Les connaissances sur les risques liés à l'inhalation de mycotoxines restent limitées, alors que ces toxines, présentes au niveau des spores fongiques, peuvent atteindre directement les épithéliums respiratoires. Les enzymes du métabolisme des xéniobiotiques pulmonaires peuvent moduler la toxicité de ces mycotoxines en les détoxifiant ou en formant des métabolites plus réactifs. Notre objectif était d'étudier in vitro le métabolisme pulmonaire de la stérigmatocystine et de la méthoxy-stérigmatocystine, deux mycotoxines présentes dans les environnements contaminés par les moisissures, et de prédire les éventuelles conséquences toxiques. L'étude du métabolisme en présence de cytochromes P450 exprimés dans des systèmes hétérologues, puis dans un modèle de culture primaire de cellules épithéliales trachéales porcines, a montré que ces mycotoxines étaient oxydées, principalement par les cytochromes P450 1A, et conjuguées par glucucoridation et sulfo-conjugaison. Ces deux toxines semblent principalement détoxifiées au niveau pulmonaire. Si une activation métabolique de la stérigmatocystine est possible, celle-ci semble limitée / Human health effects of inhaled mycotoxins remains poorly documented, despite these toxins are present in fungal spores et can directly reach the airway epithelia. Xenobiotic metabolozing enzymes can modulate lung toxicity of these mycotoxins through detoxification or reactive metabolite formation. Our aim was to study in vitro the metabolism and the cellular toxic consequences of two mycotoxins present in mold-contaminated environments, e.g. sterigmatocystin and methoxy-sterigmatocystin. The metabolism studies using recombinant cytochromes P450 enzymes and porcine tracheal epithelial cell primary cultures, showed that these mycotoxins could be oxidized by cytochrome P450 1A and conjugated by glucucoridation and sulfo-conjugation. Sterigmatocystin and methoxysterigmatocystin seem mainly detoxified in respiratory cells. If a metabolic activation of sterigmatocystin is possible, it seems limited

Les enzymes du métabolisme des xénobiotiques (EMX) jouent un rôle central dans la biotransformation et l’élimination de composés étrangers à l’organisme. Organisées en réseau de biotransformation, ces enzymes catalysent des réactions variées (oxydations, conjugaisons …) afin de rendre ces composés plus hydrophiles. Les EMX sont fortement exprimées dans l’épithélium olfactif de mammifères et des études in vitro ont montré qu’elles possèdent des activités élevées. Outre un rôle dans le métabolisme de molécules toxiques, ces enzymes pourraient être impliquées dans la modulation périphérique de l'olfaction. Les EMX pourraient contribuer à maintenir la sensibilité du système olfactif en éliminant ou en inactivant les molécules odorantes présentes dans l'espace périrécepteur. Cependant, les preuves scientifiques démontrant l’implication des EMX dans la perception olfactive restent limitées à ce jour. La première étape de ce travail a consisté à montrer que l’expression des EMX olfactives de rat peut être modulée par des traitements chimiques connus pour leur capacité d'induction au niveau hépatique (dexaméthasone, Aroclor, …). Par rapport au foie, les effets observés au niveau de la muqueuse olfactive sont plus modérés. La dexaméthasone, un glucocorticoïde de synthèse, induit significativement l’expression de plusieurs enzymes et transporteurs au niveau du tissu olfactif. Cette étude suggère que l’expression des EMX olfactives soit sous le contrôle de mécanismes spécifiques. Dans une deuxième partie, le métabolisme in vitro de quelques molécules odorantes a été étudié. Nous avons observé que la muqueuse olfactive de rat possède une forte capacité métabolique et catalyse notamment la formation de métabolites hydroxylés. Enfin, les conséquences de ce métabolisme ont été évaluées en enregistrant des électro-olfactogrammes (EOG) au niveau de la muqueuse olfactive de rat. Nous avons montré qu’à concentrations équivalentes, l’amplitude des signaux EOG générés par des métabolites est beaucoup plus faible que l’amplitude des réponses élicitées par les molécules odorantes non biotransformées. De plus, la perfusion de la muqueuse par des inhibiteurs spécifiques de cytochromes P450 ou de carboxylestérases provoque une modification significative des signaux EOG. Ces études démontrent que la biotransformation des molécules odorantes a un impact sur le signal olfactif. L’ensemble de ces études conforte l’hypothèse d’un rôle des EMX dans la première étape de la perception olfactive. Ces enzymes pourraient catalyser la biotransformation des molécules odorantes dans le but d’éviter une saturation du système olfactif. / Xenobiotic metabolizing enzymes (XMEs) play a central role in the biotransformation and the elimination of foreign compounds reaching the body. Organized as a biotransformation network, these enzymes catalyze various reactions (oxidations, conjugations …) in order to increase the water solubility of compounds. XMEs are highly expressed in the mammalian olfactory epithelium and in vitro studies showed that they have important activities. Besides a role in the metabolism of toxic compounds, a role in the peripheral regulation of the olfactory process has been hypothesized. XMEs could contribute to maintain the sensibility of the olfactory system, by eliminating or inactivating odorant molecules present in the perireceptor space. However, scientific proofs of such a role are still limited. In a first study, we demonstrated that olfactory XMEs can be modulated by chemical treatments identified to induce the enzyme expression in the liver (dexamethasone, Aroclor …). The intensities of the effects were lower in the OM than in the liver. Dexamethasone, a synthetic glucocorticoid, was found to increase significantly the expression of several enzymes and transporters in the olfactory mucosa. This study suggests that the expression of olfactory XME is controlled by tissue-specific mechanisms. In the second part, the metabolism of some odorant molecules was studied in vitro. We observed that the olfactory mucosa of rats possesses a high metabolic capacity and catalyses the formation of hydroxylated metabolites. Finally, the consequences of this metabolism were evaluated by recording electro-olfactograms (EOG) from the olfactory mucosa of rats. We showed that, at same concentrations, amplitudes of EOG signals generated by the metabolites were lower than those elicited by the parent molecules. Moreover, the perfusion of the mucosa with specific inhibitors of cytochromes P450 or carboxylesterases induced a significant modification of EOG signals. These studies demonstrate that the biotransformation of odorant molecules have an impact on the olfactory signal. Taken together, these studies support the hypothesis that XME are involved in the first stage of the olfactory perception. These enzymes could catalyze the biotransformation of odorant molecules in order to avoid the saturation of the olfactory system.

L’odorat est le sens qui permet de percevoir des substances volatiles appelées communément odeurs. Il joue un rôle important dans la subsistance et le bien être des individus car il intervient dans la communication avec leur environnement (recherche de nourriture, de partenaire, détection des prédateurs ...). L’efficacité du système olfactif repose en grande partie sur sa sensibilité, qui dépend de l’affinité des molécules odorantes pour leurs récepteurs olfactifs mais aussi d’un mécanisme de clairance enzymatique des molécules odorantes qui évite à ces récepteurs d’être saturés et qui implique les Enzymes du Métabolisme des Odorants ou EMO. En effet, des études récentes ont démontré que dans l’épithélium olfactif, les EMO qui biotransforment les molécules odorantes conduisent à l’arrêt du signal olfactif en désactivant ces molécules, ce qui permet leur élimination et participent donc ainsi in fine à la perception olfactive. Dans ce contexte, l’objectif de ce travail de thèse est d’apporter une meilleure compréhension des mécanismes enzymatiques impliquant les EMO dans la perception olfactive des mammifères et d’étudier plus particulièrement ces mécanismes chez l’Homme.Le premier axe de ce travail, basé sur des analyses physico-chimiques, a consisté à développer une technique innovante de spectrométrie de masse par réaction de transfert de protons (PTR-MS) permettant le suivi en temps réel de la biotransformation des molécules odorantes par les EMO. Cette technique a été utilisée ex vivo sur des prélèvements d’épithélium olfactif et du mucus olfactif de rat et de lapin et également in vivo directement au sein de la cavité nasale humaine. Ainsi, il a été démontré que la biotransformation olfactive de molécules odorantes catalysée par différentes enzymes de type glutathion transférases, carboxylestérases ou dicarbonyl xylulose réductases (DCXR) est un mécanisme très rapide (de l’ordre de la milliseconde) en parfaite adéquation avec la dynamique physiologique du processus olfactif. Ces analyses ont également révélé que la biotransformation des molécules odorantes peut conduire à la production de métabolites volatils odorants pouvant potentiellement participer à la perception olfactive globale en interagissant eux aussi avec les récepteurs olfactifs. Ces différents métabolites ont été formellement identifiés par une technique de chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse (GC-MS).Le second axe de ce travail, reposant sur des analyses psychophysiques, a consisté à évaluer l’impact du métabolisme des molécules odorantes sur la perception olfactive chez l’Homme. Pour atteindre cet objectif, une stratégie originale de modulation de la perception olfactive reposant sur une compétition entre des molécules odorantes métabolisées par une même EMO, développée récemment au sein de l’équipe chez le lapin, a été transposée à l’Homme. La compétition entre des molécules odorantes de type dicétone vis-à-vis de l’enzyme DCXR a tout d’abord été démontrée in vitro par des analyses biochimiques sur l’enzyme recombinante humaine. Une méthode d’analyse par olfactométrie, appliquée à un panel de 40 sujets, a permis de démontrer que ce mécanisme de compétition entre molécules odorantes induit des modulations de la biotransformation de ces molécules conduisant ainsi à des modifications de leur biodisponibilité relative et in fine de leur perception. Ces résultats inédits démontrent que des modulations affectant la biotransformation d’un odorant conduisent instantanément à une modification de sa perception. Ces travaux de thèse précisent la fonction des EMO chez les mammifères et révèlent pour la première fois, chez l’Homme, une participation significative du métabolisme des molécules odorantes dans la perception olfactive. / The sense of smell permits the perception of volatile substances commonly known as odors. This sense plays an important role in the feeding and wellness of individuals because it involves exchanges with their environment (search for food or partners, predators detection…). The efficiency of the olfactory system mainly relies on its sensitivity depending on the odorant affinity for their olfactory receptors but also on an enzymatic clearance mechanism of odorants which involves the Odorant metabolizing Enzymes (OME) to avoid the saturation of the receptors. Recent studies have shown that the biotransformation of odorants by EMO, in the olfactory epithelium, participates in the olfactory perception. Indeed, OME catalyse the deactivation of the odorants and their subsequent elimination which led to the termination of the olfactory signal. In this context, this work aims to provide a better understanding of the enzymatic mechanisms of the OME in mammal olfactory perception and to study more specifically these mechanisms in human.The first axis of this work, based on physicochemical analysis, has consisted to develop an innovative proton transfer reaction mass spectrometry technique (PTR-MS) to allow the analysis in real time of the odorants biotransformation by OME. This technique was first applied ex vivo using rats and rabbits olfactory epithelium and olfactory mucus but also in vivo directly inside the human nasal cavity. Thus, we have demonstrated that the olfactory biotransformation of odorants catalyzed by different enzymes like glutathione transferases, carboxylesterases and dicarbonyl xylulose reductases (DCXR), is a very fast mechanism (few milliseconds). This very high velocity is perfectly consistent with the physiological dynamics of the olfactory process. Moreover, PTR-MS analyzes revealed that the odorants biotransformation could produce volatile metabolites with odorous properties which could participate in the global olfactory perception by interacting also with olfactory receptors. These various metabolites have been formally identified by a gas chromatography-mass spectrometry technique (GC-MS).The second axis, based on psychophysical method, evaluated the impact of the odorant metabolism in the human olfactory perception. For this purpose, an original approach recently developed in the lab, consisting of the modulation of the olfactory perception through a competition between odorants metabolized by the same EMO was transposed from the rabbit model to the human. The metabolic competition between several diketones toward DCXR was first demonstrated by biochemical analysis using the corresponding human recombinant enzyme. Then, an olfactometric study carried out on a 40 subjects panel demonstrated that this competition mechanism between odorants induces modulations of the biotransformation of these molecules and thus leads to modifications of their relative bioavailability and in fine of their perception. These new and significant results demonstrate that modulations impacting odorants metabolism leads immediately to changes in their olfactory perception. This thesis highlights on the function of EMO in mammals and reveals for the first time in human a significant role of the odorant metabolism in olfactory perception.

Pour réduire la teneur en matière grasse des aliments, et suivre en cela les recommandations du Plan National Nutrition Santé, il est nécessaire de bien comprendre les mécanismes de la perception du gras. Dans ce contexte, ce travail de thèse avait pour objectif de contribuer à la compréhension de la perception du gras au travers de l’étude de la variabilité interindividuelle de la perception du gras et de la recherche de son origine.Pour cela, une approche pluridisciplinaire mêlant physico-chimie de molécules aromatiques à connotation grasse, physiologie orale des sujets, processus en bouche et perception sensorielle au cours de la consommation a été mise en place. Une attention toute particulière a été portée sur la composante olfactive de la perception du gras et en particulier sur la potentielle contribution des métabolites produits dans la cavité nasale de l’Homme à partir de composés volatils odorants. Ce travail montre que la réduction du taux de matière grasse dans un fromage blanc diminue la perception de l’arôme crème, augmente l’amertume et l’astringence et diminue le film gras perçu, confirmant ainsi le caractère multidimensionnel de la perception du gras. Il montre également que la perception du gras est liée à la teneur en lipide du tapissage en bouche ainsi qu’à la composition de la matrice en composés d’arômes.Il met en évidence trois groupes de sujets de sensibilité au gras significativement différents. Ces groupes présentent également des différences pour plusieurs paramètres physiologiques et anatomiques pouvant intervenir sur les sensations tactiles, gustatives et olfactives et donc potentiellement sur la perception du gras.Enfin, ce travail prouve l’existence, dans la muqueuse olfactive de l’Homme, d’enzymes capables de métaboliser les composés odorants en métabolites volatils eux-mêmes odorants susceptibles d’intervenir dans la perception du gras ou de la moduler. / To reduce the fat content in food products as recommended by the National Nutrition and Health Plan, it is necessary to understand the fat perception mechanisms. In this context, this thesis work aimed to contribute to the understanding of fat perception through the study of interindividual variability in fat perception and the research of its origin.For this purpose, a multidisciplinary approach combining physico-chemistry of “fatty” aroma molecules, subjects’ oral physiology, food oral processing and sensory perception during food consumption has been established. A particular focus has been done on the olfactory component of fat perception, especially on the potential contribution of the metabolites produced in the human nasal cavity from odorous volatile compounds.This work shows that reducing fat content in cottage cheese decreases the perception of the cream aroma, increases bitterness and astringency and decreases the perceived greasy film. The results confirmed the multidimensional nature of fat perception. This work also shows that fat perception is related to the lipid content of the mouth coating as well as the aroma compounds composition of the food matrix.It highlights three groups of subjects with significant difference in fat sensitivity. These groups also differ in several physiological and anatomical parameters which can impact tactile, taste and smell sensations and therefore potentially fat perception. Finally, this work proves the existence in the human olfactory mucosa of enzymes capable of metabolizing odorous compounds into volatile metabolites. These metabolites proved to be themselves odorants could be involved in fat perception or its modulation.

Le foie est le principal organe impliqué dans la biotransformation des xénobiotiques. Les cytochromes P450 (CYP) en sont des enzymes dés. Parmi elles, leCYP4A est impliqué dans rhydroxylatlon des acides gras et la biotransformation de médicaments, tels que le bézafibrate (BE2A), un hypolipémiant utilisé enthérapeutique humaine. Cette molécule a été montrée hépatocarcinogène chez les rongeurs mais cet effet n'a pas été rapporté chez l'Homme. H est doncimportant de connaître les mécanismes d'action impliqués dans les effets du BEZA chez l'Homme. Dans une première étude, nous avons étudié l'expression duCYP4A au niveau ARNm et apoprotéine ainsi qu'au niveau de son activité dans des cultures primaires d'népatocytes de rat et d'Homme traitées ou non par duBEZA et de la N-acétylcystéine, molécule précurseur du glutathion. Nous avons mis en évidence d'importantes différences Interespèces et l'influence del'environnement redox des cellules en termes de réponse aux Inducteurs. L'implication des récepteurs nucléaires PPARa, PXR et CAR et des CYP4A/3A/2B aensuite été évaluée pour expliquer les différences inter-espèces observées. D'autre part, nous avons montré pour la première fois que le BEZA diminuel'expression de l'ARNm de OATP2 chez le rat et la biodisponibilité des statines en utilisant un système de biochromatographie original. Enfin, nous avonsmontré que le BEZA, en fonction de l'environnement redox de la cellule, régule des protéines impliquées dans le métabolisme des acides gras et lipides, ainsique des biomarqueurs d'hépatocarcinogenèse chez l'Homme, ce qui pose réellement la question du bien-fondé de l'utilisation de cette molécule enthérapeutique / The liver is the main organ involved in biotransformation of xenobkrtics invotving the cytochrome P450 (CYP). Among thèse enzymes, the CYP4A participate in the <o-hydroxylat!on of fatty acids and the met a bolis m of drugs such as be zafibrate (Beza), a lipld-lo wering molécule used In human therapy. It has been shown hepatocarcinogen In rodent; but no effect was reported in humans. It is thus important to understand thé mechanisms of action of Beza in humans. In a first study, we Investigated the expression of CYP4A at the mRNA, apoprotein and activity leveis In primary cultures of rat and human hepatocytes treated or not wlth Beza and/or N- acetylcysteine, a glutathtone precursor. We hâve highlighted Important différences between spedes and the Influence of ce» redox envlronment in terms of response to inducers. The involvement of nudear receptors PPARa, PXR and CAR and of CYP4A/3A/2B was then evaluated to explain the différences observed between species. On the other hand, we showed for the flrst time that Beza decreases the expression of rat OATP2 mRNA and the bioavailability of statins by uslng an original biochromatography System. Flnally, we showed that Beza, dependlng on the cellular redox envlronment modulâtes proteins involved In the metabolism of fatty acids and liplds, and also some biomarkers of hepatocarcinogenesis In humans, which raises the reai question a bout the appropr iateness of using t h is drug in human therapy.