Le xyloglucane issu de la graine de tamarin (XG) est un polysaccharide provenant de la biomasse. Son association à un bloc vinylique dans une architecture de copolymères à blocs « hybrides » naturels/synthétique permet d'envisager des applications de par leur auto-assemblage en solution aqueuse. Afin d'obtenir de tels copolymères à blocs, deux stratégies de synthèse sont proposées, basées sur la modification chimio-enzymatique du xyloglucane et la polymérisation radicalaire contrôlée MADIX de monomères vinyliques : acrylamide (Am), acétate de vinyle (AcV), N-vinyl-2-pyrrolidone (NVP). La stratégie « starting from » consiste en la polymérisation radicalaire contrôlée MADIX d'un monomère vinylique à partir de l'oligosaccharide du xyloglucane modifié par une ou plusieurs fonctions polymérisantes. La stratégie « coupling onto » consiste en un couplage par « chimie click » entre un polymère vinylique issu de la polymérisation radicalaire contrôlée MADIX à partir d'un agent de transfert de chaîne porteur d'une fonction azoture, et l'oligosaccharide modifié par une fonction alcyne. Ainsi, quatre familles de copolymères à blocs « hybrides » ont été obtenus (XG-b-PAm, PAm-b-XG-b-PAm, XG-b-PAcV, XG-b-PNVP). Une étude physico-chimique en solution préliminaire des copolymères XG-b-PAcV et XG-b-PNVP a également été réalisée indiquant la formation de polymersomes.

Le réseau xyloglucanes-cellulose est la structure portante de la paroi primaire des cellules végétales chez les plantes supérieures. Les interactions entre ces deux polysaccharides ont été examinées lors de travaux antérieurs, mais le manque de substrats parfaitement caractérisés limite ces études. La préparation d'une gamme de xylogluco-oligosaccharides branchés complexes par synthèse chimio-enzymatique, utilisant la glycosynthase Cel7B E197A, associée à des xyloglucanes naturels obtenus par extraction et hydrolyse enzymatique, a permis l'étude de l'influence de nombreuses caractéristiques structurales de ces hémicelluloses, sur leur capacité d'interaction avec la cellulose. Afin d'évaluer l'impact de ces paramètres, plusieurs techniques ont été mise en oeuvre. La détermination d'isothermes d'adsorption a illustré une amélioration de la capacité d'adsorption par augmentation de la masse molaire et une taille critique, à partir de laquelle l'adsorption est significative. Les résidus galactosyle et xylosyle n'ont pas montré de conséquences majeures sur ces interactions contrairement aux résidus fucosyle qui semblent favorables, bien que la variation de répartition des ramifications puisse également être en jeu. La titration calorimétrique isotherme a montré la présence de deux types de sites identifiés comme : (i) site de surface exothermique et (ii) site endothermique localisé au niveau des rainures de la cellulose, dans le cas des substrats de faible masse molaire ou à l'auto-association dans le cas des xyloglucanes natifs. Enfin, une analyse RMN du solide de composites xyloglucanes-cellulose de contraste isotopique variable a mis en évidence la conservation de la grande mobilité des chaînes latérales après adsorption ainsi qu'une absence de modification conformationnelle des signaux relatifs aux chaînes de surface de la cellulose.

The Pseudomonas aeruginosa VIM-4 metallo-β-lactamase is a member of the subclass B1. It belongs to the VIM-type β-lactamases encoded by genetic mobile element such as class 1 integrons. This particularity enhances the relevance of VIM type enzymes since these enzymes are now disseminated among important nosocomial strains such as Klebsiella pneumoniae and Pseudomonas aeruginosa. In consequence, the study of VIM-4 was performed to determine its kinetic parameters, its 3D structure and the dependence of its activity on Zn2+ concentration. VIM-4 has been described as an efficient enzyme able to hydrolyze all the β-lactam compounds. We observed that VIM-4 activity is dependent on the Zn2+ concentration in the buffer, with a maximal activity obtained at 50 µM. Two different forms of VIM-4 were observed by X-ray crystallography in the presence or absence of Zn2+ in the crystallogenesis buffer. The first form contains two Zn2+ and the second possesses only one Zn2+ in the histidine site. The apoenzyme form was obtained. Its study revealed that this form was poorly stable with a less structured shape. The active form is not restored even in presence of a large Zn2+ excess. In order to determine the Zn2+ stoechiometry in VIM-4, ICPMS (Inductively coupled plasma mass spectrometry) experiments were performed. The results of this study indicated that the mono-zinc form of VIM-4 is favored in absence of Zn2+ ions in the buffer and the di-zinc form appears in the presence of added Zn2+ ions. The dissociation constants of the Zn2+ ions with VIM-4 enzyme were determined using benzylpenicillin. The dissociation constants of the first, the second and the third Zn2+ are respectively KD1 which is clearly below 1 µM, KD2 equal to 8.5 µM and KD3 within a range of 200 to 500 µM. A complementary titration of the free Zn2+ ions from denatured VIM-4 with a chromophore chelating agent seems to confirm this feature as only one Zn2+ could be titrated. Then with no added Zn2+, VIM-4 would be in a mono-zinc form and with a Zn2+ concentration higher than 10 µM, the di-zinc form of VIM-4 would be present. In the last decade, numerous studies have reported an increasing mortality among patients in intensive care due to multiresistant pathogens. These strains are producing at least two different classes of β-lactamases. In the eighties, a strategy of combination of β-lactamase inactivator and β-lactam antibiotics was developed against serine β-lactamases. Some of the members of this family have already developed variants resistant to these inhibitors; however this combination remains efficient. In the case of the MBLs, extensive studies have been performed to find a generic inhibitor. Unfortunately, due to the heterogeneity of this enzyme group, no solution has been found. The development of a metallo-β-lactamase inhibitor, particularly active against acquired MBLs, which are the most relevant enzymes, is thus needed. Our second purpose was the identification of new molecules that could be developed as broad spectrum MBLs inhibitors. We found a new class of compounds, mercaptophosphonates derivatives, which can be used as leads for finding generic MBL inhibitors.

La demande en composés chiraux est en plein essor ces dernières années. Pour accéder à leur synthèse, la biocatalyse, couplée à l'irradiation pourrait être une méthode innovante. Il existe en effet de nombreux cas dans la littérature où l'utilisation de micro-onde semble avoir un effet activateur sur l'efficacité enzymatique.Cependant, l'effet de l'irradiation micro-onde est mal compris et controversé. Le but de cette thèse était d'étudier l'impact de l'irradiation micro-onde sur des lipases, immobilisées ou non, en étudiant différentes réactions modèles, allant de la résolution d'alcools secondaires linéaires simples à la résolution de polyols complexes, et alcools polyfonctionalisés, par comparaison entre chauffage sous irradiation micro-onde (en conditions drastiques ou non) au chauffage classique. L'étude de l'irradiation micro-onde sur la stabilité enzymatique et sur paramètres intrinsèques de l'enzyme après modification des paramètres réactionnels a permis de mettre en évidence un rôle indéniable de l'irradiation micro-onde sur l'efficacité des réactions enzymatiques. Il a été possible d'une part de diminuer de façon importante les temps réactionnels, comparé au chauffage traditionnel,et d'autre part de contrôler efficacement l'énantio préférence et la sélectivité de la lipase pour l'obtention de molécules d'intérêt. Par des procédés innovants, l'impact de la puissance d'irradiation a été montré comme hautement dépendant du modèle réactionnel étudié. En optimisant les conditions réactionnelles pour obtenir les meilleures sélectivités et activités enzymatique sous irradiation micro-onde, la synthèse de a-hydroxyamides chiraux et de polyols parfaitement résolus a pu être entreprise de façon rapide, propre, tout en respectant les principes de chimie verte.

Quelques enzymes sont connus pour déglyquer les kétoamines résultants de la réaction de Maillard entre des sucres et des amines primaires. Il a été démontré qu’Escherichia coli possède un opéron afin de métaboliser la fructoselysine. La fructoselysine 6-kinase, de la famille des PfkB, initie le processus de déglycation permettant l’utilisation ultérieure du glucose-6-P par la bactérie. La résolution de la structure de la FL6K par cristallographie et diffraction des rayons X a permis d’identifier son site actif en présence d’ATP, d’ADP et d’AMP-PNP. La modélisation de la fructoselysine au site actif de la kinase a permis d’identifier des résidus pouvant être importants pour sa liaison et son mécanisme enzymatique. De plus, les résultats de cinétique suggèrent que le mécanisme utilisé par la FL6K semble passer par un état ternaire de type SN2. Des modifications structurales à la FL6K pourraient permettre d’augmenter la taille des substrats afin de permettre ultimement la déglycation de protéines. / Some enzymes have been found to deglycate the products of the Maillard reaction between sugars and primary amines: ketoamines. An operon is found in Escherichia coli that allows the growth on fructoselysine media. The deglycation process is done by a kinase and a “deglycase”. The fructoselysine 6-kinase, a member of the PfkB family, phosphorylates its substrate on the sixth carbon to initiate the metabolism of fructoselysine. Here are presented x-ray crystallography structures obtained for the fructoselysine 6-kinase in its native form and bound with ATP, ADP and AMP-PNP. The active site of the kinase has been determined, and modelisation of fructoselysine allowed identification of some residues that might be important for the specific binding of the substrate and the enzymatic mechanism. Kinetic results tend to suggest a SN2 mechanism for the phosphorylation catalyzed by the enzyme. Structural modifications of the FL6K could help to increase the size of the substrates recognized by the enzyme until it binds glycated proteins.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Les grandes propriétés interactives des HS dépendent de leur profil de sulfatation, finement régulé au cours de la biosynthèse du polysaccharide ainsi qu'à la surface cellulaire par l'action d'endosulfatases nommées Sulfs. Ces enzymes ôtent spécifiquement les groupements 6-O-sulfates d'un certain nombre de disaccharides trisulfatés, éléments clés de nombreuses interactions protéines/HS. Ainsi, ces enzymes sont impliquées dans de nombreux processus, autant physiologiques que pathologiques. En utilisant différentes approches (biochimique et biophysique), nous avons révélé récemment que les isoformes humain HSulf-1 et -2 agissent de façon processif et orientées pour désulfater les chaines d’HS ce qui régule différemment les facteurs de croissances FGF-1 et -2 (Seffouh et al., FASEB J. 2013). Nous avons également identifié deux motifs impliqués dans l’interaction HSulf-2/HS et qui se sont avérés importants pour l’activité 6-O-endosulfatase [Manuscrit en préparation]. Par ailleurs, HSulf-2, et contrairement à HSulf-1, s’est révélé porteuse d’une O-glycosylation capable de moduler considérablement son activité à la surface cellulaire [Manuscrit en préparation]. Enfin, et en collaboration avec l’'institut Karolinska (Stockholm, Sweden), une éventuelle implication de Sulf-1 dans le mésothéliome malin a été suggéré (Heidari-Hamedani et al., Cellular Signalling J. 2015). / Heparan sulfate (HS) is a polysaccharide able to bind and modulate a wide variety of proteins. HS large interactive properties are essentially governed by precise sulfation patterns of the polysaccharide. Sulf-1 and Sulf-2 are two endosulfatases able to cleave specific 6-O sulfate groups within HS chains. Their action can modulate critical intracellular signaling processes, many of which with key relevance for cancer development. However, little is known on their structure, substrate specificities, and on the way their catalytic activity directs the subtle modifications of HS 6-O-sulfation profile.In this work, we have identified an original enzymatic mechanism by which Sulfs catalyze the processive and orientated desulfation of HS and finely regulate the polysaccharide biological properties. We also identified two basic motifs within the N-terminal domain of HSulf-2. Recombinant enzymes mutated for these sites were then produced and characterized. We found that these epitopes are necessary for its endosulfatase activity. Altogether, these results provide further insights into the enzyme/substrate recognition process and contribute to the understanding of the fundamental role played by these enzymes in the regulation of HS activity. The biochemical study of the purified HSulf-2 allowed to highlight a O-glycosylation able to significantly modulate its activity at the cell surface. Otherwise, and in collaboration with the Karolinska Institute (Stockholm, Sweden), the study of malignant mesothelioma (MM) provided new evidence that enhanced Syndecan-1 expression also finely modulates HS structure by interfering with HS-modifying enzymes HSulf-1. These results suggest important roles for Syndecan-1 and HSulf-1 in MM.

Dans ce travail, nous avons développé différentes méthodes pour la co-immobilisation sur des électrodes poreuses de carbone de déshydrogénases NAD-dépendantes avec le complexe (2,2'-bipyridyle)(pentaméthylcyclopentadiényl)-rhodium ([Cp*Rh(bpy)Cl]+) pour des applications de synthèse électroenzymatique d’alcools et de sucres chiraux. L'objectif était d'éviter la dégradation de l'activité enzymatique provenant de l'interaction entre les groupes fonctionnels de surface de l'enzyme (-SH, -NH2) et le complexe [Cp*Rh(bpy)Cl]+, et également de permettre le recyclage des catalyseurs. L’électrogreffage de sels de diazonium a été utilisé pour introduire des fonctions alcène et/ou azoture sur une surface de carbone (carbone vitreux plan, feutre de carbone poreux ou couches de nanotubes de carbone). La chimie click « thiol-ène » a été utilisée pour lier de manière covalente une D-sorbitol déshydrogénase modifiée par un tag cystéine (soit 1 ou 2 fragments cystéine à l'extrémité N-terminale de la chaîne polypeptidique) à des électrodes de carbone. Ensuite, la réaction de cyclo-addition de Huisgen alcyne-azoture a été utilisée pour lier le complexe [Cp*Rh(bpy)Cl]+ à l’électrode. Ensuite la co-immobilisation des enzymes redox (D-sorbitol et galactitol déshydrogénases) avec le complexe [Cp*Rh(bpy)Cl]+ a été testée par l'encapsulation des protéines dans une couche de gel de silice, à l'intérieur d'un feutre de carbone poreux préalablement fonctionnalisé par le complexe de rhodium. Le catalyseur est alors stable pendant plusieurs semaines pour la réaction de régénération de NADH, mais cette architecture d'électrode conduit à l'inhibition de l'activité enzymatique, probablement causée par un microenvironnement local (augmentation du pH et de la concentration du produit). La combinaison des chimies clicks « thiol-ène » et cyclo-addition de Huisgen a ensuite été étudiée pour l'immobilisation séquentielle de [Cp*Rh(bpy)Cl]+ et d’une D-sorbitol déshydrogénase porteuse d’un tag cystéine, sur une électrode poreuse bi-fonctionnalisée par les groupes azoture et alcène. Enfin, compte tenu de la différence de durée de vie des enzymes et du complexe [Cp*Rh(bpy)Cl]+ et de la nécessité d'améliorer la séparation de ces éléments du système bioélectrochimique, l’assemblage optimal a été obtenu en associant une couche poreuse de silice dans laquelle est immobilisée l’enzyme avec un papier de nanotubes de carbone fonctionnalisé par le complexe de rhodium. Le catalyseur [Cp*Rh(bpy)Cl]+ pour la régénération de NADH peut être réutilisé successivement avec plusieurs couches de protéines. Ce système optimal a finalement été appliqué à la conversion bioélectrochimique du D-fructose en D-sorbitol / In this work we developed methods for the co-immobilization of NAD-dependent dehydrogenases and the (2,2'-bipyridyl) (pentamethylcyclopentadienyl)-rhodium complex ([Cp*Rh(bpy)Cl]+) on porous carbon electrodes for application in the electroenzymatic synthesis of chiral alcohols and sugars. The goal was to avoid the degradation of the enzymatic activity coming from the interaction of functional groups from the enzyme surface (eg.-SH, -NH2) with [Cp*Rh(bpy)Cl]+ and to promote the recyclability of the catalyst. Diazonium electrografting was used to introduce alkene and azide groups on a carbon surface (flat glassy carbon, porous carbon felt or carbon nanotubes layers). Thiol-ene click chemistry was applied to bind a D-sorbitol dehydrogenase with cysteine tags (either 1 or 2 cysteine moieties at the N terminus of the polypeptide chain) onto carbon electrodes. Azide-alkyne Huisgen cyclo-addition reaction was used to bind an alkyne-modified [Cp*Rh(bpy)Cl]+. Then co-immobilization of the redox enzymes (D-sorbitol and galactitol dehydrogenase) with the complex [Cp*Rh(bpy)Cl]+ was tested by encapsulation of the proteins in a silica gel layer, inside a rhodium-functionalized porous carbon felt. The immobilized [Cp*Rh(bpy)Cl]+ was stable over weeks for NADH regeneration, but this electrode architecture led to the inhibition of the enzymatic activity, possibly because of the local environment (increase of pH and product accumulation in the porous electrode). The combination of ‘thiol-ene’ and Huisgen cyclo-addition was then investigated for sequential immobilization of [Cp*Rh(bpy)Cl]+ and cysteine-tagged D-sorbitol dehydrogenase on an azide-alkene bi-functionalized electrode. Finally, considering the different lifetime of enzymes and [Cp*Rh(bpy)Cl]+ catalyst, and the need for a better separation of these elements from the bioelectrochemical system, the best configuration was achieved by associating a porous silica layer with the immobilized enzyme with a bucky paper of carbon nanotubes functionalized with [Cp*Rh(bpy)Cl]+. The reusability of this functionalized electrode was proved and the designed bioelectrode was successfully applied to a bioelectrochemical conversion of D-fructose to D-sorbitol

La diatomée d'eau douce A. formosa peut produire des lipides neutres en plus ou moins grandes quantités en fonction des conditions de culture. Ainsi, nous avons montré par exemple qu'une carence en silice stimule la production de triacylglycérols (TAGs) mais génère une diminution de la biomasse. En revanche, nous avons montré que l'addition de bicarbonate et de phytohormones augmente à la fois la biomasse et la production de TAGs. L'ajout de phytohormones dans les milieux de culture de cette diatomée résulte en une augmentation de l'activité d'enzymes dans les extraits et notamment celles du cycle de Benson-Calvin. Parmi ces enzymes, la GAPDH est une enzyme dont l'activité augmente significativement. Nous avons montré que chez A. formosa, cette enzyme forme un complexe ternaire avec la CP12 et la Férrédoxine NADP Réductase (FNR) et non pas avec la CP12 et la phosphoribulokinase comme chez la plupart des organismes photosynthétiques. La régulation de cette enzyme en est de fait modifiée. La phytohormone, 24-épibrassinolide conduit à une augmentation d'activité de la GAPDH qui résulte de la dissociation du complexe GAPDH-CP12 et la GAPDH n'est plus redox régulée. La GAPDH chez les diatomées est donc régulée par des interactions protéineprotéine. / A. formosa, a freshwater diatom, can produce different amounts of neutral lipids such as triacylglycerols (TAGs) under different growth conditions. We showed that as it is well-known for diatoms, starvation for silica increased the production of TAGs but decreased biomass. However, the addition of bicarbonate or phytohormones into the growth medium increased both biomass and TAGs. Addition of phytohormones increased the activities of enzymes in particular those of the Benson-Calvin cycle. Among the target enzymes of the Benson-Calvin cycle, GAPDH was strongly affected. We purified this enzyme and demonstrated that, in the diatom A. formosa, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) from the Calvin cycle, forms a complex with the small chloroplast protein CP12 and Ferredoxin NADP Reductase (FNR), which is involved in the photochemical phase of photosynthesis. In cells treated with the phytohormone, 24-epibrassinolide, GAPDH was "free", not redox-regulated and not associated anymore with CP12. Therefore GAPDH from this diatom is regulated by protein-protein interaction but the GAPDH/CP12/FNR complex replaces the one formed between GAPDH, CP12 and phosphoribulokinase found in most photoautotrophs.

Ces travaux de thèse portent sur la conception par voie chimio-enzymatique de polymères amphiphiles issus de glycolipides, capables de s’auto-assembler en phase aqueuse et susceptibles de répondre à des applications de vectorisation de principes actifs. Après une étude préalable des paramètres influents lors de la synthèse enzymatique, huit monomères glycolipidiques porteurs de fonctions esters vinyliques,méthacrylate ou [alpha]-méthylstyrène ont été synthétisés à partir de dérivés d’huile de ricin et de glucose. Les monomères porteurs d’une fonction ester vinylique comme groupement polymérisable ont été copolymérisés en présence d’acétate de vinyle mais les copolymères ainsi formés n’ont pas montré de capacité à s’autoassembler. Les monomères fonctionnalisés par un groupement méthacrylate, ont été copolymérisés en présence de méthacrylate de méthyle ; trois gammes de copolymères ont ainsi été synthétisées par polymérisation radicalaire, les deux premières selon un mécanisme non contrôlé en présence d’un agent de transfert thiolé ou pas et la troisième selon la méthodologie RAFT. Dans tous les cas, des nanoparticules bien définies et stables pendant plusieurs mois ont été obtenues par auto-assemblage de ces trois gammes de copolymères en phase aqueuse. Le Rouge de Nil a été piégé au sein de ces nanoparticules puis relargué par ajout de chlorure de sodium, laissant entrevoir des applications de stabilisation et de vectorisation de principes actifs pour ces nouveaux copolymères. / The aim of this thesis was the conception of amphiphilic polymers able to self-assembly in water forpotential drug delivery applications, from glycolipidic monomers synthesized by a chemo-enzymatic pathway.After a preliminary study of the influent parameters on glycolipid synthesis via enzymatic catalysis, eightmonomers bearing either vinyl ester, methacrylate or a-methylstyrene groups have been synthesized fromglucose and castor oil derivatives. The vinyl ester-bearing monomers have been copolymerized with vinylacetate. Unfortunately, the resulting copolymers did not show interesting self-assembly properties in water.Three families of copolymers were synthesized from the methacrylate-bearing monomers and methylmethacrylate, either by free radical polymerization in the presence or not of a transfer agent or by reversibleaddition-fragmentation polymerization (RAFT). Well-defined and stablenanoparticles were obtained from allthose copolymers. Nile Red was successfully trapped into those nanoparticles and released by adding sodiumchloride, allowing perspectives as potential drug delivery applications for those new copolymers.