En raison des restrictions législatives de plus en plus sévères sur la pollution de l'environnement, les industries laitières font face au fil des dernières années à un défi crucial de valorisation des grandes quantités de lactosérum générées. Ainsi, grâce aux récents progrès technologiques et scientifiques ainsi que la forte croissance du marché d'ingrédients biofonctionnels, une voie de valorisation plus efficiente et prometteuse du lactosérum a émergé. En effet, au cours des dernières années, plusieurs études ont démontré que les attributs nutritionnels et biofonctionnels du lactosérum sont particulièrement liés à ses protéines qui constituent une source optimale d'ingrédients alimentaires fonctionnels et de peptides bioactifs. Ainsi, la β-lactoglobuline (β-lg), protéine majeure du lactosérum est un additif fréquemment utilisé dans une large gamme de produits alimentaires en raison de ses excellentes propriétés biofonctionnelles, de sa valeur nutritionnelle élevée et de son faible coût. Ces propriétés biofonctionnelles de la β-lg peuvent être améliorées par différentes méthodes de traitement, notamment les traitements physiques, chimiques et enzymatiques. Cependant, en raison de sa structure globulaire compacte, la β-lg sous sa forme native est relativement résistante aux modifications. Bien que les traitements conventionnels soient efficaces pour améliorer les propriétés structurelles et fonctionnelles des protéines ainsi que la production de peptides biologiquement actifs, ils sont cependant consommateurs de ressources et peuvent affecter négativement la qualité des produits finaux. Par conséquent, l'application de méthodes de traitement physique non thermique émergentes s'avère nécessaire. Ainsi, dans le cadre de ce projet doctoral, les traitements électriques à hauts voltages (TEHV) respectueux de l'environnement, notamment les champs électriques pulsés (CEP) et les arcs électriques (ARC) ont été utilisés comme méthode de prétraitement de la β-lg. Un prétraitement thermique de la β-lg a été effectué afin de comparer l'efficacité des prétraitements par TEHV avec l'approche conventionnelle. De ce fait, les échantillons de β-lg préchauffés étaient considérés comme témoin positif et ceux de la forme native, comme témoin négatif. L'effet des prétraitements sur les propriétés fonctionnelles de la β-lg a été évalué. De même, l'impact des TEHV et du prétraitement thermique sur la structure de la β-lg et sa susceptibilité à l'hydrolyse trypsique et chymotrypsique a été étudié. La chromatographie liquide ultra-performante couplée à la spectrométrie de masse en tandem (UPLC-MS/MS) a été utilisée afin d'analyser et de caractériser les fractions peptidiques issus des différents hydrolysats de la β-lg. De plus, les scores d'éco-efficience (EE) de génération de peptides après hydrolyses trypsique et chymotrypsique ont été calculés dans le but de déterminer laquelle des méthodes de prétraitement était la plus efficiente. Les résultats ont démontré une amélioration des propriétés fonctionnelles (propriétés moussantes, émulsifiantes et d'hygroscopicité) de la β-lg favorisée par l'impact positif des TEHV sur sa structure secondaire. En effet, les analyses structurales ont montré que les TEHV ont induit une modification partielle de la conformation de la β-lg. Une telle modification structurelle a eu pour conséquence une augmentation du degré d'hydrolyse (DH) de près de 2 fois après prétraitement par TEHV comparée à la protéine native. Dans le cas du prétraitement par chauffage conventionnel, l'augmentation du DH était d'environ 1,2 fois comparée à la protéine native. Ces résultats ont été confirmés par l'amélioration des paramètres cinétiques de la β-lg à l'état d'équilibre, après les TEHV. Par ailleurs, une différence significative a été observée entre la trypsine et la chymotrypsine quant au DH et l'efficacité catalytique des deux enzymes. En effet, les constantes d'efficacité catalytique de la chymotrypsine étaient plus élevées que celles de la trypsine, suggérant une meilleure affinité de la chymotrypsine pour la protéine par rapport à la trypsine. En outre, l'analyse des échantillons prétraités en UPLC-MS/MS a démontré que l'application des TEHV a conduit à la libération de peptides à partir des molécules de β-lg avant même l'ajout de trypsine et de chymotrypsine aux milieux réactionnels. De plus, les TEHV ont généré en moyenne 37 à 50 % plus de peptides que les protéines natives et préchauffées. Enfin, l'analyse de l'EE a révélé que les TEHV constituaient une méthode de prétraitement plus éco-efficiente que la méthode conventionnelle car leurs scores EE étaient plus élevés tant pour les procédés d'hydrolyse que pour les peptides bioactifs résultant de l'hydrolyse. Cette thèse apporte également de nouveaux éléments de compréhension quant à la valorisation multidirectionnelle des protéines du lactosérum. / Due to increasingly severe legislative restrictions on environmental pollution, dairy industries have faced over the past few years a crucial challenge of valuing the large quantities of whey generated. Thus, thanks to recent technological and scientific progress as well as the important growth of the biofunctional ingredients market, a more efficient and promising way of whey valorization has emerged. Indeed, in recent years, several studies have demonstrated that the nutritional and biofunctional attributes of whey are particularly linked to its proteins, which constitute an optimal source of functional food ingredients and bioactive peptides. Therefore, ß-lactoglobulin (β-lg), a major whey protein is an additive frequently used in a wide range of food products due to its excellent biofunctional properties, its high nutritional value and its low cost. These biofunctional properties of β-lg can be improved by different treatment methods, including physical, chemical and enzymatic ones. However, due to its compact globular structure, β-lg in its native form is relatively resistant to modifications. Although conventional treatments are effective in improving the structural and functional properties of proteins as well as the production of biologically active peptides, they are nonetheless resource intensive and can negatively affect the quality of final products. Therefore, the application of emerging non-thermal physical treatment methods is necessary. Thus, in the frame of this doctoral project, sustainably high-voltage electrical treatments (HVET), namely pulsed electric fields (PEF) and electric arcs (ARC) were used as pretreatment method of β-lg. Thermal pretreatment of β-lg was performed in order to compare the efficiency of HVET pretreatments with the conventional approach. Therefore, the preheated β-lg samples were considered as positive control and those of the native one as negative control. The effect of pretreatments on the functional properties of β-lg was evaluated. Likewise, the impact of HVET and heat pretreatments on the structure of β-lg and its susceptibility to tryptic and chymotryptic hydrolyses was investigated. Ultra-performance liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS) was used to analyze and characterize the peptide fractions from the various hydrolysates of β-lg. In addition, the eco-efficiency (EE) scores of peptide generation after tryptic and chymotryptic hydrolyses were calculated in order to determine which of the performed pretreatment methods was the most efficient. The results demonstrated an improvement in the functional properties (foaming, emulsifying and hygroscopicity properties) of β-lg promoted by the positive impact of HVET on its secondary structure. Indeed, structural analyzes have shown that HVET induced a partial modification of the conformation of β-lg. Such structural modification resulted in almost 2-times increase in the degree of hydrolysis (DH) after HVET pretreatments compared to the native protein. In the case of the conventional heating pretreatment, the increase in DH was approximately 1.2-times compared to native protein. These results were confirmed by the improvement in the kinetic parameters of β-lg at steady state after HVET. Furthermore, a significant difference was observed between trypsin and chymotrypsin with regard to DH and the catalytic efficiency of the two enzymes. Indeed, the catalytic efficiency constants of chymotrypsin were higher than those of trypsin, suggesting a better affinity of chymotrypsin with the protein compared to trypsin. In addition, the UPLC-MS MS analysis of pretreated samples demonstrated that the application of HVET led to the release of peptides from β-lg molecules even before the addition of trypsin and chymotrypsin to the reaction media. Additionally, the HVET have generated in average 37-50% more peptides than native and preheated proteins. Finally, the EE analysis revealed that HVET were the most efficient pretreatment method than the conventional one as their EE scores were higher for both hydrolysis processes and bioactive peptides generated from performed hydrolyses. This thesis highlights new understanding elements regarding the multidirectional valorization of whey proteins.

Les protéines du jaune d’œuf délipidées sont considérées comme un sous-produit lors de l’extraction lipidique en raison de la perte de leurs propriétés fonctionnelles. Les protéines du jaune d’oeuf existent sous forme de lipoprotéines, à l’exception de la phosvitine et des livétines. Les phosphopeptides issus de l’hydrolyse de la phosvitine possèdent une activité antioxydante pouvant conduire à des applications industrielles dans le secteur alimentaire et/ou nutraceutique. Le fractionnement de la phosvitine à partir du jaune d’œuf constitue une étape nécessaire en vue de la production de phosphopeptides. Cependant, cette méthode n’est pas applicable à grande échelle en vue de la production de phosphopeptides. Le but de ce projet était de développer une approche technologique applicable à l’échelle industrielle pour la production de la phosvitine par séparation membranaire à partir d’un extrait commercial de jaune d’œuf délipidé et pour la production de peptides antioxydant combinant l’hydrolyse enzymatique et l’ultrafiltration (UF). Un extrait de phosvitine à été obtenu à partir d’un produit commercial de jaune d’oeuf délipidé, au moyen d’une precipitation par NaCl (10% p/v), d’une centrifugation et d’une étape d’UF et de diafiltration. L’effet des conditions de filtration (pH, concentration, pression transmembranaire, seuil de coupure de la membrane) sur le flux de permeation a été évalué. La récupération protéique et la capacité de dessalage de solution de phosvitine ont été comparables pour des membranes d’UF de seuil de coupure de 10 et 30 kDa, mais le flux de perméation a été plus élevé avec la membrane de 30 kDa. L’électrophorèse 2D a été effectué afin de caractériser la composition protéique d’un produit commercial de protéines de jaune d’oeuf délipidé et de ses fractions obtenues précédement par UF. La plupart des produits de clivage de la vitellogénine ont été identifiés dans l’extrait de phosvitine. Néanmoins, le profil protéique des rétentats d’UF a montré des profils différents par rapport à la composition protéique des protéines du jaune d’oeuf frais. Les résultats suggèrent que la concentration par UF affecte la composition protéique. Les protéines du jaune d’oeuf et les phosphoprotéines ont été hydrolysées au moyen de la trypsine, ou encore, par une combinaison de deux enzymes (Alcalase et Protease N). Les hydrolysats obtenus ont été fractionnés à l’aide des membranes d’UF de seuil de coupure de 5 et 1 kDa. L’activité antioxydante des fractions a été mesurée par le test Oxygen Radical Absorbance Capacity (ORAC). La fraction peptidique produite par l’hydrolyse trypsique a montré l’activité antioxydante la plus élevée (1501.1–1886.8 µM TE.g-1 de protéines). L’activité antioxydante des hydrolysats de protéines de jaune d’oeuf pourrait être reliée à la teneur en phosphore des peptides, mais aussi à d’autres facteurs comme la masse moléculaire et la composition en acides aminés de ces peptides. L’hydrolyse enzymatique des protéines du jaune d’oeuf et l’utilisation de l’UF ont permis de produire des fractions peptidiques possédant une activité antioxydante et d’augmenter l’activité de ces peptides. Ce procédé utilisant l’hydrolyse enzymatique et l’UF offre un potentiel intéressant pour valoriser les propriétés fonctionelles et nutraceutiques des protéines du jaune d’œuf. / Delipidated egg yolk proteins are considered as a by-product in the process of the lipid and protein separation. The major proportion of yolk protein exits as lipoproteins except for phosvitin and livetins. Hen egg yolk phosphopeptides from phosvitin have demonstrated free radical scavenging and antioxidant activities against lipid peroxidation. Moreover, phosphopeptides have also been shown to provide an effective defense against oxidative stress in human intestinal epithelial cells. However, the method for producing these peptides was not applicable at large scale. The goal of this study was to develop and scale up the production of phosvitin from a commercially available delipidated egg yolk proteins and the production of antioxidant egg peptides by mean of enzymatic hydrolysis and ultrafiltration (UF). Egg yolk phosvitin was concentrated and desalted from delipidated egg yolk protein by a process that involved first a salting-out with 10% NaCl (w/w) treatment followed by UF and diafiltration. Various filtration parameters such as pH, feed concentration, transmembrane pressure and molecular weight cut-off (MWCO) membranes were studied. Results showed that performance of the 10 and 30 kDa MWCO UF membranes tested were similar in terms of production and desalting capacity. However, difference in terms of permeation flux during UF was noticed with the use of the 30 kDa MWCO membrane. Two-dimensional gel electrophoresis was performed to characterize the protein composition of the commercially delipidated egg yolk proteins and its UF-fractions obtained previously. Most of the vitellogenin cleavage products were identified in the crude phosvitin. Nevertheless, as compared to protein composition of fresh egg yolk, the UF-retentate profiles showed different patterns which suggest that egg yolk protein composition is modified as a result of UF-concentration. Fractionation of phosphopeptides by sequential UF with MWCO of 5 kDa and 1 kDa was performed to produce peptide fractions with increased antioxidant capacity. Antioxidant capacity was quantified by oxygen radical absorbance capacity (ORAC) assay to determine proton-donating capacities of the egg yolk hydrolysates. The peptide fractions with the greatest antioxidant capacity (1501.1–1886.8 µM TE.g-1 protein) were produced by enzymatic hydrolysis with trypsin alone and presented some common features such as low molecular weight, composition in amino acids and phosphorus content. The enzymatic hydrolysis of phosphoproteins from commercially delipidated egg yolk proteins obtained by UF successfully produced peptide fractions with antioxidant activity, which can be increased through fractionation. The process studied in this project offers the possibility to produce egg yolk peptides with potential uses in functional and nutraceutical applications.

Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2012-2013. / Le réchauffement climatique est un problème de plus en plus préoccupant pour la communauté scientifique. La plupart des experts affirment qu'une solution temporaire à ce problème consiste à réduire les émissions de CO2. Un moyen efficace permettant de réduire les émissions de CO2 tout en continuant à exploiter les ressources mondiales de pétrole et de charbon est la capture du CO2. La dernière décennie a vue naître une technologie des plus novatrices dans le domaine de la capture du CO2 soit l'utilisation de l'anhydrase carbonique, une enzyme catalysant la réaction d'hydratation du CO2 de façon très efficace (kh » ÎOV1 ). Ce projet de maîtrise présente une étude cinétique de l'hydratation du CO2 en présence de l'anhydrase carbonique humaine de type II (l'hCA II) immobilisée, réalisée à l'aide d'un microréacteur enzymatique. Présentement, l'utilisation de cette enzyme à des fins industrielles est très limitée. Le travail présenté ici est innovateur; à notre connaissance, aucune étude similaire impliquant l'enzyme immobilisée n'est disponible dans la littérature ouverte. Cette étude cinétique contribuera ultérieurement au design d'un réacteur monolithique enzymatique destiné à la capture du CO2. La réalisation de cette étude cinétique a nécessité plusieurs étapes préliminaires : la production de l'enzyme, l'immobilisation de l'enzyme et la caractérisation de l'immobilisation. Les résultats expérimentaux ont démontré que la contribution du biocatalyseur sur la réaction globale d'hydratation du CO2 augmente avec l'augmentation du débit volumétrique et l'augmentation de la concentration initiale en molécules de tampon non protonées, ainsi qu'avec la diminution de la concentration initiale en CO2. Un modèle cinétique de l'hydratation catalytique du CO2 par l'hCA II immobilisée basé sur un mécanisme Quad Quad Iso Ping-pong aléatoire a aussi été développé grâce aux résultats expérimentaux.

Les protéines extraites des végétaux sont des matériaux relativement peu coûteux, non toxiques, biocompatibles et biodégradables. Elles représentent une bonne alternative aux protéines d’origine animale et aux polymères dérivés du pétrole. Dans le cadre de cette étude, les protéines extraites de graines de soja et de tournesol ont été utilisées en tant que matériaux enrobants pour la microencapsulation de la matière active hydrophobe (α-tocophérol) ou hydrophile (acide ascorbique) par le procédé d’atomisation. Les protéines de soja sont largement utilisées dans les applications alimentaires et non-alimentaires, notamment en microencapsulation. Elles sont donc étudiées dans ce travail comme matériau enrobant de référence. Les protéines de tournesol n’ont quant à elles pas d’application industrielle concrète, si ce n’est sous la forme de tourteaux dans l’alimentation animale. C’est pourquoi il nous semble pertinent de trouver des nouvelles voies de valorisation pour ce coproduit d’origine agricole. Plusieurs modifications des protéines, telles que l’hydrolyse enzymatique, l’acylation, la réticulation enzymatique et la cationisation ont été étudiées dans le but d’améliorer les propriétés encapsulantes du matériau enrobant. Dans le contexte de la chimie verte, toutes les modifications ont été effectuées sans utilisation de solvants organiques ni de catalyseurs chimiques. L’influence des modifications chimiques et enzymatiques des protéines, et des paramètres du procédé (pression d’homogénéisation, ratio matériau enrobant/matière active et concentration en protéines) sur les différentes caractéristiques des préparations liquides et des microparticules (viscosité, taille des gouttelettes dans le cas des émulsions, morphologie et taille des microparticules), ainsi que sur les paramètres liés au procédé d’atomisation (rendement et efficacité de microencapsulation) a été particulièrement étudiée au cours de ce travail. Les résultats obtenus confirment que l’extrait protéique de tournesol est tout à fait pertinent comme matériau enrobant et permet d’obtenir des efficacités de microencapsulation significativement plus élevées par rapport à celles obtenues avec l’extrait protéique de soja. / Proteins extracted from vegetables are relatively low-cost, non-toxic, biocompatible and biodegradable raw materials. They represent a good alternative to animal-based proteins and petroleum-extracted polymers. In this study, proteins derived from soybean and sunflower seeds were used as wall materials for microencapsulation of hydrophobic (-tocopherol) or hydrophilic (ascorbic acid) active material by spray-drying technique. Soybean proteins are widely used in food and non-food applications, especially in microencapsulation. They were studied in this work as wall material of reference. Sunflower proteins are not actually used in industrial application, but only in the form of oil-cake for animal feeding. That’s why new ways of valorization of this agricultural by-product should be investigated. Several proteins’ modifications such as enzymatic hydrolysis, acylation, cross-linking and cationization were studied in order to improve encapsulating properties of wall material. In the context of green chemistry, all the modifications and preparations were performed without use of organic solvents and chemical catalysts. The effect of protein chemical and enzymatic modifications, and process parameters (homogenization pressure, wall/core ratio and protein concentration) on different characteristics of liquid preparations and microparticles (viscosity, emulsion droplet size, microparticle size and morphology) and on parameters related to the spray-drying process (yield and efficiency of microencapsulation) was particularly investigated in this study. The obtained results confirmed that sunflower proteins are quite suitable as encapsulating agent and provide the microencapsulation efficiencies significantly higher compared to those obtained with soy proteins.

L'ADN, support de l'information génétique, est constamment soumis à des stress l'endommageant. Ceci peut conduire à des modifications structurales de la molécule d'ADN et à des conséquences biologiques néfastes de type mutagénèse ou cancérogénèse. Les lésions de l'ADN peuvent être réparées par des complexes enzymatiques qui restaurent la séquence originale. Dans le présent travail nous nous sommes intéressés aux aspects structuraux des lésions de l'ADN et à leur réparation par excision de base (BER) ou par réversion (RR). Notre travail a consisté à développer un nouvel outil de type biopuce pour détecter ces activités de réparation par mesure de fluorescence. Pour cela des oligonucléotides lésés auto-complémentaires ont été immobilisés sur des lames de verre. Après avoir mis au point les conditions d'immobilisation, par la chimie click, nous avons validé ce nouveau biocapteur pour la détection d'activités de réparation d'enzymes purifiées (glycosylases et AP-endonucléases) ou au sein d'extraits cellulaires. Utilisant un principe similaire, nous avons adapté cette biopuce pour mesurer les activités de réparation par réversion ainsi que pour le screening d'inhibiteurs. Dans une seconde partie de ce travail, nous avons appliqué la technique de résonance paramagnétique électronique pulsée (RPE pulsée) pour étudier la déformation structurale induite par plusieurs dommages de l'ADN. Pour cela nous avons développé une méthode de multi-marquage de l'ADN par des radicaux nitroxydes. Cette technique a alors été appliquée pour la première fois à la détection d'une activité enzymatique de réparation de l'ADN.

Quelques enzymes sont connus pour déglyquer les kétoamines résultants de la réaction de Maillard entre des sucres et des amines primaires. Il a été démontré qu’Escherichia coli possède un opéron afin de métaboliser la fructoselysine. La fructoselysine 6-kinase, de la famille des PfkB, initie le processus de déglycation permettant l’utilisation ultérieure du glucose-6-P par la bactérie. La résolution de la structure de la FL6K par cristallographie et diffraction des rayons X a permis d’identifier son site actif en présence d’ATP, d’ADP et d’AMP-PNP. La modélisation de la fructoselysine au site actif de la kinase a permis d’identifier des résidus pouvant être importants pour sa liaison et son mécanisme enzymatique. De plus, les résultats de cinétique suggèrent que le mécanisme utilisé par la FL6K semble passer par un état ternaire de type SN2. Des modifications structurales à la FL6K pourraient permettre d’augmenter la taille des substrats afin de permettre ultimement la déglycation de protéines. / Some enzymes have been found to deglycate the products of the Maillard reaction between sugars and primary amines: ketoamines. An operon is found in Escherichia coli that allows the growth on fructoselysine media. The deglycation process is done by a kinase and a “deglycase”. The fructoselysine 6-kinase, a member of the PfkB family, phosphorylates its substrate on the sixth carbon to initiate the metabolism of fructoselysine. Here are presented x-ray crystallography structures obtained for the fructoselysine 6-kinase in its native form and bound with ATP, ADP and AMP-PNP. The active site of the kinase has been determined, and modelisation of fructoselysine allowed identification of some residues that might be important for the specific binding of the substrate and the enzymatic mechanism. Kinetic results tend to suggest a SN2 mechanism for the phosphorylation catalyzed by the enzyme. Structural modifications of the FL6K could help to increase the size of the substrates recognized by the enzyme until it binds glycated proteins.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

La lipémie postprandiale se caractérise par une augmentation des lipoprotéines riches en triglycérides après un repas, et joue un rôle important dans la biodisponibilité des lipides alimentaires pour les tissus périphériques. En effet, une lipémie postprandiale élevée est souvent associée à l'obésité et à une dyslipidémie, deux composantes du syndrome métabolique qui peuvent engendrer des complications médicales, incluant diabète et maladies cardiovasculaires. La lactoferrine (Lf) inhibe l'épuration hépatique des chylomicrons, conduisant à une élévation de la lipémie postprandiale par des mécanismes moléculaires non élucidés. Il est aussi établi que le Lipolysis Stimulated Receptor (LSR) contribuait à l'épuration des lipoprotéines riches en triglycérides pendant la phase postprandiale. L'objectif était de déterminer s'il existait une interaction entre la Lf et le LSR. Les études de cultures cellulaires ont montré que si la Lf n'affectait pas le taux d'expression du LSR dans des cellules Hepa 1-6 de souris, elle co-localisait avec le LSR en présence d'oléate, un composé requis pour l'activation du récepteur. Des expériences de ligand-blotting ont également montré que la Lf se fixait sur le LSR purifié et inhibait la fixation de lipoprotéines riches en triglycérides. Les domaines N et C-terminaux isolés de cette protéine, ainsi qu'un mélange de peptides obtenu après double hydrolyse de la Lf par la trypsine et la chymotrypsine, conservent cette propriété. Nous proposons que l'élévation de la lipémie postprandiale observée in vivo suite à un traitement par la Lf soit médiée par son interaction avec le LSR, inhibant ainsi l'épuration des chylomicrons et de leurs remnants / Postprandial lipemia is characterized by an increase in plasma triglyceride-rich lipoproteins after the ingestion of meal, and is important towards determining the bioavailability of dietary lipids amongst the peripheral tissues. Indeed, elevated postprandial lipemia is often observed with obesity and dyslipidemia, two disorders that can lead to health complications including diabetes and cardiovascular diseases. Lactoferrin (Lf), has been shown to inhibit hepatic chylomicron remnant removal, resulting in increased postprandial lipemia, for which the molecular mechanisms remain unclear. The lipolysis stimulated lipoprotein receptor (LSR) has been shown to contribute to the removal of triglycerides-rich lipoproteins during the postprandial phase. The aim was to determine if there was interaction between Lf and LSR. Both Lf and LSR were purified with purities upper to 95% and characterized. Cell culture studies demonstrated that while Lf does not have any significant effect on LSR protein levels in mouse Hepa1-6 cells, it co-localizes with LSR in cells, but only in the presence of oleate, which is needed to obtain LSR in its active form. Ligand blotting using purified LSR revealed that Lf binds directly to the receptor in the presence of oleate and prevents the binding of triglycerides-rich lipoproteins. Both C- and N-lobes of Lf, and a mixture of peptides derived from its tryptic and chymotryptic double hydrolysis retained the ability to bind LSR. We propose that the elevated postprandial lipemia observed upon Lf treatment in vivo is mediated by its direct interaction with LSR, thus preventing clearance of chylomicrons and their remnants through the LSR pathway

Les organophosphorés (OPs) sont des neurotoxiques. Leur décontamination est difficile et coûteuse. L’utilisation d’enzymes capables de les détoxifier est une solution élégante. Les enzymes bactériennes sont peu stables et chères à produire. Nous avons identifié des enzymes très résistantes, capable de biodégrader lentement ces composés. Nous avons alors développé une stratégie permettant d'améliorer l'activité de l'enzyme très stable en nous basant sur les enzymes les plus actives. Celle-ci fut améliorée de plus de 1000 fois envers ces insecticides. Enfin, nous avons analysé l'origine de ces améliorations et mis en évidence des concepts émergents dans l'évolution des enzymes. / Organophosphorus compounds are neurotoxic. Their decontamination is difficult and cost prohibitive. An appealing solution resides in the use of enzymes capable of degrading such compounds. Bacterial enzymes are poorly stable and expensive. We identified highly resistant enzymes capable of slowly biodegrading these compounds. We have developped a strategy allowing to increase the activity of our enzyme by using the similarities with the highly active enzymes. The activity was increased by a factor of 1000 against OPs. We analyzed the origins of these ameliorations and showed emergent concepts in enzyme evolution.

Cette thèse traite de la conception de sondes fluorogènes incorporant des bras espaceurs auto-effondrables répondant à l’activité enzymatique.Ces travaux commencent par la synthèse d’une sonde modèle à trois composantes pour détecter l’activité de la Leucine AminoPeptidase (LAP). Le cœur de cette sonde est un espaceur cyclisant efficace (t1/2 cyclisation≈7sec) qui unit un substrat enzymatique à un fluorophore précipitant avec une stabilité exemplaire (pas de dégradation sur 15h d’incubation). Appliquée sur des cellules vivantes, cette sonde produit des précipités fluorescents qui marquent durablement les cellules. L’élaboration de sondes pour d’autres enzymes a cependant soulevé l’importance d’abaisser le seuil de solubilité du fluorophore.Cette thèse se penche également sur deux nouvelles conceptions de sondes à la spécificité améliorée. Alors que la première tente de réutiliser les efforts déployés pour obtenir des inhibiteurs hautement sélectifs, la seconde est basée sur deux transformations successives par deux enzymes indépendantes. Si la première solution a échoué jusqu’alors, la seconde nous a effectivement permis de différencier des populations cellulaires.Enfin, ce manuscrit détaille le développement d’une nouvelle génération d’espaceur permettant l’affinement de certaines propriétés des sondes. Focalisés sur l’amélioration de l’hydrosolubilité, les premiers exemples sont très prometteurs. Particulièrement, une sonde pour Péncilline G Amidase possède une hydrosolubilité 3500 fois supérieure à celle de son analogue commercial. Véritables multiprises chimiques, ces espaceurs devraient permettent de relever certains des grands défis de la chimie médicinale moderne. / This thesis concerns the design and evaluation of fluorogenic molecular probes that respond to enzyme activity via the help of self-immolative spacers.This work starts with the synthesis of a model three-component probe that detects the activity of Leucine AminoPeptidase (LAP). The heart of this probe is an efficient cyclizing spacer (t1/2 cyclization≈7sec) that links a specific enzyme substrate to a precipitating fluorophore with an exemplary stability (no false positive signal over 15h incubation). When incubated with live cells, this construct is processed by active LAP to yield fluorescent precipitates which lead to long-term cell-tagging. However, probes susceptible to other enzyme activity have indicated the interest in further reduction of the solubility threshold of ELF®97.This manuscript also describes two new strategies to improve the specificity of the probes. While the first tries to take advantage of the efforts made to develop highly selective inhibitors, the second is based on two consecutive transformations by two independent enzymes. The first strategy has not yet been successfully applied in our hands, but the second has led to a first prototype that allowed discriminating between different cell lines.Lastly, this thesis relates the design and synthesis of a new generation of cyclizing spacer which opens up a great number of possibilities to optimize probes’ properties. For example, a probe targeting Pencilline G Amidase and containing such a spacer possesses a hydrosolubility 3500 times higher than its commercial analogue. As true “molecular hubs”, these spacers may turn out to address the big challenges of modern imaging agent and prodrug development.