COSTA, Carlos Germano Ferreira. Caracterização fenotípica de rizóbios de solo rizosférico de leguminosas nativas do semi-árido cearense. 2010. 149 f. Dissertação (Mestrado em ecologia e recursos naturais)- Universidade Federal do Ceará, Fortaleza-CE, 2010. / Submitted by Elineudson Ribeiro (elineudsonr@gmail.com) on 2016-05-19T18:24:31Z No. of bitstreams: 1 2010_dis_cgfcosta.pdf: 5945018 bytes, checksum: 43b543c1f97909735e8ff852c376acd0 (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa (jairo@ufc.br) on 2016-05-27T20:09:03Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2010_dis_cgfcosta.pdf: 5945018 bytes, checksum: 43b543c1f97909735e8ff852c376acd0 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-05-27T20:09:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2010_dis_cgfcosta.pdf: 5945018 bytes, checksum: 43b543c1f97909735e8ff852c376acd0 (MD5) Previous issue date: 2010 / Os diferentes solos e manejos culturais afetam o equilíbrio entre solo e organismos endógenos, os quais, por sua vez afetam a sustentabilidade do solo. Desse modo acredita-se que a diversidade dos organismos do solo tenha uma relação estreita com a diversidade de outros organismos, tanto na superfície, quanto no próprio solo e que as interações dessa diversidade microbiana possam levar a uma alteração de função reduzindo ou ampliando a sustentabilidade dos ecossistemas. Interações mutualísticas são muito comuns na natureza e desempenham importante papel em muitos processos de diversos ecossistemas. Desse modo, a identificação dos padrões da estrutura espacial e abundância de microrganismos é um elemento importante e, necessário para identificar esse processo.Associações mutualísticas entre plantas e organismos do solo são essenciais para a sobrevivência e crescimento das plantas na maioria dos ecossistemas terrestres. Assim, o uso combinado de leguminosas e microrganismos na reabilitação de solos deteriorados é um processo efetivo na reestabilização dos ciclos de nutrientes nesse sistema, pois a estrutura alimentar do solo pode afetar o desenvolvimento da vegetação. O mutualismo entre rizóbios e leguminosas é possível de manipulação experimental. Diferente de alguns mutualistas, rizóbios podem crescer e ser cultivados em meios seletivos. Além disso, seu comportamento mutualista dentro dos nódulos pode ser manipulado e monitorado de modo não invasivo. objetivo deste trabalho foi avaliar a diversidade de estirpes nativas de rizóbio e a relação com algumas espécies de leguminosas arbóreas nativas ocorrentes na Reserva Particular do Patrimônio Natural (RPPN) Serra das Almas (05° 00’ a 05° 20’ S e 40° 48 a 41° 12’ W) no estado do Ceará (Brasil),em uma área de caatinga no município de Crateús-Ce, dista 390 Km de Fortaleza, entre cotas de 300 a 350 m de altitude, e que caracteriza-se pro apresentar clima semi árido e pluviosidade média de 881 mm anuais distribuída de Janeiro a Abril. Foram identificadas oito espécies de leguminosas arbóreas, que apresentaramassociações com rizóbios: Anadenanthera colubrina var. cebil (Griseb)Altschu (Angico), Bauhinia cheilantha (Bong.) Stend (Mororó), Poincianella pyramidalis (Tul.) L.P. Queiroz (Catingueira), Erythrina velutina Willd. (Mulungu), Mimosa caesalpiniifolia Benth (Sabiá), Minosa acustistipula (Mart.) Benth (Juremabranca), Mimosa tenuiflora (Willd.) Poir (Jurema-preta), Amburana Cearensis (Allemão) A.C. Smith (Emburana). Foram coletados nódulos e solo rizosférico para a identificação de bactérias diazotróficas, em dois períodos, na estação chuvosa e na seca. Foi realizado o cultivo destes rizóbios nas plantas-isca, Macropitillium atropurpureum (DC) Urban, Vigna unguiculata (L., Walp.), Cajanus cajan var. flavus DC e Mimosa pudica L, bem como a caracterização cultural caracterização cultural de estirpes de rizóbio isolados, testes de tolerância a níveis crescentes de NaCl e a altas temperaturas.Verificou-se que 92,42% dos isolados apresentara crescimento rápido e 52,24% acidificaram o meio 79. Um total de 84,93% isolados possuem tolerância a altas temperaturas (45° C), e 90,75% isolados apresentaram tolerância às concentrações salinas a 5%.Os resultados obtidos demonstraram que há relação entre a tolerância à salinidade e à temperatura quando avaliado in vitro para os isolados testados.

Submitted by Automa??o e Estat?stica (sst@bczm.ufrn.br) on 2018-02-21T21:54:36Z No. of bitstreams: 1 GabrielleMacedoPereira_TESE.pdf: 7916343 bytes, checksum: 47f4f16d292c186e81c42187080b1343 (MD5) / Approved for entry into archive by Arlan Eloi Leite Silva (eloihistoriador@yahoo.com.br) on 2018-02-23T21:04:51Z (GMT) No. of bitstreams: 1 GabrielleMacedoPereira_TESE.pdf: 7916343 bytes, checksum: 47f4f16d292c186e81c42187080b1343 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-02-23T21:04:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 GabrielleMacedoPereira_TESE.pdf: 7916343 bytes, checksum: 47f4f16d292c186e81c42187080b1343 (MD5) Previous issue date: 2017-08-25 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior (CAPES) / O bioma Caatinga ? exclusivamente brasileiro, marcado pelo clima semi?rido. Este bioma se destaca pelo alto ?ndice de endemismo e desconhecimento cient?fico ao seu respeito. Para sobreviver neste ambiente, as plantas desenvolveram mecanismos intr?nsecos de percep??o dos sinais ambientais externos e suas respectivas respostas metab?licas. Dentre as esp?cies de ocorr?ncia no bioma Caatinga, como fonte de alcaloides bioativos, destaca-se Erythroxylum pungens, que apresenta potencial pouco explorado. Assim, o objetivo deste trabalho ? investigar o proteoma total e o perfil metab?lico de E. pungens, aliado ? bioprospec??o de alcaloides trop?nicos com potencial citot?xico. Para isso, no cap?tulo 1 identificou-se, por espectrometria de massas, sete alcaloides trop?nicos conhecidos; 3-(2-metilbutiriloxi)tropan-6, 7-diol como tamb?m 3-(2-metilbutiriloxi)nortropan-6, 7-diol foram isolados e caracterizado por RMN 1D e 2D pela primeira vez. N,N-Dimetil-1-H-indol-3-etanamina foi isolado e caracterizado a partir de ra?zes de E. pungens. Al?m disso, verificou-se que alcaloides isolados de E. pungens, frente a cinco linhagens celulares, apontaram potencial seletivo de 3-(2-metilbutiriloxi)tropan-6, 7-diol contra c?lulas de tumorais de pr?stata. Para melhor conhecer a esp?cie e, com vistas na produ??o de alcaloides trop?nicos, trabalhou-se o proteoma e perfil alcalo?dico no cap?tulo 2. Dessa forma foi poss?vel identificar 1746 prote?nas nas folhas, 1779 no caule e 1026 na raiz de E. pungens. Atrav?s da recupera??o dos termos no Gene Ontology, observou-se os processos nos quais estas prote?nas est?o envolvidas, verificando o mesmo perfil de processos para os tr?s ?rg?os de E. pungens, com destaque para respostas a estresses bi?ticos, abi?ticos, qu?micos, al?m das respostas ao estresse oxidativo. Foram observados n?veis significativos de prote?nas envolvidas na fotoss?ntese das folhas de E. pungens, fotorrespira??o, al?m prote?nas relacionadas ?s respostas ao estresse: prote?nas da fam?lia 14-3-3, peroxidases, catalases, super?xido-dismutase e prote?nas de choque t?rmico, que tamb?m podem atuar no turnover prote?co. Ainda foram identificadas cinco prote?nas hom?logas a tropinona redutase na folha, e produ??o de alcaloide em todos os ?rg?os. No cap?tulo 3, por meio do experimento com esp?cimes de E. pungens submetidas a estresse h?drico por suspens?o de rega em casa de vegeta??o, notou-se que esta esp?cie investe no aumento de prote?nas relacionadas ?s respostas ao estresse h?drico, aumenta significativamente o teor de prolina livre no citosol. Ademais, mat?m a produ??o de alcaloides que parecem estar mais relacionado a fase de desenvolvimento da planta. Com isso, os resultados deste trabalho busca contribuir para a fitoqu?mica e fisiologia de E. pungens, assim como promove o uso racional da esp?cie, e consequentemente a conserva??o do bioma Caatinga. / Caatinga biome is exclusive brazilian, marked by semi-arid climate. This biome stands out for the high endemism index and scientific unfamiliarity.To survive in this environment with peculiar edaphoclimatic conditions, plants show evolution of intrinsic mechanisms of external environmental signals perception and their respectives metabolic responses. Among the occurrence genera in Caatinga biome, as bioactive alkaloids source, the Erythroxylum pungens species, which has unexplored potential, is outstanding. Thus, the objective of this work is to investigate total proteome and metabolic fingerprint of E. pungens, together with tropane alkaloids bioprospection with cytotoxic potential. For this, in chapter 1 it was possible to identify, by mass spectrometry, seven known tropane alkaloids; 3-(2-methylbutyryloxy)tropan-6, 7-diol as well as 3-(2-methylbutyryloxy)tropan-6, 7-diol were isolated and characterized by 1D and 2D NMR for the first time. N,N-Dimethyl-1-H-indol-3-ethanamine was isolated and characterized from roots of E. punctures. In addition, it was found that alkaloids isolated from E. pungens, against five cell lines, indicated selective potential of 3-(2-methylbutyryloxy)tropan-6, 7-diol against prostate tumor cells. In chapter 2, it was possible to identify 1746 proteins in the leaves, 1779 in the stem and 1026 in the root of E. pungens. Through the recovery of the GO terms, it was possible to evaluate processes in which these proteins are involved, verifying the same process profile for three organs of E. pungens, with emphasis on biotic, abiotic, chemical stress responses, as well as responses to oxidative stress. Were observed significant proteins levels involved in photosynthesis of E. pungens leaves, photorespiration, as well as many proteins related to stress responses: proteins from 14-3-3 family, peroxidases, catalases, superoxide dismutase and shock proteins, which can also act on protein turnover. Were still identificated five proteins homologous to tropinone reductase, and alkaloid production in all organs suggesting that even under chronic stress conditions, E. pungens maintains the production of these metabolites. In chapter 3, through specimens submission experiment of E. pungens to water stress by irrigation suspension in greenhouse, it was observed that this species invest in the increase of proteins related to the responses to water stress, it significantly increases free proline content in cytosol which functions as an important osmoprotector. Furthermore, maintains alkaloids production that appear to be more related to development stage of the plant than stress condition in which it is inserted. The results of this work seek to contribute to knowledge of E. pungens phytochemistry and physiology, as well as to promote the species and consequently conservation of Caatinga biome.

FundaÃÃo Cearense de Apoio ao Desenvolvimento Cientifico e TecnolÃgico / As proteÃnas desacopladoras de planta (pUCPs) sÃo proteÃnas integrais de membrana, localizadas na membrana mitocondrial interna, pertencentes a FamÃlia de Carreadores de Ãnions Mitocondriais (FCAM), responsÃveis pela dissipaÃÃo do gradiente eletroquÃmico de prÃtons, gerado pela respiraÃÃo, como calor. Na presenÃa de Ãcidos graxos livres (AGL), as pUCPs facilitam a reentrada de prÃtons do espaÃo intermembranar para a matriz, desviando-os da ATP Sintase, inibindo assim a fosforilaÃÃo oxidativa. A funÃÃo dessas enzimas ainda nÃo està completamente elucidada, mas a literatura sugere a sua participaÃÃo em processos de amadurecimento de frutos, adaptaÃÃo a situaÃÃes de estresses biÃticos e abiÃticos e proteÃÃo da cÃlula evitando a produÃÃo de espÃcies reativas de oxigÃnio (EROS). Sua participaÃÃo na termogÃnese adaptativa à questionÃvel. O objetivo do presente trabalho foi caracterizar a atividade enzimÃtica da pUCP de mitocÃndrias de hipocÃtilos de Vigna unguiculata (L.) Walp atravÃs de ensaios polarogrÃficos, identificar o(s) gene(s) das pUCPs, estudando a sua expressÃo em diferentes situaÃÃes de estresses abiÃticos. A atividade da pUCP foi avaliada em presenÃa de Ãcidos graxos (palmÃtico, linolÃico, mirÃstico e lÃurico) e BSA tendo succinato e malato como substratos e distintos pHs (6,5, 7,2 e 7,8). As maiores atividades foram obtidas com Ãcido linoleico na presenÃa de succinato em pHs mais alcalinos (7,2 e 7,8). Primers degenerados a partir de dez diferentes pUCPs, denominados pump1 e pump2, foram desenhados para a amplificaÃÃo dos fragmentos gÃnicos por RT-PCR e PCR. Isolou-se o RNA total de folhas de plÃntulas de V. unguiculata submetidas a diferentes condiÃÃes de estresses (NaCl 100mM, H2O2 1mM e PEG 200,67g/L) que foram amplificados por RT-PCR, purificados e clonados no plasmÃdio pCR4-TOPO. Sete fragmentos gÃnicos de aproximadamente 760 pb foram seqÃenciados, apresentando 100% de identidade entre si. A comparaÃÃo da seqÃÃncia deduzida de aminoÃcidos desse fragmento de cDNA com a soja revelou 94% de homologia com GmUCP1a e 90% de homologia com GmUCP1b. Os resultados sugerem que o gene do feijÃo identificado em V. unguiculata (VuUCP1a) à ortÃlogo ao gene GmUCP1a de soja (Glycine max). A expressÃo de VuUCP1a em feijÃo em condiÃÃes de estresses abiÃticos (salino, oxidativo e osmÃtico) atravÃs de anÃlise por xv. RT-PCR revelou um perfil diferencial, sugerindo induÃÃo de expressÃo de VuUCP1a apenas em resposta ao estresse salino. Isolou-se o DNA genÃmico de V. unguiculata e dois fragmentos gÃnicos (1700 e 1900pb) foram amplificados por PCR. A amplificaÃÃo de dois fragmentos distintos a partir do DNA genÃmico sugere a existÃncia de pelo menos dois genes codificando pUCPs em feijÃo, sendo assim, a pUCP à codificada por uma famÃlia multigÃnica. / The uncoupling proteins of plants (pUCPs) are integral proteins of membrane, located in the mitochondrial inner membrane, belong the Mitochondrial Anion Carrier Family (MACF). They are responsible for the dissipation as heat of the electrochemical gradient of protons, generated during respiration. In the presence of free fatty acid acids (FFA), the UCPs facilitate the re-entry of protons from intermembrane space for the matrix and these protons are deviated from the influence of the ATP sintase what leads to the inhibition the oxidative phosphorilation. The function of these enzymes completely is still not elucidated, but literature suggests its participation in processes of fruit maturation, in the adaptation to stress conditions and in cell protection by avoiding the production of reactive species of oxygen (EROS). The involvement of this enzyme in adaptive thermogenesis is questionable. The objective of the present work was to characterize the enzymatic activity of pUCP of mitochondria from hypocotyls of Vigna unguiculata (L.) Walp through polarographic assays and to identify the(s) gene(s) of pUCPs, through its expression in different conditions of abiotic stress. The activity of pUCP was evaluated in the presence of fatty acids (palmitic, linoleic, myristic and lauric) and BSA, having succinate and malate as oxidizable substrates at different pHs (6,5, 7,2 and 7,8). The higuest activities were obtained in the presence of linoleic acid, succinate as substrate and with more alkaline pHs (7,2 and 7,8). Degenerate primers, obtained from ten different pUCPs, called pump1 and pump2, has been designed for amplification of the gene fragments through RT-PCR and PCR. The total RNA was isolated from plants leaves of V. unguiculata submitted to different stress conditions (100 mM NaCl, 1 mM H2O2 and 200,67 g/L PEG) and cDNAs fragments amplified by RT-PCR had been purified and cloned in the plasmid PCR4-TOPO. Seven cDNA fragments of approximately 760 pb had been sequenced and presented 100% of identity among themselves. The comparison of the deduced amino acid sequence of this cDNA fragment with those of soybean disclosed 94% of identity with the gene GmUCP1a and 90% of identity GmUCP1b soybean gene. These results suggest that the pUCP gene identified in V. unguiculata (VuUCP1a) is ortologous to the GmUCP1a gene from soybean (Glycine max). The expression of genes of pUCP in beans, under abiotic stress xvii. conditions (salinity, oxidative and osmotic conditions) analyzed through RT-PCR disclosed a differential profile what suggests induction of expression of VuUCP1a only in response to salt stress. The genomic DNA of V. unguiculata was isolated and two gene fragments (1700 and 1900 pb) had been amplified by PCR. The amplification of two fragments from the genomic DNA suggests the existence of at least two pUCPs genes in beans what leads to the conclusion of a pUCP multigenic family.

FundaÃÃo Cearense de Apoio ao Desenvolvimento Cientifico e TecnolÃgico / Os diferentes solos e manejos culturais afetam o equilÃbrio entre solo e organismos endÃgenos, os quais, por sua vez afetam a sustentabilidade do solo. Desse modo acredita-se que a diversidade dos organismos do solo tenha uma relaÃÃo estreita com a diversidade de outros organismos, tanto na superfÃcie, quanto no prÃprio solo e que as interaÃÃes dessa diversidade microbiana possam levar a uma alteraÃÃo de funÃÃo reduzindo ou ampliando a sustentabilidade dos ecossistemas. InteraÃÃes mutualÃsticas sÃo muito comuns na natureza e desempenham importante papel em muitos processos de diversos ecossistemas. Desse modo, a identificaÃÃo dos padrÃes da estrutura espacial e abundÃncia de microrganismos à um elemento importante e, necessÃrio para identificar esse processo.AssociaÃÃes mutualÃsticas entre plantas e organismos do solo sÃo essenciais para a sobrevivÃncia e crescimento das plantas na maioria dos ecossistemas terrestres. Assim, o uso combinado de leguminosas e microrganismos na reabilitaÃÃo de solos deteriorados à um processo efetivo na reestabilizaÃÃo dos ciclos de nutrientes nesse sistema, pois a estrutura alimentar do solo pode afetar o desenvolvimento da vegetaÃÃo. O mutualismo entre rizÃbios e leguminosas à possÃvel de manipulaÃÃo experimental. Diferente de alguns mutualistas, rizÃbios podem crescer e ser cultivados em meios seletivos. AlÃm disso, seu comportamento mutualista dentro dos nÃdulos pode ser manipulado e monitorado de modo nÃo invasivo. objetivo deste trabalho foi avaliar a diversidade de estirpes nativas de rizÃbio e a relaÃÃo com algumas espÃcies de leguminosas arbÃreas nativas ocorrentes na Reserva Particular do PatrimÃnio Natural (RPPN) Serra das Almas (05 00â a 05 20â S e 40 48 a 41 12â W) no estado do Cearà (Brasil),em uma Ãrea de caatinga no municÃpio de CrateÃs-Ce, dista 390 Km de Fortaleza, entre cotas de 300 a 350 m de altitude, e que caracteriza-se pro apresentar clima semi Ãrido e pluviosidade mÃdia de 881 mm anuais distribuÃda de Janeiro a Abril. Foram identificadas oito espÃcies de leguminosas arbÃreas, que apresentaramassociaÃÃes com rizÃbios: Anadenanthera colubrina var. cebil (Griseb)Altschu (Angico), Bauhinia cheilantha (Bong.) Stend (MororÃ), Poincianella pyramidalis (Tul.) L.P. Queiroz (Catingueira), Erythrina velutina Willd. (Mulungu), Mimosa caesalpiniifolia Benth (SabiÃ), Minosa acustistipula (Mart.) Benth (Juremabranca), Mimosa tenuiflora (Willd.) Poir (Jurema-preta), Amburana Cearensis (AllemÃo) A.C. Smith (Emburana). Foram coletados nÃdulos e solo rizosfÃrico para a identificaÃÃo de bactÃrias diazotrÃficas, em dois perÃodos, na estaÃÃo chuvosa e na seca. Foi realizado o cultivo destes rizÃbios nas plantas-isca, Macropitillium atropurpureum (DC) Urban, Vigna unguiculata (L., Walp.), Cajanus cajan var. flavus DC e Mimosa pudica L, bem como a caracterizaÃÃo cultural caracterizaÃÃo cultural de estirpes de rizÃbio isolados, testes de tolerÃncia a nÃveis crescentes de NaCl e a altas temperaturas.Verificou-se que 92,42% dos isolados apresentara crescimento rÃpido e 52,24% acidificaram o meio 79. Um total de 84,93% isolados possuem tolerÃncia a altas temperaturas (45 C), e 90,75% isolados apresentaram tolerÃncia Ãs concentraÃÃes salinas a 5%.Os resultados obtidos demonstraram que hà relaÃÃo entre a tolerÃncia à salinidade e à temperatura quando avaliado in vitro para os isolados testados

O operon groESL de C. crescentus apresenta dupla regulação. A indução deste operon por choque térmico é dependente do fator sigma de choque térmico σ32. A temperaturas fisiológicas, a expressão de groESL apresenta regulação temporal durante o ciclo celular da bactéria e o controle envolve a proteína repressora HrcA e o elemento CIRCE (controlling inverted repeat of chaperonin expression). Para estudar a atividade da proteína repressora in vitro, produzimos e purificamos de E. coli a HrcA de C. creseentus contendo uma cauda de histidinas e a ligação especifica ao elemento CIRCE foi analisada em ensaios de migração retardada em gel de poliacrilamida (EMRGP). A quantidade de DNA retardada pela ligação a HrcA aumentou significativamente na presença de GroES/GroEL, sugerindo que estas proteínas modulam a atividade de HrcA. Corroboração desta modulação foi obtida analisando fusões de transcrição da região regulatória de groESL com o gene lacZ, em células de C. crescentus produzindo diferentes quantidades de GroES/EL. HrcA contendo as substituições Pro81 AJa e Arg87Ala, aminoácidos que se localizam no domínio putativo de ligação ao DNA da proteína, mostraram ser deficientes na ligação a CIRCE, tanto in vitro como in vivo. Em adição, HrcA Ser56Ala expressa na mesma célula juntamente com a proteína selvagem produziu um fenótipo dominante-negativo, indicando que a HrcA de C. crescentus liga-se a CIRCE como um oligômero, provavelmente um dímero. As tentativas de obtenção de mutantes nulos para os genes groESL ou dnaKJ falharam, indicando que as proteínas GroES/GroEL e DnaK/DnaJ são essenciais em C. crescentus, mesmo a temperaturas normais. Foram então construídas no laboratório as linhagens mutantes condicionais SG300 e SG400 de C. crescentus, onde a expressão de groESL e de dnaKJ, respectivamente, está sob controle de um promotor induzido por xilose (PxyIX). Estas linhagens foram caracterizadas quanto á sua morfologia em condições permissivas ou restritivas, assim como quanto à capacidade de sobrevivência frente a vários tipos de estresse. As células da linhagem SG300, exauridas de GroES/GroEL, são resistentes ao choque térmico a 42°C e são capazes de adquirir alguma termotolerância. Entretanto, estas células são sensíveis aos estresses oxidativo, salino e osmótico. As células da linhagem SG400, exauridas de DnaKlJ, são sensíveis ao choque térmico, à exposição a etanol e ao congelamento, e são incapazes de adquirir termotolerância. Além disso, tanto as células exauridas de GroES/GroEL quanto as exauridas de DnaK/DnaJ apresentam problemas na sua morfologia. As células de SG300 exauridas de GroES/GroEL formam filamentos longos que possuem constrições fundas e irregulares. As células de SG400 exauridas de DnaK/DnaJ são apenas um pouco mais alongadas que as células pré-divisionais selvagens e a maioria das células não possuem septo. Estas observações indicam bloqueio da divisão celular, que deve ocorrer em diferentes estágios em cada linhagem. / In Caulobacter crescentus, the groESL operon presents a dual type of control. Heat shock induction of the operon is dependent on the heat shock sigma factor σ-32. At physiological temperatures, groESL expression is cell cycle regulated and the control involves the repressor protein HrcA and the element CIRCE (controlling inverted repeat of chaperonin ~xpression). To study the activity of HrcA in vitro, we produced and purified from E. coli a histidine-tagged version of the protein, and specific binding to the CIRCE element was analyzed in electrophoretic mobility shift assays (EMSA). The amount of retarded DNA increased significantly in the presence of GroES/GroEL, suggesting that these proteins modulate HrcA activity. Further evidence of this modulation was obtained using lacZ transcription fusions with the groESL regulatory region in C. crescentus cells producing different amounts of GroES/GroEL. The mutants proteins HrcA Pro81Ala and HrcA Arg87Ala, that contain amino acid substitutions in the putative DNA-bindíng domain of the protein, were found to be deficient in binding to CIRCE in vitro and in vivo. Furthermore, HrcA Ser56Ala expressed together with the wild type protein within the same cell, produced a dominant-negative phenotype, indicating that C. crescentus HrcA binds to CIRCE in an oligomeric form, most likely as a dimer. Attempts to obtain null mutants for groESL or dnaKJ were unsuccessful indicating the importance of GroES/GroEL and DnaK/lDnaJ to the survival of C. crescentus cells. Conditional mutants were then constructed in our laboratory in which groESL and dnaKJ expression is under the control ofaxylose inducible promoter (PxyIX) , giving rise to strains SG300 and SG400, respectively. These strains were characterized in regard to their morphology under permissive and restrictive conditions, as well as their viability under different types of environmental stresses. SG300 cells depleted of GroES/GroEL are resistant to heat shock at 42°C and can acquire some thermotolerance, but they are sensitive to oxidative, saline and osmotic stresses. SG400 cells depleted of DnaKlJ are quite sensitive to heat shock, ethanol and freezing, and are unable of acquiring thermotolerance. Cells depleted of either GroES/EL or DnaKlJ also present morphological problems. SG300 cells depleted of GroES/EL form long and pinched filaments. SG400 cells depleted of DnaKlJ are only somewhat more elongated than wild-type predivisional cells and most cells do not present septum. These observations indicate a cell division arrest, which should occur at different stages in each strain.

O operon groESL de C. crescentus apresenta dupla regulação. A indução deste operon por choque térmico é dependente do fator sigma de choque térmico σ32. A temperaturas fisiológicas, a expressão de groESL apresenta regulação temporal durante o ciclo celular da bactéria e o controle envolve a proteína repressora HrcA e o elemento CIRCE (controlling inverted repeat of chaperonin expression). Para estudar a atividade da proteína repressora in vitro, produzimos e purificamos de E. coli a HrcA de C. creseentus contendo uma cauda de histidinas e a ligação especifica ao elemento CIRCE foi analisada em ensaios de migração retardada em gel de poliacrilamida (EMRGP). A quantidade de DNA retardada pela ligação a HrcA aumentou significativamente na presença de GroES/GroEL, sugerindo que estas proteínas modulam a atividade de HrcA. Corroboração desta modulação foi obtida analisando fusões de transcrição da região regulatória de groESL com o gene lacZ, em células de C. crescentus produzindo diferentes quantidades de GroES/EL. HrcA contendo as substituições Pro81 AJa e Arg87Ala, aminoácidos que se localizam no domínio putativo de ligação ao DNA da proteína, mostraram ser deficientes na ligação a CIRCE, tanto in vitro como in vivo. Em adição, HrcA Ser56Ala expressa na mesma célula juntamente com a proteína selvagem produziu um fenótipo dominante-negativo, indicando que a HrcA de C. crescentus liga-se a CIRCE como um oligômero, provavelmente um dímero. As tentativas de obtenção de mutantes nulos para os genes groESL ou dnaKJ falharam, indicando que as proteínas GroES/GroEL e DnaK/DnaJ são essenciais em C. crescentus, mesmo a temperaturas normais. Foram então construídas no laboratório as linhagens mutantes condicionais SG300 e SG400 de C. crescentus, onde a expressão de groESL e de dnaKJ, respectivamente, está sob controle de um promotor induzido por xilose (PxyIX). Estas linhagens foram caracterizadas quanto á sua morfologia em condições permissivas ou restritivas, assim como quanto à capacidade de sobrevivência frente a vários tipos de estresse. As células da linhagem SG300, exauridas de GroES/GroEL, são resistentes ao choque térmico a 42°C e são capazes de adquirir alguma termotolerância. Entretanto, estas células são sensíveis aos estresses oxidativo, salino e osmótico. As células da linhagem SG400, exauridas de DnaKlJ, são sensíveis ao choque térmico, à exposição a etanol e ao congelamento, e são incapazes de adquirir termotolerância. Além disso, tanto as células exauridas de GroES/GroEL quanto as exauridas de DnaK/DnaJ apresentam problemas na sua morfologia. As células de SG300 exauridas de GroES/GroEL formam filamentos longos que possuem constrições fundas e irregulares. As células de SG400 exauridas de DnaK/DnaJ são apenas um pouco mais alongadas que as células pré-divisionais selvagens e a maioria das células não possuem septo. Estas observações indicam bloqueio da divisão celular, que deve ocorrer em diferentes estágios em cada linhagem. / In Caulobacter crescentus, the groESL operon presents a dual type of control. Heat shock induction of the operon is dependent on the heat shock sigma factor σ-32. At physiological temperatures, groESL expression is cell cycle regulated and the control involves the repressor protein HrcA and the element CIRCE (controlling inverted repeat of chaperonin ~xpression). To study the activity of HrcA in vitro, we produced and purified from E. coli a histidine-tagged version of the protein, and specific binding to the CIRCE element was analyzed in electrophoretic mobility shift assays (EMSA). The amount of retarded DNA increased significantly in the presence of GroES/GroEL, suggesting that these proteins modulate HrcA activity. Further evidence of this modulation was obtained using lacZ transcription fusions with the groESL regulatory region in C. crescentus cells producing different amounts of GroES/GroEL. The mutants proteins HrcA Pro81Ala and HrcA Arg87Ala, that contain amino acid substitutions in the putative DNA-bindíng domain of the protein, were found to be deficient in binding to CIRCE in vitro and in vivo. Furthermore, HrcA Ser56Ala expressed together with the wild type protein within the same cell, produced a dominant-negative phenotype, indicating that C. crescentus HrcA binds to CIRCE in an oligomeric form, most likely as a dimer. Attempts to obtain null mutants for groESL or dnaKJ were unsuccessful indicating the importance of GroES/GroEL and DnaK/lDnaJ to the survival of C. crescentus cells. Conditional mutants were then constructed in our laboratory in which groESL and dnaKJ expression is under the control ofaxylose inducible promoter (PxyIX) , giving rise to strains SG300 and SG400, respectively. These strains were characterized in regard to their morphology under permissive and restrictive conditions, as well as their viability under different types of environmental stresses. SG300 cells depleted of GroES/GroEL are resistant to heat shock at 42°C and can acquire some thermotolerance, but they are sensitive to oxidative, saline and osmotic stresses. SG400 cells depleted of DnaKlJ are quite sensitive to heat shock, ethanol and freezing, and are unable of acquiring thermotolerance. Cells depleted of either GroES/EL or DnaKlJ also present morphological problems. SG300 cells depleted of GroES/EL form long and pinched filaments. SG400 cells depleted of DnaKlJ are only somewhat more elongated than wild-type predivisional cells and most cells do not present septum. These observations indicate a cell division arrest, which should occur at different stages in each strain.