La Chimie Verte s’engage entre autres à mettre au point des procédés plus respectueux de l’environnement et à émanciper de la pétrochimie les filières industrielles de fabrication de produits. Dans ce contexte, les enzymes représentent des alternatives de choix pour réaliser des réactions de synthèse de molécules écoresponsable à partir de la biomasse végétale. - L’endoglycocéramidase II de Rhodoccoccus sp. M-777, une glycoside-hydrolase, a été la cible d’un travail d'ingénierie du site actif afin de réorienter son activité hydrolytique vers la synthèse de polyglucosides d’alkyles, de potentiels biosurfactants. Une transglycosylase permettant d’atteindre des rendements de production de plus de 70% a été obtenue. La modélisation de la mutation permet de proposer des pistes sur les raisons de cette inversion du ratio hydrolyse/transglycosylation.- Une stratégie d'évolution dirigée a été appliquée à la féruloyle-estérase A d’Aspergillus niger pour la rendre plus résistante aux chocs thermiques et à la présence de solvants, deux propriétés requises pour utiliser cette enzyme pour des réactions de transfert dans des conditions thermodynamiquement favorables. Un catalogue d’enzymes améliorées, pour les deux propriétés, a été obtenu. L'accumulation de ces connaissances permettra de pouvoir plus efficacement rationaliser le design de biocatalyseur pour la synthèse de molécules, en accord avec les attentes de la chimie verte. / Green chemistry promotes the development of more environmentally friendly processes and the ending of polluting petrochemical industries by promoting the use of renewable resources. In this context, enzymes represent interesting alternatives catalysts for chemical transformations. Notably, they constitute tools of choice for synthesis of organic molecules from plant biomass.- Endoglycoceramidase II from Rhodococcus sp. M-777, a retaining glycoside hydrolase, was subjected to active-site remodelling in order to reorient its activity towards the synthesis of alkyl-polyglucosides, molecules with potential biosurfactant properties. Thus, an efficient transglycosylase able to reach production yield of more than 70% of alkyl-cellobiosides was obtained. A modelling study help to identify the determinants of this complete reversion of the transfer / hydrolysis ratio.- A directed evolution strategy was applied to Aspergillus niger feruloyl-esterase A, in order to make it more resistant to heat shocks and to the presence of solvents, two prerequisites to use this enzyme for transfer reactions under thermodynamically favourable conditions. This led to the establishment of a catalog of optimized enzymes for their thermostability, their solvent resistance, or both properties.These results will pave the way towards a more efficient way to rationally design biocatalysts meeting the expectations of green chemistry.

Les biocapteurs constituent un défi pour le diagnostic médical, la surveillance des eaux naturelles ...Dans ce travail, nous avons défini les conditions de précipitation de la structure Hôte par hydrolyse thermique de l'urée. Une nouvelle voie de synthèse d'HDL a été mise au point, utilisant la décomposition catalytique de l'urée par l'uréase. Une étude comparative des procédés d'immobilisation a permis de maîtriser la formation du matériau hybride et de contrôler la quantité d'uréase immobilisée, dont l'activité catalytique a été étudiée. L'élaboration des biocapteurs sous forme de multicouches nanostructurées HDL-Uréase a été réalisée par la technique Langmuir-Blodgett, et leur réponse a été évaluée. Cette première étude sur le confinement de protéines sur des matrices HDL, depuis l'élaboration de la matrice hôte jusqu'à la réalisation du biocapteur fonctionnel, ouvre des perspectives sur l'immobilisation d'autres enzymes et l'optimisation de films hybrides à propriétés biologiques

Les vasières intertidales sont le siège d'une forte production primaire sous la forme d'un biofilmmicrophytobenthique qui se développe en surface à marée basse. Ce biofilm se compose principalement de diatomées et de bactéries hétérotrophes. Ces deux composantes sécrètent des substances polymériques extracellulaires (EPS) qui jouent différents rôles dans le biofilm. Le travail présenté s'est basé sur différentes échelles d'observation (in situ à 2 saisons, mésocosme en laboratoire, et échelle fine du biofilm en microscopie confocale) et a permis de mettre en évidence les interactions des diatomées et des bactéries à différents moments de la marée et du nycthémère. L'utilisation d'une nouvelle méthode d'extraction des EPS a permis d'éclaircir leur rôle en évitant les contaminations par les substances internes provoquées par les méthodes classiques. Les EPS colloïdales particulièrement riches en glucose s'associent au déplacement des diatomées, notamment lors d'un stress (sursalure, carence en nutriments) et sont préférentiellement consommées par les bactéries, après leur dégradation par les enzymes ou leur hydrolyse dans l'eau interstitielle. Les EPS liées au frustule, et plus particulièrement les sucres, inhiberaient le développement bactérien à proximité de la cellule algale. Elles sont surtout sécrétées lors de la mise en place du biofilm et pour protéger la cellule quand les conditions sont osmotiquement défavorables et leur richesse en protéine leur confère un potentiel intéressant pour les bactéries qui peuvent les utiliser comme substrat azoté en cas de carence. D'autres substances ont été plutôt sécrétées parles bactéries telles que les N-acétylglucosamines et les protéines colloïdales de bas poids moléculaire,certainement des enzymes bactériennes, ainsi que le glucose qui semble être associé au EPS colloïdaux des diatomées mais aussi aux EPS bactériens selon l'analyse en microscopie confocale en utilisant des lectines comme marqueurs d'EPS.

Le xyloglucane issu de la graine de tamarin (XG) est un polysaccharide provenant de la biomasse. Son association à un bloc vinylique dans une architecture de copolymères à blocs « hybrides » naturels/synthétique permet d'envisager des applications de par leur auto-assemblage en solution aqueuse. Afin d'obtenir de tels copolymères à blocs, deux stratégies de synthèse sont proposées, basées sur la modification chimio-enzymatique du xyloglucane et la polymérisation radicalaire contrôlée MADIX de monomères vinyliques : acrylamide (Am), acétate de vinyle (AcV), N-vinyl-2-pyrrolidone (NVP). La stratégie « starting from » consiste en la polymérisation radicalaire contrôlée MADIX d'un monomère vinylique à partir de l'oligosaccharide du xyloglucane modifié par une ou plusieurs fonctions polymérisantes. La stratégie « coupling onto » consiste en un couplage par « chimie click » entre un polymère vinylique issu de la polymérisation radicalaire contrôlée MADIX à partir d'un agent de transfert de chaîne porteur d'une fonction azoture, et l'oligosaccharide modifié par une fonction alcyne. Ainsi, quatre familles de copolymères à blocs « hybrides » ont été obtenus (XG-b-PAm, PAm-b-XG-b-PAm, XG-b-PAcV, XG-b-PNVP). Une étude physico-chimique en solution préliminaire des copolymères XG-b-PAcV et XG-b-PNVP a également été réalisée indiquant la formation de polymersomes.

Le réseau xyloglucanes-cellulose est la structure portante de la paroi primaire des cellules végétales chez les plantes supérieures. Les interactions entre ces deux polysaccharides ont été examinées lors de travaux antérieurs, mais le manque de substrats parfaitement caractérisés limite ces études. La préparation d'une gamme de xylogluco-oligosaccharides branchés complexes par synthèse chimio-enzymatique, utilisant la glycosynthase Cel7B E197A, associée à des xyloglucanes naturels obtenus par extraction et hydrolyse enzymatique, a permis l'étude de l'influence de nombreuses caractéristiques structurales de ces hémicelluloses, sur leur capacité d'interaction avec la cellulose. Afin d'évaluer l'impact de ces paramètres, plusieurs techniques ont été mise en oeuvre. La détermination d'isothermes d'adsorption a illustré une amélioration de la capacité d'adsorption par augmentation de la masse molaire et une taille critique, à partir de laquelle l'adsorption est significative. Les résidus galactosyle et xylosyle n'ont pas montré de conséquences majeures sur ces interactions contrairement aux résidus fucosyle qui semblent favorables, bien que la variation de répartition des ramifications puisse également être en jeu. La titration calorimétrique isotherme a montré la présence de deux types de sites identifiés comme : (i) site de surface exothermique et (ii) site endothermique localisé au niveau des rainures de la cellulose, dans le cas des substrats de faible masse molaire ou à l'auto-association dans le cas des xyloglucanes natifs. Enfin, une analyse RMN du solide de composites xyloglucanes-cellulose de contraste isotopique variable a mis en évidence la conservation de la grande mobilité des chaînes latérales après adsorption ainsi qu'une absence de modification conformationnelle des signaux relatifs aux chaînes de surface de la cellulose.

The Pseudomonas aeruginosa VIM-4 metallo-β-lactamase is a member of the subclass B1. It belongs to the VIM-type β-lactamases encoded by genetic mobile element such as class 1 integrons. This particularity enhances the relevance of VIM type enzymes since these enzymes are now disseminated among important nosocomial strains such as Klebsiella pneumoniae and Pseudomonas aeruginosa. In consequence, the study of VIM-4 was performed to determine its kinetic parameters, its 3D structure and the dependence of its activity on Zn2+ concentration. VIM-4 has been described as an efficient enzyme able to hydrolyze all the β-lactam compounds. We observed that VIM-4 activity is dependent on the Zn2+ concentration in the buffer, with a maximal activity obtained at 50 µM. Two different forms of VIM-4 were observed by X-ray crystallography in the presence or absence of Zn2+ in the crystallogenesis buffer. The first form contains two Zn2+ and the second possesses only one Zn2+ in the histidine site. The apoenzyme form was obtained. Its study revealed that this form was poorly stable with a less structured shape. The active form is not restored even in presence of a large Zn2+ excess. In order to determine the Zn2+ stoechiometry in VIM-4, ICPMS (Inductively coupled plasma mass spectrometry) experiments were performed. The results of this study indicated that the mono-zinc form of VIM-4 is favored in absence of Zn2+ ions in the buffer and the di-zinc form appears in the presence of added Zn2+ ions. The dissociation constants of the Zn2+ ions with VIM-4 enzyme were determined using benzylpenicillin. The dissociation constants of the first, the second and the third Zn2+ are respectively KD1 which is clearly below 1 µM, KD2 equal to 8.5 µM and KD3 within a range of 200 to 500 µM. A complementary titration of the free Zn2+ ions from denatured VIM-4 with a chromophore chelating agent seems to confirm this feature as only one Zn2+ could be titrated. Then with no added Zn2+, VIM-4 would be in a mono-zinc form and with a Zn2+ concentration higher than 10 µM, the di-zinc form of VIM-4 would be present. In the last decade, numerous studies have reported an increasing mortality among patients in intensive care due to multiresistant pathogens. These strains are producing at least two different classes of β-lactamases. In the eighties, a strategy of combination of β-lactamase inactivator and β-lactam antibiotics was developed against serine β-lactamases. Some of the members of this family have already developed variants resistant to these inhibitors; however this combination remains efficient. In the case of the MBLs, extensive studies have been performed to find a generic inhibitor. Unfortunately, due to the heterogeneity of this enzyme group, no solution has been found. The development of a metallo-β-lactamase inhibitor, particularly active against acquired MBLs, which are the most relevant enzymes, is thus needed. Our second purpose was the identification of new molecules that could be developed as broad spectrum MBLs inhibitors. We found a new class of compounds, mercaptophosphonates derivatives, which can be used as leads for finding generic MBL inhibitors.

La demande en composés chiraux est en plein essor ces dernières années. Pour accéder à leur synthèse, la biocatalyse, couplée à l'irradiation pourrait être une méthode innovante. Il existe en effet de nombreux cas dans la littérature où l'utilisation de micro-onde semble avoir un effet activateur sur l'efficacité enzymatique.Cependant, l'effet de l'irradiation micro-onde est mal compris et controversé. Le but de cette thèse était d'étudier l'impact de l'irradiation micro-onde sur des lipases, immobilisées ou non, en étudiant différentes réactions modèles, allant de la résolution d'alcools secondaires linéaires simples à la résolution de polyols complexes, et alcools polyfonctionalisés, par comparaison entre chauffage sous irradiation micro-onde (en conditions drastiques ou non) au chauffage classique. L'étude de l'irradiation micro-onde sur la stabilité enzymatique et sur paramètres intrinsèques de l'enzyme après modification des paramètres réactionnels a permis de mettre en évidence un rôle indéniable de l'irradiation micro-onde sur l'efficacité des réactions enzymatiques. Il a été possible d'une part de diminuer de façon importante les temps réactionnels, comparé au chauffage traditionnel,et d'autre part de contrôler efficacement l'énantio préférence et la sélectivité de la lipase pour l'obtention de molécules d'intérêt. Par des procédés innovants, l'impact de la puissance d'irradiation a été montré comme hautement dépendant du modèle réactionnel étudié. En optimisant les conditions réactionnelles pour obtenir les meilleures sélectivités et activités enzymatique sous irradiation micro-onde, la synthèse de a-hydroxyamides chiraux et de polyols parfaitement résolus a pu être entreprise de façon rapide, propre, tout en respectant les principes de chimie verte.

Quelques enzymes sont connus pour déglyquer les kétoamines résultants de la réaction de Maillard entre des sucres et des amines primaires. Il a été démontré qu’Escherichia coli possède un opéron afin de métaboliser la fructoselysine. La fructoselysine 6-kinase, de la famille des PfkB, initie le processus de déglycation permettant l’utilisation ultérieure du glucose-6-P par la bactérie. La résolution de la structure de la FL6K par cristallographie et diffraction des rayons X a permis d’identifier son site actif en présence d’ATP, d’ADP et d’AMP-PNP. La modélisation de la fructoselysine au site actif de la kinase a permis d’identifier des résidus pouvant être importants pour sa liaison et son mécanisme enzymatique. De plus, les résultats de cinétique suggèrent que le mécanisme utilisé par la FL6K semble passer par un état ternaire de type SN2. Des modifications structurales à la FL6K pourraient permettre d’augmenter la taille des substrats afin de permettre ultimement la déglycation de protéines. / Some enzymes have been found to deglycate the products of the Maillard reaction between sugars and primary amines: ketoamines. An operon is found in Escherichia coli that allows the growth on fructoselysine media. The deglycation process is done by a kinase and a “deglycase”. The fructoselysine 6-kinase, a member of the PfkB family, phosphorylates its substrate on the sixth carbon to initiate the metabolism of fructoselysine. Here are presented x-ray crystallography structures obtained for the fructoselysine 6-kinase in its native form and bound with ATP, ADP and AMP-PNP. The active site of the kinase has been determined, and modelisation of fructoselysine allowed identification of some residues that might be important for the specific binding of the substrate and the enzymatic mechanism. Kinetic results tend to suggest a SN2 mechanism for the phosphorylation catalyzed by the enzyme. Structural modifications of the FL6K could help to increase the size of the substrates recognized by the enzyme until it binds glycated proteins.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Les grandes propriétés interactives des HS dépendent de leur profil de sulfatation, finement régulé au cours de la biosynthèse du polysaccharide ainsi qu'à la surface cellulaire par l'action d'endosulfatases nommées Sulfs. Ces enzymes ôtent spécifiquement les groupements 6-O-sulfates d'un certain nombre de disaccharides trisulfatés, éléments clés de nombreuses interactions protéines/HS. Ainsi, ces enzymes sont impliquées dans de nombreux processus, autant physiologiques que pathologiques. En utilisant différentes approches (biochimique et biophysique), nous avons révélé récemment que les isoformes humain HSulf-1 et -2 agissent de façon processif et orientées pour désulfater les chaines d’HS ce qui régule différemment les facteurs de croissances FGF-1 et -2 (Seffouh et al., FASEB J. 2013). Nous avons également identifié deux motifs impliqués dans l’interaction HSulf-2/HS et qui se sont avérés importants pour l’activité 6-O-endosulfatase [Manuscrit en préparation]. Par ailleurs, HSulf-2, et contrairement à HSulf-1, s’est révélé porteuse d’une O-glycosylation capable de moduler considérablement son activité à la surface cellulaire [Manuscrit en préparation]. Enfin, et en collaboration avec l’'institut Karolinska (Stockholm, Sweden), une éventuelle implication de Sulf-1 dans le mésothéliome malin a été suggéré (Heidari-Hamedani et al., Cellular Signalling J. 2015). / Heparan sulfate (HS) is a polysaccharide able to bind and modulate a wide variety of proteins. HS large interactive properties are essentially governed by precise sulfation patterns of the polysaccharide. Sulf-1 and Sulf-2 are two endosulfatases able to cleave specific 6-O sulfate groups within HS chains. Their action can modulate critical intracellular signaling processes, many of which with key relevance for cancer development. However, little is known on their structure, substrate specificities, and on the way their catalytic activity directs the subtle modifications of HS 6-O-sulfation profile.In this work, we have identified an original enzymatic mechanism by which Sulfs catalyze the processive and orientated desulfation of HS and finely regulate the polysaccharide biological properties. We also identified two basic motifs within the N-terminal domain of HSulf-2. Recombinant enzymes mutated for these sites were then produced and characterized. We found that these epitopes are necessary for its endosulfatase activity. Altogether, these results provide further insights into the enzyme/substrate recognition process and contribute to the understanding of the fundamental role played by these enzymes in the regulation of HS activity. The biochemical study of the purified HSulf-2 allowed to highlight a O-glycosylation able to significantly modulate its activity at the cell surface. Otherwise, and in collaboration with the Karolinska Institute (Stockholm, Sweden), the study of malignant mesothelioma (MM) provided new evidence that enhanced Syndecan-1 expression also finely modulates HS structure by interfering with HS-modifying enzymes HSulf-1. These results suggest important roles for Syndecan-1 and HSulf-1 in MM.