O aumento do estresse oxidativo e da atividade das metaloproteinases contribui para as alterações vasculares estruturais e funcionais presentes na hipertensão renovascular. O objetivo desse trabalho foi verificar se o tratamento com espironolactona, hidroclorotiazida, ou ambas as drogas modificam as alterações presentes no modelo dois-rins, um-clipe de hipertensão renovascular na pressão arterial, incluindo-se remodelamento da aorta, alterações de reatividade vascular, estresse oxidativo e níveis e atividade da metaloproteinase-2 da matriz extracelular (MMP-2). Animais controles operados ou ratos submetidos à estenose da artéria renal foram tratados com o veículo, espironolactona (25 mg.kg-1dia-1), hidroclorotiazida (20 mg.kg-1dia-1), ou a combinação dos dois medicamentos para oito semanas. A pressão arterial sistólica foi monitorada semanalmente por pleitismografia de cauda. Anéis de aorta foram isolados para avaliar o relaxamento vascular dependente e independente do endotélio. A análise morfométrica da parede da aorta foi realizada em coloração de hematoxilina/eosina. Foram avaliados a produção do ânion superóxido na aorta pela -nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato oxidase vascular, a peroxidação lipídica plasmática, medida como substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico, os níveis e atividade de MMP-2 determinados por zimografia em gel e fluorimetria em extrato de aorta, imuno-histoquímica e zimografia situ. O tratamento com espironolactona, hidroclorotiazida, ou a combinação das drogas atenuou a hipertensão arterial, reverteu a disfunção endotelial, atenuou o remodelamento vascular da aorta, assim como o aumento no estresse oxidativo, e reduziu os níveis e a atividade da MMP-2 induzidos pela hipertensão. Estes resultados sugerem que a espironolactona e hidroclorotiazida, isoladamente ou em combinação, produzem efeitos antioxidantes e diminuem o aumento da atividade da MMP-2, melhorando assim a disfunção vascular e remodelamento encontrados nesse modelo de hipertensão renovascular. / Increased oxidative stress and upregulation of matrix metalloproteinases may cause structural and functional vascular changes in renovascular hypertension. The aim of this work was to examine whether the treatment with spironolactone, hydrochlorothiazide, or both drugs modify two-kidney,one clip hypertensioninduced changes in arterial blood pressure, aortic remodeling, vascular reactivity, oxidative stress, and MMPs levels/activity. Sham operated or hypertensive rats were treated with vehicle, spironolactone (25 mg.kg-1day-1), hydrochlorothiazide (20 mg.kg-1day-1), or the combination of the two drugs for eight weeks. Systolic blood pressure was monitored weekly by tail-cuff plethysmography. Aortic rings were isolated to assess endothelium dependent and independent relaxations. Morphometry of the aortic wall was carried out in hematoxylin/eosin sections. Aortic nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase activity and superoxide production was evaluated. Formation of reactive oxygen species was measured in plasma as thiobarbituric acid reactive substances. Aortic metalloproteinase-2 levels and activity were determined by gelatin and in situ zymography, fluorimetry, and immunohistochemistry. Treatment with spironolactone, hydrochlorothiazide, or the combination attenuated two-kidney, one-clip induced hypertension and reversed the endothelial dysfunction, reversed the vascular aortic remodeling, attenuated hypertension-induced increases in oxidative stress, and reduced metalloproteinase-2 levels/activity induced by hypertension. These findings suggest that spironolactone or hydrochlorothiazide, alone or combined, produce antioxidant effects and decrease renovascular hypertension-induced MMP-2 upregulation, thus improving the vascular dysfunction and remodeling found in this model of hypertension.

A espironolactona é um esteroide sintético, diurético, usado no tratamento de várias doenças, tais como cirrose, hipocalemia, aldosteronismo e hipertensão. A literatura reporta para espironolactona as formas polimórficas I e II e também cinco solvatos (metanol, etanol, acetonitrila, acetato de etila e benzeno). Este fármaco pode apresentar diferentes formas sólidas, as quais podem gerar diferentes propriedades físico-químicas, sendo necessário acompanhamento adequado, tanto qualitativo como quantitativo, a fim de garantir produtos de alta qualidade. A forma solvatada deste trabalho foi obtida a partir da dissolução de espironolactona forma II em acetato de etila para se obter uma solução saturada, a solução foi filtrada e mantida em repouso a temperatura ambiente para evaporação lenta e obtenção de cristais. As amostras foram peneiradas através de tamisação e as técnicas de difração de Raios X por pó (DRX-pó), de análise térmica, como a Termogravimetria (TG) e Calorimetria exploratória diferencial (DSC), e Espectrofotometria na região do infravermelho (IV-RTA) foram aplicadas para caracterizar as formas sólidas. A solubilidade da espironolactona foi avaliada pelo método shake-flask. Cápsulas contendo forma II e forma solvatada foram preparadas e submetidas a estudos de estabilidade (50 ± 1 ° C) e de dissolução. As amostras foram analisadas utilizando um método de cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) que foi validado. Os resultados das análises de DRX-pó, TG e DSC mostraram que a forma solvatada foi obtida com sucesso nesse trabalho. A análise de DSC mostrou os eventos endotérmicos correspondentes aos pontos de fusão para ambas as formas estudadas, e o evento relacionado à perda de solvente da forma solvatada. A análise TG mostrou perda de peso da forma solvatada. Valores de solubilidade da forma II foram estatisticamente maiores em todos os solventes estudados. O melhor perfil de dissolução in vitro foi realizado utilizando tampão acetato de sódio pH 4,5 como meio de dissolução, com aparato cesta, a 100 rpm. A determinação quantitativa foi realizada por CLAE a 230 nm. Todos os parâmetros de validação foram satisfatórios. A aplicação do método mostrou o poder discriminatório do método de dissolução. Os resultados também mostraram a influência sobre as propriedades de dissolução e na estabilidade das diferentes formas sólidas em cápsulas. / Spironolactone, a steroidal diuretic, is widely used for the treatment of refractory edema associated with congestive heart failure, hepatic ascites, primary aldosteronism and essential hypertension. Spironolactone presents two polymorphic forms identified as form I and II and five solvates reported in the literature (methanol, ethanol, acetonitrile, ethyl acetate and benzene). It is known that different solid-state forms can cause significant differences in the physicochemical properties of a compound, thus, proper monitoring of solid-state forms, both qualitative and quantitative, is crucial in order to ensure high-quality products. The solvated form was obtained by dissolution of form II in ethyl acetate to obtain saturated solution at room temperature, and the solvent was allowed to spontaneously evaporation. The samples were sieved through stainless steel mesh. The techniques of X-ray diffraction (PXRD), infrared spectroscopy (IR), differential scanning calorimetry (DSC) and thermogravimetric analysis (TGA) were applied to characterize the forms. The solubility of spironolactone forms was determined by the equilibrium method. Capsules containing forms II and solvated form were prepared and subjected to dissolution and stability studies (50 ± 1°C). The samples were analyzed using a validated high performance liquid chromatography (HPLC) method. The results of PXRD, DSC and TG analyses showed that the solvated form was successfully obtained in this work. DSC analysis showed endothermic event corresponding to the melting points to both forms and the event related to loss of solvent to the solvated form. TGA analysis showed extensive weight loss to solvated form. Solubility values of form II were statistically higher in all solvents studied. The best in vitro dissolution profile was achieved using pH 4.5 acetate buffer as the dissolution medium with a basket stirrer at 100 rpm. The quantitative determination was performed by HPLC at 230 nm. All validation parameters were satisfactory. The application of the method showed the discriminatory power of the dissolution method. The results also showed the influence on the dissolution and stability properties of the different forms in capsules. / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES

A espironolactona (SPR) é um ingrediente farmacêutico ativo (IFA), com estrutura química esteroidal, que possui atividade diurética sendo utilizada no controle da hipertensão arterial e, também, como agente antiandrogênico. Possui incompleta absorção oral devido à sua baixa solubilidade que pode dificultar a sua liberação. O uso de solventes e diferentes processos de cristalização para a síntese de um IFA são fatores que conduzem à formação de polimorfos. No Brasil, os IFAs em sua maioria são provenientes de diversos países, portanto apresentam diferentes fabricantes e rotas sintéticas distintas e, por isso, a caracterização físico-química e a identificação da estrutura cristalina são procedimentos importantes para garantir a qualidade e eficácia do medicamento, pois distintos polimorfos podem levar a concentrações plasmáticas ineficazes ou tóxicas. O trabalho teve por objetivo caracterizar polimorfos de SPR em IFAs provenientes de diferentes fabricantes através das técnicas de difração de raios X, análises térmicas, infravermelho e ensaios de solubilidade em equilíbrio. Os IFAs caracterizados foram usados para fabricar comprimidos, avaliando a influência do polimorfismo no perfil de dissolução do medicamento. Os IFAs foram identificados como SPR-L1, L2, L3, L4 e L5, o padrão secundário como SPR-pd 2° NCQ, o comprimido de referência como SPR-R, e os lotes de comprimidos produzidos como Lote A (SPR-L1) e Lote B (SPR-L2). Os resultados mostraram que os IFAs SPR-L2, L3, L4, L5 e padrão SPR-pd 2° NCQ foram caracterizados como forma II enquanto o IFA SPR-L1 contém polimorfos I e II. O ensaio de solubilidade em equilíbrio demonstrou que SPR-L1 apresenta solubilidade significativamente maior que SPR-L2 em todos os meios avaliados (p < 0,01), a partir do teste t-Student. Ao comparar os perfis de dissolução dos lotes A e B, o valor calculado para F2 foi de 19,00, demonstrando que à dissolução dos lotes de comprimidos fabricados não foram equivalentes. Portanto, a presença de pequena quantidade do polimorfo I, mais solúvel, influenciou com aumento significativo na velocidade de dissolução do fármaco. Ao avaliar o mecanismo de ação do fármaco, o aumento na velocidade de dissolução poderia estar relacionado à maiores concentrações plasmáticas de SPR e potencializar o efeito terapêutico, podendo causar hiperpotassemia e efeitos adversos indesejáveis. Comprimidos comercializados no Brasil também foram avaliados e a formulação demonstrou papel importante na velocidade de dissolução do fármaco, pois estes medicamentos não apresentaram equivalência farmacêutica entre si. / Spironolactone (SPR) is an active pharmaceutical ingredient (API), with steroidal chemical structure and diuretic activity, administered for arterial hypertension treatment, and also as antiandrogen agent. The drug shows incomplete gastrointestinal absorption due to its poor aqueous solubility that can difficult the drug release. The use of different solvents and crystallization processes for the synthesis of an API are factors that lead to formation of polymorphs. In Brazil, APIs have been purchased from different manufacturers, including different synthetic routes. Therefore, the physicochemical characterization and identification of the crystal structure of an API are important points to ensure its quality. Different crystal structures of a drug can lead to ineffective or toxic plasma concentrations, if different aqueous solubility were determined. In this study, SPR polymorphs in five batches of APIs from different manufacturers were characterized using powder X-ray diffraction, infrared spectroscopy, thermal analysis, and equilibrium solubility measurements. Tablets were manufactured using different APIs to assess the effect of drug polymorphism on their dissolution profiles. The APIs were identified as SPR-L1, L2, L3, L4 and L5; the standard as SPR-pd 2 ° NCQ, the reference drug product as SPR-R, and the batches of the manufactured tablets are denominated as batch A (SPR-L1) and batch B (SPR-L2). The results indicated that the APIs SPR-L2, L3, L4, L5 and standard SPR-pd 2 ° NCQ were characterized as pure form II although SPR-L1 contains both forms I and II. The equilibrium solubility measurements demonstrated that SPR-L1 solubility is higher than the SPR- L2 solubility in all aqueous media (p <0.01 using Student test). When the dissolution profiles of batches A and B were compared, the calculated value for F2 was 19.00, demonstrating that the dissolution of the manufactured tablets are not equivalent. Therefore, the presence of low amounts of polymorph I, a more soluble form, increases the dissolution rate of the drug. The increase in the dissolution rate could enhance the therapeutic effects of SPR due to changes in drug plasma concentrations, and cause hyperkalemia, leading to the appearance of undesirable side effects. Marketed SPR tablets in Brazil were also evaluated and formulation showed an important role in dissolution rate of the drug, leading to lack of pharmaceutical equivalence in these drug products. / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq

O aumento do estresse oxidativo e da atividade das metaloproteinases contribui para as alterações vasculares estruturais e funcionais presentes na hipertensão renovascular. O objetivo desse trabalho foi verificar se o tratamento com espironolactona, hidroclorotiazida, ou ambas as drogas modificam as alterações presentes no modelo dois-rins, um-clipe de hipertensão renovascular na pressão arterial, incluindo-se remodelamento da aorta, alterações de reatividade vascular, estresse oxidativo e níveis e atividade da metaloproteinase-2 da matriz extracelular (MMP-2). Animais controles operados ou ratos submetidos à estenose da artéria renal foram tratados com o veículo, espironolactona (25 mg.kg-1dia-1), hidroclorotiazida (20 mg.kg-1dia-1), ou a combinação dos dois medicamentos para oito semanas. A pressão arterial sistólica foi monitorada semanalmente por pleitismografia de cauda. Anéis de aorta foram isolados para avaliar o relaxamento vascular dependente e independente do endotélio. A análise morfométrica da parede da aorta foi realizada em coloração de hematoxilina/eosina. Foram avaliados a produção do ânion superóxido na aorta pela -nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato oxidase vascular, a peroxidação lipídica plasmática, medida como substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico, os níveis e atividade de MMP-2 determinados por zimografia em gel e fluorimetria em extrato de aorta, imuno-histoquímica e zimografia situ. O tratamento com espironolactona, hidroclorotiazida, ou a combinação das drogas atenuou a hipertensão arterial, reverteu a disfunção endotelial, atenuou o remodelamento vascular da aorta, assim como o aumento no estresse oxidativo, e reduziu os níveis e a atividade da MMP-2 induzidos pela hipertensão. Estes resultados sugerem que a espironolactona e hidroclorotiazida, isoladamente ou em combinação, produzem efeitos antioxidantes e diminuem o aumento da atividade da MMP-2, melhorando assim a disfunção vascular e remodelamento encontrados nesse modelo de hipertensão renovascular. / Increased oxidative stress and upregulation of matrix metalloproteinases may cause structural and functional vascular changes in renovascular hypertension. The aim of this work was to examine whether the treatment with spironolactone, hydrochlorothiazide, or both drugs modify two-kidney,one clip hypertensioninduced changes in arterial blood pressure, aortic remodeling, vascular reactivity, oxidative stress, and MMPs levels/activity. Sham operated or hypertensive rats were treated with vehicle, spironolactone (25 mg.kg-1day-1), hydrochlorothiazide (20 mg.kg-1day-1), or the combination of the two drugs for eight weeks. Systolic blood pressure was monitored weekly by tail-cuff plethysmography. Aortic rings were isolated to assess endothelium dependent and independent relaxations. Morphometry of the aortic wall was carried out in hematoxylin/eosin sections. Aortic nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase activity and superoxide production was evaluated. Formation of reactive oxygen species was measured in plasma as thiobarbituric acid reactive substances. Aortic metalloproteinase-2 levels and activity were determined by gelatin and in situ zymography, fluorimetry, and immunohistochemistry. Treatment with spironolactone, hydrochlorothiazide, or the combination attenuated two-kidney, one-clip induced hypertension and reversed the endothelial dysfunction, reversed the vascular aortic remodeling, attenuated hypertension-induced increases in oxidative stress, and reduced metalloproteinase-2 levels/activity induced by hypertension. These findings suggest that spironolactone or hydrochlorothiazide, alone or combined, produce antioxidant effects and decrease renovascular hypertension-induced MMP-2 upregulation, thus improving the vascular dysfunction and remodeling found in this model of hypertension.

Orientadores: Heitor Moreno Junior, Maricene Sabha / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-14T18:07:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Favero_FabriciodeFaveri_M.pdf: 1407421 bytes, checksum: 06435063a3f8e02cab7d2728ccdd05e0 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: Introdução: Em pacientes hipertensos, há uma relação entre morbidade e mortalidade e dano arterial, afetando um ou vários órgãos como: coração, cérebro, rins e outros. Portanto, lesões arteriais requerem uma avaliação precoce dos fatores de risco cardiovascular, uma vez que são os maiores contribuintes para doenças cardiovasculares. Entre os métodos simples e não invasivos de avaliação da rigidez arterial, a Velocidade de Onda de Pulso (VOP) é amplamente utilizada como um índice de rigidez arterial e elasticidade, sendo preciso, simples, reproduzível e habitualmente aplicado em estudos clínicos. Objetivos: Detectar alterações na velocidade de onda de pulso (VOP) em pacientes com hipertensão arterial resistente e hipertensos controlados quando comparados a indivíduos não hipertensos, durante dois períodos. Materiais e Métodos: este estudo avaliou 129 pacientes: 42 com hipertensão arterial resistente (HAR), 46 com hipertensão arterial controlada (HAC) e 41 indivíduos sem doença hipertensiva, representando o grupo controle (CT). O estudo foi realizado em duas fases - inicialmente com terapia medicamentosa otimizada (fase 0) e, após 6 meses, os pacientes foram reavaliados com o tratamento habitual associado à espironolactona na dose de 25 mg/dia (fase 1). Resultados: Na fase 0, a VOP do grupo CT (7,8±1,06 m/s) foi inferior a do grupo HAC (8,6±1,26 m/s), que mostrou-se inferior a do grupo HAR (9,3±1,5 m/s). Na fase 1, os resultados seguiram o mesmo padrão: grupo CT = 7,8±1,12 m/s, grupo HAC = 8,42±1,19 m/s e grupo HAR = 9,4±1,45 m/s. Conclusões: As alterações da VOP encontradas nos grupos HAR e HAC sugerem um aumento na rigidez arterial desses grupos. Os resultados indicam que valores mais altos de VOP estão associados a níveis de hipertensão moderado a severo. A associação da espironolactona não alterou os valores da VOP, aparentemente, não interferindo no remodelamento vascular. No que se refere à VOP, são necessários estudos adicionais com "n" maior de pacientes, por um período mais prolongado. / Abstract: Introduction: In hypertensive patients, there is a relationship between morbidity and mortality and arterial damage, affecting one or several organs like: heart, brain, kidney and others. Therefore, large arterial injuries require early evaluation of cardiovascular risk factors, once they are major contributors to cardiovascular diseases. Among the simple and non-invasive methods of arterial assessment, the Pulse Wave Velocity (PWV) measurement is widely utilized as an index of arterial stiffness and elasticity, for being accurate, simple, reproducible and usually applied in clinical trials. Objectives: To detect PWV alterations in arterial resistant and controlled hypertensive patients when compared to subjects with no hypertensive disease, during two periods. Materials and Methods : This study assessed 129 subjects: 42 Resistant Hypertensive (RH) patients, 46 Controlled Hypertensive (CH) patients and 41 subjects with no hypertensive disease, representing the Control group (CT). The study was performed in two phases - it began at an initial therapeutic optimization time (phase 0) and, after 6 months, patients were reassessed with their usual treatment associated to a spironolactone dose of 25 mg/day (phase 1). Results: In phase 0, PWV value of the CT group (7,8±1,06 m/s) was lower than the CH group (8,6±1,26m/s), which was lower than the RH group (9,3±1,5 m/s). In phase 1, results followed the same pattern: CT group = 7,8±1,12 m/s, CH group = 8,42±1,19 m/s and RH group = 9,4±1,45 m/s. Conclusions: PWV alterations found in groups RH and CH suggest an increase in arterial stiffness in these groups. Results indicate that higher PWV values are associated to moderate-to-severe levels of hypertension. The association of spironolactone did not alter PWV values, apparently, not interfering in vascular remodeling. Regarding PWV, additional studies are necessary with an increased number of patients, for a longer period. / Mestrado / Mestre em Farmacologia

Orientador: Ana Paula Couto Davel / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-24T14:07:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Victorio_JamairaAparecida_M.pdf: 1155350 bytes, checksum: eab5bb2760f0d9abd7c5e93ac2b95b51 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: A hiperativação dos receptores ß-adrenérgicos (ß-AR) tem importante papel na patogênese de doenças cardiovasculares que cursam com hiperatividade simpática. Dentre os seus efeitos, sugere-se a indução da síntese e liberação de angiotensina II e de aldosterona sistemicamente. A hiperativação dos receptores ß-AR pode ser mimetizada pelo tratamento crônico com isoproterenol (ISO). Já foi demonstrado que o antagonismo do receptor AT1 de angiotensina II ou do receptor de mineralocorticoides (MR) previne parcialmente o remodelamento cardíaco induzido pelo ISO. Entretanto, ainda não está elucidado o envolvimento da angiotensina II e da aldosterona nos efeitos vasculares causados pela hiperativação dos receptores ß-AR. Assim, o objetivo do presente estudo foi investigar as vias de sinalização dos receptores AT1 e MR nas alterações vasculares causadas pelo tratamento por 7 dias com ISO em aorta de ratos, assim como os mecanismos envolvidos. Ratos Wistar (3 meses) foram tratados com ISO (0,3 mg/kg/dia, s.c.) ou veículo (CT) e co-tratados ou não com o antagonista do receptor AT1 losartan (LOS; 40 mg/kg/dia) ou com o antagonista do receptor MR espironolactona (ESP; 200 mg/kg/dia). O tratamento com ISO causou hipertrofia ventricular sem alterações hemodinâmicas, e o co-tratamento com LOS ou ESP atenuaram o remodelamento ventricular observado. Na aorta do grupo ISO observou-se um aumento da resposta máxima à fenilefrina associado à redução da biodisponibilidade de óxido nítrico (NO) e aumento de ânion superóxido, os quais foram prevenidos pelo co-tratamento com ESP, mas não com LOS. O efeito preventivo da ESP sobre a reatividade vascular da aorta dos ratos ISO foi acompanhado de aumento da expressão proteica da HSP90, a qual foi reduzida no grupo ISO. Além disso, a ESP preveniu o aumento da expressão proteica de ß-arrestina, Gai, p-Src, ERK1/2, p- ERK1/2 e gênica de osteopontina na aorta deste grupo. As concentrações plasmáticas de corticosterona ou aldosterona não foram alteradas entre os grupos avaliados. Em conjunto, os dados sugerem que o antagonismo do receptor MR com o uso de espironolactona previne o aumento da resposta contrátil à fenilefrina observada em aorta de ratos tratados com ISO, associado a: aumento da biodisponibilidade de NO e redução do estresse oxidativo; aumento da expressão de HSP90, a qual estabiliza a forma dimérica da eNOS; e prevenção do aumento da expressão proteica de ß- arrestina, Gai1,2, p-Src, ERK1/2 e p-ERK1/2 e gênica de osteopontina, vias de sinalização de estresse oxidativo e prejuízo da função endotelial / Abstract: ß-adrenergic (ß¿AR) receptors overstimulation plays an important role in the pathogenesis of cardiovascular diseases concurrent with sympathetic overactivity. It has been suggested to increase plasma levels of angiotensin II and aldosterone. In line with this, angiotensin II/AT1 receptor or mineralocoticoid (MR) receptor antagonism partially prevents the cardiac remodeling induced by ß-AR overstimulation mediated by isoproterenol (ISO) administration. However the implication of angiotensin II or aldosterone on vascular effects provoked by ß¿AR overstimulation is not yet elucidated. So, the aim of the present study was to investigate the AT1 and MR receptor signaling pathway on vascular alterations caused by 7-day ISO treatment on rat aorta, as well as the mechanisms involved. For this, male Wistar rats (3-month-old) were treated with ISO (0.3 mg/kg/day, s.c.) or vehicle (CT) and co-treated or not with AT1 antagonist losartan (LOS; 40 mg/kg/day, v.o.) or MR receptor antagonist spironolactone (ESP; 200 mg/kg/day, v.o.). The ISO treatment resulted in ventricular hypertrophy without hemodynamic alterations, and LOS or ESP co-treatment attenuated the ventricular remodeling of ISO group. ISO aorta showed an increased phenylephrine maximum response associated with a decreased nitric oxide (NO) bioavailability and an increased in superoxide anion; both effects were prevented by ESP co-treatment, but not by LOS. Beneficial effects of ESP on vascular reactivity of aorta from ISO-treated rats were accompanied by an increased HSP90 protein expression, which was reduced in ISO group. Moreover, ESP prevented the increased protein expression of ß-arrestin, Gai, p- Src, ERK1/2 and p-ERK1/2 and osteopontina gene expression in the aorta from ISO group. Plasma corticosterone and aldosterone were not changed between the groups. In conclusion, our results suggest that spironolactone, an MR receptor antagonist prevented the increased phenylephrine contractile response in aorta from ISO-treated rats, associated with increased NO bioavailability and decreased oxidative stress; increased expression of HSP90 and; prevented the increase of ß-arrestin, Gai1,2, p-Src, ERK1/2 and p-ERK1/2 and osteopontin induced by ß-adrenergic overstimulation. These results suggest that the vascular effects induced by ISO in aorta are mediated by a MR activation / Mestrado / Fisiologia / Mestra em Biologia Funcional e Molecular

A aldosterona participa da progressão das doenças renais em modelos experimentais e ensaios clínicos. Considerando que o modelo de hipertensão renovascular 2 rins-1 clipe (2R-1C) é caracterizado pela atividade elevada do sistema renina-angiotensina-aldosterona, o objetivo desse trabalho foi avaliar o papel da aldosterona na lesão renal presente nesse modelo através do bloqueio do receptor mineralocorticóide (RM) com espironolactona. Ratos Wistar foram submetidos ao procedimento cirúrgico para colocação de um clipe de prata na artéria renal esquerda e após 2 semanas do desenvolvimento da hipertensão renovascular 2R-1C, foram divididos em 3 grupos sendo que para o primeiro grupo nenhuma droga foi administrada (n=8), para o segundo grupo foi administrado por via oral 20 mg/Kg/dia de espironolactona (n=10) e para o terceiro, 7 mg/Kg/dia de amilorida (n=12). O peso e a pressão sistólica foram monitorados semanalmente. Coletas de urina (durante 24 h) e sangue foram realizadas em 3 períodos distintos: antes do procedimento cirúrgico; na 2° semana após a cirurgia (antes do início do tratamento) e na 6° semana após a cirurgia (após o término do tratamento). As amostras foram utilizadas para análise de creatinina, osmolalidade, sódio, potássio e albuminúria. Ao final do experimento, os rins foram perfundidos e pesados. Análise histológica para avaliar a extensão das alterações tubulointersticiais foi realizada. Além disso, marcadores de inflamação (ED-1 e p-JNK), de produção de matriz extracelular (fibronectina), de miofibroblastos (-actina de músculo liso) e de transdiferenciação tubular (vimentina) na região tubulointersticial cortical e de lesão nos podócitos (desmina) foram avaliados. O tratamento com espironolactona foi capaz de atenuar o aumento na excreção de albumina, o aumento na concentração plasmática de creatinina e a redução na depuração de creatinina. No rim clipado dos ratos 2R-1C, as lesões tubulointersticias e podocitárias, demonstradas pelos marcadores estudados, foram discretas e a terapia com espironolactona ou amilorida não foi capaz de minimizá-las. Por outro lado, no rim não clipado, a administração de espironolactona atenuou o aumento de matriz extracelular e a lesão nos podócitos. Os efeitos benéficos da espironolactona ocorreram independentes da redução na pressão sanguínea e podem ser em parte, dependentes do bloqueio do canal epitelial de sódio (ENaC). Tais efeitos trazem perspectiva para espironolactona como uma ferramenta terapêutica a ser explorada em pacientes com estenose de artéria renal. / Aldosterone is involved in the progression of renal disease in experimental models and clinical trials. Considering that the model of renovascular hypertension 2 kidney-1 clip (2K-1C) is characterized by a high activity of the renin-angiotensin-aldosterone system, the objective of this study was to assess the role of aldosterone in renal injury in this model by blocking the mineralocorticoid receptor (MR) with spironolactone. Male Wistar rats were submitted to surgery to place a silver clip on the left renal artery and after two weeks of the development of 2K-1C renovascular hypertension they were divided into three groups. The first group was administered no drug (n=8), in the second group spironolactone 20 mg/kg/day was given orally (n=10) and the third group received amiloride 7 mg/kg/day (n=12). Body weight and systolic blood pressure were monitored weekly. Samples of urine (collected for 24 h) and blood were performed in 3 distinct periods: before surgery; 2 weeks after surgery (before treatment) and 6 weeks after surgery (after treatment). The samples were used to analyze creatinine, osmolality, sodium, potassium and albuminuria. At the end of the experiment, the kidneys were perfused and weighed. Histological analysis to assess the extent of tubulointerstitial changes was performed. Additionally, markers of inflammation (ED-1 and p-JNK), production of extracellular matrix (fibronectin), myofibroblasts (-smooth muscle actin) and tubular transdifferentiation (vimentin) in the area of tubulointerstitial cortical and injury in podocytes (desmin) were evaluated. Treatment with spironolactone was able to attenuate the increase in albumin excretion, the increase in plasma concentration of creatinine and the reduction in creatinine clearance. In the clipped kidney, tubulointerstitial and podocytes injuries, demonstrated by markers studied, were discrete and therapy with spironolactone or amiloride was not able to minimize them. However, in the non-clipped kidney, administration of spironolactone attenuated the increase of extracellular matrix and podocyte injury. The beneficial effects of spironolactone occurred independent of the reduction blood pressure and can be partly dependent of epithelial sodium channel (ENaC) blockade. These effects bring perspective to espironolactone as a therapeutic tool to be explored in patients with renal artery stenosis.

A adolescência é um período crítico para o desenvolvimento dos indivíduos. Durante esta fase várias estruturas cerebrais responsáveis pelo controle das respostas estressoras atingem sua maturidade. Assim, estressores agudos ou crônicos podem repercutir negativamente e alterar a resposta de estresse bem como o comportamento na vida adulta. O eixo hipotálamo-hipófiseadrenal (HPA) integra o sistema do estresse, cujo controle inibitório está regulado pelos glicocorticoides, os quais agem em receptores dos tipos mineralocorticoide (MR) e glicocorticoide (GR). É desconhecido o papel destes receptores nos efeitos de longa duração induzidos pelo estresse na pré-puberdade em modelos animais. O objetivo deste trabalho foi verificar se o bloqueio dos receptores MR ou GR após o estresse na pré-puberdade previne suas alterações sobre o comportamento exploratório e o controle do eixo HPA, em ratas adultas. Desta forma, ratas pré-púberes, com 26 dias de idade, foram submetidas a uma ou sete sessões diárias de contenção e, em seguida, à administração dos antagonistas MR (Espironolactona) ou GR (RU- 486). Na fase adulta, aos 60 dias de idade, os animais foram avaliados no labirinto em cruz elevado e, no dia seguinte, submetidos novamente à contenção, concomitantemente com coleta seriada de sangue para avaliar a resposta do eixo HPA. Subsequentemente, realizou-se a perfusão do cérebro assim como a coleta das adrenais e timo. Efetuou-se a dosagem de corticosterona por radioimunoensaio e analisou-se a expressão e atividade dos neurônios CRH na região parvocelular medial do núcleo paraventricular do hipotálamo, por imuno-histoquímica. O estresse crônico na pré-puberdade causou redução no peso corporal, atraso na puberdade e diminuição da expressão de CRH e Fos em resposta ao estresse agudo na vida adulta. Não houve efeitos sobre o peso do timo e parâmetros comportamentais. Contudo, RU-486 promoveu aumento da corticosterona e adrenais. O estresse agudo ocasionou avanço da puberdade e associado com RU- 486 ou Espironolactona também diminuiu a atividade dos neurônios CRH em resposta ao mesmo estressor na vida adulta. Estes resultados demonstram que a administração de Espironolactona pode ser uma estratégia promissora para atenuar os efeitos centrais a longo prazo decorrentes do estresse agudo na pré-adolescência / Adolescence is a critical period to the individual\'s development. Several brain structures responsible for the control of stressful responses reach maturity during this phase. Thus, acute or chronic stressors can have a negative effect and alter the stress response as well as behavior in adulthood. The hypothalamus-pituitary-adrenal axis (HPA) is part of the stress system, whose inhibitory control is regulated by glucocorticoids through mineralocorticoid (MR) and glucocorticoid (GR) receptors. It is unknown the role of these receptors in the long-term effects induced by stress in the prepuberty in animals models. The aim of this study was determine whether MR or GR receptor blockade after stress in prepuberty prevents their changes on exploratory behavior and control of the HPA axis in adult female rats. Thus, prepuberty female rats, at 26 days old, were submitted to one or seven daily restraint sessions followed by administration of MR (Spironolactone) or GR (RU-486) antagonists. In adulthood, at 60 days old, the animals were evaluated in the elevated plus maze. In the next day, they were subject again to restraint concurrently with serial blood sampling to evaluate the HPA axis response. Subsequently, it was performed the brain perfusion as well as the collection of the adrenal glands and thymus. It was conducted the dosage of corticosterone by radioimmunoassay and analyzed the expression and activity of CRH neurons in the medial parvocellular subdivision of the paraventricular nucleus of the hypothalamus by immunohistochemistry. Chronic stress in prepuberty reduced the body weight, delayed the puberty and decreased the CRH and Fos expression in response to acute stress in adulthood. There was no effect on thymus weight and behavioral parameters. However, RU-486 increased the corticosterone secretion and adrenal glands weight. Acute stress caused advancement of puberty and associated with RU-486 or Spironolactone also reduced the activity of CRH neurons in response to the same stressor in adulthood. These results demonstrate that Spironolactone administration may be a promising strategy to attenuate the central long-term effects resulting from acute stress in prepuberty.

A adolescência é um período crítico para o desenvolvimento dos indivíduos. Durante esta fase várias estruturas cerebrais responsáveis pelo controle das respostas estressoras atingem sua maturidade. Assim, estressores agudos ou crônicos podem repercutir negativamente e alterar a resposta de estresse bem como o comportamento na vida adulta. O eixo hipotálamo-hipófiseadrenal (HPA) integra o sistema do estresse, cujo controle inibitório está regulado pelos glicocorticoides, os quais agem em receptores dos tipos mineralocorticoide (MR) e glicocorticoide (GR). É desconhecido o papel destes receptores nos efeitos de longa duração induzidos pelo estresse na pré-puberdade em modelos animais. O objetivo deste trabalho foi verificar se o bloqueio dos receptores MR ou GR após o estresse na pré-puberdade previne suas alterações sobre o comportamento exploratório e o controle do eixo HPA, em ratas adultas. Desta forma, ratas pré-púberes, com 26 dias de idade, foram submetidas a uma ou sete sessões diárias de contenção e, em seguida, à administração dos antagonistas MR (Espironolactona) ou GR (RU- 486). Na fase adulta, aos 60 dias de idade, os animais foram avaliados no labirinto em cruz elevado e, no dia seguinte, submetidos novamente à contenção, concomitantemente com coleta seriada de sangue para avaliar a resposta do eixo HPA. Subsequentemente, realizou-se a perfusão do cérebro assim como a coleta das adrenais e timo. Efetuou-se a dosagem de corticosterona por radioimunoensaio e analisou-se a expressão e atividade dos neurônios CRH na região parvocelular medial do núcleo paraventricular do hipotálamo, por imuno-histoquímica. O estresse crônico na pré-puberdade causou redução no peso corporal, atraso na puberdade e diminuição da expressão de CRH e Fos em resposta ao estresse agudo na vida adulta. Não houve efeitos sobre o peso do timo e parâmetros comportamentais. Contudo, RU-486 promoveu aumento da corticosterona e adrenais. O estresse agudo ocasionou avanço da puberdade e associado com RU- 486 ou Espironolactona também diminuiu a atividade dos neurônios CRH em resposta ao mesmo estressor na vida adulta. Estes resultados demonstram que a administração de Espironolactona pode ser uma estratégia promissora para atenuar os efeitos centrais a longo prazo decorrentes do estresse agudo na pré-adolescência / Adolescence is a critical period to the individual\'s development. Several brain structures responsible for the control of stressful responses reach maturity during this phase. Thus, acute or chronic stressors can have a negative effect and alter the stress response as well as behavior in adulthood. The hypothalamus-pituitary-adrenal axis (HPA) is part of the stress system, whose inhibitory control is regulated by glucocorticoids through mineralocorticoid (MR) and glucocorticoid (GR) receptors. It is unknown the role of these receptors in the long-term effects induced by stress in the prepuberty in animals models. The aim of this study was determine whether MR or GR receptor blockade after stress in prepuberty prevents their changes on exploratory behavior and control of the HPA axis in adult female rats. Thus, prepuberty female rats, at 26 days old, were submitted to one or seven daily restraint sessions followed by administration of MR (Spironolactone) or GR (RU-486) antagonists. In adulthood, at 60 days old, the animals were evaluated in the elevated plus maze. In the next day, they were subject again to restraint concurrently with serial blood sampling to evaluate the HPA axis response. Subsequently, it was performed the brain perfusion as well as the collection of the adrenal glands and thymus. It was conducted the dosage of corticosterone by radioimmunoassay and analyzed the expression and activity of CRH neurons in the medial parvocellular subdivision of the paraventricular nucleus of the hypothalamus by immunohistochemistry. Chronic stress in prepuberty reduced the body weight, delayed the puberty and decreased the CRH and Fos expression in response to acute stress in adulthood. There was no effect on thymus weight and behavioral parameters. However, RU-486 increased the corticosterone secretion and adrenal glands weight. Acute stress caused advancement of puberty and associated with RU-486 or Spironolactone also reduced the activity of CRH neurons in response to the same stressor in adulthood. These results demonstrate that Spironolactone administration may be a promising strategy to attenuate the central long-term effects resulting from acute stress in prepuberty.

A aldosterona participa da progressão das doenças renais em modelos experimentais e ensaios clínicos. Considerando que o modelo de hipertensão renovascular 2 rins-1 clipe (2R-1C) é caracterizado pela atividade elevada do sistema renina-angiotensina-aldosterona, o objetivo desse trabalho foi avaliar o papel da aldosterona na lesão renal presente nesse modelo através do bloqueio do receptor mineralocorticóide (RM) com espironolactona. Ratos Wistar foram submetidos ao procedimento cirúrgico para colocação de um clipe de prata na artéria renal esquerda e após 2 semanas do desenvolvimento da hipertensão renovascular 2R-1C, foram divididos em 3 grupos sendo que para o primeiro grupo nenhuma droga foi administrada (n=8), para o segundo grupo foi administrado por via oral 20 mg/Kg/dia de espironolactona (n=10) e para o terceiro, 7 mg/Kg/dia de amilorida (n=12). O peso e a pressão sistólica foram monitorados semanalmente. Coletas de urina (durante 24 h) e sangue foram realizadas em 3 períodos distintos: antes do procedimento cirúrgico; na 2° semana após a cirurgia (antes do início do tratamento) e na 6° semana após a cirurgia (após o término do tratamento). As amostras foram utilizadas para análise de creatinina, osmolalidade, sódio, potássio e albuminúria. Ao final do experimento, os rins foram perfundidos e pesados. Análise histológica para avaliar a extensão das alterações tubulointersticiais foi realizada. Além disso, marcadores de inflamação (ED-1 e p-JNK), de produção de matriz extracelular (fibronectina), de miofibroblastos (-actina de músculo liso) e de transdiferenciação tubular (vimentina) na região tubulointersticial cortical e de lesão nos podócitos (desmina) foram avaliados. O tratamento com espironolactona foi capaz de atenuar o aumento na excreção de albumina, o aumento na concentração plasmática de creatinina e a redução na depuração de creatinina. No rim clipado dos ratos 2R-1C, as lesões tubulointersticias e podocitárias, demonstradas pelos marcadores estudados, foram discretas e a terapia com espironolactona ou amilorida não foi capaz de minimizá-las. Por outro lado, no rim não clipado, a administração de espironolactona atenuou o aumento de matriz extracelular e a lesão nos podócitos. Os efeitos benéficos da espironolactona ocorreram independentes da redução na pressão sanguínea e podem ser em parte, dependentes do bloqueio do canal epitelial de sódio (ENaC). Tais efeitos trazem perspectiva para espironolactona como uma ferramenta terapêutica a ser explorada em pacientes com estenose de artéria renal. / Aldosterone is involved in the progression of renal disease in experimental models and clinical trials. Considering that the model of renovascular hypertension 2 kidney-1 clip (2K-1C) is characterized by a high activity of the renin-angiotensin-aldosterone system, the objective of this study was to assess the role of aldosterone in renal injury in this model by blocking the mineralocorticoid receptor (MR) with spironolactone. Male Wistar rats were submitted to surgery to place a silver clip on the left renal artery and after two weeks of the development of 2K-1C renovascular hypertension they were divided into three groups. The first group was administered no drug (n=8), in the second group spironolactone 20 mg/kg/day was given orally (n=10) and the third group received amiloride 7 mg/kg/day (n=12). Body weight and systolic blood pressure were monitored weekly. Samples of urine (collected for 24 h) and blood were performed in 3 distinct periods: before surgery; 2 weeks after surgery (before treatment) and 6 weeks after surgery (after treatment). The samples were used to analyze creatinine, osmolality, sodium, potassium and albuminuria. At the end of the experiment, the kidneys were perfused and weighed. Histological analysis to assess the extent of tubulointerstitial changes was performed. Additionally, markers of inflammation (ED-1 and p-JNK), production of extracellular matrix (fibronectin), myofibroblasts (-smooth muscle actin) and tubular transdifferentiation (vimentin) in the area of tubulointerstitial cortical and injury in podocytes (desmin) were evaluated. Treatment with spironolactone was able to attenuate the increase in albumin excretion, the increase in plasma concentration of creatinine and the reduction in creatinine clearance. In the clipped kidney, tubulointerstitial and podocytes injuries, demonstrated by markers studied, were discrete and therapy with spironolactone or amiloride was not able to minimize them. However, in the non-clipped kidney, administration of spironolactone attenuated the increase of extracellular matrix and podocyte injury. The beneficial effects of spironolactone occurred independent of the reduction blood pressure and can be partly dependent of epithelial sodium channel (ENaC) blockade. These effects bring perspective to espironolactone as a therapeutic tool to be explored in patients with renal artery stenosis.