O presente estudo teve como objetivo determinar a capacidade antioxidante, antimicrobiana e anti-hemolítica do gengibre (Zingiber officinale) utilizando diferentes solventes extratores. Para tal, rasuras secas de gengibre foram trituradas e usadas na proporção 1:50 (p/v) nas quatro diferentes extrações: água, etanol (70%), acetona/ácido acético (70%/2%) ou acetona (70%). Após centrifugação, o extrato foi utilizado pra determinar o conteúdo de compostos fenólicos por Folin-Ciocalteau e ação sobre os radicais ABTS+. e DPPH.. Foi selecionado o melhor solvente extrator pelas propriedades antioxidantes e facilidade de sua remoção da matriz. Este extrato foi submetido à rotaevaporaçao, liofilizaçao e ressuspenção em tampão fosfato salino (PBS) e, então, utilizado nos estudos biológicos de captura de NO, ação antioxidante sobre hemólise induzida e ação sobre o crescimento de S. aureus. Os resultados foram expressos como média e desvio padrão. Para análise estatística empregou o software Minitab® com comparação entre grupos por ANOVA, diferenças significativas por Tukey e P < 0,05. O extrato de gengibre obtido em acetona apresentou maior conteúdo de compostos fenólicos (8,52 ± 1,24 mg equivalente de ácido gálico/g de gengibre). O extrato acetona apresentou menor valor de EC50 e maior ação antioxidante mediantes o ensaio com ABTS+., sendo respectivamente 0,07 ± 0,01 mg de massa seca do extrato/mL de ensaio e 10,93 ± 0,79 mg equivalentes de trolox (ET)/g de gengibre, sem diferença significativa com os valores obtidos nos extratos etanol e acetona/ácido. No ensaio do DPPH., o extrato acetona apresentou menor valor de EC50 (0,15 ± 0,01 mg de massa seca de extrato/mL de ensaio) e maior ação antioxidante (8,35 ± 0,60 mg ET/g de gengibre), sem diferença significativa com relação ao extrato etanólico. Dentre todos os ensaios, a extração em água apresentou resultados menos satisfatórios. A acetona foi selecionada como solvente extrator dos componentes do gengibre para os estudos biológicos. O extrato de gengibre (17,25 mg de massa seca/mL) inibiu 50% da formação de produtos no ensaio de captura de NO, valor similar ao obtido pela presença do antioxidante ácido gálico. Concentrações menores de extrato também agiram sobre o NO, sendo que 1,25 mg/mL refletiu em 33% de inibição. A hemólise foi evitada em 100% pelo extrato de gengibre em concentrações acima de 113 µg de massa seca de extrato/mL, resultado similar ao encontrado no ensaio contendo ácido ascórbico. A lise das hemácias foi evitada em 44% na presença de extrato 57 µg/mL. O extrato de gengibre não apresentou ação antimicrobiana sobre S. aureus. Conclui-se o extrato de gengibre, nas condições deste estudo, apresenta atividade antioxidante sobre ABTS+. e DPPH.; bem como sobre sistemas biológicos modelos como na captura de NO e lise de membrana celular. / The aim of this study was to determinate antioxidant capacity, antimicrobial activity and anti hemolytic action of ginger (Zingiber officinale) extract obtained by different solvents. For this purpose, dried ginger flakes were powdered and used in ratio 1:50 (w/v) in the four different extractions: water, ethanol (70%), acetone/acetic acid (70%/2%) and acetone (70%). The extract was centrifuged and used for phenolic compounds determination by Folin-Ciocalteau and action on ABTS+. and DPPH. radicals. The best extractor solvent was selected by its antioxidant properties and easier elimination from the matrix. The select extract was submitted on evaporation and lyophilization, and subsequent re-suspension on phosphate buffer saline (PBS). Then, this suspension was used in biologic studies as NO scavenging, antioxidant action on induced hemolysis and effect on S. aureus growth. The values were express as mean and standard deviation. Statistical analysis carried out by Minitab® using ANOVA and Tukey to p< 0.05. Acetone ginger extract showed highest value of phenolic content (8.52 ± 1.24 mg galic acid equivalent /g of ginger). The acetone extract showed the lowest EC50 value and higher antioxidant action on ABTS+., 0.07 ± 0.01 mg of dry weight of the extract/mL of assay and 10.93 ± 0.79 mg trolox equivalents (TE)/g of ginger, respectively. These values did not show significant difference in relation to ethanol and acetone/acid extracts. For DPPH. assay, acetone extract showed lower value of EC50 (0.15 ± 0.01 mg dry weight of extract/mL assay) and higher antioxidant action (8.35 ± 0.60 mg TE/g of ginger), without significant difference in relation to ethanolic extract. Among all extracts, aqueous extract showed lesser satisfactory results. Acetone extract was selected for biological assays. Ginger extract (17.25 mg of dry weigth/mL) inhibited 50% of products formation on NO scavenging assay, similarly to galic acid results. Lower extract concentrations as 1.25 mg/mL inhibited 33% of NO. The 100% of hemolysis prevention was obtained by concentrations of ginger extract higher than 113 µg of dry weight of extract/mL of assay. Similar result was observed by presence of ascorbic acid. Erythrocytes lysis was avoided in 44% by 57 µg/mL of ginger extract. Ginger extract did not show antimicrobial action on S. aureus. In conclusion, ginger extract, in present conditions, showed antioxidant action on ABTS+. and DPPH. assays and in biological model systems as in NO scavenging assay and cell membrane lysis.

Orientadores: Lauro Tatsuo Kubota, Nelci Fenalti Hoehr / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Quimica / Made available in DSpace on 2018-08-05T05:16:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Marzal_PercyCalvo_D.pdf: 1469754 bytes, checksum: 089db3068a7acb221eecbb8dd258a085 (MD5) Previous issue date: 2005 / Doutorado / Quimica Analitica / Doutor em Ciências

Made available in DSpace on 2014-10-09T12:43:03Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2014-10-09T14:07:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 06215.pdf: 3526908 bytes, checksum: cc8e43873e065cc38e12399bc94209dc (MD5) / Tese (Doutoramento) / IPEN/T / Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN/CNEN-SP

Orientador: Eneida de Paula / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-12T15:46:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Paula_Eneidade_D.pdf: 7752367 bytes, checksum: 4ac3295742d441a15e315a3d1c9c2c3d (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: Detergentes constituem uma das ferramentas mais importantes no estudo de membranas biológicas. A eficiência de um detergente em solubilizar biomembranas e suas proteínas depende de suas propriedades físico-químicas e a solubilização parcial pode resultar em membranas resistentes a detergentes (DRMs). A resistência a detergentes dessas frações membranares constituídas principalmente de colesterol, esfingolipídios e proteínas específicas foi analisada nesse trabalho, usando membranas de eritrócitos humanos. Embora não haja evidências experimentais suficientes pra afirmar que DRMs correspondam aos microdomínios naturais existentes em biomembranas, conhecidos como lipid rafts e que também são enriquecidos em colesterol e esfingolipídios, DRMs são bons modelos para o estudo daqueles. A obtenção de DRMs com uso do detergente octaetilenoglicol mono lauril éter (C12E8) a baixa temperatura (4oC) é descrita pela primeira vez. Os detergentes zwiteriônicos ASB-14, ASB-16 e CHAPS também foram testados, mas falharam no isolamento de DRMs com baixa densidade. DRMs obtidas com C12E8 e com Triton X-100 apresentaram um aumento da razão colesterol/proteína de pelo menos três vezes em relação à membrana original. A proteína flotilina-2, considerada um marcador de lipid rafts, foi detectada em DRMs isoladas com Triton X-100 e em DRMs com C12E8 isoladas a partir de células depletadas de colesterol. Proteínas do citoesqueleto também foram encontradas em DRMs, exceto quando as células foram previamente depletadas de colesterol. Resultados de ressonância paramagnética eletrônica com uso de marcadores de spin do tipo doxil-estearato revelaram maior grau de organização das cadeias acila dos lipídios de DRMs em relação à membrana original, independentemente do detergente utilizado. Nossos resultados também mostraram que DRMs de eritrócitos podem ser também obtidos na temperatura fisiológica (37°C) como mesmo conteúdo de colesterol presente em DRMs isoladas a 4°C. A necessidade do uso de carbonato de sódio no protocolo para obtenção de DRMs sugere fortemente a existência de uma associação eletrostática entre DRMs e o citoesqueleto eritrocitário. / Abstract: Detergents constitute an important tool for the study of cell membranes. The solubilization efficiency of a specific detergent depends upon its physicochemical properties so that detergent-resistant membranes (DRMs) can be obtained as a result of the partial solubilization of biological membranes. In this study DRMs which are structures enriched in cholesterol, sphingolipids and specific proteins, were isolated and characterized from human erythrocyte membranes. Although there are no evidences to support that DRMs correspond to the natural existing microdomains of natural membranes, known as lipid rafts which are also cholesterol and sphingolipid-enriched structures, DRMs are good models for the study of rafts. DRMs from erythrocytes obtained with 8 polyoxyethylene lauryl ether (C12E8) at low temperature (4oC) are described here for the first time. The zwitterionic detergents ASB-14, ASB-16 and CHAPS failed to isolate these low buoyant density fractions. Triton X-100 and C12E8 DRMs presented a cholesterol/protein mass ratio 3 times higher than in the whole membrane. Flotillin-2, a marker of lipid rafts, was confined within the DRM fractions obtained with Triton X-100 and it was partially associated with C12E8 DRMs when erythrocyte cells were previously cholesterol-depleted. Association of membrane-skeleton proteins with DRMs was also observed, except when DRMs were prepared from cholesterol-depleted cells. Results of electron paramagnetic resonance through the use of doxyl stearate spin labels revealed that DRMs are highly ordered structures in respect to the original membrane and that their acyl chain packing is not different if prepared with either Triton X-100 or C12E8. We have also found that DRMs from erythrocytes can be isolated at physiological temperature (37°C), presenting the same cholesterol content as in DRMs prepared at 4°C. The fact that we were only able to prepare DRMs when sodium carbonate was used stronglysuggests the existence of an electrostatic association between DRMs and the membrane-skeleton. / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / In view of the need to expand the toxicologic studies of organochalcogens in biological systems, the aim of this study was to investigate the effect of exposure to organic compounds of selenium (Se) and tellurium (Te) on the structural and functional integrity of human cells in vitro. The erythrocytes and leukocytes cells were isolated and incubated with the vehicle or different compounds of Se and Te at concentrations of 50, 75 and 100 μM. After the incubation period, the structural and functional integrity of erythrocytes were evaluated through the osmotic fragility test, Na+/K+ ATPase and catalase activities, reactive oxygen species and SH levels. In leukocytes was verified the cell viability and DNA damage. The results showed that the hemolysis, measured through the test of osmotic fragility, was significantly increased in erythrocytes exposed to the compound diphenyl selenide (II), diphenyl diselenide (III), diphenyl telluride (IV), diphenyl ditelluride (V ), (S)-2-amino-1-diselenide-3-methylpropanyl (IX), butyl (styryl) telluride (XIII) and 2 - (butyltellurium) furan (XIV) when compared to controls. The organic compounds II and XIII, that had greater hemolytic effect, did not alter the activity of catalase and reactive oxygen species (ROS) and SH levels. However, these compounds caused a significant inhibition on the activity of the enzyme Na+/K+ ATPase in a concentration dependent manner. This inhibition was totally reversed by addition of DTT, showing that the organochalcogens have affinity for thiol groups of the enzyme. Moreover, the rate of oxidation of DTT was significantly increased in the presence of both compounds, suggesting a thiol oxidase activity. Indeed, the compounds II and XIII were genotoxic and cytotoxic to human leukocytes. / Tendo em vista a ambigüidade de efeitos que podem ser exibidos pelos organocalcogênios e a necessidade de ampliar os estudos toxicológicos dos mesmos nos sistemas biológicos; o presente trabalho teve como objetivo investigar o efeito da exposição de compostos orgânicos de selênio (Se) e telúrio (Te) sobre a integridade estrutural e funcional de eritrócitos humanos in vitro, assim como sobre o DNA de leucócitos humanos in vitro. Os eritrócitos e os leucócitos foram isolados e incubados com o veículo e diferentes compostos de Se e Te nas concentrações de 50, 75 e 100 μM. Após o período de incubação, a integridade estrutural e funcional dos eritrócitos foi avaliada através do teste de fragilidade osmótica, da atividade das enzimas Na+/K+ATPase e catalase e da determinação dos níveis de espécies reativas de oxigênio (EROs) e de grupos -SH. Em leucócitos foi avaliado o dano no DNA e a viabilidade celular. Os resultados obtidos demonstraram que a hemólise, calculada através do teste de fragilidade osmótica, foi significativamente aumentada nos eritrócitos expostos aos compostos seleneto de difenila (II), disseleneto de difenila (III), telureto de difenila (IV), diterureto de difenila (V), (S)-2-amino-1- disseleneto-3-metilpropanil (IX), butil(stiril)telureto (XIII) e 2-(butiltelúrio)furano (XIV) quando comparado com os compostos usados como controles. Os compostos orgânicos de Se e de Te que apresentaram maior efeito hemolítico sobre os eritrócitos (II e XIII), não alteraram a atividade da enzima catalase e os níveis de EROs e grupos SH. No entanto, ambos os compostos (II e XIII) causaram uma inibição significativa na atividade da enzima sulfidrílica Na+/K+ATPase, que foi dependente da concentração desses. Esta inibição foi totalmente revertida pela adição de ditiotreitol (DTT), demostrando que os organocalcogênios testados possuem afinidade pelos grupos tióis da enzima. Além disso, os compostos II e XIII exibiram atividade tiol oxidase, aumentando a taxa de oxidação do DTT. Em leucócitos os organocalcogênios II e XIII causaram efeitos genotóxicos e citotóxicos, verificados pelo testes do cometa e de viabilidade celular.

Red blood cells (RBCs) are the most abundant cells in human blood, representing 40 to 45% of the blood volume (hematocrit). These cells have the particular ability to deform and bridge together to form aggregates under very low shear rates. The theory and mechanics behind aggregation are, however, not yet completely understood. The purpose of this work is to provide a novel method to analyze, understand and mimic blood behaviour in microcirculation. The main objective is to develop a methodology to quantify and characterize RBC aggregates and hence enhance the current understanding of the non-Newtonian behaviour of blood at the microscale. For this purpose, suspensions of porcine blood and human blood are tested in vitro in a Poly-di-methylsiloxane (PDMS) microchannel to characterize RBC aggregates within these two types of blood. These microchannels are fabricated using standard photolithography methods. Experiments are performed using a micro Particle Image Velocimetry ( PIV) system for shear rate measurements coupled with a high speed camera for the flow visualization. Corresponding numerical simulations are conducted using a research Computational Fluid Dynamic (CFD) solver, Nek5000, based on the spectral element method solution to the incompressible non-Newtonian Navier-Stokes equations. RBC aggregate sizes are quantified in controlled and measurable shear rate environments for 5, 10 and 15% hematocrit. Aggregate sizes are determined using image processing techniques. Velocity fields of the blood flow are measured experimentally and compared to numerical simulations using simple non-Newtonian models (Power law and Carreau models). This work establishes for the first time a relationship between RBC aggregate sizes and corresponding shear rates in a microfluidic environment as well as one between RBC aggregate sizes and apparent blood viscosity at body temperature in a microfluidic controlled environment. The results of the investigation can be used to help develop new numerical models for non-Newtonian blood flow, provide a better understanding of the mechanics of RBC aggregation and help determine aggregate behaviour in clinical settings such as for degenerative diseases like diabetes and heart disease.

Orientadores: Joyce Maria Annichino-Bizzacchi, Nicola Amanda Conran Zorzetto / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-22T04:29:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Zapponi_KiaraCristinaSenger_M.pdf: 3766938 bytes, checksum: e4531f39f9f53ff883ad33f684d56647 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: Tromboembolismo venoso (TEV) é uma doença multifatorial que afeta 1-3:1000 indivíduos mundialmente. A formação do trombo venoso na superfície endotelial é um processo multicelular, de estrutura laminar composta por camadas de plaquetas, leucócitos, eritrócitos e fibrina, originando uma resposta inflamatória loco-regional. A relação entre inflamação e coagulação é bidirecional. e tem sido principalmente avaliada através de interações de proteínas entre citocinas próinflamatórias e elementos da cascata de coagulação. As células inflamatórias tais como neutrófilos, não foram previamente correlacionadas com os processos trombóticos ou pró-coagulantes. Objetivo: Avaliar as propriedades adesivas de neutrófilos, eritrócitos e plaquetas, assim como a expressão das moléculas de adesão de superfície dos neutrófilos em pacientes com TEV, correlacionando-os com marcadores sistêmicos da resposta inflamatória, presença de trombo residual e D-dímero aumentado. Pacientes e Métodos: Foram incluídos neste estudo 10 pacientes com TEV agudo atendidos no Hospital de Clínicas da Unicamp (HCUNICAMP), 30 pacientes com TEV crônico (1 a 6 anos após o evento agudo), atendidos no Hemocentro de Campinas-UNICAMP, e controles normais pareados aos pacientes por idade, gênero e etnia. A adesão de neutrófilos, eritrócitos e plaquetas foram determinados através de ensaio estático usando fibronectina (FN) e fibrinogênio (FB) como ligantes. A expressão das moléculas de adesão dos neutrófilos (CD11a, CD11b, CD18) foi avaliada por citometria de fluxo. Os níveis dos marcadores inflamatórios (IL-6, IL-8, TNF-_ e PCR) foram avaliados por ELISA e nefelometria. O trombo residual (TR) por ultrassom com Doppler e o Dímero-D (DD) por método coagulométrico. Resultados: A adesão de plaquetas ao fibrinogênio com e sem estímulo de trombina em pacientes dos grupos agudo e crônico foi semelhante ao observado nos controles normais. Da mesma forma, não houve diferença da adesão de eritrócitos à fibronectina nesses mesmos grupos analisados. No subgrupo de pacientes com alto risco de recorrência de TEV definido pela presença de altos níveis de D-dímero (>0,55mg/L) e trombo residual observou-se um aumento significativo da adesão de neutrófilos em relação aos controles (24.68% vs 19.07%, P<0.05). A atividade inflamatória também estava aumentada neste subgrupo em comparação aos outros pacientes, demonstrada pelo aumento significativo dos níveis séricos de IL-6, IL-8, TNF-_ e PCR (2.08pg/mL VS 0.90pg/mL, P=0.01; 28.72pg/mL vs 16.46pg/mL, P=0.02; 4.50pg/mL vs 2.11pg/mL, P=0.04; 0.35 pg/mL vs 0.14 pg/mL, P=0.09, respectivamente). Houve uma correlação das propriedades adesivas de neutrófilos com IL-6 (r=0.3815 e P=0.0375), e D-dímero (r=0.3831 e P=0.0367). A quantificação das proteínas de superfície (CD11a, CD11b e CD18) de neutrófilos não foi diferente entre os grupos analisados. Conclusão: Nossos resultados sugerem que pacientes com TEV não apresentam aumento das propriedades adesivas de plaquetas e eritrócitos. Entretanto, as propriedades adesivas dos neutrófilos foram aumentadas em pacientes com D-dímero aumentado e presença de trombo residual, independente da expressão quantitativa das proteínas de superfície em sua membrana. A hipótese para este aumento pode ser devido as alterações na afinidade das moléculas de adesão de superfície aos seus ligantes, como consequência do processo inflamatório associado com a hipercoagulabilidade que é característica desta doença / Abstract: Venous Thromboembolism (VTE) is a multifactorial disease that affects 1-3:1000 individuals worldwide. The venous thrombus develops via a multicellular process on the surface of the endothelium and presents a laminar structure comprised of layers of platelets, leukocytes, erythrocytes and fibrin. The relationship between inflammation and coagulation is bidirectional, and has been mainly evaluated through protein interactions between pro-inflammatory cytokines and elements of the coagulation cascade. Inflammatory cells such as neutrophils, have not been previously correlated with thrombotic or procoagulant processes. Objective: To evaluate the adhesive properties of neutrophils, erythrocytes and platelets, as well as the expression of neutrophil adhesion molecules in patients with VTE, correlating them with markers of the systemic inflammatory response, and with the presence of residual vein obstruction (RVO) and higher D-dimer (DD). Patients and Methods: Study group consisted of 30 chronic VTE patients (1-6 years after the acute episode) followed in our outpatient clinic, and 10 patients with VTE during the acute episode treated at the Hospital of Clinics (HC-UNICAMP) Campinas, as well as age, gender and ethnic background-matched healthy. Adhesive properties of neutrophils, erythrocytes and platelets were determined by a static adhesion assay using ligands such as fibrinogen (FB) and fibronectin (FN). The expression of neutrophils adhesion molecules (CD11a, CD11b, CD18) was evaluated by flow cytometry. Levels of inflammatory markers (IL-6, IL-8, TNF-_, PCR) were evaluated by ELISA and nephelometry. RVO was evaluated by Doppler ultrasound and DD by coagulometric method. Results: No significant difference could be observed in the platelets adhesion (basal: 16.37% vs. 14.59%, p=0.309; and stimulated with thrombin: 33.45% vs. 26.62%, p=0.200) and erythrocytes adhesion (7.28% vs 7.49%, p=0.859) between chronic VTE patients and healthy individuals. Similarly, no statistical differences were observed in the platelets adhesion (basal: 28.36% vs. 21.63%, p=0.109; and stimulated with thrombin: 38.45% vs. 30.15%, p=0.715) and erythrocytes adhesion (6.00% vs 4.62%, p=0.326) in the VTE acute xxii patients when compared to their respective controls. Interestingly, in patients with a higher risk of recurrent VTE (defined by the presence of high levels of DD and RVO), a significant increase in neutrophils adhesion was observed when compared to healthy individuals (24.68% vs. 19.07%, p <0.05). Inflammatory markers (IL-6, IL-8, TNF-_ and CRP) were significantly elevated (2.08pg/mL vs 0.90pg/mL, p=0.01; 28.72pg/mL vs 16.46pg/mL, p=0.02; 4.50pg/mL vs 2.11pg/mL, p=0.04; 0.35 pg/mL vs 0.14 pg/mL, p=0.09, respectively) in this subgroup of patients when compared to the other patients. Adhesive properties of neutrophils were correlated with IL-6 (r= 0.3815 and p= 0.0375) and D-dimer levels (r= 0.3831 and p= 0.0367). Neutrophils adhesion molecules (CD11a, CD11b and CD18) were not altered in any of the groups. Conclusion: Our results suggest that VTE patients do not exhibit increased adhesive properties of platelets and erythrocytes. Neutrophils adhesive properties were increased in patients with higher D-dimer levels and RVO, independently of the expression of neutrophil adhesion molecules. A hypothesis for this increase is alterations in affinity of surface adhesion molecules to their ligands, as a response to inflammatory processes associated with the hypercoagulability demonstrated in this subgroup of patients / Mestrado / Biologia Estrutural, Celular, Molecular e do Desenvolvimento / Mestra em Fisiopatologia Médica

The photobiomodulation therapy (PBMT) has many demonstrated applications in the health area including anti-inflammatory and wound healing effects. The main objective of this work is to verify if the PBMT causes measurable changes in the mechanical properties of cells, specifically in red blood cells, epithelial cells and fibroblasts. In addition, to contribute to the knowledge of the action mechanisms of the PBMT, this study intends to support applications of the PBMT during invasive procedures, such as the direct photo-treatment of the blood in surgical procedures with cardiopulmonary bypass, regarding security of the cellular integrity. For this analysis, three experimental techniques were used: optical magnetic twisting cytometry (OMTC), defocusing microscopy and confocal laser-scanning microscopy. Human bronchial epithelial cells were evaluated with OMTC. The epithelial cell culture was either photo-treated or not, with red laser (lambda=660 nm), and fixed power and time (power density of 153 mW/cm2, time 300 s). It was not possible to observe significant differences between photo-treated and control epithelial cells, for the hysteresivity (ratio between the cell loss and elastic shear moduli). The defocusing microscopy, similar to a phase contrast microscopy, was used to study human red blood cells from fresh blood. The red blood cells were either photo-treated or not, with red laser (lambda=660 nm), and different powers and times (power densities from 0 to 510 mW/cm2, times from 0 to 180 s). Some morphological and mechanical characteristics of individual red blood cells were evaluated, such as volume, radial profile of cell thickness, lateral and vertical membrane fluctuations, for the photo-treated and control red blood cells. It was not possible to detect differences between the two groups, for any of the parameters analyzed. For both techniques, the absence of detectable differences might be due to several factors, such as the non-action of the PBMT, with the parameters used, in the epithelial cells and red blood cells or to the small sensitivity of each technique. Confocal laser-scanning microscopy was used to evaluate the actin filaments of mouse fibroblasts. The fibroblast cell culture was either photo-treated or not, with red (lambda=625 nm) or infrared (lambda=808 nm) light and fixed power and time (power density from 113 to 158 mW/cm2, time 300 s). The nucleus and cell areas increased slightly when comparing photo-treated and control cells. On the other hand, the total actin, total actin density and the number of filaments decreased. These changes were detected for a short time after treatment, however, after 24 h they are not anymore detectable. The total branch length does not seem to suffer any modifications. In summary, with the data acquired with the three techniques, it was found that the PBMT, in the red range, with the parameters used, could not cause noticeable changes in red blood cells and epithelial cells, in vitro. On the other hand, the PBMT in the red and near-infrared range, with the power and times used, cause changes in actin filaments of fibroblasts, in vitro, in particular the decrease of the total actin density. / A terapia por fotobiomodulação tem muitas aplicações na área de Saúde devido a sua ação anti-inflamatória e de reparação tecidual. O objetivo geral desse trabalho é verificar se a terapia por fotobiomodulação provoca mudanças nas propriedades mecânicas de células, em particular em hemácias, células epiteliais e fibroblastos. Além de contribuir com o conhecimento dos mecanismos de ação da terapia por fotobiomodulação, este estudo pretende subsidiar aplicações da terapia por fotobiomodulação durante procedimentos mais invasivos, como a iluminação direta do sangue em procedimentos cirúrgicos com circulação extracorpórea, sob o ponto de vista da segurança quanto à integridade celular. Para essa análise foram utilizadas três técnicas experimentais: citometria óptica magnética de oscilação (OMTC), microscopia de desfocalização e microscopia confocal. Com a técnica de OMTC foram avaliadas células epiteliais brônquicas humanas em cultura, foto-tratadas com laser vermelho (lambda=660 nm), com potência e tempo fixos (densidade de potência de 153 mW/cm2, tempo 300 s). Não foi possível constatar diferenças significativas entre as células epiteliais foto-tratadas e as células controle, para a histerisividade (razão entre os módulos viscoso e elástico das células). Com a técnica de microscopia de desfocalização, semelhante a uma microscopia de contraste de fase, foram estudadas hemácias humanas de sangue recém coletado. As hemácias foram tratadas com laser vermelho (lambda=660 nm), com potências e tempos variados (densidade de potência de 0 a 510 mW/cm2, tempo de 0 a 180 s). Foram avaliadas algumas características morfológicas e mecânicas das hemácias individualmente, como o volume, perfil radial de espessura, flutuações lateral e vertical da membrana, tanto para hemácias foto-tratadas quanto para hemácias controle. Não foi possível detectar diferenças entre as hemácias foto-tratadas e controle para nenhum dos parâmetros avaliados. Para ambas as técnicas, a falta de mudanças observáveis poderia ser devida a diversos fatores, como a não ação da terapia por fotobiomodulação nas células epiteliais e nas hemácias, com os parâmetros aqui empregados, ou à falta de sensibilidade de cada uma das técnicas usadas. A microscopia confocal foi utilizada para avaliar os filamentos de actina de fibroblastos de camundongo em cultura, os quais foram foto-tratados com luz vermelha (lambda=625 nm) ou infravermelha (lambda=808 nm) e potência e tempo fixos (densidade de potência de 113 a 158 mW/cm2, tempo 300 s). Foi possível constatar ligeiro aumento nas áreas nuclear e celular das células foto-tratadas em relação aos fibroblastos controle. Também foi possível verificar a diminuição da quantidade total de actina, densidade de actina e do número de filamentos de actina nos fibroblastos foto-tratados. Essas mudanças são detectadas para tempos curtos após o tratamento, sendo que depois de 24 h elas desaparecem. O tamanho total dos filamentos parece não sofrer alterações. A partir dos dados coletados com as três técnicas, foi possível constatar que a terapia por fotobiomodulação, com os parâmetros utilizados, não consegue provocar mudanças perceptíveis em hemácias e em células epiteliais, in vitro. Porém, causa mudanças nos filamentos de actina de fibroblastos, in vitro, em particular a diminuição da densidade de actina total.

This thesis examines the hypothesis that human erythrocyte net sugar transport is the sum of two serial processes: sugar translocation followed by interaction of newly imported sugar with an intracellular binding complex from which sugar dissociates into the bulk cytosol. This hypothesis suggests that steady-state transport measurements in the human erythrocyte do not accurately reflect the intrinsic catalytic features of the glucose transporter and unless correctly interpreted, may lead to apparent inconsistencies in the operational behavior of the human erythrocyte sugar transport system. Our results support this proposal by demonstrating that although sugar transport measurements in human red blood cells suggest that transport is catalytically asymmetric, ligand binding measurements indicate that transport must be symmetric. In order to examine the serial compartments hypothesis, we set out to determine the following: 1) identify the component(s) of the proposed sugar binding complex, 2) determine whether cytosolic ATP levels and transporter quaternary structure affect sugar binding to the sugar binding complex, and 3) determine whether the sugar binding site(s) are located within or outside the cell. We present findings which support the hypothesis that the sugar binding complex is in fact the sugar transport protein, GLUT1. The number of sugar binding sites and the release of sugar from the GLUT1 complex are regulated by ATP and by GLUT1 quaternary structure. The sugar binding sites are located on a cytoplasmic domain of the GLUT1 complex. We show how these observations can account for the apparent complexity of erythrocyte sugar transport and its regulation by ATP.

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