do gene CYP1A1 teriam um efeito protetor com relação ao CCR, enquanto que os indivíduos portadores de um alelo M1 ou M2 e os homozigotos M2 teriam um aumento de risco que seriam respectivamente de 6, quase 3 (2,89) e quase 4 vezes (3.70). Com relação ao gene CYP2C9, o genótipo N/N (sem as mutações *2 e *3) teria um efeito protetor, enquanto que o heterozigoto *3 traria um risco 6 vezes maior (5.90) e o homozigoto *3 , três vezes. A presença dos alelos M1 e M2 parecem estar relacionados a um pior prognóstico da doença, enquanto que *3 do CYP2C9 traria um melhor prognóstico. Maiores estudos são necessários para confirmar esses achados. No caso do polimorfismo 1B1*3 do gene CYP1B1, parece não haver relação com o fenótipo CCR / Abstract: The colorectal cancer (CRC) characterizes a neoplasia which reaches the colon and the rectum tissues. It is classified as so, despites the biological and epidemiological differences between the colon and rectum cancer, because there is not a clear anatomical separation of these areas. The importance of external factors in the pathology of the sporadical CRC has been certified by epidemiological data. Thus, P450 polymorphisms might be associated to cancer due to the fact that these proteins play a role in transforming endogenous compounds during the process of differentiation of transformed cells, until its malignant stage. The objective of this work was to evaluate the prevalence of the polymorphisms M1 and M2 in CYP1A1 gene, 2C9*2 and 2C9*3 in CYP2C9 gene and 1B1*3 in CYP1B1 gene. Also, the correlation among the presence of these polymorphisms, the tobaccoism and the clinical stagnancy of the illness was performed. Polymerase chain reactions (PCRs) followed by specific enzymatic digestions were performed in order to analyze the polymorphisms. We evaluated 102 patients with sporadical CRC and 230 control individuals without familial history of CRC. Our results indicated that individuals that did not carry M1 and M2 variants of CYP1A1 gene presented a protective effect against CRC, while individuals who presented M1 or M2 variants had a 6 and almost 3 (2.89) times increasing of the risk, respectively, while patients with both M2 alleles had an almost 4 times (3.70) increasing risk. Analysis of CYP2C9 gene showed that genotype N/N (without * 2 and * 3 mutations) presented a protective effect, while individuals heterozygotes for * 3 mutation had an increase close to 6 times (5.90) of their risk. Homozygotes for the same mutation would present a 3 times increased risk. M1 and M2 alleles presence seems to be related to a worse prognostic of the illness, while the presence of * 3 mutation in CYP2C9 gene would result in a better prognostic. Other studies are necessary to confirm these findings. Polymorphism 1B1*3 of CYP1B1 gene does not seem to be related to CRC phenotype / Mestrado / Mestre em Farmacologia

Orientador: Elias Basile Tambourgi / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Química / Made available in DSpace on 2018-08-18T11:14:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Marques_PetrusPires_M.pdf: 1926670 bytes, checksum: c90fed5582358b0c850c13626f16e393 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: A lipase é uma enzima de alto interesse comercial, com aplicabilidades diversas na indústria, desde aditivo de detergentes até ferramenta de síntese da indústria farmacêutica. O uso da enzima é limitado, no entanto, pelo alto custo de obtenção em nível de pureza adequado, de acordo com a finalidade. O objetivo desse trabalho foi imobilizar a lipase diretamente de seu extrato bruto, excluindo no processo outras proteínas, promovendo uma imobilização seletiva, atuando como extração, ou purificação de baixa resolução. A enzima foi produzida utilizando uma cepa de Burkholderia cepacia com óleo de oliva como indutor. O fermentado produzido pela bactéria foi caracterizado quanto à sua atividade lipolítica utilizando o p-npp como substrato. O extrato apresentou temperatura ótima de 50°C e pH ótimo 9,0. A enzima foi avaliada ainda quanto à sua afinidade pelo substrato utilizado, revelando um Km=18,4 mM, com uma velocidade máxima de atividade de 5,56 mM.min-1. Através dos dados da cinética foi possível calcular a energia de ativação da enzima em 38 kJ.mol-1.K-1. O extrato enzimático foi utilizado em procedimento de imobilização utilizando alginato de sódio em solução. As já documentadas interações entre o alginato e lipases permitiram realizar um processo de imobilização seletiva por precipitação com cloreto de cálcio. Foram estudadas, com o auxílio de planejamento estatístico de experimentos, as seguintes variáveis atuantes no processo: pH e concentração da solução de alginato, concentração da solução de cloreto de cálcio, tamanho das esferas produzidas e relação volume alginato/volume solução enzimática. As melhores condições encontradas para o processo foram concentração de alginato de 2%, pH da solução 3,68 e concentração de cloreto de cálcio 200mM, com uma relação de 40% de volume alginato/60% solução enzimática, produzindo esferas de 2 mm de diâmetro. Com essas condições obteve-se uma taxa de imobilização de 168,07%, que representa uma concentração da proteína alvo em 1,68 vezes, e recuperação superior a 99% em um procedimento de etapa única / Abstract: Lipase is an enzyme of high commercial value, with several applications in industry, from detergent additive to pharmaceutical synthesis tool. Nevertheless, the lipase use is limited by the high cost of its production in the necessary purity grade according to its use. The objective of this work was to entrap lipase directly from its crude extract excluding contaminant proteins in the process, promoting a selective entrapment, acting as a pre-purification or extraction. The enzyme was produced using a strain of Burkholderia cepacia and olive oil as inducer. The crude extract was characterized according to its lipolytic activity using p-npp as substrate. The crude extract presented optimal temperature of 50 °C and optimal pH of 9.0. Lipase was also evaluated according to its affinity for the substrate, revealing a Km of 18.4 mM and maximum velocity of 5.56 mM.min-1. From the data obtained it was also possible to calculate the activation energy of the enzyme: 38 kJ.mol-1.K-1. This crude extract was used in the immobilization procedure using sodium alginate solution. The already published data about the affinity of lipases and alginate allowed a performance of a selective entrapment by precipitation with calcium chloride. Using statistical design of experiments the following variables were studied in the process: concentration and pH of alginate solution, concentration of calcium chloride solution, diameter of the produced beads and relation alginate volume/enzyme solution volume. The best conditions found were: alginate concentration 2% at pH 3.68, 200 mM calcium chloride concentration and a relation 40% alginate solution volume/60% enzyme solution, producing 2 mm diameter beads. In these conditions, it was possible to obtain a immobilization yield of 168.07%, which represents a concentration of 1.68 times of the target protein and an enzyme recovery superior to 99% in a single step procedure / Mestrado / Sistemas de Processos Quimicos e Informatica / Mestre em Engenharia Química

O crescimento cada vez maior da industrialização e a existência de um mercado globalizado vêm exigindo dos produtores rurais à utilização de modernas tecnologias ligadas à produção animal. O baixo custo de produção e o aumento da qualidade do produto final gerado têm sido a grande meta dos pecuaristas e centros de pesquisa voltados à agropecuária. Devido à necessidade de aumento na produção, propriedades agropecuárias têm recorrido ao uso de todo e qualquer recurso disponível que possa promover melhorias na atividade produtiva.O uso indiscriminado dos antimicrobianos com a intenção de aumentar a produção animal pode resultar em concentrações residuais nos produtos como carne, ovos e leite acima das doses aceitáveis para o consumo humano. Inicialmente, os antibióticos eram usados como medida terapêutica, mas com o avanço do conhecimento e desenvolvimento de novos compostos, passaram a ser utilizados também como medida preventiva e como promotores do crescimento.O que se deve questionar não é a presença destes resíduos, mas sim o tipo e as concentrações dos mesmos. De fato, as modernas tecnologias analíticas têm permitido a detecção de partes por bilhão de substâncias químicas, componentes ou metabólitos de medicamentos de uso veterinário em alimentos e, nestas quantidades, dificilmente elas representariam perigo à saúde dos consumidores. Portanto, há necessidade de se estabelecer metodologias analíticas mais eficientes que possam auxiliar os órgãos de fiscalização da agricultura no controle do uso desses antimicrobianos na produção animal. Assim como auxiliar no controle de qualidade, principalmente em indústrias exportadoras que almejam expansão de mercado, onde essa prática é quase uma imposição no contexto do comércio internacional de produtos pecuários \"in natura\" e processados. Devido a essas necessidades, o objetivo do presente foi padronizar e desenvolver reagentes imunoenzimáticos para a pesquisa da ciprofloxacina em produtos de origem animal. Os resultados obtidos no desenvolvimento desses imunoreagentes foram positivos quando correlacionado (r2 = 0,9588) com o kit referência RIDASCREEN® Enro/Cipro da R-Biopharm. Diante disso, é possível concluir que o Brasil possui infra-estrutura adequada para padronizar esses testes rápidos, evitando com isso um grande gasto na importação desses kits / The growth each time higher of industrialization and the existence of a global market forces the rural producers to use modern technologies related to animal production. The low production cost and the increasing of obtained final product quality have been the great aim of cattle farmers and cattle farming research centers. Due to the necessity of increasing the production, rural properties have required the use of any available source able to promote better productive activities. The indiscriminated antibiotics use aiming to increase animal production may result in residual concentrations found in products such as meat, eggs and milk over acceptable doses to the human consumption. Firstly, antibiotics were used as therapeutic prescriptions although the advances on knowledge and development of new compounds were also used as a preventive way and as growth promoters. What must be questionable its not the presence of these residuals but surely what kind of residual and their concentrations. In fact, the modern analytic technologies make possible the detection of parts per billions (ppb) of chemical substances, compounds or medicine metabolites of veterinary use in food and in these quantities, hardly they would be dangerous to the consumer health. However, it\'s necessary to establish more efficient analytic methodologies to help on agriculture supervising organs in the control of these antibiotics use in the animal production. Thus, how to help in the quality control, mainly in industries that export to get the market expansion, where this activity is almost an imposition at the international trade context of farming products \"in natura\" and industrialized ones. Due to these necessities, the goal of our present work was to standard and develop immunoenzymatics reagents to the ciprofloxacin researching from animal products. The results obtained on development of these immunoreagents were positive when correlated (r2= 0,9588) to the kit RIPASCREEN® Enro/Cipro from R-Biopharm reference. At the light of these knowledge, it?s possible to conclude that Brazil has adequate proper-structure to standardize these quick tests, to avoid in this way a high cost to import these kits.

Orientador: Ely Nahas / Banca: João Lúcio de Azevedo / Banca: Drauzio Eduardo Naretto Rangel / Banca: jaime Mais dos Santos / Banca: Rita de Cássia panizzi / Resumo: O uso de agentes biológicos para controle de nematóides é considerado uma das várias medidas a serem empregadas em um manejo integrado de pragas, sendo uma preocupação de caráter mundial. Contudo, foram estudados os fatores determinantes da freqüência de fungos totais e nematófagos, da atividade enzimática e da distribuição de nematóides de solos não rizosféricos e rizosféricos sob alface (Lactuca sativa L.); banana (Musa cavendishii L.); grama batatais (Paspalum notatum) e Impatiens (Impatiens valleriana). A atividade predadora dos fungos nematófagos foi avaliada contra o nematóide Panagrellus redivivus. O número de fungos totais variou de 6,9 x 105 a 31,2 x 105 UFC g-1 solo seco no solo não-rizosférico e de 6,9 x 105 a 25,6 x 105 UFC g-1 solo seco no solo rizosférico. As contagens dos fungos nematófagos corresponderam a 23-41 % e 23-34 % dos fungos totais encontrados no solo rizosférico e não-rizosférico, respectivamente. Enquanto as contagens dos fungos totais do solo rizosférico se distribuíram na seguinte seqüência: alface > banana > grama-batatais > Impatiens, os nematófagos diminuíram na seguinte ordem: alface > Impatiens > banana > grama-batatais. A matéria orgânica e a umidade do solo influenciaram a distribuição tanto dos fungos totais como dos nematófagos do solo não-rizosférico. A distribuição dos nematóides nas amostras de solo e raiz foram Rotylenchulus sp., Helicotylenchus sp. e Tylenchus sp. para alface, Meloidogyne sp., Helicotylenchus sp., Pratylenchus sp. e Rotylenchulus sp. para banana, Meloidogyne sp., Helicotylenchus sp., Pratylenchus sp. e Rotylenchulus sp. para grama-batatais, Meloidogyne sp., Helicotylenchus sp., Pratylenchus sp., Rotylenchulus sp. e Tylenchus sp. para Impatiens. Em termos gerais, as atividades da desidrogenases, amilases, celulases e endoglucanases distribuíram-se no solo não-rizosférico de acordo ...(Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Biological control of nematodes is considered one of the many practices that can be used in integrated pest management. We investigated the factors affecting the frequency of the total and the nematophagous fungi, soil enzymatic activity as well as the distribution of the nematodes in rhizospheric and bulk soil of lettuce (Lactuca sativa L.); Impatiens (Impatiens valleriana); banana (Musa cavendishii L.) and Bahiagrass (Paspalum otatum). The effect of the nematophagous fungi were evaluated against the nematode Panagrellus redivivus. The total fungal number ranged from 6,9 x 105 to 31,2 x 105 UFC g-1 dry soil in the bulk soil and from 6,9 x 105 to 25,6 x 105 UFC g-1 dry soil in the rhizosphere. Nematofagous fungi counts were to 23-41 % and 23-34 % of the total fungi found in the rhizosphere and bulk soil, respectively. While the total fungi counts of the rizosphere were distributed in the following sequence: lettuce > banana > Bahiagrass > Impatiens, the nematophagous fungi decreased in the following order: lettuce> Impatiens >banana > Bahiagrass. Moisture and organic matter contents of the bulk soil influenced the distribution of the total and nematophagous fungi of the soil. The following phytonematodes found in the samples of soil and roots were Rotylenchulus sp., Helicotylenchus sp. and Tylenchus sp (lettuce), Meloidogyne sp., Helicotylenchus sp., Pratylenchus sp. and Rotylenchulus sp (banana), Meloidogyne sp., Helicotylenchus sp., Pratylenchus sp. and Rotylenchulus sp. (Bahiagrass), Meloidogyne sp., Helicotylenchus sp., Pratylenchus sp., Rotylenchulus sp. and Tylenchus sp. (Impatiens). In general, the activities of the enzymes desidrogenase, amylase, celulase and endoglucanase followed the distribution of the frequency of the soil total and nematophagous fungi ...(Complete abstract, click electronic access below) / Doutor

O crescimento cada vez maior da industrialização e a existência de um mercado globalizado vêm exigindo dos produtores rurais à utilização de modernas tecnologias ligadas à produção animal. O baixo custo de produção e o aumento da qualidade do produto final gerado têm sido a grande meta dos pecuaristas e centros de pesquisa voltados à agropecuária. Devido à necessidade de aumento na produção, propriedades agropecuárias têm recorrido ao uso de todo e qualquer recurso disponível que possa promover melhorias na atividade produtiva.O uso indiscriminado dos antimicrobianos com a intenção de aumentar a produção animal pode resultar em concentrações residuais nos produtos como carne, ovos e leite acima das doses aceitáveis para o consumo humano. Inicialmente, os antibióticos eram usados como medida terapêutica, mas com o avanço do conhecimento e desenvolvimento de novos compostos, passaram a ser utilizados também como medida preventiva e como promotores do crescimento.O que se deve questionar não é a presença destes resíduos, mas sim o tipo e as concentrações dos mesmos. De fato, as modernas tecnologias analíticas têm permitido a detecção de partes por bilhão de substâncias químicas, componentes ou metabólitos de medicamentos de uso veterinário em alimentos e, nestas quantidades, dificilmente elas representariam perigo à saúde dos consumidores. Portanto, há necessidade de se estabelecer metodologias analíticas mais eficientes que possam auxiliar os órgãos de fiscalização da agricultura no controle do uso desses antimicrobianos na produção animal. Assim como auxiliar no controle de qualidade, principalmente em indústrias exportadoras que almejam expansão de mercado, onde essa prática é quase uma imposição no contexto do comércio internacional de produtos pecuários \"in natura\" e processados. Devido a essas necessidades, o objetivo do presente foi padronizar e desenvolver reagentes imunoenzimáticos para a pesquisa da ciprofloxacina em produtos de origem animal. Os resultados obtidos no desenvolvimento desses imunoreagentes foram positivos quando correlacionado (r2 = 0,9588) com o kit referência RIDASCREEN® Enro/Cipro da R-Biopharm. Diante disso, é possível concluir que o Brasil possui infra-estrutura adequada para padronizar esses testes rápidos, evitando com isso um grande gasto na importação desses kits / The growth each time higher of industrialization and the existence of a global market forces the rural producers to use modern technologies related to animal production. The low production cost and the increasing of obtained final product quality have been the great aim of cattle farmers and cattle farming research centers. Due to the necessity of increasing the production, rural properties have required the use of any available source able to promote better productive activities. The indiscriminated antibiotics use aiming to increase animal production may result in residual concentrations found in products such as meat, eggs and milk over acceptable doses to the human consumption. Firstly, antibiotics were used as therapeutic prescriptions although the advances on knowledge and development of new compounds were also used as a preventive way and as growth promoters. What must be questionable its not the presence of these residuals but surely what kind of residual and their concentrations. In fact, the modern analytic technologies make possible the detection of parts per billions (ppb) of chemical substances, compounds or medicine metabolites of veterinary use in food and in these quantities, hardly they would be dangerous to the consumer health. However, it\'s necessary to establish more efficient analytic methodologies to help on agriculture supervising organs in the control of these antibiotics use in the animal production. Thus, how to help in the quality control, mainly in industries that export to get the market expansion, where this activity is almost an imposition at the international trade context of farming products \"in natura\" and industrialized ones. Due to these necessities, the goal of our present work was to standard and develop immunoenzymatics reagents to the ciprofloxacin researching from animal products. The results obtained on development of these immunoreagents were positive when correlated (r2= 0,9588) to the kit RIPASCREEN® Enro/Cipro from R-Biopharm reference. At the light of these knowledge, it?s possible to conclude that Brazil has adequate proper-structure to standardize these quick tests, to avoid in this way a high cost to import these kits.

O mutante redA de Dictyostelium discoideum, obtido por inativação gênica aleatória, tem crescimento aparentemente normal, porém seu ciclo de desenvolvimento não progride além do estágio de agregados compactos. Neste trabalho relatamos a caracterização deste mutante, cujo gene defeituoso codifica a enzima NADPH citocromo P450 redutase (NCPR). O principal papel desta enzima é transportar elétrons do NADPH para as várias isoformas do citocromo P450. Um cDNA de 2094 pb que codifica a NCPR de D. discoideum (DdNCPR) foi isolado através da varredura de uma biblioteca de cDNA com uma sonda derivada de um fragmento do gene inativado no mutante redA. A análise da seqüência de aminoácidos deduzida do cDNA DdNCPR revelou que esta codifica uma proteína de 631 aminoácidos com 31% de identidade e 50% de similaridade com a NCPR humana. Verificamos o acúmulo do mRNA da DdNCPR durante fase de crescimento mas durante as fases iniciais do desenvolvimento ocorre significativa diminuição em seus níveis até a formação dos agregados compactos onde o mRNA da NCPR não é detectável. Demonstramos que o gene que codifica a NCPR aparentemente está presente em uma única cópia no genoma de Dictyostelium. Ademais, a análise de outras linhagens mutantes nocautes do gene da NCPR confirmaram que a inativação deste gene está diretamente relacionada ao fenótipo exibido pelo mutante redA-. Contudo, é provável que um ou mais produtos gênicos possam complementar a ausência desta enzima, uma vez que nem a linhagem redA nem as outras linhagens nocautes do gene da NCPR apresentaram alteração na taxa de crescimento e, em algumas circunstâncias experimentais, não exibiram qualquer alteração no ciclo de desenvolvimento. Nossos resultados sugerem, ainda que o bloqueio do desenvolvimento eventualmente observado no mutante redA pode ser devido a um provável papel da NCPR no metabolismo de DIF-1 (fator indutor de diferenciação-1), que parece desempenhar um papel primordial no controle da diferenciação de células pré-talo e células pré-esporo durante o desenvolvimento de D. discoideum. / The Dictyostelium discoideum redA mutant, obtained by random gene inactivation, exhibits normal growth but has its developmental cycle impaired at tight mound stage. In this study we describe the characterization of this mutant whose defective gene encodes the enzyme NADPH cytochrome P450 reductase (NCPR). NCPR is known to play an essential role in the transfer of reducing equivalents from NADPH to various cytochrome P450 isoforms. We isolated a 2094 bp cDNA that encodes D. discoideum NCPR (DdNCPR) by screening a cDNA library using as probe the mutated gene fragment rescued from redA cells. Analysis of the deduced aminoacid sequence of DdNCPR cDNA shows that it encodes a 631 aminoacid protein with 31% of identity and 50% of similarity with human NCPR. Northern blot analysis showed that DdNCPR mRNA levels is maximum during growth phase and decreases at early stages of the development. After slug stage this mRNA is not detectable. D. discoideum has a single copy of NCPR gene and, as shown by analysis of other NCPR knockout mutants, inactivation of this gene is strongly correlated to the redA phenotype. However, redA, as well as the other NCPR knockout strains, do have growth alterations and in some circumstances they do not show the described developmental defects. Thus, it is possible that one or more proteins be able to compensate for the lack of NCPR in these mutants. Our results also suggest that the redA developmental phenotype might play a role of NCPR on the metabolism of DIF-1, a prime candidate for controlling prestalk and prespore cell differentiation during D. discoideum development.

O nitrogênio é um dos elementos mais limitantes no desenvolvimento de plantas. Vernonia herbacea (Vell.) Rusby, Asteraceae do cerrado, possui órgãos subterrâneos (rizóforos) que armazenam frutanos do tipo inulina. Estudos anteriores mostraram que o tratamento com solução nutritiva contendo 1,3 mmol L-1 NO3 - (Nlimitado) promoveu o acúmulo de frutanos nos rizóforos em detrimento do aumento de biomassa aérea e que o inverso ocorreu com plantas que receberam 10,7 mmol L-1 NO3 - (N-suficiente). Entretanto, não foram obtidas informações quanto às atividades das enzimas, em plantas sob esses tratamentos. Considerando a importância de estudos de nutrição mineral para a adequação de tratamentos de fertilização visando à produtividade de plantas de interesse econômico e em vista do teor elevado de frutanos em V. hebacea, este projeto teve como objetivos analisar o efeito do nitrogênio no crescimento e na alocação da biomassa, bem como no conteúdo e na composição de frutanos, nas atividades das enzimas de síntese (SST e FFT) e degradação (FEH e INV) de frutanos nos rizóforos e na atividade da redutase do nitrato (RN) e conteúdo de nitrato em folhas de V.herbacea. No presente trabalho, plantas de V. herbacea tratadas com baixo teor de nitrogênio (2,5 mmolL-1 de nitrato) apresentaram atividades de síntese (SST e FFT) superiores às tratadas com teor mais elevado de nitrogênio (11,9 mmol L-1 de nitrato), enquanto o inverso, ou seja, atividade elevada de despolimerização (FEH) ocorreu nas plantas que receberam 11,9 mmol L-1 de nitrato. O conteúdo de frutanos foi maior em plantas sob condições limitantes de nitrogênio, coerente com a maior atividade de síntese encontrada nestas plantas. Entretanto, maiores biomassas aérea e subterrânea foram encontradas nas plantas que receberam 2,5 mmolL-1 NO3 -, não sendo possível afirmar que baixos níveis de nitrato limitaram o seu crescimento. Dessa forma, para melhor compreensão do efeito do nitrato no crescimento, na alocação de biomassa e no metabolismo de frutanos em V. herbacea, foi conduzido um novo experimento que teve como objetivos analisar o efeito de diferentes concentrações de nitrato (0, 2,5, 5, 10 e 15 mM de KNO3) nos mesmos parâmetros analisados no experimento anterior em rizóforos e folhas de V. herbacea. Assim foi possível concluir que plantas tratadas com 10 mM apresentaram melhor eficiência no acúmulo total de biomassa e de frutanos nos rizóforos. Neste experimento, também foi demonstrado que plantas de V. herbacea, além dos frutanos, acumulam quantidades elevadas de nitrato nos rizóforos, mas assimilam preferencialmente esse mineral nas folhas. Uma vez que as plantas apresentaram maior massa seca aérea e subterrânea quando receberam soluções nutritivas enriquecidas com 10 mM de nitrato, foi realizado outro experimento para verificar a melhor fonte de nitrogênio no cultivo dessa espécie. As plantas foram submetidas ao cultivo com nitrato (KNO3), amônio ((NH4)2SO4) e a mistura de nitrato e amônio(NH4NO3), ambas na concentração de 10 mM, sendo possível verificar que esta espécie não apresentou preferência pela fonte nitrogenada, e sugerindo que o cultivo pode ser realizado em qualquer uma das fontes nitrogenadas estudadas. / Nitrogen is the most limiting element to plant development. Vernonia herbacea (Vell.) Rusby, Asteracea from the cerrado, bears underground organs (rhizophores) which accumulate inulin-type fructans. Previous studies showed that nutrient solution containing 1.3 mmol L-1 NO3 - (N-Limited treatment) promoted fructan accumulation in rhizophores and decrease of aerial biomass, while the opposite occurred in plants treated with nutrient solution containing 10.7 mmol L-1 NO3 - (N-sufficient treatment). However, as the activities of fructan metabolizing enzymes were not measured in these plants, new experiments were designed with this purpose. Thus, considering the importance of studies on mineral nutrition for the adjustment of the fertilization treatment, aiming at high contents of fructan and increase in plant productivity, the aim of this project was to analyse the effect of nitrogen on growth and biomass allocation, on fructan content and composition, on the activity of enzymes involved in fructan metabolism (SST, FFT, FEH and INV) in rhizophores, as well as on the activity of nitrate reductase (NR) and nitrogen content in leaves and rhizophores of V. herbacea. In the present work, plants treated with a low nitrogen concentration (2.5 mmol L-1 NO3 -) presented higher fructan biossynthetic activities than those treated with higher nitrogen concentration (11.9 mmol L-1 NO3 -). Oppositely, a higher mobilization activity occurred under high nitrogen concentration. Fructan content was higher in plants under low nitrogen concentration, in accordance with the higher biosynthetic activity in this treatment. However, higher aerial and underground biomass were detected in the 2.5 mmol L-1 NO3 - plants, indicating that growth was not limited under low levels of nitrate. Therefore, in order to improve the understanding of the effect of nitrate on growth, biomass allocation and fructan metabolism in V. herbacea, a new experiment was performed in which different concentrations of nitrate concentration (0, 2.5, 5.0, 10.0, 15.0 mM) were supplied in the same conditions mentioned above. The results showed that 10 mM nitrate was the most efficient concentration for total plant biomass and fructan accumulation in the rhizophore. It was also shown that, besides fructan, nitrate is accumulated in the rhizophores, but is preferably assimilated in leaves, where RN activity is higher. Considering results obtained with 10 mM nitrate, a third experiment was done in order to compare the effect of different nitrogen sources on growth of V. herbacea. The plants were treated with nutrient solutions containing ammoniun ((NH4)2SO4), nitrate(KNO3) and a mixture of nitrate and ammoniun (NH4NO3), both at a final concentration of 10 mM. No preference for the nitrogen source was observed when growth parameters were analysed. Therefore, the results suggest that plants of V. herbacea can be cultivated under any of the nitrogen sources used in this study.

Made available in DSpace on 2014-10-09T12:36:57Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2014-10-09T13:56:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 04487.pdf: 6202047 bytes, checksum: d6f9351f75eefa6c4071a16adc9fca21 (MD5) / Tese (Doutoramento) / IPEN/T / Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN/CNEN-SP

O nitrogênio é um dos elementos mais limitantes no desenvolvimento de plantas. Vernonia herbacea (Vell.) Rusby, Asteraceae do cerrado, possui órgãos subterrâneos (rizóforos) que armazenam frutanos do tipo inulina. Estudos anteriores mostraram que o tratamento com solução nutritiva contendo 1,3 mmol L-1 NO3 - (Nlimitado) promoveu o acúmulo de frutanos nos rizóforos em detrimento do aumento de biomassa aérea e que o inverso ocorreu com plantas que receberam 10,7 mmol L-1 NO3 - (N-suficiente). Entretanto, não foram obtidas informações quanto às atividades das enzimas, em plantas sob esses tratamentos. Considerando a importância de estudos de nutrição mineral para a adequação de tratamentos de fertilização visando à produtividade de plantas de interesse econômico e em vista do teor elevado de frutanos em V. hebacea, este projeto teve como objetivos analisar o efeito do nitrogênio no crescimento e na alocação da biomassa, bem como no conteúdo e na composição de frutanos, nas atividades das enzimas de síntese (SST e FFT) e degradação (FEH e INV) de frutanos nos rizóforos e na atividade da redutase do nitrato (RN) e conteúdo de nitrato em folhas de V.herbacea. No presente trabalho, plantas de V. herbacea tratadas com baixo teor de nitrogênio (2,5 mmolL-1 de nitrato) apresentaram atividades de síntese (SST e FFT) superiores às tratadas com teor mais elevado de nitrogênio (11,9 mmol L-1 de nitrato), enquanto o inverso, ou seja, atividade elevada de despolimerização (FEH) ocorreu nas plantas que receberam 11,9 mmol L-1 de nitrato. O conteúdo de frutanos foi maior em plantas sob condições limitantes de nitrogênio, coerente com a maior atividade de síntese encontrada nestas plantas. Entretanto, maiores biomassas aérea e subterrânea foram encontradas nas plantas que receberam 2,5 mmolL-1 NO3 -, não sendo possível afirmar que baixos níveis de nitrato limitaram o seu crescimento. Dessa forma, para melhor compreensão do efeito do nitrato no crescimento, na alocação de biomassa e no metabolismo de frutanos em V. herbacea, foi conduzido um novo experimento que teve como objetivos analisar o efeito de diferentes concentrações de nitrato (0, 2,5, 5, 10 e 15 mM de KNO3) nos mesmos parâmetros analisados no experimento anterior em rizóforos e folhas de V. herbacea. Assim foi possível concluir que plantas tratadas com 10 mM apresentaram melhor eficiência no acúmulo total de biomassa e de frutanos nos rizóforos. Neste experimento, também foi demonstrado que plantas de V. herbacea, além dos frutanos, acumulam quantidades elevadas de nitrato nos rizóforos, mas assimilam preferencialmente esse mineral nas folhas. Uma vez que as plantas apresentaram maior massa seca aérea e subterrânea quando receberam soluções nutritivas enriquecidas com 10 mM de nitrato, foi realizado outro experimento para verificar a melhor fonte de nitrogênio no cultivo dessa espécie. As plantas foram submetidas ao cultivo com nitrato (KNO3), amônio ((NH4)2SO4) e a mistura de nitrato e amônio(NH4NO3), ambas na concentração de 10 mM, sendo possível verificar que esta espécie não apresentou preferência pela fonte nitrogenada, e sugerindo que o cultivo pode ser realizado em qualquer uma das fontes nitrogenadas estudadas. / Nitrogen is the most limiting element to plant development. Vernonia herbacea (Vell.) Rusby, Asteracea from the cerrado, bears underground organs (rhizophores) which accumulate inulin-type fructans. Previous studies showed that nutrient solution containing 1.3 mmol L-1 NO3 - (N-Limited treatment) promoted fructan accumulation in rhizophores and decrease of aerial biomass, while the opposite occurred in plants treated with nutrient solution containing 10.7 mmol L-1 NO3 - (N-sufficient treatment). However, as the activities of fructan metabolizing enzymes were not measured in these plants, new experiments were designed with this purpose. Thus, considering the importance of studies on mineral nutrition for the adjustment of the fertilization treatment, aiming at high contents of fructan and increase in plant productivity, the aim of this project was to analyse the effect of nitrogen on growth and biomass allocation, on fructan content and composition, on the activity of enzymes involved in fructan metabolism (SST, FFT, FEH and INV) in rhizophores, as well as on the activity of nitrate reductase (NR) and nitrogen content in leaves and rhizophores of V. herbacea. In the present work, plants treated with a low nitrogen concentration (2.5 mmol L-1 NO3 -) presented higher fructan biossynthetic activities than those treated with higher nitrogen concentration (11.9 mmol L-1 NO3 -). Oppositely, a higher mobilization activity occurred under high nitrogen concentration. Fructan content was higher in plants under low nitrogen concentration, in accordance with the higher biosynthetic activity in this treatment. However, higher aerial and underground biomass were detected in the 2.5 mmol L-1 NO3 - plants, indicating that growth was not limited under low levels of nitrate. Therefore, in order to improve the understanding of the effect of nitrate on growth, biomass allocation and fructan metabolism in V. herbacea, a new experiment was performed in which different concentrations of nitrate concentration (0, 2.5, 5.0, 10.0, 15.0 mM) were supplied in the same conditions mentioned above. The results showed that 10 mM nitrate was the most efficient concentration for total plant biomass and fructan accumulation in the rhizophore. It was also shown that, besides fructan, nitrate is accumulated in the rhizophores, but is preferably assimilated in leaves, where RN activity is higher. Considering results obtained with 10 mM nitrate, a third experiment was done in order to compare the effect of different nitrogen sources on growth of V. herbacea. The plants were treated with nutrient solutions containing ammoniun ((NH4)2SO4), nitrate(KNO3) and a mixture of nitrate and ammoniun (NH4NO3), both at a final concentration of 10 mM. No preference for the nitrogen source was observed when growth parameters were analysed. Therefore, the results suggest that plants of V. herbacea can be cultivated under any of the nitrogen sources used in this study.

O mutante redA de Dictyostelium discoideum, obtido por inativação gênica aleatória, tem crescimento aparentemente normal, porém seu ciclo de desenvolvimento não progride além do estágio de agregados compactos. Neste trabalho relatamos a caracterização deste mutante, cujo gene defeituoso codifica a enzima NADPH citocromo P450 redutase (NCPR). O principal papel desta enzima é transportar elétrons do NADPH para as várias isoformas do citocromo P450. Um cDNA de 2094 pb que codifica a NCPR de D. discoideum (DdNCPR) foi isolado através da varredura de uma biblioteca de cDNA com uma sonda derivada de um fragmento do gene inativado no mutante redA. A análise da seqüência de aminoácidos deduzida do cDNA DdNCPR revelou que esta codifica uma proteína de 631 aminoácidos com 31% de identidade e 50% de similaridade com a NCPR humana. Verificamos o acúmulo do mRNA da DdNCPR durante fase de crescimento mas durante as fases iniciais do desenvolvimento ocorre significativa diminuição em seus níveis até a formação dos agregados compactos onde o mRNA da NCPR não é detectável. Demonstramos que o gene que codifica a NCPR aparentemente está presente em uma única cópia no genoma de Dictyostelium. Ademais, a análise de outras linhagens mutantes nocautes do gene da NCPR confirmaram que a inativação deste gene está diretamente relacionada ao fenótipo exibido pelo mutante redA-. Contudo, é provável que um ou mais produtos gênicos possam complementar a ausência desta enzima, uma vez que nem a linhagem redA nem as outras linhagens nocautes do gene da NCPR apresentaram alteração na taxa de crescimento e, em algumas circunstâncias experimentais, não exibiram qualquer alteração no ciclo de desenvolvimento. Nossos resultados sugerem, ainda que o bloqueio do desenvolvimento eventualmente observado no mutante redA pode ser devido a um provável papel da NCPR no metabolismo de DIF-1 (fator indutor de diferenciação-1), que parece desempenhar um papel primordial no controle da diferenciação de células pré-talo e células pré-esporo durante o desenvolvimento de D. discoideum. / The Dictyostelium discoideum redA mutant, obtained by random gene inactivation, exhibits normal growth but has its developmental cycle impaired at tight mound stage. In this study we describe the characterization of this mutant whose defective gene encodes the enzyme NADPH cytochrome P450 reductase (NCPR). NCPR is known to play an essential role in the transfer of reducing equivalents from NADPH to various cytochrome P450 isoforms. We isolated a 2094 bp cDNA that encodes D. discoideum NCPR (DdNCPR) by screening a cDNA library using as probe the mutated gene fragment rescued from redA cells. Analysis of the deduced aminoacid sequence of DdNCPR cDNA shows that it encodes a 631 aminoacid protein with 31% of identity and 50% of similarity with human NCPR. Northern blot analysis showed that DdNCPR mRNA levels is maximum during growth phase and decreases at early stages of the development. After slug stage this mRNA is not detectable. D. discoideum has a single copy of NCPR gene and, as shown by analysis of other NCPR knockout mutants, inactivation of this gene is strongly correlated to the redA phenotype. However, redA, as well as the other NCPR knockout strains, do have growth alterations and in some circumstances they do not show the described developmental defects. Thus, it is possible that one or more proteins be able to compensate for the lack of NCPR in these mutants. Our results also suggest that the redA developmental phenotype might play a role of NCPR on the metabolism of DIF-1, a prime candidate for controlling prestalk and prespore cell differentiation during D. discoideum development.