Made available in DSpace on 2015-05-27T13:34:59Z (GMT). No. of bitstreams: 2 172.pdf: 4084743 bytes, checksum: a14b960291b86dfd51452b5c15a760c6 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2013 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães. Recife, PE, Brasil / Dengue (DENV) é a arbovirose de maior prevalência em humanos no mundo. Estudos moleculares são necessários para melhor entendimento de sua origem e história evolucionária. Análises filogenéticas e epidemiológicas sugerem que genótipos mais virulentos estão substituindo os de menor impacto epidemiológico. O presente trabalho teve como objetivo caracterizar geneticamente os sorotipos 1, 2 e 3 do DENV isolados no estado de Pernambuco, de 1995 a 2010, através do sequenciamento e análise de variações do genoma completo do vírus. Os isolados de DENV-1 foram incluídos no genótipo V e três linhagens foram observadas: a linhagem I se relacionou com a cepa BR-90, oriunda do Rio de Janeiro; a linhagem II com isolados da Colômbia e Venezuela; a linhagem III mostrou relação com cepas das Ilhas Virgens e de Cingapura, sugerindo possível origem a partir do Caribe e/ou Ásia. Para o DENV -2 foi identificado o genótipo Sudeste Asiático/Americano. Duas linhagens foram observadas, a linhagem I teve sua origem provável a partir da Venezuela e foi substi tuída pela linhagem II, que possivelmente se originou da Jamaica. Os isolados de DENV-3 foram incluídos no genótipo III cuja origem possivelmente se deu pela introdução de uma cepa do Rio de Janeiro, oriunda das ilhas do Caribe. Substituições em nucleotídeos e aminoácidos foram encontradas ao longo dos genomas, as quais podem estar envolvidas em importantes alterações em funções das proteínas virais, mas nenhuma associação com a forma clínica da doença ou tipo de infecção foi identificada. Apenas alterações nucleotídicas em 5´UTR de DENV-3 previu estrutura secundária diferente. Alterações nucleotídicas e estruturais em 3´UTR não se relacionaram com a gravidade da doença. A pressão evolucionária observada foi seleção purificadora. Foram identificadas mutações que são específicas dos isolados e/ou linhagens de Pernambuco, que podem ser elementos virais genéticos que contribuem para sua contínua circulação na região e seu potencial epidêmico

PEREIRA, Samuel Arruda Rodrigues. Adenovírus em infecções respiratórias agudas infantis em Fortaleza-Ce, de 2001 a 2013. 2014. 84 f. Dissertação (Mestrado em Microbiologia Médica) – Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2014. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2015-10-26T16:03:18Z No. of bitstreams: 1 2014_dis_sarpereira.pdf: 1580211 bytes, checksum: 9d5e0e702f11da8e7784d09fe1eea6f8 (MD5) / Approved for entry into archive by denise santos(denise.santos@ufc.br) on 2015-10-26T16:31:28Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_dis_sarpereira.pdf: 1580211 bytes, checksum: 9d5e0e702f11da8e7784d09fe1eea6f8 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-10-26T16:31:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_dis_sarpereira.pdf: 1580211 bytes, checksum: 9d5e0e702f11da8e7784d09fe1eea6f8 (MD5) Previous issue date: 2014 / 4 ABSTRACT Human adenovirus (HAdV) is commonly viral agent associated with infections of the respiratory tract, both upper and lower, mainly in children under the age of five. HAdV are cl assified into seven species (A - G) and divided into 54 types. Hexon protein is primarily responsible for inter - and intra - group antigenic variation of the virus. The aim s of this study ware to characterize the periods of circulation and the diversity of species and types of HAdV found in Fortaleza, Ceará - Brazil, for 150 consecutive months (from January 2001 to June 2013). Indirect immunofluorescence assay (IFA) was used for the detection o f HAdV, respiratory syncytial virus, influenza A and B, parainfluenza virus 1, 2 and 3; and direct immunofluorescence assay (DFA) was used for detection of human metapneumovirus (HMPV). PCR and nested PCR followed by sequencing the six hypervariable region s of the hexon gene were used to characterize the species and types of HAdV. HAdV were detected 290 (3.41%) of the 8,517 samples, 60 (20.69%) of those found in coinfection with one, two or three viruses. A total of 190 (65,52%) HAdV were molecularly charac terized: 162 HAdV belonging to species B (85.72%), 21 to HAdV - C (11.11%) and 6 to HAdV - 3 (3, 17%), getting a strain without identification. The species circulated throughout the period the predominance of species B in almost all years analyzed. Seven diff erent types were identified circulating in Fortaleza during the analysis period. The predominant types were 3 (67.73%) and 7 (17.80%). HAdV - 3 was found in all the years and the HAdV - 7 was not observed in years 2006, 2010 and 2011. Only in 2011, all kinds o f species identified C circulated, and the only representative of the species and the HAdV - 4, began to be identified in our population only from 2007. Better understanding of the circulation of HAdV can be achieved if the monitoring is continuous and asso ciated with the use of methods of greater sensitivity in the detection of these viruses. / O adenovírus humano (ADVh) é um agente viral comumente relacionado a infecções do trato respiratório, tanto superior quanto inferior, principalmente em crianças com idade inferior a cinco anos. Os ADVh são classificados em sete espécie (A-G) e divididos em 54 tipos. A proteína hexon é a principal responsável pela variação antigênica inter e intragrupos desse vírus. O objetivo desse estudo foi caracterizar os períodos de circulação e a diversidade de espécie e tipos de ADVh encontrados em Fortaleza, Ceará – Brasil, durante 150 meses consecutivos (janeiro de 2001 a junho de 2013). A imunofluorescência indireta (IFI) foi utilizada para a detecção dos ADVh, vírus sincicial respiratório, influenza A e B, parainfluenza 1, 2 e 3, já a imunofluorescência direta (IFD) foi utilizado na detecção do metapneumovírus humano (MPVh) . A PCR e Nested-PCR seguida do sequenciamento das seis primeiras regiões hipervariável do gene Hexon foram utilizadas para caracterizar as espécies e tipos dos ADVh. Os ADVh foram detectados 290 (3,41%) das 8.517 amostras, sendo 60 (20,69%) destas encontradas em coinfecção com um, dois ou três vírus. Um total de 190 (65,52%) ADVh foram molecularmente caracterizados, sendo 162 pertencente à espécie ADVh-B (85,72%), 21 à ADVh-C (11,11%) e 6 à ADVh-E (3,17%), ficando um cepa sem identificação. As espécies circularam durante todo o período analisados sendo observado o predomínio da espécie B em quase todos os anos. Sete diferentes tipos foram identificados circulando em Fortaleza durante o período analisado. Os tipos predominantes foram o 3 (67,73%) e o 7 (17,80%). O ADVh-3 foi encontrado em todos os anos, já o ADVh-7 não foi observado nos anos de 2006, 2010 e 2011. Somente em 2011 todos os tipos identificados da espécie C circularam, e o único representante da espécie E, o ADVh-4, começou a ser identificado na nossa população apenas a partir de 2007. O melhor conhecimento da circulação de ADVh poderá ser alcançado se a vigilância for contínua e associada ao uso de métodos de maior sensibilidade na detecção desses vírus.

Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas. CIPHARMA, Escola de Farmácia, Universidade Federal de Ouro Preto. / Submitted by Oliveira Flávia (flavia@sisbin.ufop.br) on 2015-05-08T19:33:59Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 22190 bytes, checksum: 19e8a2b57ef43c09f4d7071d2153c97d (MD5) DISSERTAÇÃO_PolimorfismoGeneEnzima.pdf: 1301394 bytes, checksum: d3c4c2a2e4593d496918d632c418d5b5 (MD5) / Approved for entry into archive by Gracilene Carvalho (gracilene@sisbin.ufop.br) on 2015-05-12T13:22:42Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 22190 bytes, checksum: 19e8a2b57ef43c09f4d7071d2153c97d (MD5) DISSERTAÇÃO_PolimorfismoGeneEnzima.pdf: 1301394 bytes, checksum: d3c4c2a2e4593d496918d632c418d5b5 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-05-12T13:31:31Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 22190 bytes, checksum: 19e8a2b57ef43c09f4d7071d2153c97d (MD5) DISSERTAÇÃO_PolimorfismoGeneEnzima.pdf: 1301394 bytes, checksum: d3c4c2a2e4593d496918d632c418d5b5 (MD5) Previous issue date: 2015 / A Metilenotetrahidrofolato Redutase (MTHFR) é uma enzima que atua no metabolismo do folato e polimorfismos em seu gene vêm sendo associados de maneira controversa ao desenvolvimento do câncer cervical. Esta neoplasia, causada principalmente pela infecção persistente pelo Papilomavírus Humano (HPV), possui altas taxas de prevalência e mortalidade na população feminina. Neste trabalho, a pesquisa de HPV nas amostras histológicas foi realizada por Imunohistoquímica e Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) com os iniciadores SPF e GP5+/GP6+. O polimorfismo C677T no gene da enzima MTHFR foi analisado por PCR seguida de digestão enzimática (RFLP) utilizando eletroforese em gel de agarose, em gel de poliacrilamida e eletroforese capilar. Após a definição da metodologia mais adequada para a detecção viral e a avaliação desse polimorfismo no material parafinado, as análises foram realizadas em 240 amostras, sendo 120 do grupo controle e 120 casos. A frequência dos genótipos da MTHFR na amostragem foi de 64% CC, 31% CT e 5% TT. Associação estatisticamente significativa foi encontrada entre o polimorfismo C677T da MTHFR e a presença de lesões intraepiteliais cervicais/carcinoma epidermoide invasor, sendo que o alelo T foi observado em 33,1% do grupo controle e em apenas 21,6% dos casos (p=0,023). A avaliação de risco (Odds ratio – OR) sugeriu que a presença do alelo polimórfico pode agir com um fator de proteção para lesões cervicais (OR: 0,557; IC95% 0,355- 0,925; p=0,024). Resultados similares foram encontrados no grupo com faixa etária superior a 30 anos. Por outro lado, não foi observada associação estatisticamente significativa entre a infecção viral e o polimorfismo C677T da MTHFR. Assim, pode-se concluir que mulheres com o polimorfismo C677T no gene da MTHFR possuem um risco menor de apresentarem lesões préneoplásicas e neoplásicas da cérvice uterina. _____________________________________________________________________________________ / ABSTRACT: The Methylenetetrahydrofolate Reductase (MTHFR) is an enzyme that acts in folate metabolism and gene polymorphisms have been associated in a controversial way to the development of cervical cancer. This neoplasia, mainly caused by persistent infection by Human Papillomavirus (HPV), has high prevalence and mortality rates in the female population. In this work, the detection of HPV in histological samples was performed by Immunohistochemistry and PCR with primers SPF and GP5+/GP6+. The C677T polymorphism in the MTHFR gene was analyzed by PCR/RFLP using electrophoresis in agarose gel, polyacrylamide gel and capillary electrophoresis. After defining the most appropriate methodology for viral detection and evaluation of this polymorphism in paraffin material, the analyses were performed with 240 samples, 120 in the control group and 120 cases. The frequency of MTHFR genotypes in the sample was 64% CC, 31% CT and 5% TT. Statistically significant association was found between MTHFR polymorphism and the presence of cervical intraepithelial lesions/invasive squamous cell carcinoma, and the T allele was observed in 33.1% of the control group and only 21.6% of cases (p =0.023). Risk assessment (Odds Ratio - OR) suggested that the presence of polymorphic allele may act with a protective factor for cervical lesions (OR: 0,557; IC95% 0,355-0,925; p=0,024). Similar results were observed in the group over 30 years old. However, there was no statistically significant association between viral infection and the C677T MTHFR polymorphism. Thus, it can be concluded that women with the MTHFR C677T polymorphism have a lower risk of developing neoplastic and preneoplastic lesions of the uterine cervix.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:31:00Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2006-05-29Bitstream added on 2014-06-13T19:40:42Z : No. of bitstreams: 1 pandolfi_jrc_dr_araiq.pdf: 716701 bytes, checksum: 707d1bc6d263e145f12c4e53feeae657 (MD5) / O presente trabalho evidencia os esforços realizados na tentativa de se aperfeiçoar a técnica de MIRU (Mycobacterial Interspersed Repetitive Units). Esta utiliza como marcadores, diferenças em fragmentos de DNA não codificadores específicos do Mycobacterium tuberculosis e vem sendo empregada para o estudo epidemiológico da tuberculose, pela facilidade de execução. A técnica de MIRU possibilita uma comparação entre linhagens de diferentes áreas geográficas e permite o rastreamento da movimentação de linhagens individuais. Na otimização os seguintes parâmetros foram determinados: 1. protocolos de purificação de DNA; 2. estratégias de amplificação pela PCR; 3. comparações entre um kit de PCR (PCR Master Mix - PROMEGA) e a utilização da PCR da maneira convencional; 4. testes de variadas condições de amplificação utilizando o kit e os reagentes convencionais de PCR; 5. determinação de protocolos de ciclagem para a amplificação dos fragmentos desejados; 6. teste de amplificação sem a prévia extração de DNA das amostras utilizadas. Após a padronização a metodologia foi utilizada na tipagem de 82 amostras de M. tuberculosis que se encontravam divididas em dois grupos, sendo o primeiro com 49 amostras, provenientes de pacientes do Serviço Especial de Saúde de Araraquara (SESA - USP, Araraquara) e o segundo, composto de 33 amostras de bactérias com perfil de resistência a pirazinamida e a outras drogas, provenientes de Maringá. Nesta etapa foram realizados: 7. PCR para a confirmação de gênero e espécie para M. tuberculosis nas 82 amostras analisadas. 8. Aplicação da técnica de MIRU e análise manual de todas as amostras provenientes de pacientes; 9. Emprego de ferramentas de bioinformática (programa PAST Paleontological Statistics Software Package for Education and Data Analysis) para a análise das amostras... / The present work shows efforts to improve the MIRU (Mycobacterial Interspersed Repetitive Units) assay. This methodology, that has been exploited for fingerprinting the Mycobacterium tuberculosis in molecular epidemiological studies, allows for direct and reliable comparison of results between laboratories and the development of large-scale epidemiological studies. In the optimization of MIRU assay, some parameters were defined: DNA purification protocols and PCR strategies were compared, to select the most practical and economical among them. After the standartization, 82 M. tuberculosis strains, from two different groups were analised. The 49 bacteria strains from the first group were sensible and the 33 from the second one were resistant to pyrazinamide and another drugs as isoniazide and/or rifampicin. To stablish the allelic studies the samples were first confirmed as M. tuberculosis by PCR. Then the MIRU assay was applied and the genetic profile was determined. These results generated dendrograms, obtained by bioinformatic tools. This study showed that any kind of DNA purification and even the use of fresh bacterial culture directly into the PCR tube can be used. When the PCR strategies were compared the utilization of the PCR kit seemed to be more practical and to avoid some mistakes that can happens during the home-made PCR mixture preparation. Furthermore, it allows some dilutions higher than those recommended by the manufacturer. In the same way, the home-made mixture in amounts smaller than those suggested can be used. These experiments indicated that only two annealing temperatures can be used to the PCR with the twelve primer pairs, always in the same MgCl2 concentration, allowing the amplification of more samples at the same time. To generate dendrograms with the allelic data from clinical samples... (Complete abstract click electronic access below)

RIBEIRO, Joyce Fonteles. Histoplasma capsulatum var. capsulatum : taxa de conversão in vitro, detecção do gene ryp1 e estudo da diversidade genética de cepas brasileiras. 2012. 115 f. Tese (Doutorado em Microbiologia Médica) - Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Medicina, Fortaleza, 2012. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2013-05-17T15:24:56Z No. of bitstreams: 1 2012_tese_jfribeiro.pdf: 1426912 bytes, checksum: e111b9c14b7470ec8bd7984189fd837a (MD5) / Rejected by Erika Fernandes(erikaleitefernandes@gmail.com), reason: on 2013-05-17T15:34:11Z (GMT) / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2013-05-17T15:44:11Z No. of bitstreams: 1 2012_tese_jfribeiro.pdf: 1426912 bytes, checksum: e111b9c14b7470ec8bd7984189fd837a (MD5) / Approved for entry into archive by Erika Fernandes(erikaleitefernandes@gmail.com) on 2013-05-20T12:41:38Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_tese_jfribeiro.pdf: 1426912 bytes, checksum: e111b9c14b7470ec8bd7984189fd837a (MD5) / Made available in DSpace on 2013-05-20T12:41:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_tese_jfribeiro.pdf: 1426912 bytes, checksum: e111b9c14b7470ec8bd7984189fd837a (MD5) Previous issue date: 2012 / Histoplasmosis, caused by the dimorphic fungus Histoplasma capsulatum, is the most prevalent systemic mycosis in the Americas and it is frequently observed in AIDS patients. Since the beginning of the HIV epidemic, there has been a significant increase in the number of histoplasmosis cases in the Ceará state, Northeast Brazil. The lack of epidemiological data of the genotypes circulating in the Northeast region shows the importance of more detailed studies on the molecular epidemiology of H. capsulatum in this region. Different molecular techniques have been used to better characterize the genetic profile of H. capsulatum strains. It is noteworthy that, most studies of H. capsulatum are performed in the yeast phase due to its parasitic characteristics. Thus, the use of laboratory techniques for in vitro conversion and maintenance is extremely important. Given the above, this study aimed to determine the in vitro conversion rate of H. capsulatum isolates in six different culture media, as well as to detect by PCR the presence of ryp1 gene, an important transcriptional regulator of the conversion from filamentous to yeast phase. In addition, it aimed to establish the molecular profile of H. capsulatum strains, from human and veterinary source, from Ceará and Southeast region of Brazil through RAPD-PCR assay and to assess the genetic diversity of the ITS1-5.8S-ITS2 region of these isolates compared with isolates from other countries, through the sequencing of nuclear ribosomal DNA. In the study of in vitro conversion, all tested media allowed the conversion, however, the Sabouraud agar media supplemented with 10% sheep blood showed the highest conversion capacity in relation to the other tested media. The ryp1 gene was detected in 18 H. capsulatum strains (from human and animal source) and in three tested clinical specimens (whole blood), not being detected, however, in isolates of Candida albicans, Paracoccidioides brasiliensis, Sporothrix schenckii and Coccidioides posadasii. The analysis of the genetic variability of the H. capsulatum isolates, by RAPD-PCR assay, allowed the detection of two clusters circulating in the state of Ceará. The first cluster included strains from Southeast and Northeast regions of Brazil, being observed, within this cluster, the separation of isolates into three distinct subgroups (subgroups 1a, 1b and 1c). The second cluster included only strains from Northeast region of Brazil. There were no differences in clinical and epidemiological characteristics of individuals whose isolates belonged to different groups, obtained by RAPD-PCR. The sequencing of the ITS1-5, 8S-ITS2 region allowed the detection of two major clades. The clade 1 comprised the majority of the isolates tested, including strains from the Northeast, and included isolates from different geographical locations. The clade 2 was composed exclusively of isolates from the state of Rio de Janeiro. Therefore, it can be concluded that the Sabouraud agar supplemented with 10% sheep blood showed higher conversion capacity of H. capsulatum strains compared to the other tested media, and may be considered the medium of choice for converting of H. capsulatum strains. Furthermore, the ryp1 gene can be used to identify and detect H. capsulatum from clinical specimens, may be used for diagnosis of histoplasmosis. Finally, the H. capsulatum isolates from the state of Ceará can be grouped into two main clusters, detected by RAPD-PCR. In addition, phylogenetic analysis of the ITS1-5.8S-ITS2 region revealed that strains from the Northeast presented genetic differences compared with strains from other Brazilian regions, being grouped in a different cluster of them. / A histoplasmose, causada pelo fungo dimórfico Histoplasma capsulatum, é a mais prevalente das micoses sistêmicas nas Américas, sendo frequentemente observada em pacientes com AIDS. Desde o início da epidemia de HIV, na década de 80, existe um aumento significativo no número de casos de histoplasmose no Estado do Ceará, Nordeste do Brasil. A escassez de dados epidemiológicos dos genótipos que circulam na região Nordeste ressalta a importância de estudos mais detalhados sobre a epidemiologia molecular de H. capsulatum nessa região. Diferentes técnicas moleculares têm sido utilizadas para melhor caracterizar o padrão genético de cepas de H. capsulatum circulantes no mundo. Vale ressaltar que, grande parte dos estudos de H. capsulatum é realizada na sua fase leveduriforme, quando expressa as suas características parasitárias. Assim, o uso de técnicas laboratoriais para a conversão in vitro para a fase leveduriforme e sua manutenção é extremamente importante. Diante do exposto, o presente estudo objetivou averiguar a taxa de conversão in vitro dos isolados de H. capsulatum em seis meios de cultura diferentes, bem como detectar, através da técnica de PCR, a presença do gene ryp1, um importante regulador transcricional da conversão da fase filamentosa para leveduriforme. Além disso, visou conhecer o perfil molecular de cepas de H. capsulatum, de origem humana e veterinária, oriundas do Estado do Ceará e da região Sudeste do Brasil, através da técnica de RAPD-PCR e avaliar a diversidade genética da região ITS1-5.8S-ITS2 desses isolados comparados com isolados de outros países, através do sequenciamento do DNA ribossômico nuclear. No estudo de conversão in vitro, todos os meios testados foram capazes de possibilitar a conversão de fases, contudo, o meio ágar Sabouraud suplementado com 10% de sangue de carneiro mostrou a maior capacidade de conversão em relação aos outros meios testados. O gene ryp1 foi detectado em 18 cepas de H. capsulatum (de origem humana e animal) e em três espécimes clínicos positivos para H. capsulatum (sangue total) testados, não sendo detectado, contudo, em isolados de Candida albicans, Paracoccidioides brasiliensis, Sporothrix schenckii e Coccidioides posadasii. A análise da variabilidade genética dos isolados de H. capsulatum, pela técnica de RAPD-PCR, permitiu a detecção de dois clusters que circulam no Estado do Ceará. O cluster 1 incluiu cepas das regiões Sudeste e Nordeste do Brasil, sendo observado dentro desse cluster a separação dos isolados em três subgrupos distintos (subgrupos 1a,1b e 1c). O cluster 2, por sua vez, incluiu somente cepas da região Nordeste do Brasil. Não foram observadas diferenças nas características clínicas e epidemiológicas dos indivíduos cujas cepas pertenciam aos diferentes agrupamentos, obtidos pela técnica de RAPD-PCR. O sequenciamento da região ITS1-5.8S-ITS2 possibilitou a detecção de dois clados principais. O clado 1 foi constituído da maioria das cepas analisadas, inclusive as cepas da região Nordeste e incluiu isolados de localizações geográficas distintas. O clado 2, por sua vez, foi constituído exclusivamente de isolados oriundos do Estado do Rio de Janeiro. Portanto, pode-se concluir que o ágar Sabouraud suplementado com 10% de sangue de carneiro apresentou maior capacidade de conversão das cepas de H. capsulatum em relação aos outros meios testados, podendo ser considerado o meio de escolha para conversão de cepas de H. capsulatum. Ademais, o gene ryp1 pode ser utilizado para identificar isolados de H. capsulatum, bem como, detectar a presença do fungo em amostras clínicas, podendo ser utilizado para diagnóstico de histoplasmose. Por fim, os isolados de H. capsulatum oriundos do Estado do Ceará podem ser agrupados em dois clusters principais, detectados através da técnica de RAPD-PCR. Além disso, a análise filogenética da região ITS1-5.8S-ITS2 revelou que as cepas da região Nordeste apresentaram diferenças genéticas quando comparadas com as cepas de outras regiões brasileiras, ficando agrupadas em um cluster diferente das mesmas.

Submitted by Diogo Misoguti (diogo.misoguti@gmail.com) on 2016-07-04T17:31:23Z No. of bitstreams: 1 cp076419.pdf: 1045738 bytes, checksum: 5237df70e47139e5fc38d68eed3c013a (MD5) / Approved for entry into archive by Diogo Misoguti (diogo.misoguti@gmail.com) on 2016-07-04T17:31:56Z (GMT) No. of bitstreams: 1 cp076419.pdf: 1045738 bytes, checksum: 5237df70e47139e5fc38d68eed3c013a (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-04T17:31:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 cp076419.pdf: 1045738 bytes, checksum: 5237df70e47139e5fc38d68eed3c013a (MD5) Previous issue date: 2008 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Objetivos: (i) avaliar a distribuição dos tipos de SCCmec e freqüência da leucocidina de Panton-Valentine (PVL) em Staphylococcus aureus resistentes à meticilina (MRSA), coletados como parte de um programa de vigilância em sete centros médicos na Argentina, Brasil e Chile; (ii) avaliar a relação entre os tipos de SCCmec e perfis de sensibilidade a antimicrobianos; (iii) caracterizar os clones de MRSA predominantes nestes centros médicos, utilizando a técnica de eletroforese em campo pulsado (PFGE). Material e Métodos: Foram incluídos todos os isolados MRSA dos sete centros médicos, coletados como parte do Programa SENTRY na América Latina no período 1997-2006. As amostras foram estratificadas em dois subgrupos, de acordo com a sensibilidade in vitro a agentes não β-lactâmicos: multissensível (MS-MRSA) e multirresistente (MR-MRSA). Amostras representativas de cada subgrupo, selecionadas de acordo com o ano e país de isolamento, foram submetidas a testes fenotípicos e genotípicos adicionais. Os tipos de SCCmec foram caracterizados pela reação em cadeia da polimerase (PCR) multiplex, seguidos da pesquisa do complexo ccr e PVL, caso pertinente. Os tipos clonais foram investigados por PFGE. As características demográficas dos pacientes infectados foram analisadas de acordo com cada subgrupo de SCCmec. Resultados: Foram avaliados 56 isolados de MS-MRSA e 141 de MR-MRSA. A maioria de amostras MS-MRSA carreavam SCCmec I (35,7%) ou IV (46,4%); por outro lado, o tipo III predominou no subgrupo MR-MRSA. A maioria de SCCmec I foi detectado na Argentina (n=5) e Chile (n=14). A maioria das 26 amostras tipo IV foram identificadas no Brasil (n=20), apenas cinco foram positivas para PVL, e a média da concentração inibitória mínima (CIM) para oxacilina foi de 45,1 µg/ml. O dendograma obtido pelo perfil de bandas de PFGE classificou as amostras em três grupos distintos: clone brasileiro epidêmico (SCCmec III), clone pediátrico (SCCmec IV), e uma linhagem possivelmente relacionada ao clone Chile/Córdoba (SCCmec I). Conclusões: A coleção de MRSA avaliada continha uma grande diversidade de tipos de SCCmec e linhagens clonais. Os perfis de sensibilidade (MS-MRSA e MR-MRSA) correlacionaram-se bem aos tipos de SCCmec nas diferentes regiões geográficas avaliadas. / Objectives: (i) to evaluate the SCCmec type distribution and the frequency of PantonValentine leukocidin (PVL) gene among methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) collected as part of a surveillance program from seven medical centers in Argentina, Brazil and Chile; (ii) to evaluate the relationship between SCCmec types and antimicrobial susceptibility profiles; (iii) to characterize the predominant MRSA clones in these medical centers, employing the pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) technique. Material and Methods: All MRSA isolates from the seven participant centers, collected as part of the SENTRY Latin American Program during 1997-2006 were included. MRSA were stratified into two subgroups: multi-susceptible (MS-MRSA) and multi-resistant (MR-MRSA), according to in vitro susceptibility to selected non-β- lactam agents. Representative isolates of each subgroup, selected by year and country of isolation, were submitted to additional phenotypic and genotypic testing. SCCmec types were characterized by multiplex polymerase chain reaction, followed by ccr complex and PVL assessment if applicable. Clonal types were determined by PFGE. Demographic characteristics of infected patients were analyzed according to each SCCmec subgroup. Results: Overall, a total of 56 MS-MRSA and 141 MR-MRSA were evaluated. Most MS-MRSA harbored either SCCmec I (35,7%) or IV (46,4%); in contrast, SCCmec III prevailed among MR-MRSA. The majority of SCCmec I was detected in Argentina (n=5) and Chile (n=14). Among the 26 type IV isolates, most were identified in Brazil (n=20), only five carried the PVL gene and their mean oxacillin minimal inhibitory concentration (MIC) value was 45,1 µg/ml. The band-based dendogram clustered the Latin American MRSA strains into three distinct PFGE groups: the Brazilian epidemic clone (SCCmec III), the pediatric clone (SCCmec IV), and a lineage possibly related to the Chile/Cordoba clone (SCCmec I). Conclusions: Genetic and geographic diversity of SCCmec and clonal types were identified in the MRSA collection evaluated. Phenotypic susceptibility patterns (MS-MRSA and MR-MRSA) correlated well to specific SCCmec types in the geographic regions evaluated.

Made available in DSpace on 2016-04-15T12:56:11Z (GMT). No. of bitstreams: 2 juliana_andrade_ioc_mest_2013.pdf: 2734146 bytes, checksum: 7430ee31960a9248ee0ab399f4659502 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2013 / Os vírus do gênero Norovirus pertencem à família Caliciviridae e são divididos em cinco genogrupos (G) e 35 genótipos, sendo GI, GII e GIV capazes de infectar humanos e o genótipo GII.4 com suas variantes o de maior impacto epidemiológico. Os norovirus (NoV) são os principais agentes de surtos de gastroenterite aguda (GA) em todo o mundo, infectando indivíduos de todos os grupos etários. No Brasil, a importância destes vírus em casos esporádicos e de surtos de GA tem sido demonstrada pela prevalência e diversidade dos vírus circulantes em alguns estados, embora ainda não exista um sistema de vigilância rotineiro que investigue a prevalência desses vírus em todo o país. A ausência de dados sobre a caracterização molecular dos NoV no estado do Rio Grande do Sul (RS) chama atenção pelo número de surtos de GA relatados nos últimos anos. O objetivo desta dissertação foi realizar um estudo de epidemiologia e caraterização molecular de NoV provenientes de casos de GA decorrentes de surtos ocorridos no RS no período de 2004 a 2011, contribuindo para o estabelecimento da vigilância epidemiológica e molecular desses vírus. Com esta finalidade, foram analisadas 2265 amostras de fezes enviadas pelo Laboratório Central do Rio Grande do Sul (LACEN-RS) do estado ao Laboratório de Virologia Comparada e Ambiental (LVCA) provenientes de 741 surtos ocorridos neste período. Para detecção simultânea dos NoV GI e GII foi realizada a reação em cadeia da polimerase precedida de transcrição reversa (RT-PCR), tendo como alvo de amplificação a região da RNA polimerase viral RNA dependente (RdRp), conhecida como região B NoV foi detectado em 36,1% (817/2265) das amostras estudadas, sendo associado a 327 (44,1%) surtos, dos quais 60,5% (109/180) ocorridos no ano de 2006. A analise dos aspectos epidemiológicos revelou uma tendência no aumento da taxa de infecção de acordo com o aumento do grupo etário, assim como uma sazonalidade dos virus nos meses de primavera e inverno, com taxas de detecção de 41,9% e 43%, respectivamente. Em relação aos aspectos clinicos, vômito e dor abdominal foram as manifestações mais observadas nos indivíduos infectados. Para a caracterização molecular dos vírus, de cada um dos oito anos de estudo, foram selecionados aleatoriamente 142 vírus representativos das sete mesorregiões que compõem o estado. A caracterização em GI e GII foi realizada pelo seqüenciamento parcial dos nucleotideos pela amplificação genomica de duas regiões que codificam a proteína do capsideo viral (VP1), denominadas região C e D. Deste total, 110 vírus foram caracterizados como GII (77,4%) e duas como GI (1,4%), sendo o GII.4 (72,3%) o genótipo mais detectado, seguido pelo GII.6 (9,8%). Em menor número também foram caracterizados GII.2, GII.3, GII.4, GII.6, GII.12, GII.13, GII.14, GII.15, GII.17, GII.21, GI.1 e GI.3. Com o subsequente sequenciamento da região P2, também localizada na VP1, foram identificadas cinco variantes do GII.4 circulando no estado, nomeadas: 2003, 2004, 2006a, 2006b e 2010. A variante 2006b foi detectada em 47,8% (22/46) das amostras, seguida da variante 2010 com 41,3% (19/46) de detecção entre os GII.4. A grande diversidade de genótipos encontrados e alta prevalência do genótipo GII.4 e suas variantes corrobora a necessidade de se manter uma vigilância epidemiológica e molecular desses vírus no país, principalmente devido a associação do surgimento de novas variantes a surtos de de NoV de dimensões globalizadas / Viruses of the genus Norovirus belongs to the family Caliciviridae and are divided into five genogroups (G) and 35 genotypes, GI, GII and GIV able to infect humans and the genotype GII.4 and its variants has the highest epidemiological impact. The norovirus (NoV) are the main agents of outbreaks of acute gastroenteritis (AG) worldwide, infecting individuals of all age groups. In Brazil, the importance of these viruses in sporadic cases and outbreaks of AG has been demonstrated by the prevalence and diversity of circulating viruses in some states, although there is no system of routine surveillance to investigate the prevalence of these viruses across the country. The absence of data on the molecular characterization of NoV in the state of Rio Grande do Sul (RS) stands out by the number of outbreaks of AG reported in recent years. The aim of this dissertation was perform a study of the epidemiology and molecular characterization of NoV from cases of AG due to outbreaks in the RS state from 2004 to 2011, contributing to the establishment of epidemiological and molecular surveillance of these viruses. For this purpose, we analyzed 2265 stool samples sent by the Central Laboratory of RS (LACEN-RS) of the state to Virology Laboratory Comparative and Environmental (LVCA) from 741 outbreaks in this period. For simultaneous detection of GI and GII NoV was performed polymerase chain reaction reverse transcription (RT-PCR), aiming the target amplification the region of viral RNA dependent RNA polymerase (RdRp), known as Region B. NoV was detected in 36,1% (817/2265) of the samples studied, and linked to 327 (44,1%) outbreaks, of which 60,5% (109/180) occurred in 2006 The analysis of epidemiological revealed a tendency in the increased rate of infection in accordance with increasing in the age, as well as seasonality of virus in the months of spring and winter, with detection rates of 41,9% and 43%, respectively. Regarding clinical aspects, vomiting and abdominal pain were the most observed manifestations in infected individuals. For the molecular characterization of the viruses, each of the eight years of the study, were randomly selected 142 representative viruses of the seven mesoregions belonging to state. The characterization in GI and GII was performed by partial sequencing of genomic amplification of nucleotides by two regions that encodes viral capsid protein (VP1), termed region C and D. Of this total, 110 viruses were characterized as GII (77,4%) and two as GI (1,4%), being the GII.4 (72,3%) genotype mostly detected, followed by GII.6 (9,8%). In lower number were also characterized GII.2, GII.3, GII.4, GII.6, GII.12, GII.13, GII.14, GII.15, GII.17, GII.21, and GI.1 GI.3. With the subsequent sequencing of the P2 region, also located in VP1, we identified five variants of GII.4 circulating in the state, namely: 2003, 2004, 2006a, 2006b and 2010. The variant 2006b was detected in 47,8% (22/46) samples, then the variant 2010 with 41,3% (19/46) between the GII.4 detection. The great diversity of genotypes found and high prevalence of genotype GII.4 and its variants supports the need to maintain a molecular and epidemiological surveillance of these viruses in the country, mainly due to the association of the emergence of new variants of NoV with outbreaks of globalized dimensions

As beta-lactamases de espectro ampliado (ESBL) representam um importante mecanismo de resistência aos beta-lactâmicos. Essas enzimas disseminaram-se entre membros da família Enterobacteriaceae que causam infecções relacionadas à assistência à saúde, especialmente as nosocomiais. Objetivos: (a) Determinar a prevalência de Escherichia coli e Klebsiella spp produtores de ESBL de origem hospitalar e comunitária; (b) Verificar a origem dos isolados (amostra clínica e unidade de internação); (c) Avaliar a acurácia dos testes fenotípicos de detecção de ESBL; (d) Determinar os perfis de sensibilidade aos antimicrobianos; (e) Determinar os genes de beta-lactamase; (f) Avaliar o modo de disseminação e; (g) Realizar experimentos de transferência de resistência. Material e métodos: Foram avaliados 1346 isolados (1162 E. coli, 180 K. pneumoniae e 4 K. oxytoca), de pacientes internados e ambulatoriais, entre abril de 2003 a maio de 2006, em Caxias do Sul. Um isolado/paciente foi incluído e a infecção hospitalar definida pelo CDC (Centers for Diseases Control and Prevention). Pelo método disco-difusão, conforme CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute) identificou-se os produtores de ESBL (triagem: aztreonam, cefotaxima, ceftazidima, ceftriaxona e cefpodoxima e confirmatório: cefpodoxima, ceftazidima, cefotaxima, com e sem ác. clavulânico). A cefepima foi incluída nos testes. Os isolados foram submetidos a testes de sensibilidade aos antimicrobianos, por disco-difusão, segundo a CLSI; ao método de PCR para detecção dos genes bla TEM, bla SHV, bla CTX-M e; à tipagem por PGFE. A cepa E. coli αDH, como receptora, foi usada na conjugação e os transconjugantes pesquisados para produção de ESBL e perfil de sensibilidade. Resultados: As prevalências de ESBL em nível hospitalar foram: K. pneumoniae (43,7%) e E. coli (6,7%) e a comunidade, respectivamente, de 2,6% e 0,4%. As vias aéreas (escarro, aspirado traqueal, lavado broncoalveolar) , sangue e urina, e as UTIs e Clínica-Cirúrgicas foram as amostras clínicas e unidades de internação com os maiores percentuais de isolados produtores de ESBL. Independente da bactéria analisada, a ceftazidima foi o substrato com o pior desempenho nos testes. Já a cefpodoxima, a cefotaxima, a ceftriaxona e o aztreonam apresentaram sensibilidade de 100% e especificidade >94,0% para isolados de Klebsiella spp. Para E. coli a cefpodoxima foi o melhor substrato (sensibilidade de 100,0% e especificidade de 75,0%). A cepefima apresentou excelente desempenho. Os isolados de Klebsiella spp produtores de ESBL apresentaram taxas de resistência superiores àqueles apresentados pelos isolados não produtores de ESBL, para vários antimicrobianos beta-lactâmicos e não beta-lactâmicos. Independente da produção de ESBL esses isolados foram sensíveis aos carbapenêmicos e tigeciglina. Foram detectados em E. coli e Klebsiella spp com fenóitpo ESBL os genes de beta-lactamase blaTEM (89,0%), blaCTX-M (75,6%) e blaSHV (35,4%). Foram identificados 22 padrões de PFGE, sendo 11 com mais de um isolado. Esses padrões envolveram 50 isolados de K. pneumoniae produtores de ESBL, com alta disseminação intra-hospitalar entre as unidades de internação do hospital e por período superior a um ano. Os transconjugantes apresentaram fenótipo de ESBL e resistência aos aminoglicosídeos. Conclusões: Nossos resultados mostraram que a produção de ESBL constitui um problema essencialmente nosocomial. Concluímos que a adição da cefepima nos testes de detecção de ESBL leva a um aumento significante na acurácia para E. coli. No entanto, os isolados produtores de ESBL do gênero Klebsiella representam o maior problema no hospital. Esses apresentaram ampla variabilidade genômica, indicando forte pressão seletiva de antimicrobianos, mas também disseminação multiclonal, indicando transmissão cruzada e uma situação de endemia dessas bactérias no hospital. Por fim, nossos resultados indicaram uma fácil disseminação de plasmídeos multirresistentes, o que pode representar um impacto importante nas opções terapêuticas para o tratamento de infecções por bactérias produtoras de ESBL. / Submitted by Marcelo Teixeira (mvteixeira@ucs.br) on 2014-05-23T19:16:15Z No. of bitstreams: 1 Tese Claudia Wollheim.pdf: 783754 bytes, checksum: 3ec34679603cc7ab1e9b4dffac5e5855 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-05-23T19:16:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese Claudia Wollheim.pdf: 783754 bytes, checksum: 3ec34679603cc7ab1e9b4dffac5e5855 (MD5) / The extended-spectrum beta-lactamases (ESBL) represent an important mechanism of resistance to beta-lactam antibiotics. Such enzymes have spread among members of the Enterobacteriaceae family, which are responsible for infections related to health care, particularly nosocomial infections. Objectives: (a) To determine the prevalence of ESBL producing Escherichia coli and Klebsiella spp of hospital and community origin; (b) To verify the origin of the isolates (clinical sample and internment unit); (c) To evaluate the accuracy of the phenotypic tests for ESBL detection; (d) To determine the sensitivity profiles to antimicrobial drugs; (e) To identify the beta-lactamase genes; (f) To evaluate the dissemination way and; (g) To perform experiments of resistance transfer. Materials and Methods: 1,346 isolates were evaluated (1,162 E. coli, 180 K. pneumoniae and 4 K. oxytoca), from inpatient and outpatients, between April 2003 and May 2006, in Caxias do Sul. One isolate/patient was included and the nosocomial infection defined by the CDC (Centers for Diseases Control and Prevention). By means of the disc-diffusion method, according to the CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute), the ESBL producers were identified (screening: aztreonam, cefotaxime, ceftazidime, ceftriaxone, and cefpodoxime and confirmation: cefpodoxime, ceftazidime, cefotaxime, with and without clavulanic acid). Cefepime was included in the tests. The isolates were submitted to sensitivity tests to antimicrobial drugs, using disc-diffusion, defined by CLSI; to PCR for detecting the bla TEM, bla SHV, bla CTX-M genes, and; to PGFE typification. The E. coli a-DH strain was used as the receptor in conjugation experiments and the transconjugants were analyzed with regards to ESBL production and sensitivity profile. Results: The ESBL prevalences at the hospital level were: K. pneumoniae (43.7%) and E. coli (6.7%) and at the community, 2.6% and 0.4%, respectively. The airways (sputum, traqueal aspiration and broncoalveolar lavage), blood, and urine, and the ICUs and surgical units were the clinical samples and the internment units presenting the largest percentages of ESBL producing isolates. Independently of the bacterium, ceftazidime was the substrate which provided the poorest results in the tests. On the other hand, cefpodoxime, cefotaxime, ceftriaxone, and aztreonam showed 100% sensitivity and specificity >94.0% for Klebsiella spp isolates. For E. coli, the best substrate was cefpodoxime (100% sensitivity and 75.0% specificity). Cefepime presented excellent performance. The ESBL producing Klebsiella spp isolates showed higher resistance rates than the ESBL non-producing strain, for several antimicrobial drugs, either beta-lactamic or not. Irrespectively of ESBL production, these isolates showed sensitivity to carbapenems and tigecyiclin. In the E. coli and Klebsiella spp with the ESBL phenotype, the beta-lactamase genes blaTEM (89.0%), blaCTX-M (75.6%) e blaSHV (35.4 %). Were detected. 22 PFGE patterns were identified, 11 with more than one isolate. These clones comprised 50 isolates of ESBL producing K. pneumoniae, with high intra-hospital dissemination among the internment units and for times longer than one year. The transconjugants presented the ESBL phenotype and resistance to aminoglycosides. Conclusions: Our results have shown that ESBL production constitutes an essentially nosocomial problem. We conclude that the addition of cefepime to the ESBL detection tests significantly enhances the accuracy of the test when applied to E. coli. However, the ESBL producing isolates of the genus Klebsiella represent the main problem in the hospital. These isolates presented great genomic variability, indicating strong selective pressure by antimicrobial drugs, but also multiclonal dissemination, which indicates cross-transmission and an endemic situation of these bacteria in the hospital. Finally, our results indicate an easy spreading of multi-resistant plasmids, what can represent an important impact on the therapeutic options for the treatment of ESBL producing bacteria.

Resumo: O presente trabalho evidencia os esforços realizados na tentativa de se aperfeiçoar a técnica de MIRU ("Mycobacterial Interspersed Repetitive Units"). Esta utiliza como marcadores, diferenças em fragmentos de DNA não codificadores específicos do Mycobacterium tuberculosis e vem sendo empregada para o estudo epidemiológico da tuberculose, pela facilidade de execução. A técnica de MIRU possibilita uma comparação entre linhagens de diferentes áreas geográficas e permite o rastreamento da movimentação de linhagens individuais. Na otimização os seguintes parâmetros foram determinados: 1. protocolos de purificação de DNA; 2. estratégias de amplificação pela PCR; 3. comparações entre um "kit" de PCR ("PCR Master Mix" - PROMEGA) e a utilização da PCR da maneira convencional; 4. testes de variadas condições de amplificação utilizando o "kit" e os reagentes convencionais de PCR; 5. determinação de protocolos de ciclagem para a amplificação dos fragmentos desejados; 6. teste de amplificação sem a prévia extração de DNA das amostras utilizadas. Após a padronização a metodologia foi utilizada na tipagem de 82 amostras de M. tuberculosis que se encontravam divididas em dois grupos, sendo o primeiro com 49 amostras, provenientes de pacientes do Serviço Especial de Saúde de Araraquara (SESA - USP, Araraquara) e o segundo, composto de 33 amostras de bactérias com perfil de resistência a pirazinamida e a outras drogas, provenientes de Maringá. Nesta etapa foram realizados: 7. PCR para a confirmação de gênero e espécie para M. tuberculosis nas 82 amostras analisadas. 8. Aplicação da técnica de MIRU e análise manual de todas as amostras provenientes de pacientes; 9. Emprego de ferramentas de bioinformática (programa PAST "Paleontological Statistics Software Package for Education and Data Analysis") para a análise das amostras... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The present work shows efforts to improve the MIRU (Mycobacterial Interspersed Repetitive Units) assay. This methodology, that has been exploited for fingerprinting the Mycobacterium tuberculosis in molecular epidemiological studies, allows for direct and reliable comparison of results between laboratories and the development of large-scale epidemiological studies. In the optimization of MIRU assay, some parameters were defined: DNA purification protocols and PCR strategies were compared, to select the most practical and economical among them. After the standartization, 82 M. tuberculosis strains, from two different groups were analised. The 49 bacteria strains from the first group were sensible and the 33 from the second one were resistant to pyrazinamide and another drugs as isoniazide and/or rifampicin. To stablish the allelic studies the samples were first confirmed as M. tuberculosis by PCR. Then the MIRU assay was applied and the genetic profile was determined. These results generated dendrograms, obtained by bioinformatic tools. This study showed that any kind of DNA purification and even the use of fresh bacterial culture directly into the PCR tube can be used. When the PCR strategies were compared the utilization of the PCR kit seemed to be more practical and to avoid some mistakes that can happens during the "home-made" PCR mixture preparation. Furthermore, it allows some dilutions higher than those recommended by the manufacturer. In the same way, the "home-made" mixture in amounts smaller than those suggested can be used. These experiments indicated that only two annealing temperatures can be used to the PCR with the twelve primer pairs, always in the same MgCl2 concentration, allowing the amplification of more samples at the same time. To generate dendrograms with the allelic data from clinical samples... (Complete abstract click electronic access below) / Orientador: Clarice Queico Fujimura Leite / Coorientador: Sandro Roberto Valentini / Banca: Mario Hiroyuki Hirata / Banca: Fernando Augusto Fiúza de Melo / Banca: Daisy Nakamura Sato / Banca: Rosilene Fressatti Cardoso / Doutor

As beta-lactamases de espectro ampliado (ESBL) representam um importante mecanismo de resistência aos beta-lactâmicos. Essas enzimas disseminaram-se entre membros da família Enterobacteriaceae que causam infecções relacionadas à assistência à saúde, especialmente as nosocomiais. Objetivos: (a) Determinar a prevalência de Escherichia coli e Klebsiella spp produtores de ESBL de origem hospitalar e comunitária; (b) Verificar a origem dos isolados (amostra clínica e unidade de internação); (c) Avaliar a acurácia dos testes fenotípicos de detecção de ESBL; (d) Determinar os perfis de sensibilidade aos antimicrobianos; (e) Determinar os genes de beta-lactamase; (f) Avaliar o modo de disseminação e; (g) Realizar experimentos de transferência de resistência. Material e métodos: Foram avaliados 1346 isolados (1162 E. coli, 180 K. pneumoniae e 4 K. oxytoca), de pacientes internados e ambulatoriais, entre abril de 2003 a maio de 2006, em Caxias do Sul. Um isolado/paciente foi incluído e a infecção hospitalar definida pelo CDC (Centers for Diseases Control and Prevention). Pelo método disco-difusão, conforme CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute) identificou-se os produtores de ESBL (triagem: aztreonam, cefotaxima, ceftazidima, ceftriaxona e cefpodoxima e confirmatório: cefpodoxima, ceftazidima, cefotaxima, com e sem ác. clavulânico). A cefepima foi incluída nos testes. Os isolados foram submetidos a testes de sensibilidade aos antimicrobianos, por disco-difusão, segundo a CLSI; ao método de PCR para detecção dos genes bla TEM, bla SHV, bla CTX-M e; à tipagem por PGFE. A cepa E. coli αDH, como receptora, foi usada na conjugação e os transconjugantes pesquisados para produção de ESBL e perfil de sensibilidade. Resultados: As prevalências de ESBL em nível hospitalar foram: K. pneumoniae (43,7%) e E. coli (6,7%) e a comunidade, respectivamente, de 2,6% e 0,4%. As vias aéreas (escarro, aspirado traqueal, lavado broncoalveolar) , sangue e urina, e as UTIs e Clínica-Cirúrgicas foram as amostras clínicas e unidades de internação com os maiores percentuais de isolados produtores de ESBL. Independente da bactéria analisada, a ceftazidima foi o substrato com o pior desempenho nos testes. Já a cefpodoxima, a cefotaxima, a ceftriaxona e o aztreonam apresentaram sensibilidade de 100% e especificidade >94,0% para isolados de Klebsiella spp. Para E. coli a cefpodoxima foi o melhor substrato (sensibilidade de 100,0% e especificidade de 75,0%). A cepefima apresentou excelente desempenho. Os isolados de Klebsiella spp produtores de ESBL apresentaram taxas de resistência superiores àqueles apresentados pelos isolados não produtores de ESBL, para vários antimicrobianos beta-lactâmicos e não beta-lactâmicos. Independente da produção de ESBL esses isolados foram sensíveis aos carbapenêmicos e tigeciglina. Foram detectados em E. coli e Klebsiella spp com fenóitpo ESBL os genes de beta-lactamase blaTEM (89,0%), blaCTX-M (75,6%) e blaSHV (35,4%). Foram identificados 22 padrões de PFGE, sendo 11 com mais de um isolado. Esses padrões envolveram 50 isolados de K. pneumoniae produtores de ESBL, com alta disseminação intra-hospitalar entre as unidades de internação do hospital e por período superior a um ano. Os transconjugantes apresentaram fenótipo de ESBL e resistência aos aminoglicosídeos. Conclusões: Nossos resultados mostraram que a produção de ESBL constitui um problema essencialmente nosocomial. Concluímos que a adição da cefepima nos testes de detecção de ESBL leva a um aumento significante na acurácia para E. coli. No entanto, os isolados produtores de ESBL do gênero Klebsiella representam o maior problema no hospital. Esses apresentaram ampla variabilidade genômica, indicando forte pressão seletiva de antimicrobianos, mas também disseminação multiclonal, indicando transmissão cruzada e uma situação de endemia dessas bactérias no hospital. Por fim, nossos resultados indicaram uma fácil disseminação de plasmídeos multirresistentes, o que pode representar um impacto importante nas opções terapêuticas para o tratamento de infecções por bactérias produtoras de ESBL. / The extended-spectrum beta-lactamases (ESBL) represent an important mechanism of resistance to beta-lactam antibiotics. Such enzymes have spread among members of the Enterobacteriaceae family, which are responsible for infections related to health care, particularly nosocomial infections. Objectives: (a) To determine the prevalence of ESBL producing Escherichia coli and Klebsiella spp of hospital and community origin; (b) To verify the origin of the isolates (clinical sample and internment unit); (c) To evaluate the accuracy of the phenotypic tests for ESBL detection; (d) To determine the sensitivity profiles to antimicrobial drugs; (e) To identify the beta-lactamase genes; (f) To evaluate the dissemination way and; (g) To perform experiments of resistance transfer. Materials and Methods: 1,346 isolates were evaluated (1,162 E. coli, 180 K. pneumoniae and 4 K. oxytoca), from inpatient and outpatients, between April 2003 and May 2006, in Caxias do Sul. One isolate/patient was included and the nosocomial infection defined by the CDC (Centers for Diseases Control and Prevention). By means of the disc-diffusion method, according to the CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute), the ESBL producers were identified (screening: aztreonam, cefotaxime, ceftazidime, ceftriaxone, and cefpodoxime and confirmation: cefpodoxime, ceftazidime, cefotaxime, with and without clavulanic acid). Cefepime was included in the tests. The isolates were submitted to sensitivity tests to antimicrobial drugs, using disc-diffusion, defined by CLSI; to PCR for detecting the bla TEM, bla SHV, bla CTX-M genes, and; to PGFE typification. The E. coli a-DH strain was used as the receptor in conjugation experiments and the transconjugants were analyzed with regards to ESBL production and sensitivity profile. Results: The ESBL prevalences at the hospital level were: K. pneumoniae (43.7%) and E. coli (6.7%) and at the community, 2.6% and 0.4%, respectively. The airways (sputum, traqueal aspiration and broncoalveolar lavage), blood, and urine, and the ICUs and surgical units were the clinical samples and the internment units presenting the largest percentages of ESBL producing isolates. Independently of the bacterium, ceftazidime was the substrate which provided the poorest results in the tests. On the other hand, cefpodoxime, cefotaxime, ceftriaxone, and aztreonam showed 100% sensitivity and specificity >94.0% for Klebsiella spp isolates. For E. coli, the best substrate was cefpodoxime (100% sensitivity and 75.0% specificity). Cefepime presented excellent performance. The ESBL producing Klebsiella spp isolates showed higher resistance rates than the ESBL non-producing strain, for several antimicrobial drugs, either beta-lactamic or not. Irrespectively of ESBL production, these isolates showed sensitivity to carbapenems and tigecyiclin. In the E. coli and Klebsiella spp with the ESBL phenotype, the beta-lactamase genes blaTEM (89.0%), blaCTX-M (75.6%) e blaSHV (35.4 %). Were detected. 22 PFGE patterns were identified, 11 with more than one isolate. These clones comprised 50 isolates of ESBL producing K. pneumoniae, with high intra-hospital dissemination among the internment units and for times longer than one year. The transconjugants presented the ESBL phenotype and resistance to aminoglycosides. Conclusions: Our results have shown that ESBL production constitutes an essentially nosocomial problem. We conclude that the addition of cefepime to the ESBL detection tests significantly enhances the accuracy of the test when applied to E. coli. However, the ESBL producing isolates of the genus Klebsiella represent the main problem in the hospital. These isolates presented great genomic variability, indicating strong selective pressure by antimicrobial drugs, but also multiclonal dissemination, which indicates cross-transmission and an endemic situation of these bacteria in the hospital. Finally, our results indicate an easy spreading of multi-resistant plasmids, what can represent an important impact on the therapeutic options for the treatment of ESBL producing bacteria.