Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Mes travaux de thèse ont porté sur l’étude de deux modèles murins d’épilepsies génétiques de l’enfance liées à des mutations des canaux Nav1.1 (impliqués dans l’excitabilité des neurones inhibiteurs) : le Syndrome de Dravet (SD), une épilepsie pharmaco-résistante sévère, et l’Epilepsie Génétique avec Convulsions Fébriles Plus (EGCF+), présentant un phénotype plus modéré.Ils se sont décomposés en 3 axes : - La première partie mettant en évidence un phénomène d’épileptogenèse dans ces modèles murins.- La seconde permettant d’identifier des conditions expérimentales d’induction d'activités épileptiformes spécifiques du modèle murin du SD sur des tranches de cerveau.- La dernière consistant à mettre au point une stratégie pour réduire l’hyperexcitabilité cérébrale / During my thesis, I studied two murine models of childhood genetic epilepsies, caused by mutations of Nav1.1 channels (involved in the excitability of inhibitory neurons): Dravet Syndrome (DS), a severe and drug resistant epilepsy, and Genetic Epilepsy with Febrile Seizures Plus (GEFS+), characterized by a milder phenotype.My work is divided into three parts:- The first one revealed a process of epileptogenesis in these murine models.- In the second, I identified experimental conditions to induce epileptiform activities which are specific of the DS model in brain slices, which could allow pharmacological screens ex-vivo.- The third one was aimed at developing a new strategy to reduce cerebral hyperexcitability

Le cerveau est composé de réseaux de neurones interconnectés dont la mise en place au cours du développement cérébral est hautement régulée par des processus cellulaires, moléculaires et fonctionnels. Un dysfonctionnement de ces processus peut perturber l’établissement de ces réseaux et conduire à des pathologies neurologiques. L’épilepsie absence est une pathologie génétiquement déterminée qui apparait au cours de l’enfance. Les crises d’absences sont caractérisées par une altération de la conscience et par la présence de décharges de pointe-ondes (DPO) sur l’électroencéphalogramme initiées au sein d’un zone restreinte du cortex. Cependant, on sait peu de choses sur les mécanismes conduisant à la mise en place des décharges épileptiques récurrentes au cours de l’enfance (i.e. l’épileptogenèse). Nous avons fait l’hypothèse que des anomalies du processus de maturation cérébrale sont à l’origine de l’apparition des DPO.J’ai vérifié cette hypothèse chez un modèle génétique d’épilepsie absence, le rat GAERS. Dans un premier temps, j’ai étudié l’épileptogenèse du GAERS grâce à l’enregistrement in vivo du potentiel de champs local et de l’activité intracellulaire des neurones pyramidaux au niveau du site d’initiation des DPO, le cortex somatosensoriel (SoCX). Nous avons mis en évidence que les DPO se développent progressivement après la fin d’une période de maturation hautement sensible et malléable du SoCx (i.e. période critique). La maturation des décharges épileptiques consiste en une augmentation de leur fréquence, de leur durée et en l’évolution du motif de décharge jusqu’à l’âge adulte, période à laquelle ces paramètres atteignent une relative stabilité. De plus, ces changements sont associés à une altération graduelle des propriétés intrinsèques des neurones pyramidaux qui s’accompagne d’une augmentation progressive de la force de l’activité synaptique locale et d’une propension accrue des neurones du SoCx à générer des oscillations synchrones.Nous avons ensuite recherché les raisons de cette prédisposition anormale des neurones du SoCx à se synchroniser chez le GAERS. Dans ce but, nous avons cherché à mettre en évidence des anomalies de la maturation corticale au niveau de la structure et de l’organisation fonctionnelle du SoCx avant l’apparition des DPO. En combinant l’IRM, des marquages immunohistochimiques et le traçage rétrograde monosynaptique des connexions longue distance par le virus de la rage modifié, nous avons pu montrer qu’aucune anomalie globale du cerveau et du SoCx n’est présente chez le GAERS avant l’apparition des DPO. Afin de déterminer la présence d’anomalies fonctionnelles nous avons utilisé l’imagerie calcique biphoton et enregistré in vivo la dynamique de l’activité spontanée du réseau de neurones des couches 2-3 du SoCx. Chez le GAERS, nous avons mis en évidence que ces neurones sont plus actifs et dévoilent une organisation fonctionnelle différente de celle des animaux contrôles. Enfin, pour comprendre comment cette organisation fonctionnelle anormale est médiée, nous avons étudié la structure dendritique et synaptique du SoCx en combinant la microscopie électronique et la reconstruction morphologique de neurones. Nous avons mis en évidence un élargissement des épines dendritiques associé à un allongement de la densité post-synaptique au sein du SoCx chez le GAERS.L’ensemble de ces résultats démontrent la nature progressive du développement de l’épilepsie absence ainsi que l’existence d’anomalies de la maturation corticale qui affectent la structure et la fonction du réseau neuronal, avant l’apparition des crises épileptiques. Ces altérations constituent une prédisposition à l’établissement et l’évolution des DPO et sont une cible thérapeutique potentielle qui pourrait permettre de bloquer la mise en place des crises d’absences. / The brain is organized into several interconnected neuronal networks whose formation is highly regulated by cellular, molecular and functional processes. The dysfunction of these processes during brain development could disrupt neuronal circuit establishment and lead to neurological pathologies. Absence epilepsy is a genetically determined disease with a childhood onset. Absence seizures are characterized by an impairment of the consciousness associated on the electroencephalogram with spike and wave discharges (SWD). However, little is known about the mechanisms leading to the establishment of recurrent epileptic discharges (i.e. epileptogenesis). We hypothesized that SWD onset originates from an abnormal brain maturation.During my PhD, I examined this hypothesis in a recognized genetic model of absence epilepsy, the GAERS rat. First, I studied the epileptogenic process by recording in vivo the local field potential and the intracellular activities of pyramidal neurons in the initiating area of SWD, the somatosensory cortex (SoCx), at different post natal days in GAERS. We showed that SWD progressively developed after the end of a highly sensitive and plastic maturation period of the SoCx (i.e critical period). Afterward, epileptic discharges maturation consists in an increase of their duration, their number and in an evolution of the pattern reaching a relative stability at adulthood. Moreover, these changes are associated with a gradual abnormal alteration of the intrinsic properties of pyramidal neurons which is accompanied with a progressive increase in the strength of the local synaptic activity and a growing propensity of SoCx neurons to generate synchronized oscillations.Then, we explored the reasons for this abnormal susceptibility of SoCx neurons to be more synchronized in GAERS. We sought to bring to light anomalies of SoCx maturation at the structural and functional organization level prior to SWD onset in GAERS. Combining MRI, immunohistochemistry labeling and rabies-mediated retrograde monosynaptic tracing to reveal long-range connectivity, we showed that, prior to SWD onset, no brain and SoCx architecture abnormalities could be observed in GAERS. Then, using two photon calcium imaging we recorded in vivo the spontaneous activity of SoCx layers 2-3 neurons to evidence their functional organization. We found that these neurons were more active and unveiled a different functional organization in GAERS compared to control animals. Finally, to understand how is mediated this abnormal functional organization, we studied the dendritic and synaptic fine structure of SoCx neurons by combining electron microscopy and morphological neuron reconstruction. We highlighted an enlargement of the dendritic spines as well as an increase of the post-synaptic density length in the GAERS SoCx.Taken together, these findings showed the progressive nature of absence epilepsy development and the presence of abnormalities in the cortical maturation which affect the structure and the functional of the neuronal network the prior to SWD. These alterations constitute a breeding ground for the establishment and evolution of SWD. Future studies will aim at interfering with the epileptogenesis process should target these early alterations to stop seizure development.

L’épilepsie du lobe temporal (ELT) est une pathologie neurologique sévère dont le fort taux de pharmacorésistance nécessite de nouveaux traitements. Le modèle lithium-pilocarpine modélise les caractéristiques et le développement de l’ELT. L’administration du carisbamate au début de l’épileptogenèse empêche l’apparition de l’ELT dans une sous-population de rats et la remplace par une épilepsie de type absence (ETA). L’évaluation cognitive effectuée durant la phase chronique a permis de distinguer les deux sous-populations : le groupe épilepsie de type absence ne développe pas le déficit cognitif sévère observé dans le modèle lithium pilocarpine. La spectroscopie du 13C n’a pas révélé de différence métabolique majeure entre les deux sous populations traitées, qu’elles développent une ELT ou une ETA. Ce travail souligne que l’administration précoce de carisbamate peut transformer l’ELT en une épilepsie moins sévère et fortement améliorer les comorbidités cognitives qui accompagnent l’ELT. / Temporal lobe epilepsy (TLE) is a severe neurological disease with a high refractory rate, which requires new treatments. The lithium-pilocarpine model allows reproducing human TLE features and development. Carisbamate administration at epileptogenesis onset prevents TLE incidence in a rats’ subpopulation, which is substituted by absence-like epilepsy (ALE). Behavioral and cognitive assessment performed during chronic period allowed differentiating the two subpopulations: ALE group did not develop the severe cognitive impairment shown in the lithium-pilocarpine model. 13C spectroscopy did not show major metabolism difference between the two treated subpopulations, whatever they develop TLE or ALE. This work demonstrates that early carisbamate administration can induce a shift from TLE in a less severe epilepsy form, and can strikingly improve TLE-related cognitive comorbidities.

L’épilepsie du lobe temporal (ELT) est la forme d’épilepsie partielle la plus fréquente chez l’adulte. Elle se caractérise par une période de latence pendant laquelle l’ELT se met en place. Cette période est appelée épileptogenèse. L’épileptogenèse reste une période inaccessible chez l’Homme. Cependant, les modèles animaux présentent l’avantage de pouvoir l’étudier, dans le but de prévenir l’ELT. Ainsi, mon travail de thèse a consisté à mettre en évidence des marqueurs prédictifs de l’épileptogenèse, sur le plan cognitif et électrophysiologique in vivo, à partir du modèle pilocarpine. Les résultats ont montré que dès le stade précoce de l’épileptogenèse, des déficits de mémoire spatiale corrélaient avec une diminution de la puissance des oscillations thêta chez les animaux pilocarpine, sans modification jusqu’au stade chronique. Au même stade, une diminution de la puissance et de la fréquence des oscillations thêta lors du comportement d’exploration a été observée. L’activité interictale, activité paroxystique présente chez les patients entre leurs crises et caractéristique du stade épileptogène dans les modèles animaux, ne corrèle pas directement avec les déficits cognitifs mais diminue la puissance des oscillations thêta dans l’onde après la pointe au cours de l’épileptogenèse mais plus au stade chronique, ce qui suggère une importante modification du réseau avant le stade chronique. On a également décrit deux types d’activité interictale dont les propriétés (amplitude, nombre) et la dynamique au cours du temps sont modifiées juste avant la première crise spontanée, ce qui pourrait constituer, comme les déficits spatiaux et l’altération du rythme thêta, un marqueur prédictif de l’épileptogenèse. De plus, une augmentation du couplage entre l’hippocampe et le CE est observée au cours de l’épileptogenèse mais plus au stade chronique, alors qu’une modification du flux de l’information entre ces deux structures au stade épileptogène précoce persiste jusqu’au stade chronique, indépendamment de la présence ou non d’activité interictale. Ces résultats mettent en évidence la construction d’un réseau épileptogène, un changement majeur du réseau avant la première crise spontanée, et des marqueurs qui pourraient être prédictifs de l’épileptogenèse. L’ELT, les oscillations et les fonctions cognitives faisant intervenir des propriétés de réseau, tels les processus de synchronisation, l’enregistrement de 15 structures au sein du lobe temporal a montré, à partir du modèle pilocarpine, un réseau doté de caractéristiques plus « small-world » (SW) qui tendrait à se synchroniser plus localement, avec une perte des connexions longue distance. Ces résultats pourraient expliquer les altérations de réseau observées précédemment au cours de l’épileptogenèse. L’analyse SW et de cohérence, à l’échelle de ce réseau de structures, lors de différents états (comportementaux, processus cognitifs), mettent en évidence des changements de la dynamique lors de ces états, en conditions normales et pathologiques. Toutes ces modifications de réseau doivent être sûrement recrutées dans la mise en place d’un cerveau épileptique et des altérations cognitives associées. / Temporal lobe epilepsy (TLE) is the most common form of partial epilepsy in adults. TLE is characterized by a latent period during which TLE takes place. This period is called epileptogenesis. In TLE patients, epileptogenesis is unexplored. However, the use of animal models, like pilocarpine model, allows the study of epileptogenic processes, in order to try to prevent TLE. Thus, my PhD work tries to yield some predictive markers of epileptogenesis, in the pilocarpine model. We studied cognitive and electrophysiological in vivo alterations in this model. We showed that there are early and persistent spatial deficits that correlate with a decrease of the power of theta oscillations, i.e. during the early stage of epileptogenesis and the chronic stage. At the same time, there is also a decrease of power and frequency of theta rhythm during exploratory behaviors. Interictal-like activity (ILA) is a pathological activity present during epileptogenesis in experimental models. ILA does not correlate with cognitive deficits, but decreases theta power after the spike, i.e. in its wave, during epileptogenesis but not during the chronic stage anymore. This suggests an important network alteration before the chronic stage. Indeed, we described two types of ILA, whose properties (number, amplitude) and dynamics evolved during epileptogenesis with a major switch just before the first spontaneous seizure. All together, these results may constitute, with spatial deficits and theta rhythm alterations, predictive markers of epileptogenesis. Moreover, we showed an increase in the coupling, ILA-dependent, between the hippocampus and the entorhinal cortex, during epileptogenesis but not during the chronic stage, whereas a reversal of the information flow between these two structures occurs at the early stage of epileptogenesis and persists without any modification till the chronic stage. These results suggest the build-up of an epileptogenic network, a major switch of network properties just before the first spontaneous seizure, and some markers that could be predictive of epileptogenesis. TLE, oscillations and cognition involved processes at the network level, in particular synchronization processes. These processes could be possible via oscillations, which allow information transfer between structures of the network, in order to provide behavioral and cognitive processing. Recordings performed in 15 different structures of the temporal lobe showed, in pilocarpine animals, a network with more “small-world” (SW) features, with a higher local clustering and a loss of long-range connections. These results could explain cognitive and oscillatory alterations observed previously during epileptogenesis. SW and coherence analysis, at the network level, between signals during different brain-states (behaviors and cognitive processes) showed changes in dynamics occurring during these states, in normal and epileptogenic conditions. All these modifications in network activities may be involved in the construction of an epileptic brain and in associated cognitive deficits.

L'épilepsie du lobe temporal (ELT) est la forme la plus fréquente de l'épilepsie chez l'adulte. Elle se traduit par des crises spontanées et récurrentes, qui sont résistantes à tout traitement dans 90% des cas. Une agression initiale du cerveau (traumatisme crânien, méningite, convulsions fébriles etc.), est souvent à l'origine de la transformation d'un cerveau « sain » en cerveau épileptique. L'ensemble des processus responsables de cette transition s'appelle l'épileptogenèse. Pouvoir bloquer et/ou retarder l'épileptogenèse chez les patients à risque est une question de santé majeure. En plus des crises, l'ELT soulève d'autres questions. Elle est souvent associée à des déficits cognitifs, qui sont la conséquence de la réorganisation des circuits neuronaux. Ces déficits pourraient être traités de façon indépendante de l'épilepsie elle-même. Le projet de recherche de cette thèse s'inscrit dans ce cadre général. / Temporal Lobe Epilepsy (TLE) is the most common form of epilepsy in adults. It translates into spontaneous and recurrent seizures, which are resistant to any treatment in 90% of cases. An initial brain insult (head injury, meningitis, febrile seizures etc.), is often the cause of the transformation of a "healthy" brain into an epileptic one. The process responsible for this transition is called epileptogenesis. Blocking and/or delaying epileptogenesis in at-risk patients is a key issue for public health. In addition to the seizures, TLE raises other problems. It is often associated with cognitive deficits, which are the result of the reorganization of neuronal circuits. These deficits may be treated independently of epilepsy itself. The work presented here fits into this general framework.

Les récepteurs de type Toll (TLR) sont des récepteurs cellulaires jouant un rôle pivot dans le déclenchement de la réponse immunitaire après une infection ou une blessure, c'est-à-dire une inflammation. L'activation de la signalisation TLR a été associée à l’épilepsie. Dans ce projet, j'utilisai trois modèles distincts pour étudier comment le déclenchement des TLR contribue à l'épileptogenèse. Il existe une corrélation entre les malformations corticales développementales telle la dysplasie corticale focale (FCD) et convulsions fébriles dans les enfants de bas âge. Récemment, une réponse neuro-inflammatoire fut identifiée dans les lésions FCD. Nous postulâmes que l'inflammation induite par le FCD peut augmenter la sensibilité aux crises (chapitre 2). Nous modélisâmes FCD en induisant une congélation-lésion corticale chez le rat néonatal. La lésion corticale déclencha des effecteurs en aval de TLR4, spécifiquement le précurseur de la cytokine Caspase-1, dans l'hippocampe ipsilatéral à la lésion. Les rats lésés développèrent des crises fébriles expérimentales nettement plus rapidement que les rats témoins. Le blocage de l'activité de la Caspase-1 prolongea significativement la latence des crises chez les rats lésés. Nos résultats impliquent l'inflammation médiée par la Caspase-1 en tant que déclencheur des crises fébriles chez les enfants avec FCD préexistante. Des études antérieures déterminèrent que l'activation systémique de la cascade TLR4 abaisse le seuil de crise. Nous étudiâmes si la pénétration des cellules immunitaires périphériques dans le cerveau pendant la stimulation TLR4 favorise l'activité ictal en stimulant la voie TLR4 dans les leucocytes prélevés sur la rate de rat (splénocytes). Ensuite, nous co-cultivâmes des splénocytes avec des coupes organotypiques dérivées du cerveau in vitro (chapitre 3). L'ajout de splénocytes stimulés par TLR4 donna lieu à une neuro-inflammation et à une excitation neuronale accrue. L’ajout de splénocytes non-stimulés n’eut aucun effet pro-inflammatoire ou pro-excitateur dans les coupes organotypiques. De plus, l'inhibition de la Caspase-1 dans des coupes organotypiques co-cultivées avec des splénocytes stimulés diminua la neuro-inflammation et l'hyperexcitabilité neuronale. Nos résultats suggèrent que l'infiltration de leucocytes activés par TLR4 dans le cerveau augmente la prédisposition aux crises via les mécanismes médiés par la Caspase-1. Précédemment, des rapports montrèrent que l'activation de la signalisation TLR3 facilite l'évolution des crises. L'introduction d'un agoniste synthétique TLR3 chez la souris in vivo et des coupes organotypiques hippocampiques in vitro produisirent des mécanismes anti-inflammatoires dépendants de la dose et du temps (chapitre 4). La stimulation TLR3 supprimait les crises d'hippocampe in vivo et réduisait l'excitabilité synaptique dans le réseau hippocampique à la fois in vivo et in vitro. Nous avons déterminé que les effets anticonvulsivants médiés par TLR3 étaient principalement provoqués par les cascades en aval IRF3 / IFN-β. Ainsi, nos données suggèrent que l'activation de TLR3 peut protéger le cerveau contre les crises par la production d'IFN-β. Nos résultats donnent un aperçu des nouveaux mécanismes cellulaires sous-jacents à la modulation inflammatoire de l'excitabilité neurale. Notre découverte des rôles de la Caspase-1 et de l'IFN-β dans l'influence du seuil de crise améliorera notre compréhension des fondements moléculaires de la génération de crises ce qui pourraient améliorer le traitement de l'épilepsie. / Toll-like receptors (TLRs) are cellular receptors that play a pivotal role in initiating immune response following infection or injury, i.e. inflammation. Nevertheless, activation of TLR signaling has been associated with seizure manifestation. In this research, I employed three distinct models to study how triggering TLRs contributes to ictogenesis. There is a correlation between developmental cortical malformations, e.g. focal cortical dysplasia (FCD), and fever-provoked, i.e. febrile, seizures in young children. Recently, neuroinflammation was reported in FCD lesions. Therefore, we posited that FCD-induced inflammation may increase seizure susceptibility (Chapter 2). To recapitulate FCD pathology, we induced a cortical freeze-lesion in neonatal rats. Lesioning the cortex triggered TLR4 downstream effectors, specifically the cytokine precursor Caspase-1, in the hippocampus ipsilateral to the lesion. Further, lesioned rats developed experimental febrile seizures markedly faster than sham control rats. Strikingly, blocking Caspase-1 activity prior to seizure induction significantly prolonged seizure latency in lesioned rats. Our results implicate Caspase-1-mediated inflammation as a main driver of febrile seizures in children with pre-existing brain malformations. In addition, previous reports determined that systemic activation of TLR4 cascade lowers seizure threshold. Hence, we developed an in vitro model to investigate whether penetration of peripheral immune cells into the brain during TLR4 stimulation promotes ictogenic activity (Chapter 3). First, we stimulated TLR4 pathway in leukocytes harvested from rat spleen, i.e. splenocytes. Thereafter, we co-cultured splenocytes with brain-derived organotypic slices in vitro. Adding TLR4-stimulated splenocytes gave rise to neuroinflammation and enhanced neuronal excitation, whereas adding unstimulated splenocytes failed to evoke pro-inflammatory or proexcitatory effects in organotypic slices. Moreover, Caspase-1 inhibition in organotypic slices cocultured with stimulated splenocytes diminished neuroinflammation and neuronal hyperexcitability. Our findings suggest that infiltration of TLR4-activated leukocytes into the brain elevate seizure predisposition via Caspase-1-mediated mechanisms. Beside TLR4 pathway, it was previously shown that activation of TLR3 signaling facilitates seizure evolution. In chapter 4, introducing a synthetic TLR3 agonist to mice in vivo and to hippocampal organotypic slices in vitro yielded anti-inflammatory mechanisms in a dose- and time-dependent manner. Also, we found that TLR3 stimulation suppressed hippocampal seizures in vivo and reduced synaptic excitability in the hippocampal network both in vivo and in vitro. Finally, we determined that TLR3-mediated anticonvulsive effects were chiefly driven by IRF3/IFN-β downstream cascades. Thus, our data suggests that TLR3 activation may protect the brain from seizures through production of IFN-β. Altogether, our findings provide insight into novel cellular mechanisms underlying inflammatory modulation of neural excitability. Furthermore, our discovery of the roles of Caspase-1 and IFN-β in influencing seizure threshold will improve our understanding of the molecular underpinnings of seizure generation, which may ultimately have therapeutic benefits for epilepsy treatment.