As proteínas-cinases ativadas por mitógenos (MAPKs) participam de rotas de transdução de sinais universais em eucariotos e compõem cascatas de fosforilação que levam as células a responder a estímulos extracelulares. Em plantas, MAPKs estão associadas a processos de desenvolvimento e na reposta a hormônios e a estresses bióticos e abióticos. Em trabalhos anteriores de nosso grupo, o gene Egmpk5 de Eucalyptus grandis foi clonado e seu padrão de expressão foi caracterizado em plantas submetidas a diferentes tratamentos. Ainda, plantas de Nicotiana tabacum SR1 foram transformadas com Egmpk5 sob regulação do promotor CaMV 35S para futuro estudo de função do gene. No presente trabalho, foi avaliada mais amplamente a estrutura, a expressão e o produto deste gene. Análises in silico revelaram que Egmpk5 apresenta-se como cópia única no genoma, está organizado em seis éxons e seus cinco íntrons possuem sítios canônicos de splicing de RNA. O produto deduzido deste gene apresenta em sua sequência a assinatura do domínio proteína-cinase e os motivos de ligação a ATP e de ativação/dupla fosforilação, indicando a possibilidade de ser uma proteína funcional. Árvore filogenética foi construída pelo método de Máxima Verossimilhança utilizando o algoritmo MUSCLE para alinhamento das sequências e um valor de bootstrap de 500 repetições com sequências peptídicas similares à proteína deduzida EgMPK5 e permitiu a identificação de MAPKs de outras plantas com função já comprovada na sinalização da divisão celular e na resposta a estresses abióticos, ferimento e patógenos. Análise de RT-qPCR mostrou a expressão de Egmpk5 em níveis comparáveis em raízes, caules e folhas de plantas de E. grandis tratadas com água, e foi detectado um aumento de sua expressão em folhas tratadas com ácido abscísico (ABA) e em todos os órgãos tratados com solução de cloreto de sódio a 200 mM. O estudo da região promotora de Egmpk5 revelou um grupo de possíveis elementos de ação cis relacionados a respostas a estresses. Seis linhagens transformadas de tabaco que tiveram seu estado transgênico confirmado por PCR foram desafiadas com tratamentos de seca e cloreto de sódio, e linhagens mais tolerantes foram identificadas. Ao final destas diversas análises, os resultados obtidos sugerem a participação de Egmpk5 em respostas a estresses abióticos. / Mitogen-activated protein kinases (MAPKs) are part of phosphorylation cascades found in all eukaryotes and are responsible for transducing extracellular stimuli into intracellular responses. In plants, MAPK cascades are involved in growth and development processes and have roles in the response to hormones and biotic and abiotic stresses. In our previous studies, the Egmpk5 gene from Eucalyptus grandis was cloned and its expression profile was characterized in plants subjected to different treatments. Also, Nicotiana tabacum SR1 plants were transformed with Egmpk5 under the control of the CaMV 35S promoter for further function studies. In the present study the structure, expression profiles and product of this gene were further characterized. In silico analyses revealed that the Egmpk5 gene is present as a single copy in the E. grandis genome, and that its structure comprises six exons and five introns with conserved sites for transcript splicing. The deduced product of this gene presents the protein kinase domain signature, ATP-binding site and activation/dual phosphorylation motifs in its structure. A phylogenetic tree was built with sequences similar to the deduced EgMPK5 peptide and lead to the identification of plant MAPKs that have had proven activity in cell division signaling and in the response to abiotic stresses, wounding and pathogens. RT-qPCR analysis showed equal expression of Egmpk5 in roots, stems and leaves of plants treated with water and we detected an increase of expression in leaves treated with abscisic acid (ABA) and also increase in expression in all three organs upon treatment with 200 mM sodium chloride. Analysis of the promoter region of Egmpk5 revealed a group of putative cis-acting elements related to stress responses. Six transformed tobacco lines were confirmed by PCR and were assayed with drought and sodium chloride treatments for the identification of more tolerant individuals. After all analyses performed, results allowed us to suggest that Egmpk5 is involved in abiotic stresses responses.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:26:47Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-03-19Bitstream added on 2014-06-13T18:55:11Z : No. of bitstreams: 1 lopes_tc_me_botfca.pdf: 369263 bytes, checksum: 7a2e501b9cbc772082621a138b4fdf38 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Universidade Estadual Paulista (UNESP) / Espécies vegetais apresentam diferentes comportamentos quando submetidas a determinados níveis de salinidade, podendo apresentar diminuição no seu crescimento e produtividade. Estudos realizados com NaCl apresentam resultados que demonstram efeitos nocivos às características morfofisiológicas de plantas. No Brasil existem poucos estudos que relatam o comportamento de espécies do gênero eucalipto sob o efeito da presença de sais no solo. Para recuperação e utilização das áreas que contêm alta concentração de sais no solo é necessário que se conheça o comportamento do material desejado quando submetido a diferentes níveis de condutância elétrica e tipos de sais presentes. A água, quando presente no solo em quantidade suficiente ao adequado desenvolvimento dos vegetais, pode evitar problemas como a toxicidade causada por íons como o Na+ e o Cl-, uma vez que participa de praticamente todos os processos bioquímicos e fisiológicos da mesma, atuando como principal constituinte dos tecidos, solvente para sais e nutrientes, reagente em processos metabólicos, mantenedora da turgescência e moderadora térmica dos tecidos. Deste modo foi avaliada, nesta pesquisa, a influência dos níveis de salinidade de solo sobre o desenvolvimento inicial pós-plantio de mudas de Eucalyptus platyphylla. O teste experimental foi conduzido em casa de vegetação, no Departamento de Engenharia Rural, da Faculdade de Ciências Agronômicas/UNESP – Botucatu, no período de 20 de abril a 07 de junho de 2011. Para realização do estudo, foram utilizados vasos cilíndricos preenchidos com solo, contendo doses de NaCl, de modo a proporcionar os níveis e condutividade elétrica desejados: 1,41; 2,50; 4,50; 6,45 e 8,33 dS.m-1, contou ainda com duas lâminas de irrigação (- 1,5 e -0,01 MPa de potenciais mínimos... / Vegetable species present different behavior when subjected to certain levels of salinity, which may have decreased their growth and productivity. Studies of NaCl plant application present results that demonstrate harmful effects on plants. In Brazil there are few studies which report the Eucalyptus platyphylla behavior under the effect of salts in the soil. In order to recovery of areas containing high salt concentration in soil it is necessary to know plant behavior when subjected to different electrical conductance levels. Water in sufficient quantity to proper development of plants can prevent problems such as toxicity caused by ions such as Na+ and Cl-. Experimental testing was conducted in a greenhouse at the Department of Rural Engineering, Faculty of Agricultural Sciences / UNESP – Botucatu, in the period April, 20 to June, 07, 2011. For accomplishment of study cylindrical pots filled with soil were utilized containing doses of NaCl to provide the following electrical conductivity levels: 1.41, 2.50, 4.50, 6.45 and 8.33 dS.m-1. Two minimum soil water potential were applied: -0.01 and -1,5 MPa. The evaluations regarding morphophysiological features were held throughout the period of conductance of work. Based on the results obtained by the Tukey test at 5% significance level the salinity levels applied did not influence significantly some of the morphophysiological parameters analyzed in this study, such as mass of... (Complete abstract click electronic access below)

Um dos principais avanços da era pós-genômica consiste na possibilidade da análise da expressão global de genes pela tecnologia de microarranjos de DNA, a qual permite a investigação simultânea do perfil de transcrição de milhares de genes. Com os microarranjos, tornou-se possível comparar os padrões de expressão entre indivíduos de diferentes espécies, de diferentes órgãos/tecidos dentro de uma mesma espécie ou diferentes tecidos submetidos a várias situações e tratamentos e, ainda, analisar os genes de proteínas potencialmente reguladoras da transcrição, os fatores de transcrição. Uma etapa fundamental após a análise dos resultados dos microarranjos consiste na validação experimental dos dados de expressão gênica. Esta validação é realizada pela utilização da técnica de qRT-PCR (“Real Time Quantitative RT-PCR”) um método que, atualmente, apresenta maior sensibilidade e especificidade na análise de transcritos. A qRT-PCR necessita, entretanto, de normalização para uma leitura adequada dos dados. Essa normalização tornou-se bastante específica já que depende da disponibilidade de genes que apresentem transcritos com expressão uniforme em todas as células do organismo ou entre as espécies que estão sendo analisadas, bem como durante várias fases do desenvolvimento e sob diferentes condições ambientais. São os chamados genes-referência ou housekeeping. Entretanto, alguns trabalhos vêm constatando que os genes-referência utilizados na era prégenômica não apresentam expressão estável entre tecidos e genótipos e, por este motivo, não são adequados como controles em qRT-PCR. O objetivo desse trabalho foi investigar a estabilidade de expressão de genes constitutivos freqüentemente utilizados como controles internos em estudos de expressão gênica e selecionar novos genes-referência para Eucalyptus por meio de experimentos de qRT-PCR para a sua utilização na validação de experimentos de microarranjos do Projeto Genolyptus. Como resultados das análises de qRT-PCR, foi possível observar que para xilemas de E. globulus e xilemas e folhas maduras de E. grandis, os genes EuC12, At2g28390, EuC10, Histona H2B, Gliceraldeído- 3-fosfato-desidrogenase (GAPDH), EuC06 e EuC09 foram os que demonstraram, respectivamente, menor variação em suas expressões, caracterizando-se como constitutivos para estes tecidos. De acordo com os resultados encontrados nas análises com cDNAs derivados de folhas e xilemas de E. grandis, somente EuC12 e At2g28390 demonstraram invariabilidade de expressões entre os tecidos. Dois tradicionais genes constitutivos, Histona H2B e GAPDH, apresentaram uma variação considerável nas suas expressões entre os tecidos. Os genes selecionados, servirão como controles internos em todas as qRTPCRs subseqüentes nas avaliações de dados gerados pelos microarranjos de DNA para todos os demais genes sob análise no Projeto Genolyptus, e demais linhas de investigação de Eucalyptus. Paralelamente realizou-se, ainda, a seleção e análise de treze genes com expressão diferencial significativa entre tecidos vasculares das espécies de E. grandis e E. globulus. Estes foram selecionados com base nos resultados de microarranjos do Genolyptus e terão seus padrões de expressão analisados por qRT-PCR. / One of the most important advances of post-genomic era is the possibility of global gene expression analysis by DNA microarray technology, which allow verifying transcription profile for thousand genes simultaneously. Microarray allows comparing expression patterns among individuals from distinct species, from distinct organs/tissues within of the same specie or distinct tissues submitted across a wide range of developmental and environmental conditions, beyond genes of proteins mighty involved in transcriptional regulation, the transcription factors. A basic stage of microarray analysis is the experimental validation from gene expression data. This validation is carried out by the use of qRT-PCR (“Real Time Quantitative RT-PCR”) technique witch is the method that currently presents greater sensitivity and specificity in transcript analysis. However, qRTPCR needs normalization for an accurate data interpretation. This data normalization is specific since it depends on the availability of a gene which displays highly uniform expression in all organism cells, between species under analysis, during various phases of development and under different environmental conditions. They are known as reference or housekeeping genes. However, some studies come evidencing that reference genes normally used in pre-genomic era doesn’t show steady expression between tissues and genotypes and, for this reason, are not suitable as controls in qRT-PCR. The objective of this work was to investigate the expression stability of housekeeping genes often used as internal controls in genetic expression studies and select novel genes for Eucalyptus by qRT-PCR for its use in the validation of Genolyptus Project microarray experiments. As results it was possible to identified histone, EuC06, EuC09, EuC10, EuC12, At2g28390 and GAPDH as the most stably expressed genes between E. globulus xylems and E. grandis xylems and mature leafs, as well pointing them out as control genes for these tissues. In accordance with the results found in the analysis with cDNAs derived from E. grandis leaves and xylems, only EuC12 and At2g28390 had demonstrated expression invariability between tissues. We found out that two traditional housekeeping genes, Histone and GAPDH, shown a considerable expression variation between those tissues. According to our analysis the selected genes will serve as internal controls in all subsequent qRT-PCRs, in microarray data evaluation to other genes under investigation in Genolyptus Project as well as another research lines in Eucalyptus. At the same time, we selected and analyzed thirteen genes with significant differential expression between E. grandis and E. globulus vascular tissues. These had been selected on the basis of the results of Genolyptus microarrays. Their expression patterns will be analyzed by qRTPCR.

O continuo aumento na concentração de dióxido de carbono na atmosfera, resultado da combustão de combustíveis fósseis, de mudanças no uso do solo e do desmatamento para a agricultura, é um assunto de grande importância devido a suas implicações no aquecimento global e nas mudanças climáticas. O florestamento é visto como uma solução para frear o aumento na concentração de CO2 atmosférico, podendo contribuir na mitigação das mudanças climáticas através do seqüestro de carbono na biomassa das árvores e no solo. O presente estudo teve como objetivo avaliar alguns dos processos que envolvem o estoque e a dinâmica do carbono em sistemas florestais manejados com eucalipto. O estudo abrangeu trabalhos de campo para quantificar o estoque de carbono nos componentes do sistema florestal com árvores de Eucalyptus saligna com três anos de idade na região Sul do Brasil e a investigação do efeito de variações sazonais e ontogenéticas sobre as emissões respiratórias de CO2 das folhas e do caule de Eucalyptus globulus com 6 e 11 anos de idade sob clima Mediterrâneo na região central de Portugal. Os resultados do experimento de campo realizado no Brasil mostraram que a biomassa do caule representa o principal pool de carbono no sistema florestal (média de 68% do estoque total), seguido pelo solo (média de 30%) enquanto que os pools mais lábeis de carbono, como a biomassa das folhas, raízes e a serrapilheira representam uma menor proporção do estoque total de carbono (média de 2%). O teor de argila e o conteúdo gravimétrico de água no solo foram positivamente relacionados com as variações observadas no estoque de carbono no solo e na biomassa de folhas e do caule. O acúmulo de carbono no solo não foi associado com a produção e composição química de serrapilheira. Por outro lado, as variações observadas no estoque de carbono nas frações do solo (carbono associado a minerais e carbono orgânico particulado) foram significativamente associadas com as características do solo, principalmente o teor de argila e a concentração de cobre; e com a composição química das raízes. As relações observadas entre as características do solo e das raízes com as frações de carbono associado a minerais e de carbono orgânico particulado parecem estar associadas com a função dessas variáveis sobre os processos de decomposição e estabilização da matéria orgânica no solo. Os resultados do experimento de campo conduzido em Portugal evidenciaram que a medida que as árvores tornam-se maiores e mais velhas ocorre um aumento nas perdas respiratórias de CO2 das folhas e do caule. Entretanto, o acentuado aumento observado nas emissões respiratórias nas árvores mais velhas (11 anos) ocorreu apenas durante o outono, sendo associado com a recuperação do status hídrico da planta após um período de déficit hídrico durante o verão. O aumento na respiração foliar e do caule nas árvores mais velhas após a recuperação do turgor celular durante o outono parece estar relacionado com o aumento na energia requerida para os processos de manutenção celular mais do que aos processos de respiração de crescimento. Os resultados deste estudo indicaram que em sistemas florestais manejados, o caule das árvores representa o principal pool de carbono e que as perdas de carbono através das emissões respiratórias de CO2 tornam-se mais acentuadas nas árvores mais velhas, apenas em condições ambientais favoráveis ao ganho de carbono, tais como no outono, sendo influenciadas pelo turgor celular. Por outro lado, o acúmulo de carbono no solo parece estar relacionado com a relação entre as características intrínsecas do solo, sobretudo a granulometria, e a composição química das raízes, sobre os processos de estabilização da matéria orgânica no solo do que em relação à quantidade de serrapilheira depositada no solo. / The continuous increase in the concentration of carbon dioxide in the atmosphere, due to the combustion of fossil fuels, changes in land use and deforestation for agriculture, is a matter of great importance due to its implications on global warming and climate change. Afforestation is seen as a solution to mitigate the increase in atmospheric CO2 concentration and may contribute to climate change mitigation through carbon sequestration in the trees’ biomass and soil. In this study we tried to assess some of the processes involving the carbon balance in forestry systems with eucalyptus. The study included field work to quantify the carbon stocks in the components forest system with trees of Eucalyptus saligna in the South of Brazil and the investigation of the effect of seasonal and ontogenetic variations on CO2 respiratory emissions from the leaves and stem of Eucalyptus globulus under the Mediterranean climate in central Portugal. The results of the Brazilian experiment showed that the stem biomass is the main pool of carbon in the forestry system (average 68% of total stock), followed by soil (30%) while the more labile carbon pools, such as leaf and root biomass and litter mass represent a smaller proportion of total carbon stock (2%). Clay and gravimetric water contents in the soil were associated with the observed variations in carbon storage in the soil and in the leaf and stem biomass. The accumulation of soil carbon was not directly associated with the production and chemical composition of the litter. However, the observed variations in carbon stock in the soil fractions (particulate and mineral organic carbon) were significantly associated with soil characteristics, especially the clay content, the concentration of copper and the chemical composition of roots. The observed relationships between soil characteristics and root fractions with the mineral and particulate organic carbon fractions seem to be associated with the function of the variables, cited above, on the processes of decomposition and stabilization of organic matter in soil. The results of the field experiment conducted in Portugal revealed that as the trees become larger and older, there is an increase in CO2 respiratory losses from leaves and stems. However, the marked increase in respiratory emissions observed in the older trees occurred only during the autumn, being associated with the recovery of plant water status after a period of drought during the summer. The increase in leaf and stem respiration of older trees after the recovery of cell turgor during the autumn seem to be related to increased energy costs in the processes of cellular maintenance rather than on growth respiration. The results of this study indicated that in managed forestry systems, the tree stem represents the major pool of carbon and carbon losses through the CO2 respiratory emissions become more pronounced in older trees, only under conditions favorable for carbon gain, such as in the autumn, being influenced by cell turgor. Moreover, the accumulation of carbon in the soil seems to be more related to the relationship between the intrinsic characteristics of the soil, particularly grain size and chemical composition of roots on the processes of stabilization of organic matter in the soil rather than the amount of litter deposited in soil.

Os isoprenóides são compostos essenciais a todos os organismos e representam um grupo extremamente amplo estruturalmente e funcionalmente. Em plantas, mais de 30.000 compostos desta classe foram identificados até hoje. Todas as plantas produzem isoprenóides que desempenham papéis essenciais como os carotenóides, as clorofilas e as plastoquinonas (fotossíntese); ubiquinona (respiração); citocininas, brassinosteróides, giberelinas, ácido abscísico (regulação do crescimento e desenvolvimento). No entanto, a maior variedade de isoprenóides é representada pelos metabólitos secundários (óleos essenciais como eucaliptol, cineol, citronelal). Os isoprenóides possuem papel marcante nas relações da planta com o ambiente onde estão inseridas, já que medeiam as relações planta-inseto, planta-microorganismo e planta-planta. Devido ao valor comercial dos compostos isoprenóides, há grande interesse em produzi-los por bioengenharia em bactérias ou em plantas e o entendimento do papel dos genes e proteínas codificadas na rota de síntese dessas unidades básicas de formação de terpenóides é extremamente importante. Nesse trabalho, nós recuperamos, a partir da seleção dos plasmídios de clonagem pSPORT1 (Invitrogen) purificados do Projeto “Genolyptus: Rede Brasileira de Pesquisa do Genoma de Eucalyptus”, os clones selecionados e potencialmente codificadores de 1-desoxi-D-xilulose-5-fosfato redutoisomerase (DXR) e de outras enzimas atuantes nas rotas de síntese de isoprenóides, como 1-desoxi-D-xilulose 5-fosfato sintase (DXS), mevalonato difosfato descarboxilase (MDC), isopentenil difosfato isomerase 1 (IPPI1) e isopentenil difosfato isomerase 2 (IPPI2). Nos estoques de plasmídios do projeto Genolyptus, foi possível encontrar as sequências completas dos genes dxr, ippi1 e ippi2. Os genes foram analisados in silico e a sequência de ippi1 foi utilizada na modelagem molecular e dinâmica molecular para avaliação de características peculiares do folding protéico desse tipo de proteína eucariótica. Os genes foram clonados em vetores pGEX-4T (GE Healthcare) e heterologamente expressos em Escherichia coli. Foi realizada, também, uma análise transcricional comparativa dos genes selecionados pela técnica de microarranjos. / Isoprenoids are essential to all organisms and are the most structurally and functionally diverse group of plant metabolites. In plants, more than 30,000 compounds of this class were identified to date. All plants produce isoprenoids that can play essential roles as carotenoids, chlorophylls and plastoquinone (photosynthesis); ubiquinone (respiration); regulation of growth and development (cytokinins, brassinosteroids, gibberellins, abscisic acid). However, the majority of isoprenoids is represented by secondary metabolites (essential oils like eucaliptol, cineol, citronelal). Isoprenoids have important roles in the relationships between plants and the environment, since they can mediate plant-insect, plant-microorganism and plant-plant interactions, as well as participate in abiotic stress responses. Due to the high value of isoprenoid compounds, there is great interest in producing them by bioengineering in bacteria or plants. Understanding the role of genes and proteins related to the biosynthetic pathway of isoprenoids is extremely important. In this work, we retrieved, from the collection of cloning plasmids pSPORT1 (Invitrogen) generated in the “Genolyptus Project: The Brazilian Research Network on the Eucalytpus Genome”, selected clones that potentially codified the 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate reductoisomerase (DXR) and other enzymes from the isoprenoid biosynthetic pathway including 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase (DXS), mevalonate disphosphate decarboxilase (MDC), isopentenil disphosphate isomerase 1 (IPPI1) and isopentenil disphosphate isomerase 2 (IPPI2). Complete sequences of the dxr, ippi1 and ippi2 genes were succesfully recovered from the Genolyptus stocks. The genes were analyzed in silico and the ippi1 sequence was used in studies of molecular modeling and molecular dynamics in order to evaluate specific folding characteristics of this kind of eukaryotic IPPI. The genes were cloned into pGEX-4T vectors (GE Healthcare) and expressed in Escherichia coli. Also, the transcriptional analysis of the selected genes was performed by microarray analysis.

As proteínas-cinases ativadas por mitógenos (MAPKs) participam de rotas de transdução de sinais universais em eucariotos e compõem cascatas de fosforilação que levam as células a responder a estímulos extracelulares. Em plantas, MAPKs estão associadas a processos de desenvolvimento e na reposta a hormônios e a estresses bióticos e abióticos. Em trabalhos anteriores de nosso grupo, o gene Egmpk5 de Eucalyptus grandis foi clonado e seu padrão de expressão foi caracterizado em plantas submetidas a diferentes tratamentos. Ainda, plantas de Nicotiana tabacum SR1 foram transformadas com Egmpk5 sob regulação do promotor CaMV 35S para futuro estudo de função do gene. No presente trabalho, foi avaliada mais amplamente a estrutura, a expressão e o produto deste gene. Análises in silico revelaram que Egmpk5 apresenta-se como cópia única no genoma, está organizado em seis éxons e seus cinco íntrons possuem sítios canônicos de splicing de RNA. O produto deduzido deste gene apresenta em sua sequência a assinatura do domínio proteína-cinase e os motivos de ligação a ATP e de ativação/dupla fosforilação, indicando a possibilidade de ser uma proteína funcional. Árvore filogenética foi construída pelo método de Máxima Verossimilhança utilizando o algoritmo MUSCLE para alinhamento das sequências e um valor de bootstrap de 500 repetições com sequências peptídicas similares à proteína deduzida EgMPK5 e permitiu a identificação de MAPKs de outras plantas com função já comprovada na sinalização da divisão celular e na resposta a estresses abióticos, ferimento e patógenos. Análise de RT-qPCR mostrou a expressão de Egmpk5 em níveis comparáveis em raízes, caules e folhas de plantas de E. grandis tratadas com água, e foi detectado um aumento de sua expressão em folhas tratadas com ácido abscísico (ABA) e em todos os órgãos tratados com solução de cloreto de sódio a 200 mM. O estudo da região promotora de Egmpk5 revelou um grupo de possíveis elementos de ação cis relacionados a respostas a estresses. Seis linhagens transformadas de tabaco que tiveram seu estado transgênico confirmado por PCR foram desafiadas com tratamentos de seca e cloreto de sódio, e linhagens mais tolerantes foram identificadas. Ao final destas diversas análises, os resultados obtidos sugerem a participação de Egmpk5 em respostas a estresses abióticos. / Mitogen-activated protein kinases (MAPKs) are part of phosphorylation cascades found in all eukaryotes and are responsible for transducing extracellular stimuli into intracellular responses. In plants, MAPK cascades are involved in growth and development processes and have roles in the response to hormones and biotic and abiotic stresses. In our previous studies, the Egmpk5 gene from Eucalyptus grandis was cloned and its expression profile was characterized in plants subjected to different treatments. Also, Nicotiana tabacum SR1 plants were transformed with Egmpk5 under the control of the CaMV 35S promoter for further function studies. In the present study the structure, expression profiles and product of this gene were further characterized. In silico analyses revealed that the Egmpk5 gene is present as a single copy in the E. grandis genome, and that its structure comprises six exons and five introns with conserved sites for transcript splicing. The deduced product of this gene presents the protein kinase domain signature, ATP-binding site and activation/dual phosphorylation motifs in its structure. A phylogenetic tree was built with sequences similar to the deduced EgMPK5 peptide and lead to the identification of plant MAPKs that have had proven activity in cell division signaling and in the response to abiotic stresses, wounding and pathogens. RT-qPCR analysis showed equal expression of Egmpk5 in roots, stems and leaves of plants treated with water and we detected an increase of expression in leaves treated with abscisic acid (ABA) and also increase in expression in all three organs upon treatment with 200 mM sodium chloride. Analysis of the promoter region of Egmpk5 revealed a group of putative cis-acting elements related to stress responses. Six transformed tobacco lines were confirmed by PCR and were assayed with drought and sodium chloride treatments for the identification of more tolerant individuals. After all analyses performed, results allowed us to suggest that Egmpk5 is involved in abiotic stresses responses.

A indústria de base florestal é estratégica para o Brasil devido ao seu perfil fortemente exportador. O setor responde pela segunda posição na balança comercial do agronegócio brasileiro, ficando atrás somente da soja em grão. Atualmente, a área ocupada com florestas de eucaliptos no Brasil atinge 1,9 milhões de ha. Diante da importância sócio-econômica que a silvicultura desempenha no mercado brasileiro e do aumento progressivo das áreas plantadas com florestas de Eucalyptus, o grande desafio para o melhoramento do eucalipto está na integração da biotecnologia mais avançada ao seu cultivo, o que compreende a identificação de genes controladores das características de importância econômica e ambiental e a transferência destes genes entre árvores por meio de cruzamentos controlados ou modificação direcionada. Portanto, os objetivos deste estudo foram apresentados em 3 capítulos distintos: I - a identificação de genes expressos em flores de E. grandis em processo de antese; II - o estudo mais refinado de mineração e identificação de genes potencialmente codificadores de fatores de transcrição presentes no genoma de E. grandis; e III - seleção de 50 genes cujas expressões mostraram-se constitutivas entre folhas e xilemas de E. grandis e xilema de E. globulus, pela técnica de hibridização de microarranjos de DNA. No capítulo I é apresentada uma breve fundamentação teórica sobre as flores de E. grandis e a importância do estudo da expressão gênica e da identificação de genes envolvidos em determinados processos metabólicos e fisiológicos das plantas. Nos resultados, apresentados juntamente com a discussão, estão apresentados o conjunto de transcritos identificados e a anotação dos mesmos conforme as bibliotecas geradas. As sequências de genes expressos estão fundamentalmente envolvidas na manutenção do órgão, na senescência e em respostas a estímulos ambientais. Também são mostrados resultados obtidos por RT-qPCR para genes selecionados a partir das anotações cujo perfil de transcrição foi avaliado para as partes da flor, folha e xilema. Ao final do capítulo, é feita uma breve descrição da metodologia e das conclusões referente a este estudo. A partir dos dados anotados dos genes expressos nas bibliotecas de flores e botões florais descritos no primeiro capítulo, foram encontradas algumas famílias de fatores de transcrição, dentre elas, a família Dof, encontrada nas bibliotecas de carpelos/receptáculos florais. Assim, um segundo capítulo foi redigido na forma de manuscrito de artigo científico a ser submetido ao periódico BMC Plant Biology, em língua inglesa. Após a fundamentação teórica sobre os fatores Dof em plantas, foram apresentados os resultados obtidos de um estudo mais refinado de mineração e identificação de genes potencialmente codificadores destes fatores de transcrição presentes no genoma de E. grandis. Posteriormente, uma quantificação dos níveis de mRNA para alguns dos genes Dof de E. grandis a partir da técnica de RT-qPCR foi realizada. A análise foi realizada para órgãos diferentes da planta e em plântulas submetidas a estresses abióticos e sinalização por reguladores de crescimento vegetais. Os resultados e a discussão deste capítulo também são mostrados em uma única sessão, assim como a descrição da metodologia e as conclusões sobre esta etapa. O terceiro e último capítulo, também apresentado na forma de manuscrito de artigo científico a ser submetido ao periódico BMC Plant Biology, em língua inglesa, é composto de um estudo paralelo aos temas citados acima, realizado a partir da seleção de 50 genes cujas expressões mostraram-se constitutivas entre folhas e xilemas de E. grandis e xilema de E. globulus, pela técnica de hibridização de microarranjos de DNA. Dos 50 genes selecionados e anotados, oito foram selecionados para a validação por RT-qPCR em seis espécies de Eucalyptus e em três órgãos diferentes (flor, folha e xilema). As expressões destes genes candidatos foram comparadas àquelas de sete genes normalizadores tradicionais, usados frequentemente em estudos de avaliação da expressão gênica em plantas. Como nos demais capítulos, as conclusões referentes a este estudo, bem como a metodologia empregada, são apresentadas ao final do capítulo. Na parte final desta tese, constam as conclusões gerais sobre a totalidade do trabalho conduzido. / The forest industry is strategic to Brazil due to its strong export profile. The sector accounts for the second position in the trade brazilian agribusiness balance. Currently, the area planted with Eucalyptus forests in Brazil reached 1.9 million/ha. Given the socioeconomic importance that forestry plays in the brazilian market and the gradual increase in areas planted with Eucalyptus forest, the great challenge for the Eucalyptus breeding is the integration of advanced biotechnology to cultivation, which includes the identification of economic importance genes controlling environmental effects and transfer of genes between trees through intersections controlled or directed modification. The objectives of this study were presented in three distinct chapters: I - the identification of expressed genes in E. grandis flowers in the anthesis process; II – more refined study, mining and identification of genes potentially encoding transcription factors present in the E. grandis genome and III - selection of 50 genes whose expressions were shown to be constitutive in E. grandis xylem and leaves and E. globulus xylem, by DNA microarray hybridization tecnique. In Chapter I, we present a brief theoretical background on the E. grandis flowers and the importance of studying gene expression and identifying genes involved in metabolic and physiological processes of plants. The results, presented transcripts sets identified and annotation the libraries generated. The sequences of expressed genes are mainly involved in organ maintaining, senescence and in responses to environmental stimuli. Also shown are results obtained by RT-qPCR for selected genes from the notes whose transcription profile was assessed for part of the flower, leaf and xylem. At the end of the chapter is a brief description of the methodology and conclusions about this study. From the data recorded in the libraries of genes expressed in flowers and flower buds described in the first chapter, we found some families of transcription factors, among them, the Dof family, found in the libraries of carpel/floral receptacles. Thus, a second chapter was drafted as a manuscript of a scientific paper to be submitted to the journal BMC Plant Biology. After the theoretical DOF on the factors in plants, we presented the results of a more refined mining and identification of genes potentially encoding these transcription factors present in the E. grandis genome. Subsequently, a quantification of mRNA levels for some of E. grandis Dof genes from the RT-qPCR was performed. The analysis was performed for different plant organs and in seedlings subjected to abiotic stress signaling and plant growth regulators. The results and discussion of this chapter are also shown in a single session, as well as a description of the methodology and conclusions about this step. The third and final chapter, also presented as a manuscript of a scientific paper to be submitted to the journal BMC Plant Biology, is composed of a parallel study to the subjects mentioned above, performed by the selection of 50 genes whose expression showed is constitutive of E. grandis leaves and xylem and E.globulus xylem, by the DNA microarray hybridization tecnique. Of the 50 selected genes and annoted, eight were selected for validation by RT-qPCR in six Eucalyptus species and three different organs (flower, leaf and xylem). The expression of these candidate genes were compared to those of traditional standard-seven genes, often used in evaluation studies of gene expression in plants. As in other chapters, the findings of this study and the methodology employed, are included at the end of the chapter. In the final part of this thesis, contains the general conclusions about the totality of the work conducted.

O continuo aumento na concentração de dióxido de carbono na atmosfera, resultado da combustão de combustíveis fósseis, de mudanças no uso do solo e do desmatamento para a agricultura, é um assunto de grande importância devido a suas implicações no aquecimento global e nas mudanças climáticas. O florestamento é visto como uma solução para frear o aumento na concentração de CO2 atmosférico, podendo contribuir na mitigação das mudanças climáticas através do seqüestro de carbono na biomassa das árvores e no solo. O presente estudo teve como objetivo avaliar alguns dos processos que envolvem o estoque e a dinâmica do carbono em sistemas florestais manejados com eucalipto. O estudo abrangeu trabalhos de campo para quantificar o estoque de carbono nos componentes do sistema florestal com árvores de Eucalyptus saligna com três anos de idade na região Sul do Brasil e a investigação do efeito de variações sazonais e ontogenéticas sobre as emissões respiratórias de CO2 das folhas e do caule de Eucalyptus globulus com 6 e 11 anos de idade sob clima Mediterrâneo na região central de Portugal. Os resultados do experimento de campo realizado no Brasil mostraram que a biomassa do caule representa o principal pool de carbono no sistema florestal (média de 68% do estoque total), seguido pelo solo (média de 30%) enquanto que os pools mais lábeis de carbono, como a biomassa das folhas, raízes e a serrapilheira representam uma menor proporção do estoque total de carbono (média de 2%). O teor de argila e o conteúdo gravimétrico de água no solo foram positivamente relacionados com as variações observadas no estoque de carbono no solo e na biomassa de folhas e do caule. O acúmulo de carbono no solo não foi associado com a produção e composição química de serrapilheira. Por outro lado, as variações observadas no estoque de carbono nas frações do solo (carbono associado a minerais e carbono orgânico particulado) foram significativamente associadas com as características do solo, principalmente o teor de argila e a concentração de cobre; e com a composição química das raízes. As relações observadas entre as características do solo e das raízes com as frações de carbono associado a minerais e de carbono orgânico particulado parecem estar associadas com a função dessas variáveis sobre os processos de decomposição e estabilização da matéria orgânica no solo. Os resultados do experimento de campo conduzido em Portugal evidenciaram que a medida que as árvores tornam-se maiores e mais velhas ocorre um aumento nas perdas respiratórias de CO2 das folhas e do caule. Entretanto, o acentuado aumento observado nas emissões respiratórias nas árvores mais velhas (11 anos) ocorreu apenas durante o outono, sendo associado com a recuperação do status hídrico da planta após um período de déficit hídrico durante o verão. O aumento na respiração foliar e do caule nas árvores mais velhas após a recuperação do turgor celular durante o outono parece estar relacionado com o aumento na energia requerida para os processos de manutenção celular mais do que aos processos de respiração de crescimento. Os resultados deste estudo indicaram que em sistemas florestais manejados, o caule das árvores representa o principal pool de carbono e que as perdas de carbono através das emissões respiratórias de CO2 tornam-se mais acentuadas nas árvores mais velhas, apenas em condições ambientais favoráveis ao ganho de carbono, tais como no outono, sendo influenciadas pelo turgor celular. Por outro lado, o acúmulo de carbono no solo parece estar relacionado com a relação entre as características intrínsecas do solo, sobretudo a granulometria, e a composição química das raízes, sobre os processos de estabilização da matéria orgânica no solo do que em relação à quantidade de serrapilheira depositada no solo. / The continuous increase in the concentration of carbon dioxide in the atmosphere, due to the combustion of fossil fuels, changes in land use and deforestation for agriculture, is a matter of great importance due to its implications on global warming and climate change. Afforestation is seen as a solution to mitigate the increase in atmospheric CO2 concentration and may contribute to climate change mitigation through carbon sequestration in the trees’ biomass and soil. In this study we tried to assess some of the processes involving the carbon balance in forestry systems with eucalyptus. The study included field work to quantify the carbon stocks in the components forest system with trees of Eucalyptus saligna in the South of Brazil and the investigation of the effect of seasonal and ontogenetic variations on CO2 respiratory emissions from the leaves and stem of Eucalyptus globulus under the Mediterranean climate in central Portugal. The results of the Brazilian experiment showed that the stem biomass is the main pool of carbon in the forestry system (average 68% of total stock), followed by soil (30%) while the more labile carbon pools, such as leaf and root biomass and litter mass represent a smaller proportion of total carbon stock (2%). Clay and gravimetric water contents in the soil were associated with the observed variations in carbon storage in the soil and in the leaf and stem biomass. The accumulation of soil carbon was not directly associated with the production and chemical composition of the litter. However, the observed variations in carbon stock in the soil fractions (particulate and mineral organic carbon) were significantly associated with soil characteristics, especially the clay content, the concentration of copper and the chemical composition of roots. The observed relationships between soil characteristics and root fractions with the mineral and particulate organic carbon fractions seem to be associated with the function of the variables, cited above, on the processes of decomposition and stabilization of organic matter in soil. The results of the field experiment conducted in Portugal revealed that as the trees become larger and older, there is an increase in CO2 respiratory losses from leaves and stems. However, the marked increase in respiratory emissions observed in the older trees occurred only during the autumn, being associated with the recovery of plant water status after a period of drought during the summer. The increase in leaf and stem respiration of older trees after the recovery of cell turgor during the autumn seem to be related to increased energy costs in the processes of cellular maintenance rather than on growth respiration. The results of this study indicated that in managed forestry systems, the tree stem represents the major pool of carbon and carbon losses through the CO2 respiratory emissions become more pronounced in older trees, only under conditions favorable for carbon gain, such as in the autumn, being influenced by cell turgor. Moreover, the accumulation of carbon in the soil seems to be more related to the relationship between the intrinsic characteristics of the soil, particularly grain size and chemical composition of roots on the processes of stabilization of organic matter in the soil rather than the amount of litter deposited in soil.

A indústria de base florestal é estratégica para o Brasil devido ao seu perfil fortemente exportador. O setor responde pela segunda posição na balança comercial do agronegócio brasileiro, ficando atrás somente da soja em grão. Atualmente, a área ocupada com florestas de eucaliptos no Brasil atinge 1,9 milhões de ha. Diante da importância sócio-econômica que a silvicultura desempenha no mercado brasileiro e do aumento progressivo das áreas plantadas com florestas de Eucalyptus, o grande desafio para o melhoramento do eucalipto está na integração da biotecnologia mais avançada ao seu cultivo, o que compreende a identificação de genes controladores das características de importância econômica e ambiental e a transferência destes genes entre árvores por meio de cruzamentos controlados ou modificação direcionada. Portanto, os objetivos deste estudo foram apresentados em 3 capítulos distintos: I - a identificação de genes expressos em flores de E. grandis em processo de antese; II - o estudo mais refinado de mineração e identificação de genes potencialmente codificadores de fatores de transcrição presentes no genoma de E. grandis; e III - seleção de 50 genes cujas expressões mostraram-se constitutivas entre folhas e xilemas de E. grandis e xilema de E. globulus, pela técnica de hibridização de microarranjos de DNA. No capítulo I é apresentada uma breve fundamentação teórica sobre as flores de E. grandis e a importância do estudo da expressão gênica e da identificação de genes envolvidos em determinados processos metabólicos e fisiológicos das plantas. Nos resultados, apresentados juntamente com a discussão, estão apresentados o conjunto de transcritos identificados e a anotação dos mesmos conforme as bibliotecas geradas. As sequências de genes expressos estão fundamentalmente envolvidas na manutenção do órgão, na senescência e em respostas a estímulos ambientais. Também são mostrados resultados obtidos por RT-qPCR para genes selecionados a partir das anotações cujo perfil de transcrição foi avaliado para as partes da flor, folha e xilema. Ao final do capítulo, é feita uma breve descrição da metodologia e das conclusões referente a este estudo. A partir dos dados anotados dos genes expressos nas bibliotecas de flores e botões florais descritos no primeiro capítulo, foram encontradas algumas famílias de fatores de transcrição, dentre elas, a família Dof, encontrada nas bibliotecas de carpelos/receptáculos florais. Assim, um segundo capítulo foi redigido na forma de manuscrito de artigo científico a ser submetido ao periódico BMC Plant Biology, em língua inglesa. Após a fundamentação teórica sobre os fatores Dof em plantas, foram apresentados os resultados obtidos de um estudo mais refinado de mineração e identificação de genes potencialmente codificadores destes fatores de transcrição presentes no genoma de E. grandis. Posteriormente, uma quantificação dos níveis de mRNA para alguns dos genes Dof de E. grandis a partir da técnica de RT-qPCR foi realizada. A análise foi realizada para órgãos diferentes da planta e em plântulas submetidas a estresses abióticos e sinalização por reguladores de crescimento vegetais. Os resultados e a discussão deste capítulo também são mostrados em uma única sessão, assim como a descrição da metodologia e as conclusões sobre esta etapa. O terceiro e último capítulo, também apresentado na forma de manuscrito de artigo científico a ser submetido ao periódico BMC Plant Biology, em língua inglesa, é composto de um estudo paralelo aos temas citados acima, realizado a partir da seleção de 50 genes cujas expressões mostraram-se constitutivas entre folhas e xilemas de E. grandis e xilema de E. globulus, pela técnica de hibridização de microarranjos de DNA. Dos 50 genes selecionados e anotados, oito foram selecionados para a validação por RT-qPCR em seis espécies de Eucalyptus e em três órgãos diferentes (flor, folha e xilema). As expressões destes genes candidatos foram comparadas àquelas de sete genes normalizadores tradicionais, usados frequentemente em estudos de avaliação da expressão gênica em plantas. Como nos demais capítulos, as conclusões referentes a este estudo, bem como a metodologia empregada, são apresentadas ao final do capítulo. Na parte final desta tese, constam as conclusões gerais sobre a totalidade do trabalho conduzido. / The forest industry is strategic to Brazil due to its strong export profile. The sector accounts for the second position in the trade brazilian agribusiness balance. Currently, the area planted with Eucalyptus forests in Brazil reached 1.9 million/ha. Given the socioeconomic importance that forestry plays in the brazilian market and the gradual increase in areas planted with Eucalyptus forest, the great challenge for the Eucalyptus breeding is the integration of advanced biotechnology to cultivation, which includes the identification of economic importance genes controlling environmental effects and transfer of genes between trees through intersections controlled or directed modification. The objectives of this study were presented in three distinct chapters: I - the identification of expressed genes in E. grandis flowers in the anthesis process; II – more refined study, mining and identification of genes potentially encoding transcription factors present in the E. grandis genome and III - selection of 50 genes whose expressions were shown to be constitutive in E. grandis xylem and leaves and E. globulus xylem, by DNA microarray hybridization tecnique. In Chapter I, we present a brief theoretical background on the E. grandis flowers and the importance of studying gene expression and identifying genes involved in metabolic and physiological processes of plants. The results, presented transcripts sets identified and annotation the libraries generated. The sequences of expressed genes are mainly involved in organ maintaining, senescence and in responses to environmental stimuli. Also shown are results obtained by RT-qPCR for selected genes from the notes whose transcription profile was assessed for part of the flower, leaf and xylem. At the end of the chapter is a brief description of the methodology and conclusions about this study. From the data recorded in the libraries of genes expressed in flowers and flower buds described in the first chapter, we found some families of transcription factors, among them, the Dof family, found in the libraries of carpel/floral receptacles. Thus, a second chapter was drafted as a manuscript of a scientific paper to be submitted to the journal BMC Plant Biology. After the theoretical DOF on the factors in plants, we presented the results of a more refined mining and identification of genes potentially encoding these transcription factors present in the E. grandis genome. Subsequently, a quantification of mRNA levels for some of E. grandis Dof genes from the RT-qPCR was performed. The analysis was performed for different plant organs and in seedlings subjected to abiotic stress signaling and plant growth regulators. The results and discussion of this chapter are also shown in a single session, as well as a description of the methodology and conclusions about this step. The third and final chapter, also presented as a manuscript of a scientific paper to be submitted to the journal BMC Plant Biology, is composed of a parallel study to the subjects mentioned above, performed by the selection of 50 genes whose expression showed is constitutive of E. grandis leaves and xylem and E.globulus xylem, by the DNA microarray hybridization tecnique. Of the 50 selected genes and annoted, eight were selected for validation by RT-qPCR in six Eucalyptus species and three different organs (flower, leaf and xylem). The expression of these candidate genes were compared to those of traditional standard-seven genes, often used in evaluation studies of gene expression in plants. As in other chapters, the findings of this study and the methodology employed, are included at the end of the chapter. In the final part of this thesis, contains the general conclusions about the totality of the work conducted.

Os isoprenóides são compostos essenciais a todos os organismos e representam um grupo extremamente amplo estruturalmente e funcionalmente. Em plantas, mais de 30.000 compostos desta classe foram identificados até hoje. Todas as plantas produzem isoprenóides que desempenham papéis essenciais como os carotenóides, as clorofilas e as plastoquinonas (fotossíntese); ubiquinona (respiração); citocininas, brassinosteróides, giberelinas, ácido abscísico (regulação do crescimento e desenvolvimento). No entanto, a maior variedade de isoprenóides é representada pelos metabólitos secundários (óleos essenciais como eucaliptol, cineol, citronelal). Os isoprenóides possuem papel marcante nas relações da planta com o ambiente onde estão inseridas, já que medeiam as relações planta-inseto, planta-microorganismo e planta-planta. Devido ao valor comercial dos compostos isoprenóides, há grande interesse em produzi-los por bioengenharia em bactérias ou em plantas e o entendimento do papel dos genes e proteínas codificadas na rota de síntese dessas unidades básicas de formação de terpenóides é extremamente importante. Nesse trabalho, nós recuperamos, a partir da seleção dos plasmídios de clonagem pSPORT1 (Invitrogen) purificados do Projeto “Genolyptus: Rede Brasileira de Pesquisa do Genoma de Eucalyptus”, os clones selecionados e potencialmente codificadores de 1-desoxi-D-xilulose-5-fosfato redutoisomerase (DXR) e de outras enzimas atuantes nas rotas de síntese de isoprenóides, como 1-desoxi-D-xilulose 5-fosfato sintase (DXS), mevalonato difosfato descarboxilase (MDC), isopentenil difosfato isomerase 1 (IPPI1) e isopentenil difosfato isomerase 2 (IPPI2). Nos estoques de plasmídios do projeto Genolyptus, foi possível encontrar as sequências completas dos genes dxr, ippi1 e ippi2. Os genes foram analisados in silico e a sequência de ippi1 foi utilizada na modelagem molecular e dinâmica molecular para avaliação de características peculiares do folding protéico desse tipo de proteína eucariótica. Os genes foram clonados em vetores pGEX-4T (GE Healthcare) e heterologamente expressos em Escherichia coli. Foi realizada, também, uma análise transcricional comparativa dos genes selecionados pela técnica de microarranjos. / Isoprenoids are essential to all organisms and are the most structurally and functionally diverse group of plant metabolites. In plants, more than 30,000 compounds of this class were identified to date. All plants produce isoprenoids that can play essential roles as carotenoids, chlorophylls and plastoquinone (photosynthesis); ubiquinone (respiration); regulation of growth and development (cytokinins, brassinosteroids, gibberellins, abscisic acid). However, the majority of isoprenoids is represented by secondary metabolites (essential oils like eucaliptol, cineol, citronelal). Isoprenoids have important roles in the relationships between plants and the environment, since they can mediate plant-insect, plant-microorganism and plant-plant interactions, as well as participate in abiotic stress responses. Due to the high value of isoprenoid compounds, there is great interest in producing them by bioengineering in bacteria or plants. Understanding the role of genes and proteins related to the biosynthetic pathway of isoprenoids is extremely important. In this work, we retrieved, from the collection of cloning plasmids pSPORT1 (Invitrogen) generated in the “Genolyptus Project: The Brazilian Research Network on the Eucalytpus Genome”, selected clones that potentially codified the 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate reductoisomerase (DXR) and other enzymes from the isoprenoid biosynthetic pathway including 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase (DXS), mevalonate disphosphate decarboxilase (MDC), isopentenil disphosphate isomerase 1 (IPPI1) and isopentenil disphosphate isomerase 2 (IPPI2). Complete sequences of the dxr, ippi1 and ippi2 genes were succesfully recovered from the Genolyptus stocks. The genes were analyzed in silico and the ippi1 sequence was used in studies of molecular modeling and molecular dynamics in order to evaluate specific folding characteristics of this kind of eukaryotic IPPI. The genes were cloned into pGEX-4T vectors (GE Healthcare) and expressed in Escherichia coli. Also, the transcriptional analysis of the selected genes was performed by microarray analysis.