El presente trabajo se realizó con el propósito de evaluar los cambios en las características clínicas, seminales y endocrinas en carneros con aislamiento escrotal térmico. Se utilizaron 12 animales adultos de raza Merino, distribuidos al azar en dos grupos: a) Control: n = 4 y b) Tratado: n = 8. Los animales del grupo tratado fueron sometidos a aislamiento escrotal con una bolsa de algodón cubierta con plástico para elevar la temperatura a 39.0 ± 0.5 °C por 48 horas. Se registraron cambios en volumen del eyaculado, consistencia testicular, circunferencia escrotal; concentración; motilidad masal (0 - 5); motilidad individual (%) ; anormalidades espermatozoides (%); perfiles endocrinos de testosterona y LH. Se realizó la colección de semen por electroeyaculación, tres veces por semana y para la determinación hormonal, los animales fueron canulados en la vena yugular y se tomó muestras de sangre por 6 horas a intervalos de 15 minutos. Las muestras fueron analizadas mediante radioinmunoanálisis. El periodo de evaluación fue de 35 días. Los resultados señalan cambios en la circunferencia escrotal de 30.43 ± 1.1 (inicio) a 25.00 ± 0.5 cm (semana 5). No se registraron cambios en volumen pero si en concentración espermática a partir de la segunda semana. En motilidad masal se registraron observaciones de valores 0 a partir de la semana 2 y 2.45 ± 3.1 en motilidad individual en la semana 2. El porcentaje de anormales se incremento a 82.3 ± 29.3 % en la semana 3, siendo las anormalidades de cabeza sola, cola doblada y gota citoplasmática, las principales anormalidades observadas. Las concentraciones de Testosterona disminuyen a partir de la semana 2 (280 ± 83 pg/ml) y se incrementan las concentraciones de LH a 0.96 ± 0.72 a partir de la semana 2, con la presencia de un mayor número de pulsos de LH (0.92 ±0 33 / 6 horas). Se concluye que la aplicación de bolsas de algodón, para incrementar la temperatura a nivel del testículo producen cambios en las características clínicas, seminales, proporción de espermatozoides normales, concentración, motilidad masal e individual y cambios en las concentraciones hormonales de Testosterona y LH, por lo que se recomienda adecuadas prácticas de manejo para evitar efectos del incremento de la temperatura a nivel escrotal y las consiguientes deficiencias en el comportamiento reproductivo de los animales machos.

La acuicultura de peces planos se ha incrementado notablemente en los últimos años, sin embargo existen disfunciones reproductivas que no permiten una reproducción exitosa en cautiverio, por lo tanto, conocer el estado reproductivo de los ejemplares así como la calidad de sus gametos es de vital importancia. La evaluación de la calidad espermática permite incrementar no solo los índices de supervivencia larval sino la aplicación de técnicas como la fecundación in vitro, el monitoreo de las condiciones de cultivo y la criopreservación con el fin de asegurar la reproducción en cautiverio. Los resultados obtenidos en relación a los parámetros de calidad espermática del lenguado Paralichthys adspersus acondicionado al cautiverio fueron el volumen espermático con 758 ± 310 µL, la concentración espermática fue de 2.49 ± 0.26 x 1010 espermatozoides/mL, la clase de motilidad fue 4.00 ± 0.26 con un porcentaje el 50 y 90 % y la viabilidad espermática se evaluó mediante dos técnicas de tinción, se obtuvo 98.31 ± 0.26 % con Eosina-Nigrosina y 87.67 ± 8.28 % con el Kit LIVE/DEAD®. Además, se realizaron ensayos preliminares en criopreservación de espermatozoides, donde se evaluó la motilidad espermática post-incubación en soluciones crioprotectoras, obteniéndose los mejores resultados con DMSO a una concentración de 1.5 M cuya clasede motilidad fue 3.04 ± 0.23 con un 51.79 ± 5.83 %. Por otro lado, la motilidad espermática luego de la criopreservación fue 12.09 ± 2.27 %, con una tasa de congelamiento de – 15 °C/min y de descongelamiento de 50 °C/min. La presente tesis se presenta como el primer reporte de la calidad espermática de Paralichthys adspersus en cautiverio, así como los primeros ensayos para la criopreservación de espermatozoides en esta especie. -- PALABRAS CLAVE: Paralichthys adspersus, espermatozoides, calidad espermática y criopreservación. / -- Flatfish aquaculture has increased markedly in recent years; however there are reproductive dysfunctions that prevent successful reproduction in captivity, therefore, to know the reproductive status of individuals and the quality of their gametes is of great importance. The evaluation of sperm quality can increase not only the larval survival rates but the application of techniques such as artificial insemination, monitoring culture conditions and cryopreservation in order to ensure the reproduction in captivity. The results obtained in relation to semen quality parameters of flounder Paralichthys adspersus conditioned to captivity were sperm volume with 758 ± 310 µl, sperm concentration was 2.49 ± 0.26 x 1010 cells/mL, the class of motility was 4.00 ± 0.26 indicating a range 50 to 90 % and spermatozoa viability was determined using two different staining techniques, with Eosin - Nigrosine techniquewasobtained98.31±0.26 % and with the kit LIVE/DEAD ®was obtained 87.67 ± 8.28 %. In addition, preliminary assays on cryopreservation of spermatozoa were carried out, sperm motility was assessed postincubation in cryoprotectant solutions, obtaining the best results with DMSO at a concentration of 1.5 M, the class of motility was 3.04 ± 0.23 and the percentage of sperm motility was 51.79 ± 5.83 %. On the other hand, sperm motility after thawing was 12.09 ± 2.27%, with a cooling rate -15 ° C/min and thawing rate 50 ° C/min. This thesis is presented as the first study of sperm quality for P. adspersus in captivity, and the first assays for the cryopreservation of sperm in this species. -- KEY WORDS: Paralichthys adspersus, spermatozoa, sperm quality and criopreservation.

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / La adecuada interacción de los gametos depende de la capacidad que tengan los espermatozoides de experimentar la capacitación y reacción acrosómica, procesos esenciales para la fecundación del ovocito y que pueden verse afectados por el proceso de refrigeración espermática. En este trabajo se estudió el efecto del tiempo de capacitación en espermatozoides refrigerados de perro, a través de la capacidad de unión y penetración a la zona pelúcida de ovocitos de perra madurados in vitro. El semen se obtuvo de la estimulación digital a 5 perros adultos. Un total de 9 eyaculados provenientes de los mismos perros, fueron procesados como muestras frescas o refrigeradas. Posterior a la evaluación seminal, el plasma seminal fue retirado por centrifugación. Los espermatozoides frescos se resuspendieron inmediatamente en Fert Talp y los espermatozoides a refrigerar se resuspendieron en diluyente en base a TRIS - yema de huevo - ácido cítrico - fructuosa y se conservaron a 4ºC por 24 horas, para luego ser mantenidos a 37°C por 10 minutos y posteriormente centrifugados para retirar el diluyente. Luego, los espermatozoides frescos (control) y refrigerados, fueron incubados en Fert Talp para capacitación in vitro, a temperatura ambiente (20°C) durante 0 a 3 horas y, posterior a cada tiempo de incubación, co-incubados con ovocitos madurados in vitro. Posterior a la co-incubación, los ovocitos inseminados fueron lavados y luego procesados separadamente para ser examinados bajo microscopia electrónica de barrido (MEB) y microscopia de epifluorescencia. Para MEB, se evaluaron un total de 318 ovocitos (174 y 134 ovocitos para espermatozoides frescos y refrigerados, respectivamente). El análisis de MEB consideró un ovocito con espermatozoides unidos cuando fueron encontrados uno o más espermatozoides adheridos a la zona pelúcida ovocitaria (ZP), y un ovocito con espermatozoides penetrados cuando se encontraron uno o más espermatozoides atravesando la ZP. Para la microscopia de epifluorescencia se evaluaron un total de 466 ovocitos (219 y 247 ovocitos para espermatozoides frescos y refrigerados, respectivamente), considerando un ovocito con espermatozoides unidos cuando se encontraron uno o más espermatozoides adheridos a la ZP y ovocito con epermatozoides penetrados cuando fueron encontrados uno o más espermatozoides atravesando la ZP, en el espacio perivitelino o dentro del citoplasma ovular. Los resultados se analizaron mediante un procedimiento de Regresión Logística Binomial (Statistical Analysis System, SAS Institute, Cary, NC, USA). Tanto en MEB como en microscopia de epifluorescencia, los resultados de fecundación in vitro con espermatozoides frescos y refrigerados, no mostraron diferencias significativas en la unión ni en la penetración espermática (p≥0,05), a través de los diferentes tiempos de capacitación. Asimismo, al comparar entre ambos tipos de espermatozoides, la unión y penetración en los diferentes tiempos de capacitación, no se evidenciaron diferencias significativas entre ellos (p≥0,05). En conclusión, los espermatozoides frescos y refrigerados caninos, capacitados in vitro durante 0 a 3 horas, no difieren en su capacidad para unirse y penetrar la ZP de ovocitos de perra madurados in vitro / Proyecto Fondecyt 1060602

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / Una fecundación exitosa depende, entre otras cosas, de la capacidad que tengan los espermatozoides de experimentar la reacción acrosómica. Este fenómeno es esencial para una adecuada interacción gamética y posterior fecundación del ovocito. El espermatozoide de perro al ser sometido a criopreservación puede verse afectado alterando negativamente este proceso y por tanto, su capacidad fecundante. En este trabajo se estudió el efecto del tiempo de capacitación en espermatozoides congelados de perro a través de la actividad enzimática de la acrosina, mediante dos métodos de evaluación: hidrólisis de gelatina en placa y por espectrofotometría, la hidrólisis de esteres de bajo peso molecular (BAEE). La obtención de semen se realizó a partir 5 machos adultos sanos, mediante estimulación manual del pene. Se utilizó la segunda fracción espermática de cada eyaculado, midiendo su volumen en copa recolectora y la motilidad espermática se evaluó en forma subjetiva al microscopio de contraste de fases. La concentración espermática se determinó mediante recuento en la cámara de Neubauer, de acuerdo a las técnicas estandarizadas en el laboratorio. Se trabajó con semen fresco (control) y semen congelado proveniente de los mismos machos. El pellet obtenido de cada muestra se ajustó a una concentración de 200x106 de esp/ml, incubándolas por períodos de 0, 30, 60 y 90 minutos a temperatura ambiente (21°C) para inducir la capacitación de los espermatozoides. Luego de cada tiempo de capacitación se realizó la medición de la actividad enzimática de acrosina a través de hidrólisis de gelatina en placa y espectrofotometría de esteres de bajo peso molecular (BAEE). 7 Los resultados obtenidos en relación a la actividad enzimática de acrosina durante la capacitación espermática en perros se describieron en términos de promedios, y se evaluaron mediante análisis de varianza ANOVA y LSD Fisher a posteriori. Se realizaron 5 replicas experimentales y se usó 1 eyaculado por perro en promedio. En relación al tipo de población espermática, los espermatozoides congelados y frescos (control) presentaron diferencias (P < 0,05) en relación al tamaño de los halos de digestión, observándose un diámetro promedio de halo mayor en espermatozoides frescos en comparación a los congelados de acuerdo a los tiempos de capacitación. Al evaluar la actividad enzimática de acrosina a través de la hidrólisis de BAEE, se observó que durante los diferentes tiempos de capacitación en los espermatozoides frescos, la actividad enzimática de acrosina presentó variaciones (P<0,05) con mayor actividad enzimática en los espermatozoides a partir de los 60 min, mientras que en espermatozoides congelados la mayor actividad se observó al tiempo 0 de capacitación (no capacitados) (P <0,05). La actividad enzimática de acrosina en espermatozoides congelados sería menor que en los espermatozoides frescos, tanto en su actividad proteolítica en gelatina, como en espectrofotometría con BAEE. Además, la actividad de proacrosina/acrosina en espermatozoides caninos frescos se vería aumentada a través del tiempo de capacitación a diferencia de los espermatozoides congelados donde no se observó diferencias entre los diferentes tiempos de incubación en medio capacitante, por lo que se sugeriría que los espermatozoides frescos podrían retener mayores cantidades de acrosina que aquellos congelados/descongelados, lo que se traduciría en una acción más gradual en el tiempo observándose la mayor liberación de enzima entre los tiempos 60 y 90 minutos. / Proyecto Fondecyt 1060602-1080618

El objetivo del estudio fue evaluar el efecto de cuatro combinaciones de dos agentes crioprotectores permeantes más dos no permeantes sobre la calidad del semen ovino post-descongelamiento. Para esto, primero (Experimento 1) se seleccionó, entre tres dilutores (A, B y C), el más adecuado para ser usado en la segunda parte (Experimento 2), en la cual se evaluaron las siguientes combinaciones de agentes crioprotectores permeantes y no permeantes: 1)Glicerol - Trehalosa, 2)Glicerol - Sacarosa, 3)Etilenglicol - Trehalosa y 4)Etilenglicol - Sacarosa sobre la calidad del semen ovino post-descongelamiento. Para tal efecto, se realizaron 6 repeticiones para el Experimento 1 y 8 repeticiones para el Experimento 2. Cada repetición constó de 4 eyaculados cada una. En el experimento 1 se encontró que el Dilutor A mantenía mejor la motilidad progresiva y viabilidad e integridad acrosomal post-descongelamiento (69% y 63%) en comparación con el Dilutor B (37% y 35%) y el Dilutor C (23% y 23%). Por lo cual, el Dilutor A fue empleado en el experimento 2. En el experimento 2 se encontró que la motilidad progresiva, la viabilidad e integridad acrosomal, la termoresistencia y la integridad de membrana plasmática post-descongelamiento fue mejor en los grupos con glicerol-sacarosa (64%; 56%; 40% y 63%) y glicerol-trehalosa (64%; 58%; 38% y 60%) en comparación con los grupos con etilenglicol-sacarosa (48%; 42%; 25% y 37%) y etilenglicol-trehalosa (44%; 38%; 27% y 40%). Lo cual demuestra que el glicerol es un mejor crioprotector permeante en comparacion con el etilenglicol. Sin embargo, no existe diferencia en el uso de sacarosa o trehalosa. Se concluye que un dilutor con las características del dilutor A, utilizando glicerol más trehalosa o sacarosa constituye una buena alternativa para la criopreservación de semen ovino. / The objective of the study was to evaluate the effect of four combinations of two permeant and two non permeant cryoprotectant agents on the quality of post thaw ram semen. In Experiment 1, three extender were evaluated (A, B, and C) in order to have th ebetter one for the next step. In Experiment 2, different combinations of cryoprotectant agents were evaluated as follow: 1) Glycerol–Trehalose, 2) Glycerol–Sucrose, 3) Ethyleneglycol-Trehalose, and 4) Ethyleneglycol–Sucrose. In this way, 6 assays for Experiment 1 and 8 assays for the Experiment 2 were carry out. In each assay, 4 ejaculated were mixed to work as an original sample. Percentages of motility, viability and acrosomal integrity in extender A were higher (69% and 63%) than extender B (37% and 35%) and extender C (23% and 23%). Therefore, extender A was used for experiment 2. In the experiment 2, motility, viability and acrosomal integrity, thermoresistance, and plasmatic membrane integrity were higher in groups Glycerol-sucrose (64%; 56%; 40%, and 63%) and Glycerol-trehalose (64%; 58%; 38%, and 60%) in comparison with groups Ethileneglycol-sucrose (48%; 42%; 25% and 37%) and Ethileneglycol-trehalose (44%; 38%; 27% and 40%). However, there is not significative differences between sucrose or trehalose. In conclusion, an extender with characteristics of extender A, it means, using glycerol plus trehalose or sucrose constitute a good alternative for cryopreservation of ram semen.

Publicación a texto completo no autorizada por el autor / El documento digital no refiere asesor / Evalúa los indicadores fisiológicos más importantes de la capacitación espermática, los cuales son: el aumento de la movilidad espermática, la reacción acrosomal y la capacidad de unión a la zona pelúcida. Se realizaron tres etapas experimentales con el objetivo de evaluar el efecto del fluido folicular sobre la capacitación de espermatozoides epididimarios de alpaca. En la primera etapa, el fluido folicular fue inactivado por calentamiento y el medio fue suplementado con suero bovino fetal, para determinar el efecto sobre la movilidad espermática. Los resultados obtenidos luego de la primera hora fueron los siguentes: fluido folicular inactivado sin FBS, 58,75%; fluido folicular inactivado con FBS, 58,75%; fluido folicular fresco sin FBS, 62,33%; con fluido folicular fresco con FBS, 64,83%; control sin FBS, 37,00% y control con FBS, 39,58%. Luego de la segunda hora de incubación, la movilidad fue la siguiente: fluido folicular inactivado sin FBS, 47,75%; fluido folicular inactivado con FBS, 53,75%; fluido folicular fresco sin FBS, 54,25%; fluido folicular fresco con FBS, 50,58%; control sin FBS, 32,25%; control con FBS, 36,92%. En la segunda etapa experimental, se evaluó el efecto del fluido folicular, en relación al tamaño folicular del cual provenían; para ello se clasificó el fluido folicular de acuerdo al tamaño del folículo proveniente, como sigue: De folículos menores de 3 mm, de folículos de entre 3 y 6 mm, y de folículos mayores de 6 mm. En esta etapa experimental se evaluó el efecto del fluido sobre la movilidad y sobre la reacción acrosomal. Los resultados de la movilidad luego de la primera hora fueron los siguientes: fluido de folículos pequeños, 48,00%; fluido de folículos medianos, 43,33%; fluido de folículos grandes, 34,53%; control sin FBS, 26,00%; control con FBS, 29,20%. Luego de la segunda hora, los resultados fueron como sigue: fluido de folículos pequeños, 46,53%; fluido de folículos medianos, 40,00%; fluido de folículos grandes, 35,60%; control sin FBS, 28,13%; control con FBS, 26,80%. En el análisis de la reacción acrosomal se obtuvieron los siguientes resultados: fluido folicular de folículos pequeños, 66,3%; fluido folicular de folículos medianos, 58,86%; fluido de folículos grandes, 67,63%; control sin FBS, 30,06%; el control con FBS, 44,04%. En la tercera etapa, se evaluó la capacidad de los espermatozoides incubados con fluido folicular para unirse a la zona pelúcida de ovocitos homólogos. En este experimento, se enfrentaron los espermatozoides con zonas pelúcidas en el medio HAM F10 suplementado con fluido folicular y se determinó el número de espermatozoides unidos. Los resultados fueron los siguientes: fluido folicular, 7,90; control sin FBS, 1,68, control con FBS, 2,70. Los resultados permitieron reconocer que el fluido folicular de alpaca no es tóxico para los espermatozoides de alpaca, promueve la movilidad espermática sí solo (α=0,05). Por otro lado, el fluido folicular favorece la movilidad espermática, independientemente del tamaño del folículo (α=0,05); aunque el fluido de folículos medianos y pequeños ejercían un efecto ligeramente mayor. Asimismo, se pudo observar que el fluido folicular promovía la reacción acrosomal de los espermatozoides (α=0,05). Adicionalmente, el fluido folicular favorecía la capacidad de los espermatozoides de alpaca para unirse a la zona pelúcida del ovocito (α=0,05). Ante las evidencias, se concluye que el fluido folicular de alpaca es un inductor de la capacitación espermática para esta especie. / Tesis

Evalúa los criterios analíticos del espermatograma y cuál es su nivel de cumplimiento en laboratorios clínicos de Lima Metropolitana en el año 2016. Realiza un estudio descriptivo de tipo transversal. Utiliza listas de chequeo para la recolección de información. Participan técnicos de laboratorio y tecnólogos médicos que realizan la prueba de espermatograma; procedentes de laboratorios clínicos de Lima Metropolitana. La lista de chequeo fue validada mediante el método de juicio de expertos y completada por un observador mientras el profesional de laboratorio procesaba la muestra. Se usaron los programas Microsoft Excel 2003 y IBM SPSS Statistics Visor versión 23 para el análisis estadístico. Se obtuvieron 31 listas de chequeo; 21 tecnólogos médicos y 10 técnicos de laboratorio clínicos; en 11 laboratorios de Lima Metropolitana. Encuentra que el mayor nivel de cumplimiento en el procesamiento del espermatograma por laboratorio fue de 64% y por total de profesionales de laboratorio fue del 51%; clasifican la movilidad total en tres categorías, utilización de la coloración de Papanicolau y evaluación de la concentración espermática fueron del 36%, 9% y 100% respectivamente por laboratorio. El porcentaje de cumplimiento del protocolo de trabajo es del 63.4% para tecnólogos médicos y 56.1% para técnicos de laboratorio clínico. Concluye que el nivel de cumplimiento del espermatograma de los laboratorios clínicos no fue del cien por ciento, asimismo, se estableció que los criterios analíticos empleados son los recomendados por la OMS; pero algunos criterios analíticos son excluidos de su protocolo de trabajo según lo crea conveniente el laboratorio. Estos hallazgos sugieren una necesidad urgente de estandarizar el análisis de semen con controles de calidad aceptables para cada parámetro, y desarrollar un programa de control de calidad nacional para que los resultados sean repetibles y significativos. / Tesis

Doctora en Ciencias, Mención Computación / La infertilidad es un problema clínico que afecta hasta a 15% de parejas en edad reproductiva, con implicancias tanto emocionales como fisiológicas. Un análisis de semen es el primer paso en la evaluación de una pareja infértil. El énfasis en identificar no sólo cabezas normales de espermatozoides sino también categorías de cabezas anormales puede tener una significativa utilidad clínica al decidir por un tratamiento de fertilidad. Esta tesis propone una nueva metodología para detectar, segmentar, caracterizar y clasificar cabezas de espermatozoides humanos, con el objetivo de facilitar el posterior análisis morfológico, para diagnósticos de fertilidad, toxicología reproductiva, investigación básica o estudios de salud pública. En la primera parte de este tesis, se ha tratado la detección y segmentación de cabezas de espermatozoides humanos. En este sentido, se propone un gold-standard para segmentación de espermatozoides construido con la cooperación de un experto referente en el área, para comparar métodos para detección y segmentación de espermatozoides. Además, se ha desarrollado un framework para la detección y segmentación de componentes de cabezas de espermatozoides humanos (incluyendo acrosoma y núcleo) que usa tres espacios de color además de técnicas de clustering y análisis estadístico del histograma. La evaluación experimental muestra que el método propuesto mejora el desempeño del estado del arte. Los resultados logran 98% de detección correcta a expensas de un número menor de falsos positivos, comparado con el estado del arte. Así mismo, los resultados de segmentación de cabeza, acrosoma y núcleo muestran más de 80% de solapamiento comparado con las máscaras de segmentación manual del gold-standard. En la segunda parte de esta tesis, el enfoque estuvo en la caracterización y clasificación de cabezas de espermatozoides humanos. Así, se introduce un gold-standard para clasificación de cabezas de espermatozoides humanos, construido con la colaboración de tres expertos referentes en área, y de acuerdo al criterio de la OMS. Además, se ha formulado un nuevo descriptor para cabezas de espermatozoides que, combinado con otros descriptores basados en forma, permite discriminar entre cabezas de espermatozoides normales y anormales, identificando cuatro tipos de cabezas anormales. También se propone un esquema de clasificación, que permite categorizar las cabezas de espermatozoides en 5 clases diferentes, según la OMS. La evaluación experimental muestra que el esquema propuesto tiene mejor desempeño que distintos clasificadores monolíticos, así como varios esquemas de clasificación en cascada que fueron diseñados en el contexto de esta investigación. Los resultados muestran más de 70% de clasificación correcta usando un dataset de total concordancia entre expertos del área.

El potencial de membrana mitocondrial (PMM) es uno de los parámetros espermáticos más importantes debido a que las mitocondrias son la principal fuente de ATP necesaria para la movilidad espermática en el tracto reproductivo de la hembra para lograr la fecundación. La criopreservación de espermatozoides es una técnica que permite y facilita el uso de material genético de alto valor. El objetivo es demostrar mediante la citometría de flujo que el porcentaje de espermatozoides de alpaca con alto PMM se reduce significativamente luego del proceso de criopreservación. Se trabajaron con 41 testículos de alpaca obtenidos del Camal Municipal de Ninacaca. Provincia de Pasco. Se recuperaron los espermatozoides de la cola del epidídimo con 1 mL de dilutor en base a leche descremada y se congelaron. Sólo fueron congeladas las muestras con mínimo 30% de motilidad y concentración de 50x106 espermatozoides/mL. La evaluación de PMM se realizó antes y después del proceso de criopreservación. Cada muestra se incubó durante 10 minutos a 38 °C con MitoTracker Deep Red (100 nM) para determinar el porcentaje de alto PMM, mediante citometría de flujo con imágenes. El efecto de la criopreservación en el porcentaje de espermatozoides con alto PMM fue evaluado mediante la prueba de T-student pareada. Asimismo, se correlacionaron los porcentajes de motilidad y espermatozoides con alto PMM. Se obtuvo un 49.82 ± 12.41% de alto PMM en muestras antes del proceso de criopreservación, el cual fue significativamente (p<0.05) mayor al porcentaje de alto PMM de las muestras descongeladas (34.97 ± 9.96%). También se encontró una correlación positiva (r: 0.62; p<0.0001) entre motilidad y PMM. Se concluye que el PMM se reduce significativamente luego del proceso de criopreservación, parámetro relacionado a la motilidad espermática. / Tesis

Determina el efecto de la criopreservación sobre la integridad acrosomal de los espermatozoides viables de alpaca recuperados del epidídimo, determinado mediante citometría de flujo. Se procesaron muestras de 46 testículos de alpaca obtenidos de Camal Municipal de Ninacaca, Pasco, que presentaron una motilidad ≥ 30% y concentración espermática ≥ 50x106 espermatozoides/mL, en promedio 46.6% y 61x106 espermatozoides/mL, respectivamente del total de las muestras obtenidas. Los espermatozoides se recuperaron de la cola del epidídimo con 1mL de dilutor a base de leche descremada, yema de huevo, fructuosa y DMA; separándose luego en 2 alícuotas de 500 μL. La primera alícuota se utilizó para la evaluación de la viabilidad e integridad acrosomal inicial y la segunda alícuota se congeló en pajillas mediante un sistema automático de criopreservación, para luego almacenarse en nitrógeno líquido hasta el día de su evaluación. Todas las muestras, frescas y descongeladas fueron lavadas 2 veces por centrifugación con solución PBS para retirar el dilutor. Para la evaluación de viabilidad e integridad acrosomal, 100μL de cada muestra fue incubada con 2.5μL de FITC-PSA (100 μg/mL) y 0.5μL de Ioduro de Propidio (PI, 2.4 nM) por 10 minutos a 38°C, obteniendo finalmente una concentración de 2.5 μg/mL y 12 μM, respectivamente. Inmediatamente después las muestras se evaluaron por citometría de flujo con analizador de imágenes, adquiriéndose diez mil eventos compatibles con espermatozoides por muestra. FITC-PSA y PI fueron excitados con el láser de 488 nm, mientras que la emisión de fluorescencia fue detectada utilizando los canales Ch02 (505-560 nm) para FITC-PSA y Ch05 (642-740nm) para PI. Se seleccionó la población de espermatozoides viables (PI negativos), que en promedio fue el 75% del semen fresco y un 42% del semen descongelado, para de ellos determinar el porcentaje de integridad acrosomal (FITC-PSA negativos) y de reacción acrosomal (FITC-PSA positivos). Se realizó un análisis de T-student pareado para determinar como la criopreservación afecta la integridad acrosomal en los espermatozoides viables. Se encontró que la integridad acrosomal de los espermatozoides viables inicial (98.25 ± 5.40%) fue similar (p>0.05) a la integridad acrosomal de los espermatozoides viables post descongelamiento (98.75 ± 2.17%). Se concluye que si bien la criopreservación disminuye la cantidad de espermatozoides viables, la estructura acrosomal no se altera en los espermatozoides de alpaca que sobreviven a este proceso. / Trabajo de suficiencia profesional