La résistance à la chimiothérapie constitue un frein majeur à son efficacité. Notre équipe a récemment pu montrer que le masitinib, un nouvel inhibiteur de protéines tyrosine kinases, possède une activité de resensibilisation des cellules tumorales résistantes à la chimiothérapie lorsqu'il est combiné à certaines chimio-drogues. L'objectif des travaux de cette thèse est de déterminer les voies de signalisation, modulées par l'action du masitinib, qui sont impliquées dans la resensibilisation aux chimiothérapies et amélioration de l'activité anti-tumorale.Dans la première partie de la thèse, nous avons pu identifier la nucléoside kinase dCK (désoxycytidine kinase), protéine activatrice d'un grand nombre de chimiothérapies, comme nouvelle cible du masitinib. Cette première étude nous a permis de mettre en évidence un nouveau concept thérapeutique: le masitinib, un composé chimique de type inhibiteur de protéines tyrosine kinases, peut jouer en même temps le rôle d'activateur de nucléoside kinase.Nous avons pu mettre en évidence dans la deuxième partie de la thèse que le traitement combiné entre l'épi-drogue décitabine et le masitinib peut être plus efficace pour la réexpression de certains gènes non ou peu induits par la décitabine seule.En conclusion, ces travaux nous ont permis de mettre en évidence l'interaction entre un inhibiteur de protéine tyrosine kinases et une nucléoside kinase, dans un concept d'activation enzymatique qui pourra certainement servir de base pour l'élaboration de nouvelles petites molécules chimiques spécifiques de l'activation de dCK ou d'autres nucléosides kinases nécessaires à l'activation des drogues de chimiothérapie. / Resistance to chemotherapy is considered as one of the major blockers of its efficacy. Recently, our team demonstrated that masitinib, a new tyrosine kinases inhibitor, possesse a resensitization activity of cell lines resistant to chemotherapy when associated with chemodrugs.The aim of this work is to determine signaling pathways, modulated by masitinib action, that could explain the resensitization to chemotherapy and improvement of anti-tumoral activity.In the first part of this work, we identified the nucleoside kinase dCK (deoxycytidine kinase), a chemotherapy activating protein, as a new target of masitinib. In summary, this first part of the work allowed us to describe a new and never described concept: masitinib, a small molecule belonging to tyrosine kinases group, can also play a role as nucleoside kinase activator.We were able to demonstrate through the second part of the work that the combined treatment of the epidrug decitabine and masitinib can be more effective than decitabine treatment for the re-expression of some genes non or weakly induced by decitabine when used alone.In conclusion, These data allowed us to introduce an interaction between a tyrosine kinases inhibitor and a nucleoside kinase, as an enzymatic activation new concept. This could be used as a base for the design of new small chemical molecules specific for dCK or other nucleoside kinases essential for the activation of chemodrugs. This concept will obviously help to imagine and evaluate more potential therapeutic combinations of chemodrugs and small chemical molecules to overcome the resistance to chemotherapy dependent on nucleoside kinases.

L’imagerie par résonnance magnétique trouve depuis ces dernières années des applications notables dans le domaine de l’imagerie moléculaire, qui représente un atout considérable pour l’investigation et la compréhension des processus biologiques. Des agents de contraste dits « intelligents » et spécifiques du processus physiologique que l’on souhaite détecter (pH, température, concentration en ion métallique, métabolite, etc.) sont alors développés. Cette thèse se concentre sur le développement et l’étude de nouveaux agents de contraste conçus pour la détection spécifique de l’activité enzymatique. Ces agents consistent en un complexe de lanthanide paramagnétique de type LnDO3A couplés par le biais d’un espaceur (auto-immolable par exemple) au substrat spécifique de l’enzyme ciblée. Après coupure du substrat par l’enzyme, la structure chimique de l’agent de contraste est modifiée entrainant des variations significatives de la relaxivité et des propriétés paraCEST des complexes. La caractérisation physico-chimique de certains complexes de Ln³⁺ et de Mn²⁺ a été réalisée. Les complexes de Gd³⁺ étudiés ont eu des réponses enzymatiques T1 prometteuses et les complexes de Ln³⁺ paramagnétiques étudiés (autres que Gd³⁺) ont montré une possible détection paraCEST de l’activité enzymatique. Les paramètres influençant l’effet CEST (structure moléculaire du complexe, choix du lanthanide, etc.) ont également été mis en évidence. Cependant la coupure enzymatique de certains composés reste encore à améliorer. / Over the past years, Magnetic Resonance Imaging has found significant applications in the field of molecular imaging, which is a considerable asset for investigating and understanding biological processes. Towards this objective, smart or responsive contrast agents (CA) which are specific of the physiological phenomenon that we aim to visualize (pH, temperature, metal ion concentration, metabolites, etc.) have been widely explored. This thesis focuses on the synthesis and the investigation of novel CAs designed for specific detection of enzyme activities. These CAs consist of a DO3A-type lanthanide chelate coupled via a spacer (e.g. a self-immolative linker) to an enzyme-specific substrate. After cleavage of the substrate by the enzyme, the CA’s chemical structure is modified leading to significant variations in the relaxivity or the paraCEST properties of the complexes. In this context, the physical chemical characterization of several Ln³⁺ and Mn²⁺ complexes has been achieved. Some Gd³⁺ complexes showed promising T1 responses while other paramagnetic Ln³⁺ complexes (Ln³⁺ = other than Gd³⁺) exhibited interesting paraCEST properties for enzymatic detection. The parameters affecting CEST properties (e.g. molecular structure of the complex, choice of lanthanide, etc.) have also been widely investigated. Nevertheless, the enzymatic cleavage of some compounds still need to be improved.

La transformation des produits marins génère d’importantes quantités de rejets. La majorité est transformée pour des applications de masse avec une faible valeur ajoutée. Au Nouveau Brunswick, 85 000 tonnes de produits marins sont transformés annuellement et la moitié est peu ou pas valorisée, c’est le cas de l’holothurie Cucumaria frondosa. Face aux différentes pressions de leur environnement, et notamment la prédation, ces invertébrés marins ont évolué en développant des métabolites d’une large chimiodiversité, ce qui en fait d’excellents candidats pour le développement de substances naturelles bioactives. L’objectif de cette étude a tout d’abord été de chercher à valoriser les coproduits majeurs de Cucumaria frondosa en constituant une large librairie d’extraits et en évaluant, par fractionnement bioguidé, les activités antiherpétiques in vitro des fractions obtenues par différents procédés d’extraction (extractions par solvants et hydrolyses enzymatiques). Nous avons pu mettre en évidence la présence de fractions anti-VHS-1 (Virus Herpes Simplex de type 1). L’hydrolyse enzymatique s’est avérée être une technique efficace pour la génération de substances actives. Le bulbe aquapharyngé peu considéré d’un point de vue industriel représente un réel potentiel pour l’extraction de composés anti-VHS-1, et notamment lorsque celui-ci est hydrolysé par la papaïne en conditions contrôlées. L’activité antiherpétique la plus efficace a été reliée à la présence de molécules à haut poids moléculaires. Dans un second temps, nous avons cherché à comprendre et à mettre en évidence les mécanismes de défense de l’holothurie par l’étude de ces métabolites secondaires relargués en situation de stress. Les métabolites ont été évalués sur différents modèles écotoxicologiques et les molécules actives ont été caractérisées par fractionnement bioguidé par l’utilisation de modèle d’évaluation de cytotoxicité, en parallèle à différents procédés analytiques. L’étude a confirmé l’existence et la production de composés toxiques relargués en situation de stress. Ces métabolites secondaires ont montré une forte toxicité sur différents modèles écotoxicologiques chronique et aiguë. Le fractionnement bioguidé par couplage analytique nous a conduit à l’identification de plusieurs composés du type glycoside triterpénique et notamment le Frondoside A retrouvé dans la fraction responsable de la cytotoxicité. L’étude a permis d’optimiser l’extraction de ce composé d’un intérêt biologique prometteur sans pour autant entraîner la mort de l’animal. / The transformation of marine products generates huge quantities of rejects. The majority of these rejects is used for an upgrading of products with low added value. In New Brunswick, 85 000 tons of marine products are transformed annually, the half is little or not upgraded, that is the case of the holothurian Cucumaria frondosa. Confronted with environmental pressures, and especially predation, the marine invertebrates have evolved and developed various metabolites of different chemical classes. Thus, these metabolites represent ideal candidates for the development of new natural bioactive substances. The objectives of this study was first based on the upgrading of the major byproducts from Cucumaria frondosa by creating a wide library of extracts obtained by different type of extractions (solvent extractions and enzymatic hydrolysis) and then, by bioguided fractionation, evaluating the in vitro anti-HSV-1 (Herpes Simplex Virus, type 1) activities of the fractions. We showed the presence of potent antiherpetic fractions without cytotoxicity on mammalian cells. The enzymatic hydrolysis has been demonstrated to be efficient for the generation of high molecular weight active substances regarding HSV-1. The aquapharyngeal bulb, considered to be less used industrially, represents a real potential for the extraction of anti-HSV-1 compounds, and especially when hydrolyzed by papain under controlled conditions. Secondly, we have searched to understand the mechanism of defense of the holothurian under stress conditions. The secondary metabolites involved were evaluated on different ecotoxicological models. This work has confirmed the existence and the production of toxic compounds released under stress conditions. These secondary metabolites have shown a strong toxicity on acute and chronic ecotoxicological models. The bioguided fractionation assisted by analytical evaluation led to the identification of several triterpene glycosides, and especially the Frondoside A into the cytotoxic fraction. This study has permitted the optimization of the upgrading of the byproducts from Cucumaria frondosa by the extraction of antiherpetic molecules without cytotoxicity and the identification and the characterization of the defense

Une série d'homopolymères tels que poly(L-lactide) (PLLA), poly(triméthylène carbonate) (PTMC), poly (e-caprolactone) (PCL) et les copolymers ont été synthétisés par polymérisation par ouverture de cycles de monomère appropriés en utilisant du zinc lactate ou octanoate d'étain comme catalyseur. Leurs propriétés thermiques, dégradation hydrolytique, dégradation enzymatique, propriétés mécaniques et comportement à mémoire de forme ont été étudiées à l'aide de DSC, RMN, SEC, ESEM, DMA et machine à traction Instron. Les copolymères de triméthylène carbonate et DL-lactide (PTDLA) peuvent être dégradés non seulement par simple hydrolyse, mais aussi par la protéinase K. Le copolymère PTDLA composé de 50/50 TMC/LA est très élastique, Tg servant de température de transition entre les formes temporaire et permanente. Le PTMC ne peut pas être dégradé par simple hydrolyse ou par la protéinase K, mais peut être dégradé par les lipases de Candida Antarctica et Hog Pancreas. La biocompatibilité des PLLA, PTMC, PCL, PTLLA, PTDLA et PTCA a été évaluée par des expériences d'hémolyse, adhésion des plaquettes, MTT et culture cellulaire. Les résultats montrent des tous les polymères présentent très bonnes propriétés hémolytiques et anti-coagulantes, bonne adhésion, propagation et prolifération des cellules. / A series of homopolymers such as poly(L-lactide) (PLLA), poly(trimethylene carbonate) (PTMC), poly(e-caprolactone) (PCL) and various copolymers were synthesized by ring opening polymerization of appropriate monomer feeds using zinc lactate or stannous octoate as catalyst. Their thermal properties, hydrolytic degradation, enzymatic degradation, mechanical properties and shape memory behavior were investigated by using DSC, NMR, SEC, ESEM, DMA and Instron tensile instrument. Among the various polymers, copolymers of trimethylene carbonate and DL-lactide (PTDLA) can be degraded not only by pure hydrolysis, but also by proteinase K. PTDLA composed of the same TMC and LA contents is highly elastic, Tg acting as the switch temperature between temporary and permanent shapes. PTMC cannot be degraded by pure hydrolysis or by proteinase K, but can be degraded by lipases from Candida Antarctica or Hog Pancreas. The biocompatibility of PLLA, PTMC, PCL, PTLLA, PTDLA and PTCA was evaluated from haemolysis experiments, platelet adhesion, MTT assay and cell culture. The results showed that all the polymers present outstanding haemolytic and anti-coagulant properties, and good cellular adhesion, spreading and proliferation.

L'émergence de bactéries résistantes aux antibiotiques constitue un problème majeur de santé publique responsable d'un nombre croissant de décès, surtout dans les hôpitaux. La résistance aux aminoglycosides est principalement due à l'expression d'enzymes capables de les modifier, comme les aminoglycosides phosphotransférases (APH).Le premier volet de ce travail de thèse vise à mieux comprendre les bases moléculaires des interactions protéine-ligands et de la catalyse enzymatique d'une de ces enzymes, l'APH(2”)-IVa. La spécificité de substrats a été caractérisée en détails pour différents aminoglycosides par des méthodes thermodynamiques, de mesures cinétiques à l'état stationnaire et transitoire, par amarrage moléculaire et cristallographie aux rayons X. La seconde partie de cette étude consiste à développer et optimiser des inhibiteurs allostériques de ces enzymes capables de restaurer l'efficacité des aminoglycosides. Pour cela, une cavité, potentiellement impliquée dans la dynamique de l'APH(2”)-IVa, a été identifiée à partir de simulations de dynamique moléculaire. Celle-ci a servi de cible pour cribler, in silico, 12 000 composés issus de la banque de données Zinc. Ainsi, 14 composés ont été testés in vitro pour leur capacité à diminuer l'activité enzymatique d'APH. Parmi ces derniers, une molécule s'est révélée être un inhibiteur non-compétitif de l'APH(2”)-IVa. Une étude des relations structure-fonction a permis de déterminer les groupements les plus favorables à l'inhibition et d'identifier un composé plus efficace. L'utilisation de ces deux molécules permet de restaurer, par exemple, la sensibilité à la sisomicine d'une souche d'E. faecium exprimant cette enzyme. Cette étude fournit des bases au développement de thérapies combinant un aminoglycoside et un inhibiteur des enzymes d'inactivation constituant une stratégie pour lutter contre la résistance aux antibiotiques dans un contexte thérapeutique. / Emergence of multi-drug resistant bacteria leads to increasing fatal issues especially in hospitals. Resistance to aminoglycoside antibiotics is mainly due to the expression of modifying enzymes, such as aminoglycoside phosphotransferases (APH). The first aim of this project was to elucidate the molecular basis of protein-ligand interactions and catalysis of one of these enzymes, the APH(2”)-IVa. Promiscuity of aminoglycoside substrates has thus been characterized in details using thermodynamics, transient and steady state kinetics, molecular docking and X-ray crystallography techniques.The second part aimed to develop and optimize allosteric inhibitors of these enzymes able to counterbalance aminoglycoside resistance. For this purpose, a small cavity, potentially involved in APH dynamics, was identified from molecular dynamic simulations. This cavity was used as a target to virtually screen 12 000 compounds of the Zinc database. The efficiency of the 14 high-ranked molecules to inhibit APH was evaluated in vitro and lead to the identification of a non-competitive inhibitor of APH(2”)-IVa. Structure-activity relationships highlighted the most favourable substituents for APH inhibition and permitted to obtain a more potent compound. The two molecules were able to restore, for example, sisomicin susceptibility of an E. faecium strain, expressing this enzyme.This study provides a basis for the development of combined chemotherapies (antibiotic with enzyme inhibitor) which may overcome antibiotic resistance in a clinical context.

Les applications des cellules souches pluripotentes humaines (CSP) dans le domaine biomédical sont particulièrement prometteuses, aussi bien au niveau expérimental qu’au niveau clinique. Leur utilisation comme source inépuisable de cellules permettant de tester et développer de nouvelles molécules thérapeutiques (notamment par modélisation de pathologies in vitro, criblage haut-débit et tests de cytotoxicité) s’ajoute à l’important potentiel qu’elles présentent en médecine régénérative et en thérapie cellulaire. Utilisables comme matériel biologique permettant de restaurer partiellement ou totalement un organe ou un tissu défaillant, il reste essentiel de vérifier l’intégrité génétique des lignées cellulaires utilisées afin de garantir une utilisation sécurisée pour le patient. Parmi les facteurs responsables de l’apparition d’anomalies génétiques chez les CSP, les conditions cultures jouent un rôle essentiel. Des techniques de culture inadaptées peuvent facilement provoquer l’émergence d’une instabilité génomique. Toute altération doit être détectée et documentée afin de pouvoir définir des critères d’acceptation préalable à leur utilisation clinique.Les CSP sont des cellules particulièrement sensibles au stress qui peut résulter de techniques de repiquage inappropriées. La dérive génétique qui découle de ce stress peut être précoce et apparaître dès les premiers passages des lignées cultivées. Notre équipe a pu tester de nombreuses méthodes de repiquage sur différentes lignées cellulaires pluripotentes. Nous avons notamment observé que des anomalies génétiques majeures caryotypiques (trisomies) et infra-caryotypiques (SNPs) ainsi que des changements phénotypiques (survie augmentée, acquisition de mobilité) apparaissaient rapidement suite à l’utilisation de techniques de repiquage basées sur l’utilisation d’enzyme de dissociation (TryPLE). Ces altérations apparaissent dans des lignées qui s’adaptent progressivement à la dissociation en cellules uniques (dissociation « single-cell ») provoquées par ces enzymes.Notre équipe étudie les conséquences cellulaires liées à ce phénomène d’adaptation des CSP provoquée par la dissociation « single-cell ». Grâce à des techniques de séquençage dernière génération (RNA-Seq), nous avons comparé les profils transcriptomiques de CSP repiquées par des techniques standard (comme le passage mécanique) et par des techniques basées sur la dissociation « single-cell » (comme le passage enzymatique par TryPLE). Cette comparaison a montré au niveau transcriptionnel une surexpression spectaculaire d’ARNs non codants appartenant à une classe récemment décrite : les longs ARNs non codants (lncRNAs).L’objectif principal de ce travail de thèse a été d’évaluer le niveau d’implication de ces lncRNAs dans le processus d’adaptation des CSP en culture, et leur rôle fonctionnel potentiel. Nous avons ainsi dans un premier temps déterminé in silico quels lncRNAs étaient différentiellement exprimés dans les CSP adaptées, et après validation expérimentale par biologie moléculaire des candidats les plus prometteurs, nous avons utilisé des tests fonctionnels (notamment par RNA interférence (siRNA)) afin de déterminer le rôle de ces lncRNAs dans la machinerie cellulaire et la pluripotence des CSP. Autour de ce projet principal, nous avons essayé de comprendre les mécanismes régissant les changements phénotypiques et comportementaux provoquées par la dissociation « single-cell ». Nous avons notamment pu suggérer la mise en place d’un phénomène de transition épithélio-mésenchymateuse (EMT) chez des CSP dissociées. Enfin, l’attractivité que représente un sujet d’étude récent comme les lncRNAs et la disponibilité croissante de publications les concernant nous ont poussé à publier une revue approfondie ainsi qu’une méta-analyse sur l’implication des longs ARN non codants dans le développement précoce de l’embryon et dans les cellules souches pluripotentes. / The actual and future applications of human pluripotent stem cells (PSC) in the biomedical field are highly promising. Their use for the discovery of new therapeutic drugs through the development of high-throughput screening tests, cytotoxicity tests and in vitro disease modeling has been added to their tremendous interests in regenerative medicine and cellular therapy. As a source of biological material that can be used to restore partially or totally the lost functions of a damaged organ or tissue, or as a source of normal cells to study human development or test putative new drugs, their genomic integrity has to be thoroughly assessed. Therefore, an effective optimization of their culture conditions has to be considered, in order to control the absence of genomic instability and prevent their potential emergence. Any genetic or epigenetic alteration resulting from cell culturing must be detected in order to define and characterize acceptance criteria for scientific and medical purposes.PSC are particularly sensitive to stress resulting from unappropriated passaging techniques, which cause rapid genetic drift. Indeed, our team observed that many genomic abnormalities arise from aggressive single cell, enzymatic based, passaging methods, and that substantial phenotypical changes such as increased survival after cell dissociation and variation in cell shape can then occur.In order to understand the mechanisms governing the emergence of those adverse alterations, the team focused on the consequences resulting from the adaptation of PSC to single-cell dissociation. By using new generation sequencing techniques as RNA-Seq, we compared transcriptomics of PSC passaged by standard techniques (such as mechanical passaging) versus single-cell enzymatic dissociation (such as TRyPLE-based single-cell passaging). This comparison showed that the most striking difference in the gene expression pattern between adapted and non adapted cells concerned the dramatic overexpression of RNAs from a recently discovered class: long non-coding RNAs (lncRNAs).The aim of this thesis work was to determine to which extent some of these lncRNAs were functionally linked to adaptation of PSC. In order to address this matter, we first investigated in silico which lncRNAs were upregulated by single-cell dissociation, and after experimental validation of lncRNA candidates by molecular biology, we performed functional in vitro analysis (notably by siRNA-mediated loss of function) and sought their cellular localization in order to decipher their role in the cellular machinery and their level of implication. Beside this main project, other auxiliary projects were grafted. The observation of major changes in cell phenotype and behavior led to the investigation of the global mechanisms governing these modifications, underlining the potential role of epithelial-to-mesenchymal transition provoked by single-cell dissociation. Finally, the global attractiveness of lncRNAs and the emergence of exponential documentation concerning non-coding RNAs prompted the writing of an extensive review and meta-analysis concerning the implications of lncRNAs during embryo development and in pluripotent stem cells.

La valorisation non alimentaire de la biomasse végétale représente un enjeu actuel majeur dans le contexte du développement de la bioraffinerie végétale. En Champagne-Ardenne, la transformation des co-produits d'origine agricole fait l'objet d'études importantes. Le son et la paille, co-produits abondants de la filière blé, sont riches en hémicelluloses, polysaccharides constitués essentiellement de pentoses, majoritairement de D-xylose. La principale voie de valorisation des pentoses tels que le xylose est leur fonctionnalisation par voie chimique, mais l'utilisation d'enzymes telles que des xylanases et des β-xylosidases représente une voie de synthèse plus respectueuse de l'environnement et permettant, en outre, d'accéder à de nouvelles molécules inaccessibles par la voie chimique classique (DP plus importants). L'étude conduite dans le cadre de la thèse a concerné l'évaluation et l'amélioration de la synthèse enzymatique par transglycosylation d'alkyl xylosides et oligoxylosides catalysée par une β-xylosidase et deux xylanases. Une seconde voie de valorisation enzymatique a été étudiée, à savoir la synthèse de xylosides et oligoxylosides présentant des propriétés biologiques pouvant notamment être exploitées pour des applications cosmétiques. A travers la mutagénèse dirigée au niveau du sous-site aglycone d'une β-xylosidase de Bacillus halodurans, nous avons montré l'importance de résidus aromatiques de ce sous-site sur les capacités d'hydrolyse et de transglycosylation de l'enzyme. Les résultats obtenus nous ont permis de dégager quelques pistes d'ingénierie du sous-site aglycone de la xylosidase pour optimiser les rendements de transglycosylation en présence d'alcools à longues chaînes carbonées. L'étude de l'effet des conditions réactionnelles sur la synthèse d'alkyl oligoxylosides catalysée par deux xylanases (l'une de Thermobacillus xylanilyticus, l'autre commerciale) a montré la possibilité de produire les alkyl oligoxylosides par voie enzymatique avec des rendements satisfaisants, notamment en réduisant les problèmes physiques d'accessibilité de l'alcool au site actif de l'enzyme. Nous avons également mis en évidence des profils de synthèse différents d'une enzyme à l'autre mais également en fonction des conditions réactionnelles, notamment en ce qui concerne le DP moyen. Notre étude montre également que la synthèse d'alkyl oligoxylosides est possible directement à partir de son de blé prétraité par voie hydrothermale. En ce qui concerne les propriétés physico-chimiques des produits de transglycosylation, nous avons montré que, tout en étant non purifiés, les pentyl et octyl β-D-oligoxylosides obtenus par synthèse enzymatique présentent des propriétés comparables à celles de produits commerciaux utilisés pour leurs propriétés tensio-actives. L'étude de méthodes de synthèse enzymatiques et chimio-enzymatique de xylosides et d'oligoxylosides ciblés pour certaines propriétés biologiques a montré que les deux xylanases étudiées précédemment pouvaient utiliser en tant qu'accepteur, en plus des alcools linéaires, des alcools aromatiques, des diols ou encore un ester ou un alcyne, ce qui a permis d'accéder à des produits originaux. Des tests biologiques réalisés sur des fibroblastes humains, ont montré que les xylosides et oligoxylosides ainsi produits ne sont pas cytotoxiques. Des tests sur l'initiation de la biosynthèse de glycosaminoglycanes, menés avec certains produits, ont conduit à des résultats positifs pour la biosynthèse d'acide hyaluronique. / Non-food valorization of plant biomass currently represents a major challenge in the context of plant biorefinery. In Champagne-Ardenne, the processing of agricultural by-products is the subject of numerous studies. Wheat bran and straw are abundant agricultural by-products and are rich in hemicelluloses, which are polysaccharides essentially constituted by pentoses, mainly D-xylose. The major route for the valorization of pentoses such as xylose is their functionalization by chemical means. Nevertheless, the use of enzymes, such as xylanases and β-xylosidases, represents a more environmentally friendly way and can also lead to the synthesis of new molecules inaccessible through conventional chemistry. The study conducted during the PhD concerned the evaluation and the improvement of the enzymatic synthesis by transglycosylation of alkyl xylosides and oligoxylosides catalyzed by a β-xylosidase and two xylanases. The second pathway for enzymatic valorization investigated was the synthesis of xylosides and oligoxylosides with biological properties that could be applied for cosmetic use.By site-directed mutagenesis in the aglycone subsite of a β-xylosidase from Bacillus halodurans, we have shown the role of aromatic residues on the hydrolysis and transglycosylation capabilities of the enzyme. The results obtained allowed us to identify some engineering of the aglycone subsite of the β-xylosidase to optimize the transglycosylation yields in the presence of alcohols with long carbon chains.The study of the effect of the reaction conditions on the synthesis of alkyl oligoxylosides catalyzed by two xylanases (one from Thermobacillus xylanilyticus and other is commercially available) has shown the ability to produce alkyl oligoxylosides by enzymatic synthesis with acceptable yields. We also pointed out that, depending on the reaction conditions, the products obtained were different particularly as regards the average DP. Our study has also shown that the synthesis of alkyl oligoxylosides is possible directly from hydrothermally pretreated wheat bran. Concerning the physico-chemical properties of transglycosylation products, we have demonstrated that non purified pentyl and octyl β-D-oligoxylosides obtained by enzymatic transglycosylation exhibit similar properties than commercial products used for their surface-active properties. The study of enzymatic an chemo-enzymatic methods for the synthesis of xylosides and oligoxylosides targeted for their biological properties showed that both xylanases previously studied could use linear alcohols but also aromatic alcohols, diols, ester or alkyne alcohols as acceptors for the preparation of original compounds. Biological tests performed on human fibroblasts pointed out that the xylosides and oligoxylosides produced are not cytotoxic. Initiation of the biosynthesis of glycosaminoglycans tested with some of the products has led to positive results for the synthesis of hyaluronic acid by the fibroblasts.

L'élimination des protéines est une étape clé lors de la production du vin blanc afin d'éviter l'apparition éventuelle d'un voile inoffensif mais inesthétique. Des solutions de rechange à l'utilisation de la bentonite sont activement recherchées en raison des problèmes technologiques, organoleptiques et de durabilité associés à son utilisation. Dans cette étude, MpAPr1, une protéase aspartique extracellulaire préalablement isolée et partiellement caractérisée à partir de la levure Metschnikowia pulcherrima, a été clonée et exprimée de manière hétérologue dans la levure Komagataella pastoris. Les propriétés enzymatiques de MpAPr1 ont été initialement caractérisées dans un extrait brut. Après plusieurs essais faisant appel à différentes techniques, MpAPr1 a été purifié avec succès par chromatographie échangeuse de cations. Son activité contre les protéines de raisin a été initialement testée dans une solution modèle dans des conditions environnementales optimales pour l'activité de MpAPr1 puis dans celles qui règnent lors de la vinification. Ensuite, l'activité de MpAPr1 a été évaluée dans du moût de raisin et au cours de la fermentation alcoolique. La présence de MpAPr1, supplémenté au moût de raisin, a entraîné une dégradation partielle des protéines de raisin tout au long de la fermentation et une légère différence dans la composition en composés volatils du vin. L'étude a confirmé que les protéases aspartiques pourraient représenter une alternative à la bentonite pour l'industrie du vin et que les levures non-Saccharomyces telles que M. pulcherrima pourraient avoir un impact bénéfique sur les propriétés du vin. / Protein removal is a key step during the production of white wine in order to avoid the possible appearance of a harmless but unsightly haze. Alternatives to the use of bentonite are actively sought because of technological, organoleptic and sustainability issues associated with its use. In this study, MpAPr1, an extracellular aspartic protease previously isolated and partially characterised from the yeast Metschnikowia pulcherrima, was cloned and expressed heterologously in Komagataella pastoris. Enzymatic properties of MpAPr1 were initially characterised in a crude extract. After several attempts using different techniques, MpAPr1 was successfully purified via cation exchange chromatography. Its activity against haze-forming grape proteins was initially tested in a model solution under optimal environmental conditions for MpAPr1 activity and under those occurring during winemaking. Thereafter, MpAPr1 activity was evaluated in grape must and throughout alcoholic fermentation. The presence of MpAPr1, supplemented to grape must, resulted in the partial degradation of grape proteins throughout fermentation and ultimately in a slight difference in the wine’s composition in volatile compounds. The study provides further evidence that aspartic proteases could represent a potential alternative to bentonite for the wine industry and that non-Saccharomyces yeasts such as M. pulcherrima could have a beneficial impact on wine properties.

La bioluminescence est un processus complexe dans lequel la réaction chimique d'un substrat, catalysée par une protéine, entraîne l'apparition d'une émission de lumière dans le spectre visible. Dans le cas des lucioles, un insecte émettant dans le domaine du jaune-vert, le substrat se nomme luciférine et la protéine luciférase. Cependant, la taille et la complexité de ce système chimique limite sa compréhension, notamment celle du mécanisme réactionnel.L'apport de la chimie théorique dans ce domaine est essentiel et a prouvé son utilité dans de nombreux cas. L'utilisation de la méthode QM/MM, méthode hybride couplant la mécanique quantique et la mécanique moléculaire permet de modéliser et d'étudier ces systèmes biologiques.Cette thèse se focalise sur deux approches différentes de l'étude de la bioluminescence chez les lucioles. La première consiste à étudier l'effet de certaines modifications chimiques sur la couleur de la bioluminescence. On s'intéresse plus particulièrement à un analogue de la luciférine et à certaines luciférases issues d'autres systèmes bioluminescents. Par cette étude on cherche à rationaliser et à prédire l'effet ainsi que l’impact de ces changements sur l’émission. Le deuxième sujet explore deux étapes du mécanisme réactionnel de la bioluminescence: d'une part, la coordination du dioxygène sur un intermédiaire de la réaction, une étape encore non étudiée et d'autre part la réaction de tautomérisation dans l'état excité et au sein de la protéine entre deux formes émissives possibles de la luciférine / The bioluminescence is a complex process that involves the reaction of a substrate, catalysed by an enzyme that sheds light in the visible spectra. In fireflies, the light emitted has a yellow-green tone thanks to the interaction between the substrate luciferin and the protein luciferase. However the size and the complexity of the system prevent its comprehension especially when dealing with the reaction mechanism.The use of computational chemistry is key to understand and improve the comprehension of the bioluminescence. The hybrid QM/MM method that combines quantum mechanics with molecular mechanics is a great tool to model and study bioluminescent systems.This thesis deals with two different approaches of the bioluminescence in fireflies. The first one is related to the study of chemical modifications that tune the emission colour. We will discuss about one analogue of the luciferin and on new luciferases from others bioluminescent species. The goals of this study are to rationalise and predict both the effect and the impact of these modifications on the emission. The second subject deals with two different steps of the bioluminescent mechanism. The first one discusses the binding of the dioxygen to the bioluminescent intermediate, which was so far unstudied and the second one about the tautomerization in the excited state and in the protein of two possible emissive forms of the luciferin

La nutrition azotée des bactéries et des plantes est actuellement un sujet de grande importance, notamment pour comprendre comment améliorer les voies métaboliques aboutissant à l’assimilation de l’azote et à plus grande échelle, optimiser des apports d’engrais et augmenter le rendement des cultures. Dans ce contexte, la réaction d’amidation catalysée par la glutamine synthétase (GS), qui fixe l’ammonium (NH₄)⁺ en glutamine, est cruciale car elle est à la fois le point d’entrée de l’azote dans les végétaux, et une étape-clef du recyclage de l’azote (en particulier, NH₄⁺ photorespiratoire). Dans cette étude, nous nous sommes intéressés à la cinétique enzymatique et au mécanisme chimique de la GS. Des systèmes analytiques (HPLC, RMN , GC-MS) ont  été optimisés pour permettre la mesure de l’activité enzymatique in vitro et pour réaliser des analyses par spectrométrie de masse à ratio isotopique. Avec ces techniques, nous avons pu regarder précisément les effets isotopiques ¹²C/¹³C, ¹⁴N/¹⁵N et H₂O/D₂O (solvant) lors de la catalyse, en utilisant la GS d’E. coli et d’Arabidopsis thaliana (GS1,2). Nos résultats montrent qu’il n’y a pas d’effet isotopique ¹²C/¹³C, mais qu’il y a un fractionnement ¹⁴N/¹⁵N de »16‰. En outre, il y a un effet inverse du solvant (réaction 1.5 à 2 fois plus rapide dans D₂O).  Cela suggère que la création de la liaison C----N (amidation) est partiellement limitante (engagement catalytique de »14% seulement) et que le réseau de ponts hydrogènes dans le site actif est crucial pour déterminer la vitesse de la réaction. L’apparition d’effets ¹⁴N/¹⁵N inverses dans certaines circonstances et les effets drastiques causés par une substitution du cofacteur métallique (Mg²⁺) suggèrent en outre que l’étape d’amidation peut être réversible et que la coordination par un métal joue un rôle très important pour stabiliser les intermédiaires de la réaction, en interaction avec le solvant. Ainsi, dans son solvant naturel qu’est H₂O, la GS réalise une réaction ‘chimiquement difficile’ (barrière énergétique élevée de l’amidation) rendue possible par le clivage de l’ATP et son caractère exergonique. / Nitrogen nutrition in bacteria and plants is currently an important topic, in particular to identify key points for metabolic improvements in N assimilation and more generally, to optimize fertilization and crop yield. In such a context, the amidation reaction catalyzed by glutamine synthetase (GS), which fixes ammonium (NH₄)⁺ into glutamine, is of crucial importance since it both represents the N entry in plants and the main step of N recycling (such as photorespiratory (NH₄)⁺. Here, we examined GS kinetics and chemical mechanism. Analytical methods (HPLC, NMR, GC-MS) have been set up so as to measure in vitro activities and isotopic abundance by isotope ratio mass spectrometry. These gave access to isotope effects (¹²C/¹³C, ¹⁴N/¹⁵N et H₂O/D₂O – solvent) during catalysis, with the GS from either E. coli or A. thaliana (GS1,2). Our results show that there no ¹²C/¹³C isotope effect but there is significant ¹⁴N/¹⁵N isotope fractionation of ca. 16‰. In addition, there is an inverse solvent isotope effect (reaction 1.5 to 2 times faster in D₂O). This suggests that forming the C----N bond (amidation) is partially rate-limiting (catalytic commitment of ca. 14% only) and the H-bond network in the active site is of substantial importance for the reaction rate. The occurrence of inverse ¹⁴N/¹⁵N isotope effects under certain circumstances as well as the drastic impact of changing the metal cofactor (Mg²⁺)) indicate that the amidation step can be reversible and that the coordination by the metal plays a key role in stabilizing reaction intermediates, by interfacing the solvent. In other words, in its natural solvent H₂O, the GS catalyses an intrinsically ‘difficult’ reaction (high energy barrier of amidation) made possible by both ATP cleavage and its exergonic nature.