Dans des travaux précédents, les liens amides de la Leu-enképhaline, un pentapeptide endogène agoniste des récepteurs opioïdergiques, ont été substitués séquentiellement et systématiquement par des alcènes trans, des esters, des N-méthylamides et des thioamides. Des essais pharmacologiques sur l’affinité et sur l’activité (inhibition de la contraction du mouse vas deferens et phosphorylation de ERK 1 et ERK 2) des composés peptidomimétiques résultants envers le récepteur opioïdergique δ ont démontré que la substitution de l’amide 1 par un alcène, la substitution de l’amide 2 par un thioamide et la substitution de l’amide 4 par un ester, un N-méthylamide ou un thioamide sont des modifications tolérées pour l’obtention de composés ayant une activité agoniste. Cet ouvrage traite de la conception, de la synthèse et de la caractérisation chimique, pharmacologique et physico-chimique de molécules peptidomimétiques dotées de plusieurs de ces isostères (à la même position que celle menant à des composés actifs). Un composé peptidomimétique de la Leu-enképhaline a aussi été synthétisé en substituant l’amide 3 par un fluoroalcène, un isostère jusqu’ici inexploré par notre laboratoire. Les résultats démontrent que les molécules peptidomimétiques dotées de plus d’un isostère gardent, dans certains cas, une bonne affinité pour le récepteur δ. Cependant, des pertes au niveau de l’activité sont observées dans la majorité des cas. D’un point de vue pharmacocinétique, l’approche a permis la synthèse de composés peptidomimétiques ayant un profil plus favorable que celui de la Leu-enképhaline. En effet, tous les composés synthétisés ont démontré une lipophilicité et une résistance enzymatique (sauf dans un cas) accrue par rapport à la Leu-enképhaline.

Les interactions mito-nucléaire sont au centre des fonctions de la mitochondrie, telles que la production d’énergie. Or, peu d’informations sont connues sur comment le génome mitochondrial peut influencer la réponse nucléaire. Les cybrides (hybrides cytoplasmiques) peuvent présenter des modifications phénotypiques (adaptatives ou non) dûe à ces interactions. Dans cette étude, les différents mitotypes (haplotype mitochondriale) de l'espèce Chrosomus eos furent utilisés comme modèle afin d’étudier plus en profondeur les interactions entre les différents génomes d’une cellule. Ce complexe présente en plus du type sauvage, deux types de cybrides, dont les mitochondries proviennent de deux refuges glaciaires différents : Mississippien et Atlantique. Cette étude fut effectuée sur des individus en sympatrie afin de prendre en compte l’influence environnementale. Des populations en allopatrie furent également mesurés séparément afin de complémenter les études précédentes. Afin de répondre à ces objectifs, plusieurs approches furent employées, adressant ainsi divers niveaux d’intégration : la méthylation, la transcription, la protéomique et l’activité enzymatique. Des différences entre les divers mitotypes furent observées, mais de magnitude inférieure à l’influence environnementale. Ce résultat suggère donc que les différences associées au mitotype en sympatrie affecte leur répartition et leur habileté à coloniser différents types d’environnements, créant ainsi la similarité intra-mitotype inter-lac observé dans les études précédentes. Pour adresser l’analyse transcriptomique, une référence a été produite. Cette référence offre beaucoup d’informations pour des applications futures. / The mito-nuclear interactions are at the center of the mitochondrial functions, such as energy production. Despite their importance, little is known about how the influence of the mitochondrial genome on the nuclear genes expressions. The cybrids (cytoplasmic hybrids) can present phenotype modification (adaptive or not) caused by the mito-nuclear interactions. In this study, different mitotype of Cybrids of the Chrosomus eos species were used as model to further study the interaction between a cell’s genomes. This complex of species has two types of cybrids, the mitochondria of which originates from two different glacial refugia : Atlantic and Mississippian. This set up of this study was a sympatric lake, to minimise the environmental factor. Allopatric population were also separately analysed to supplement past studies. To accomplish these goals, multiple methods were used, assessing also multiple levels of gene expression: Methylation, transcription, protein and enzymatic activity. Differences between mitotypes were observed, but of lesser magnitude then the environmental factor. Thus, this result suggest that the differences associated to the sympatric mitotypes drive a deference in environment colonization, which would create the inter-lake intra-mitotype similarity observed in past studies. To assess the transcription of mitotype, a transcriptomic reference was produced. This reference offers a lot of information and future applications.

L’induction de la synthèse d’une acide férulique estérase (AFE) a été étudiée chez Streptomyces ambofaciens ATCC 23877. L’activité la plus élevée a été détectée en présence de son de blé désamidonné ou de xylane d’avoine (0,22, 0,21 mU/mg protéine, respectivement). Des productions d’AFE en bioréacteur ont également été réalisées en utilisant 1% (p/v) de son de blé comme inducteur. Le niveau de production de l’AFE a été trois fois plus important en bioréacteur qu’en fiole d’Erlenmeyer. L’AFE de Streptomyces ambofaciens ATCC 23877 et celle de Humicola sp., présente dans un mélange enzymatique commercial (DepolTM 740L), ont été partiellement purifiées et caractérisées. A l’issue de la purification, l’activité AFE de Streptomyces ambofaciens ATCC 23877 a été trop faible pour pouvoir être utilisée ultérieurement en synthèse. Par contre, le potentiel de l’AFE de Humicola sp., concentrée par précipitation à l’acétone, pour la synthèse de différents esters phénoliques a été testé. Les meilleurs rendements de conversion ont été observés lors de l’absence de substitutions sur le cycle aromatique de l’acide phénolique ou en présence de groupements hydroxyles. Les synthèses en milieu non aqueux (M2B2) se sont montrées infructueuses en raison, peut-être, d’un effet néfaste du solvant sur l’enzyme / The induction of the ferulic acid esterase (FAE) synthesis was studied with Streptomyces ambofaciens ATCC 23877. The highest activity was detected in the presence of either destarched wheat bran or oat spelt xylan (0,22, 0,21 mU/mg protein, respectively). FAE productions in bioreactor were also carried out using 1% (w/v) of wheat bran as inducer. The FAE production level was three times higher in bioreactor than in Erlenmeyer flask. FAE of Streptomyces ambofaciens ATCC 23877 and that of Humicola sp., present in an enzymatic commercial mixture (DepolTM 740L), were partially purified and characterised. At the end of the purification, FAE activity of Streptomyces ambofaciens ATCC 23877 was too weak to be used later in synthesis. However, the FAE potential of Humicola sp., concentrated by acetone precipitation, for the synthesis of various phenolic esters was tested. The best conversion yields were observed in the absence of substitution on the phenolic acid aromatic cycle or in the presence of hydroxyl groups. The synthesis in non-aqueous medium (M2B2) were unsuccessful maybe because of an harmful effect of the solvent on the enzyme

L’hexokinase (HK) est la première enzyme du métabolisme des hexoses et catalyse la réaction qui permet aux hexoses d’entrer dans le pool des hexoses phosphates et donc par le fait même la glycolyse. Bien que le glucose soit son principal substrat, cette enzyme peut aussi phosphoryler le mannose et le fructose. Malgré son importance dans le métabolisme primaire, l’HK n’a jamais été purifiée à homogénéité sous forme native. Le but de ce travail était donc de purifier une isoforme d’HK à partir de tubercule de Solanum tuberosum et par la suite de caractériser ses propriétés cinétiques. Bien avant que je commence mon travail, un groupe de recherche avait déjà séparé et partiellement purifié trois isoformes d’HK de S. tuberosum. Un protocole d’extraction était donc disponible, mais l’HK ainsi extraite était peu stable d’où le besoin d’y apporter certaines modifications. En y ajoutant certains inhibiteurs de protéases ainsi qu’en modifiant les concentrations de certains éléments, le tampon d’extraction ainsi modifié a permis d’obtenir un extrait dont l’activité HK était stable pendant au moins 72h après l’extraction, en empêchant la dégradation. À l’aide du tampon d’extraction optimisé et d’une chromatographie sur colonne de butyl sépharose, il a été possible de séparer 4 isoformes d’HKs. Par la suite, une isoforme d’HK (HK1) a été purifiée à l’homogénéité à l’aide de 5 étapes de chromatographie supplémentaires. En plus de caractériser les propriétés cinétiques de cette enzyme, l’analyse de séquençage par MS/MS a permis de l’associer au produit du gène StHK1 de Solanum tuberosum. Avec une activité spécifique de 10.2 U/mg de protéine, il s’agit de l’HK purifiée avec l’activité spécifique la plus élevée jamais rapportée d’un tissu végétal.L’ensemble des informations recueillies lors de la purification de HK1 a ensuite été utilisée pour commencer la purification d’une deuxième isoforme (HK3). Ce travail a permis de donner des lignes directrices pour la purification de cette isoforme et certains résultats préliminaires sur sa caractérisation enzymatique. / Hexokinase (HK) catalyzes the first step of hexose metabolism by phosphorylating hexose to generate the corresponding hexose phosphate thereby allowing hexose entrance in glycolysis. Even though glucose is the main substrate, HK can also phosphorylate a broad spectrum of hexoses. Despite its importance this enzyme has never been purified to homogeneity in a native form. The aim of this work was therefore to purify this enzyme from Solanum tuberosum tubers and subsequently characterize its kinetic properties. Before I started this work, another group had already separated and partially purified 3 HK isoform from S. tuberosum. An extraction protocol was available but improvement was necessary since the extracted HK had little stability. By adding some protease inhibitors and by modifying the concentration of certain components in the extraction buffer we were able to obtain an extract with a HK activity stable for at least 72 h after extraction by preventing degradation. With this buffer and chromatography on butyl sepharose it was possible to separate 4 HK isoforms from S. tuberosum. After 5 more chromatographic steps, one HK isoform was purified to homogeneity (HK1). This enzyme was characterized and sequenced by MS/MS. We were able to associate this protein sequence with the gene product of StHK1 from S. tuberosum. With a specific activity of 10.2 U/mg of protein, this is the HK with the highest specific activity ever reported from a plant tissue. All the information gathered while purifying HK1 was used to undertake the purification of a second isoform (HK3). We were able to obtain preliminary results on its kinetic properties.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Les plantations d'Eucalyptus, au Congo (région de Pointe-Noire) comme au Maroc (forêt de la Maâmora), soulèvent des controverses quant à leurs effets sur des sols sableux pauvres en matière organique. Dans un enjeu de développement durable de tels écosystèmes anthropiques, les recherches sur le sujet se sont multipliées. Toutefois, les connaissances relatives au fonctionnement biologique des sols sous ces plantations méritent encore d'être approfondies. Principaux acteurs de ce fonctionnement biologique, les organismes vivant dans ces sols et leurs activités ne sont que trop peu décrites, et nécessitent en ce sens de se trouver au cœur des études sur le sujet. Notre travail de thèse s'inscrit dans ces problématiques. Ainsi, nous évaluons les conséquences du reboisement sur les communautés de la macrofaune et des microorganismes de ces sols, et également l'activité des enzymes clés liées aux principaux cycles biogéochimiques (C, N et P).Cette recherche présente la particularité de la prise en compte simultanée de deux facteurs peu souvent évoqués, que sont, l'« âge des plantations » et la « profondeur du sol ». Nous avons abordé ces questions par une étude multi-échelle.Ainsi, nous avons étudié les macroinvertébrés quant à leur diversité taxonomique et à leur composition verticale, selon une approche combinée (TSPF + carré anglais). Par la suite, les premières caractérisations de structure et de diversité des communautés microbiennes ont été réalisées. Ceci, par mesure de densité et par déterminations morphotypiques (cultures in vitro) et génétiques (DGGE), au niveau des communautés totales. Par mesure du potentiel métabolique pour ce qui est des communautés fonctionnelles (plaques Biolog). Enfin, l'activité biologique des sols a été évaluée en mesurant l'activité de huit enzymes et l'activité microbienne globale (hydrolyse FDA).Ainsi, par comparaison à la forêt naturelle adjacente, cette étude nous a permis de mettre en évidence que l'introduction d'eucalyptus sur savane (Congo) ou sur chêne-liège dégradé (Maroc), modifie la structure et la diversité des communautés de la macrofaune et des microorganismes du sol ainsi que le profil des activités enzymatiques. Aussi bien en fonction de l'âge des plantations que de la profondeur du sol, ceci est valable. C'est le fonctionnement biologique qui se trouve donc impacté.Les proportions et les conséquences de cet impact restent toutefois particulières à chaque cas. Il faut cependant noter exception pour les activités enzymatiques liées au cycle de l'azote, qui apparaissent influencées de façon comparable dans les deux cas à l'étude. Ces activités diminuent significativement avec l'âge du peuplement, confirmant le statut déficitaire en azote de ce type de plantation. / Eucalyptus plantations in Congo (Pointe-Noire region) and in Morocco (Mamora forest) raised certain controversies regarding their effects on the sandy poor soils. In such anthropogenic ecosystems, researches on the subject have multiplied in order to ensure their sustainable management. However, knowledge on the biological functioning of soils in these plantations still needs to be explored. Main actors of this biological functioning are soil organisms and their activities which have been described very little, and need to be more studied. Our thesis encompasses this problematic. Therefore, we evaluated the impact of reforestation on the communities of macrofauna and microorganisms of soil, and the activity of different key enzymes, as well, related to main biogeochemical cycles (C, N and P). This research presents, particularly, a simultaneous consideration of two factors rarely mentioned before: the "age of the plantations" and "soil depth". We addressed these issues by a multi-scale study. We studied macroinvertebrates by their taxonomic diversity and vertically composition by a combined approach (TSPF + English square). Subsequently, the characterization of structure and diversity of microbial communities was done by density measurements, morphotype-specific (in-vitro culture) and the genetic determinations (DGGE) and by measuring the metabolic potential in terms of functional communities (Biolog plates). Finally, soil biological activity was evaluated by determining the activity of eight different enzymes and the total microbial activity (FDA hydrolysis).Therefore, as compared to the adjacent natural forest soils, this study allowed us to demonstrate that the introduction of eucalyptus plantations, in savanna (Congo) or in degraded cork oak ecosystem (Morocco), alters the structure and diversity of macrofauna communities, soil microorganisms and the enzymatic activity profiles. Consequently, the biological functioning of the soils is impacted both in terms of the age of plantations and soil depth. However, the proportions and the consequences of this impact were very specific in each case, with the exception of enzymatic activities related to the nitrogen cycle, which influenced comparatively in both studies. These activities decreased significantly along with the stand age of eucalyptus plantations, confirming the deficient status of nitrogen in such plantations.

La demande en composés chiraux est en plein essor ces dernières années. Pour accéder à leur synthèse, la biocatalyse, couplée à l’irradiation pourrait être une méthode innovante. Il existe en effet de nombreux cas dans la littérature où l’utilisation de micro-onde semble avoir un effet activateur sur l’efficacité enzymatique.Cependant, l’effet de l’irradiation micro-onde est mal compris et controversé. Le but de cette thèse était d’étudier l’impact de l’irradiation micro-onde sur des lipases, immobilisées ou non, en étudiant différentes réactions modèles, allant de la résolution d’alcools secondaires linéaires simples à la résolution de polyols complexes, et alcools polyfonctionalisés, par comparaison entre chauffage sous irradiation micro-onde (en conditions drastiques ou non) au chauffage classique. L’étude de l’irradiation micro-onde sur la stabilité enzymatique et sur paramètres intrinsèques de l’enzyme après modification des paramètres réactionnels a permis de mettre en évidence un rôle indéniable de l’irradiation micro-onde sur l’efficacité des réactions enzymatiques. Il a été possible d’une part de diminuer de façon importante les temps réactionnels, comparé au chauffage traditionnel,et d’autre part de contrôler efficacement l’énantio préférence et la sélectivité de la lipase pour l’obtention de molécules d’intérêt. Par des procédés innovants, l’impact de la puissance d’irradiation a été montré comme hautement dépendant du modèle réactionnel étudié. En optimisant les conditions réactionnelles pour obtenir les meilleures sélectivités et activités enzymatique sous irradiation micro-onde, la synthèse de a-hydroxyamides chiraux et de polyols parfaitement résolus a pu être entreprise de façon rapide, propre, tout en respectant les principes de chimie verte. / Chiral molecules demand is booming in recent years. Biocatalyse under microwave irradiation is found to be an attractive way to synthesise these molecules. Indeed, in the literature, some cases show an activation effect on the enzymatic efficiency by microwave irradiation, compared to classical heating. However, the effect of microwave irradiation is not well understood and controversial. The aim of his PhD was to study the impact of the microwave irradiation on some lipases, immobilized or not. Different model reactions were studied from secondary linear alcohol resolution, to the resolution of more complex polyols or polyfunctionalized secondary alcohols comparing the microwave heating (in drastic conditions or not) to the classical heating. Studying the enzymatic stability and intrinsic parameters after modifying the reaction parameters, we observed a clearly microwave effect on the efficiency of the enzymatic resolutions. Using microwave heating, it could be possible to decrease, in an important way, the reaction time, compared to the classical heating and to control the énantiopréférence of the lipase to efficiently obtain chiral product. Trough innovative processes, the impact of the irradiation has been studied and it depends on the model reaction.Optimizing the conditions to obtain the best enzyme selectivities and activities under microwave irradiation, we could synthesise chiral a-hydroxyamides and polyols, in a rapid, clean way, respecting the principles of green chemistry.

Le travail présenté dans ce manuscrit a pour objectif la synthèse d'analogues sélectifs NTS2 de la neurotensine et l'étude de leur potentiel analgésique. La faible biodisponibilité de la neurotensine, caractérisée par sa courte durée de demi-vie et le non passage de la barrière hémato-encéphalique, est l'un des problèmes majeurs pour son activité biologique. Dans un premier temps, nous avons développé la synthèse d'aminoacides non naturels hydrophobes : la (triméthyl)silylalanine, des glycines N-substituées et des α-aminoacides insaturés, alliant la non reconnaissance par les enzymes et l'amélioration du passage des membranes. Puis, certains d'entre eux ont été incorporés à la séquence minimale active NT[8-13] afin d'évaluer leur impact sur l'affinité et/ou l'activité de ce fragment. Pour cela, nous avons synthétisé une série de peptides et pseudopeptides afin d'étudier d'une part leur affinité vers les récepteurs NTS1 et NTS2 et, pour certains d'entre eux, leur activité in vivo par des expérimentations sur le modèle de la douleur en collaboration avec l'université de Sherbrooke. Enfin, nous avons préparé une première série d'analogues de la neuromédine, agoniste des récepteurs de la NT et métabolite issu d'un précurseur commun, la pro-neurotensine. / The aim of this work concerns the synthesis of selective NTS2 neurotensin analogues as potent antinociceptive agents followed by biological activities studies. Poor bioavailability of neurotensin is one of the major obstacles for therapeutic effects. Indeed, this tridecapeptide has a short half-life time due to enzymatic degradation and is too hydrophilic to cross blood-brain barrier. First, we developed different methods to obtain hydrophobic unnatural amino acids like (trimethyl)silylalanine, N-substituted glycines and unsatured α-amino acids. All these peptide building blocks combine lipophilic properties facilitating membrane permeability and enzymatic unrecognition advantages. Some of them have been incorporated in the C-terminal active fragment NT[8-13] in order to evaluate their impact on affinity and/or biological activities. Thus, a series of new peptides and pseudopeptides was prepared and in vivo behavior was studied using a pain model designed in Sherbrooke university. Finally, we synthesized new analogues of neuromedin which is a neurotensin agonist issued from a common precursor, the pro-neurotensine.

Issue de l'Archaea extrêmophile Sulfolobus solfataricus, SsoPox est une enzyme à fort potentiel biotechnologique du fait de son extrême stabilité. Nous avons caractérisé son activité lactonase naturelle ainsi que son activité de promiscuité phosphotriestérase. Elle est capable d'hydrolyser les organophosphorés (OPs), des agents neurotoxiques utilisés en tant qu'insecticide et arme chimique de guerre dont les méthodes actuelles de décontamination restent insatisfaisantes. Non optimale, l'activité phosphotriestérase de SsoPox a été améliorée en redessiné in silico son site actif de afin qu'il ressemble à celui des PTEs, hydrolysant très efficacement les OPs. L'enzyme ainsi développée offre des perspectives d'utilisation pour la décontamination des pollutions aux OPs. L'activité lactonase de l'enzyme a également été améliorée envers certaines N-Acyl Homosérine Lactones (AHLs), des molécules impliquées dans la communication inter-bactérienne (quorum sensing). Or, le quorum sensing régule notamment la virulence bactérienne (e.g. Pseudomonas aeruginosa). Ainsi, l'utilisation de lactonases telles que SsoPox constituerait une alternative aux antibiotiques par interférence au quorum sensing (i.e. quorum quenching). L'ensemble de ces travaux a conduit au dépôt d'un brevet protégeant les séquences des variants améliorés ainsi que leurs domaines d'applications. Ils permirent également d'étudier des phénomènes clés dans l'évolution des enzymes tels que l'épistasie, la promiscuité et la flexibilisation. Ce projet, mêlant Sciences fondamentales et appliquées, pourrait, in fine, mener à la valorisation d'un projet de recherche académique. / Issued from the extremophilic Archaea Sulfolobus solfataricus, SsoPox exhibits an important biotechnological potential because of its extreme stability. Belonging to the phosphotriesterase-like lactonase family, its natural lactonase and promiscuous phosphotriesterase activities were characterized. The enzyme is able to hydrolyze organophosphates (OPs), i.e. nerve agents used as insecticides and chemical warfare agents for which current methods of decontamination are unsatisfactory. The phosphotriesterase activity of SsoPox is suboptimal unlike some mesophilic enzymes (PTEs). To develop a robust bio-decontaminant of OPs, we redesigned, in silico, SsoPox active site in the aim to mimic that of PTEs. Using a mutation database in an in vitro evolution protocol, we screened, selected and characterized efficient enzymes for OPs insecticides hydrolysis, offering prospects in OPs decontamination. SsoPox lactonase activity was also improved for some N-Acyl Homoserine Lactones (AHLs), molecules involved in the inter-bacterial communication (quorum sensing). Quorum sensing regulates several functions such as virulence of some pathogens (e.g. Pseudomonas aeruginosa). The use of lactonases such as SsoPox could constitute an alternative to antibiotics by quorum sensing (and thus virulence) inhibition (i.e. quorum quenching). These works were patented, protecting the sequences of improved variants and their fields of application. They also allowed to study key phenomena in enzyme evolution such as epistasis, promiscuity and flexibility. This project, combining basic and applied Sciences, could lead, in fine, to the promotion of an academic research project.