Le but de la recherche menée dans le cadre de cette thèse est de développer et d’appliquer de nouveaux outils de modifications chromosomiques ciblées et d’évolution dirigée in vivo chez Clostridium phytofermentans, une bactérie mésophile et anaérobie qui fermente la biomasse lignocellulosique. L’introduction présente une vue d’ensemble des recherches fondamentales et appliquées dans la biologie et la génétique des Clostridia, incluant les souches pathogènes et environnementales. Une description de l’industrie des biocarburants est détaillée pour montrer les applications possibles de C. phytofermentans dans ce domaine très compétitif. Le premier chapitre présente l’utilisation de la génomique fonctionnelle et de l’inactivation de gènes cibles pour identifier des transporteurs d’hexoses chez C. phytofermentans. Le second chapitre décrit l’application de la technique Genome Editing via Targetron and Recombinases (GETR) pour effectuer de larges délétions chromosomiques chez cette bactérie. Le troisième chapitre présente l’évolution dirigée in vivo chez C. phytofermentans pour améliorer sa résistance aux inhibiteurs issus de la biomasse lignocellulosique, incluant l’analyse des variations transcriptomique et génomiques des souches résistantes. Dans son ensemble, ce travail de thèse souligne les avantages et limites de l’approche ciblé ou de l’approche par évolution in vivo, pour étudier et modifier les Clostridia. / The research aim of this thesis project was to develop and apply new tools for targeted chromosomal changes and in vivo directed evolution of Clostridium phytofermentans, a mesophilic anaerobe that ferments lignocellulosic biomass. The introduction presents an overview of previous basic and applied research in Clostridia biology and genetics, including both pathogenic and environmental strains. A focus on the biofuel industry is reported to describe applications of C. phytofermentans in this competitive industry. Chapter one presents a study using functional genomics and targeted gene inactivation to identify hexose sugar transporters in C. phytofermentans. Chapter two describes the application of Genome Editing via Targetron and Recombinases (GETR) to make large-scale chromosomal deletions in this bacterium. Chapter 3 presents the in vivo directed evolution of C. phytofermentans to enhance its resistance to lignocellulosic inhibitors including analyses of genome-wide transcription patterns and genomic variants that arose in the resistant strains. Together, this thesis work highlights the advantages and limitations of both targeted and evolutional approaches to study and engineer Clostridia.

De nombreuses méthodes in vitro d’évolution d'enzymes existent mais elles sont souvent coûteuses en temps et en main d'œuvre. Une approche alternative, l’évolution dirigée in vivo, permet la sélection de variantes d'enzymes améliorées ou modifiées à moindre coût et peut être appliquée à des enzymes de structure inconnue. Des dispositifs automatisés de culture continue (GM3), ont été développés et construits au Genoscope. Le GM3 a été conçu pour maintenir indéfiniment des cultures bactériennes en suspension tout en les soumettant à des régimes de culture sélectifs de type turbidostat et chémostat. Le principal objectif du présent travail était l’optimisation par évolution dirigée in vivo d’enzymes de la famille des dioxygénases à α-cétoglutarate et fer-dépendantes (α-KAO). Les α-KAOs catalysent l'hydroxylation d’un atome de carbone non substitué et sont donc d’intéressants outils pour la fonctionnalisation de molécules en synthèse organique. La dynamique de fixation d’une mutation bénéfique dans une population en croissance en fonction du régime de culture et du format d’expression a été étudiée. Des souches d’Escherichia coli ont été génétiquement modifiées pour que leur croissance dépende strictement d’une activité α-KAO. Des populations de ces bactéries exprimant une α-KAO ont été soumises à des protocoles d’évolution dirigée in vivo pour sélectionner: dans un premier temps, des variants d’expression optimisée sur le substrat naturel de l’enzyme, dans un second temps, des variants utilisant des analogues de substrat non naturels. Deux variantes de la L-isoleucine dioxygénase (E65K, A62P) ont été obtenues. L’étude des paramètres cinétiques déterminera l’effet de ces mutations sur l’activité de l’enzyme. En collaboration avec l’équipe du Dr. Tolonen, la culture continue a été appliquée à l’évolution de la bactérie cellulolytique Clostridium phytofermentans. Cette bactérie anaérobie stricte qui dégrade la lignocellulose en éthanol et H2 présente un intérêt applicatif pour la valorisation de la biomasse. La dégradation de la lignocellulose libère des composés phénoliques, en particulier l’acide férulique. C. phytofermentans a été adapté à résister à des concentrations croissantes de ce composé inhibiteur. Des isolats résistant au ferulate ont été analysés et leur génomes séquencés (Cerisy et al., 2017). / Numerous methods of directed evolution in vitro have been developed. These methods are often expensive and time-consuming. An alternative approach, directed evolution in vivo, allows the selection of protein variants at lower cost and does not require prior knowledge of the protein’s structure and mechanism. An automated continuous culture device, the GM3, has been developed and built at the Genoscope. The GM3 technology enables the maintenance of steady-state microbial growth over an extended period of time.The main objective of the present study was the optimization by directed evolution in vivo of enzymes of the family of the Iron(II)/α-ketoacid-dependent oxygenases (α-KAOs). The α-KAOs catalyze the hydroxylation of non-activated C-H bonds and thus are interesting tools for the functionalization of organic molecules in synthetic chemistry.The dynamics of fixation of beneficial mutations in a growing cell population depending on the expression format and the culture regime has been explored.Strains of Escherichia coli have been genetically modified such that their growth strictly depended on a α-KAO activity. Populations of these bacteria expressing a α-KAO were subjected to protocols of directed evolution in continuous culture in order to select, in a first round, variants showing optimized expression on natural substrates of the enzyme, and in a second round, variants with activity towards non-natural analogs of the substrate. Two variants of L-isoleucine dioxygenase (E65K, A62P) were obtained. The determination of the kinetic parameters will reveal the influence of these mutations on the activity of the enzyme variants.In collaboration with the group of Dr. Tolonen, directed evolution in continuous culture was applied to the cellulolytic bacteria Clostridium phytofermentans. This anaerobic bacterium degrades lignocellulose into ethanol and H2 and can thus be applied for biomass valorization. The degradation of lignocellulose liberates phenolic compounds like ferulic acid known to be toxic to the bacteria. C. phytofermentans was adapted in the GM3 to resist to growing concentrations of this inhibitor. Resistant bacteria were analyzed and their genomes sequenced (Cerisy et al., 2017).

Les DD-peptidases sont des enzymes impliquées dans la synthèse de la paroi bactérienne. Elles sont aussi appelées "Penicillin Binding Proteins" (PBPs) car elles forment des acyl-enzymes stables avec des antibiotiques de type beta-lactames comme la pénicilline, la stabilité de ces complexes étant à l'origine de l'effet antibiotique. Certaines bactéries sont résistantes aux b-lactames grâce à la production de beta-lactamases, capables d'hydrolyser ces antibiotiques jusqu'à 10E8 fois plus rapidement que les PBPs selon un mécanisme impliquant deux étapes, d'acylation puis de désacylation. Il est généralement accepté que les beta-lactamases ont évolué à partir d'une PBP ancestrale en intégrant au site actif un mécanisme catalytique efficace pour la réaction de déacylation. L'objectif de cette thèse s'inscrit dans la compréhension des mécanismes d'évolution de la catalyse enzymatique au niveau moléculaire. Nous tenterons de reproduire un mécanisme évolutif en créant in vitro une activité b-lactamase à partir d'une DD-peptidase. La protéine de départ pour ce travail est la PBP-A de Thermosynechococcus elongatus, appartenant à une nouvelle famille de PBPs homologue aux beta-lactamases de classe A. L'analyse biochimique de cette protéine suggère que c'est une DD-peptidase, et une approche rationnelle par substitution d'un résidu dans le site actif de PBP-A a permis d'augmenter la vitesse de désacylation de l'acyl-enzyme formé avec la pénicilline d'un facteur 90. L'analyse des structures 3-D de PBP-A sauvage et mutante laisse ouverte la question de savoir comment évoluer cette PBP en beta-lactamase. Ainsi, pour l'évolution dirigée de cette protéine, deux banques ont été construites par approches aléatoire et semi-rationnelle. Il a été possible de sélectionner par "phage display" des enzymes améliorées pour la réaction d'acylation. L'obtention de mutants améliorés pour l'acylation ou la désacylation constitue des premiers pas vers l'évolution de PBP-A en beta-lactamase.

Les déshydrogénases sont faiblement actives en présence de fortes concentrations (> 50 % (v/v)) de liquides ioniques (LIs) miscible à l'eau et les raisons précises de cette inactivation ne sont pas connues. La structure de la formiate déshydrogénase de Candida boidinii (FDH) en présence de ces LIs miscibles à l'eau a été étudiée par atténuation de fluorescence par de l'iode ou de l'acrylamide. Une concentration critique, la CILc ("Critical Ionic Liquid concentration"), au dessus de laquelle la fluorescence n'est pas exploitable, est déterminée. Elle se situe entre 30 et 40 % (v/v) des LIs de cette étude. Les LIs s'avèrent être de forts agents dénaturants : les constantes d'atténuation de fluorescence en présence de LI sont de 1,4 à 2 fois plus importantes qu'en présence d'urée. La FDH a été modifiée chimiquement par des cations analogues aux cations des LIs afin de la préserver de l'interaction avec les LIs. Les enzymes modifiées par des cations de plus petite taille présentent une importante activité résiduelle (30-45%) en présence de 70% (v/v) de LI tandis que l'enzyme sauvage est inactive. En présence de 30% (v/v) de LI, l'efficacité catalytique (kcat/KM) des enzymes modifiées augmente de 1,3 à 3,6 fois et la constante de Michaelis (KM) diminue de 1,7 à 4,6 fois suivant le cation utilisé. Selon la taille du cation greffé, le temps de demi-vie des enzymes modifiées augmente de 3 à 5 fois en solution tamponnée. Enfin, la structure des enzymes modifiées est préservée en présence de 40% (v/v) de LI tandis que l'enzyme native commence à se dénaturer. La technique d'évolution dirigée a également été utilisée. A ce jour, 987 mutants ont été criblés. Un mutant (M60) présente une activité résiduelle de 35% à 70% (v/v) de LI tandis que l'enzyme sauvage est inactive. Ce dernier porte deux mutations, N187S et T321S, situées à la surface de la structure protéique. En présence de 30 % (v/v) de LI, le mutant 60 fixe les substrats avec des valeurs de de KMNAD et de KDN3 (N3 est l'azide, un inhibiteur compétitif du formiate) 2 fois plus faibles que celles de l'enzyme sauvage.

Les virus oncolytiques sont une nouvelle classe d’agents thérapeutiques pouvant être une alternative au traitement des cancers. Plusieurs virus oncolytiques sont actuellement développés en clinique, néanmoins de nombreuses améliorations sont à apporter afin de créer une nouvelle classe de virus plus efficaces et moins toxiques. Le premier objectif de cette thèse a été d’améliorer la spécificité tumorale du virus de la vaccine via le ciblage de l’antigène MUC1 présenté à la surface des cellules tumorales. Pour cela un virus recombinant présentant à sa surface un fragment d’anticorps (scFv) dirigé contre l’antigène tumoral MUC1 a été construit et produit. Les tests in vitro n’ont toutefois pas permis de mettre en évidence un ciblage spécifique du virus recombinant. Un deuxième aspect de cette thèse a été de tester le potentiel oncolytique de virus de la famille des Poxviridae. Durant ce travail de thèse, les capacités oncolytiques de douze poxvirus, appartenant à 8 genres différents, ont été étudiés. Leurs effets sur la prolifération de cellules cancéreuses humaines ont été évalués. Les virus caractérisés par un effet oncolytique élevé ont été, par la suite, modifiés et armés par ingénierie virale afin d’augmenter leur efficacité. La dernière partie de cette thèse a été consacrée à la génération et la sélection de virus chimériques basées sur la méthode d’évolution dirigée. Cette méthode est utilisée pour mimer le processus naturel de sélection évolutif. Appliqué à la virothérapie oncolytique, ce procédé nous a permis de générer un nouveau virus oncolytique chimérique caractérisé par un potentiel anti-cancéreux amélioré. En résumé, cette thèse a permis, par des techniques d’ingénierie virale, par un criblage de nouveaux virus et par la méthode d’évolution dirigée, de créer et de sélectionner une nouvelle génération de poxvirus oncolytiques présentant une activité thérapeutique accrue avec un profil de toxicité atténué et pouvant être utilisés dans diverses indications thérapeutiques. / Oncolytiques viruses are a new class of therpeutic agents which could be an alternative for cancer treatment. Currently, several oncolytic viruses are evaluated in clinical trial, nevertheless improvements are needed to create a new class of more efficiente and less toxic viruses. The first objective of this thesis was to improved the vaccinia virus specificity through the targeting of the tumor-associated antigen MUC1. To address this goal, a recombinant virus expressing an scFv targeting the MUC1-protein was engineered and produced. However, in vitro, the demonstration of a specific targeting by the recombinant virus was not possible. A second aspect of this thesis work was to evaluate the oncolytic potential of Poxviridae family viruses. Oncolytic capacities of twelve viruses, belonging to eight genera, were evaluated. Their impact on human cancer cells was tested. In order to increase their efficacity, viruses with the highest oncolytic capacities were then modified and armed by genetic engineering. The third part of this work was devoted to the generation of chimeric viruses based on directed evolution process. This methodology is used to mimic the natural process of evolutionary selection. Applied to oncolytic virotherapy, this technique allowed the generation of a new chimeric oncolytic virus caracterised by an enhanced antitumoral potential. In summary, this thesis has allowed, through viral engineering, poxviruses screening and directed evolution methodology, the creation and selection of a new generation of oncolytic poviruses. These viruses demonstrate an increased therpeutic activity and greatest safety profil enabling their application in several therapeutic indication.

Les virus adéno-associés (AAVs) font partie des vecteurs les plus efficaces pour le transfert de gène, en particulier dans la rétine. Ils sont utilisés aussi bien pour des études biologiques que pour la thérapie génique. Malgré cela, il reste encore des barrières qui limitent leur utilisation. Nous proposons ici d’utiliser une technique d’évolution dirigée pour surmonter ces barrières et améliorer l’efficacité des AAVs en tant que vecteurs de gènes. Dans un premier temps, nous avons créé trois librairies virales hautement diversifiées basées sur l’AAV2. Ces librairies étaient constituées de capsides modifiées aléatoirement pour leur donner de nouvelles propriétés. Nous avons ensuite réalisé deux types de sélections. D’une part, nous avons sélectionné nos librairies virales dans le système visuel de la souris pour obtenir une capside capable de transport axonal antérograde trans-synaptique afin de pouvoir étudier simultanément l’activité et la connectivité de réseaux neuronaux. Cette sélection a fortement convergée vers une capside nommée AAV2-7mD, dont la capacité de transport axonal antérograde trans-synaptique est plus efficace que les AAVs 1 et 2. D’autre part, nous avons sélectionné nos librairies virales directement sur des explants de maculas de rétine humaine afin découvrir une capside capable de traverser la membrane limitante interne de la macula humaine. Ceci a pour but d’avoir un vecteur efficace pour des traitements de thérapie génique par voie intra-vitréenne. Cette librairie a commencé à converger mais nous sommes toujours en attente du dernier cycle de sélection. Nous traitons donc dans cette thèse des résultats de deux évolutions dirigées sur l’AAV2 afin de créer des vecteurs de gènes plus performants dans le système visuel. / Adeno-associated viruses (AAVs) are among the most efficient vectors for gene transfer, particularly in the retina. They are used for asking biological questions as well as for gene therapy. Nonetheless, some barriers are still restraining their use. Here, we used a directed evolution method to overcome those barriers and improve the efficiency of AAVs for gene transfer. First, we created three highly diversified viral libraries based on AAV2. Those libraries were based on randomly modified capsids displaying new properties. Then, we did two types of selections. On one hand, we selected our libraries in the retinofugal pathway in order to obtain a capsid with enhanced axonal anterograde trans-synaptic transport capacities, so we could study simultaneously the activity and the connectivity of neuronal networks between the retina and the brain. This selection converged strongly toward a new capsid, named AAV2-7mD, with enhanced axonal anterograde trans-synaptic transport capacities compared to AAV1 and AAV2. On the other hand, we directly selected our viral libraries on human macular explants, to select capsids capable of crossing the human macular inner limiting membrane. Such a capsid would be very useful for retinal gene therapy via intravitreal injections. This library started to converge but we are still waiting to complete the last cycle of selection. In this thesis we discuss the results of these two directed evolution studies on AAV2 to create enhanced gene delivery vectors in the visual system.

Les organophosphorés (OPs) sont des composés neurotoxiques qui sont largement utilisés comme pesticides. Cette utilisation intensive a conduit à une importante pollution des sols et des effluents agricoles et sont retrouvés jusque dans les aliments. Ces pesticides sont responsables de 300 000 morts à travers le monde. Les OPs ont également été développés comme agents neurotoxiques de guerre tel que le sarin. Actuellement, il n’existe pas de méthode de décontamination externe satisfaisante pour dégrader les OPs, c’est pourquoi l’utilisation d’enzymes est une stratégie attractive. Parmi les enzymes capables de dégrader les OPs, les phosphotriestérases (PTEs) sont les plus actives mais sont peu stables ce qui limite leurs applications. Les enzymes hyperthermostables ont donc été considérées. Ainsi l’enzyme SsoPox, isolée de l’archée Sulfolobus solfataricus ayant une activité lactonase et une activité de promiscuité phosphotriestérase, a été plus particulièrement étudiée. SsoPox est extrêmement robuste mais son activité phosphotriestérase est en revanche plus faible. Une stratégie d’ingénierie protéique a été réalisée afin d’obtenir un compromis entre l’activité d'une PTE et la stabilité de SsoPox. En utilisant les similarités structurales entre ces deux enzymes, une base de données mutationnelle a été réalisée pour transférer le site actif hautement performant d’une PTE dans la structure hyperstable de SsoPox. Cette stratégie a permis d’obtenir des variants de SsoPox améliorés jusqu’à 2000 fois. L'efficacité de ces variants a été démontrée in vivo chez un modèle animal, la planaire, permettant d'améliorer la survie ainsi que la mobilité et la capacité de régénération. / Organophosphates (OPs) are neurotoxic compounds widely used as pesticides. Over the years, utilization of OP led to a considerable environmental contamination of soils and agricultural wastewaters, this pollution is furthermore a major health issue as these insecticides can be found in food. OP are highly toxic and are responsible for 300,000 deaths in the world every year. OPs were also developed as chemical warfare nerve agents such as sarin. Currently, no satisfying method for external decontamination is available, therefore bioremediation with enzymes is highly appealing. Among OP degrading enzymes, phosphotriesterases (PTEs) are the most active biocatalysts but are poorly stable what hinders their potential for bioremediation. Hyperthermostable enzymes from extreme environments were thus considered to circumvent this limitation. In particular, SsoPox isolated from the archaeon Sulfolobus solfataricus, displaying a lactonase activity and a promiscuous phosphotriesterase activity was deeply investigated. SsoPox is extremely robust but its activity for OP degradation is from far lower. A protein engineering strategy was started in order to reach a compromise between PTE activity and SsoPox robustness. Using structural similarities between PTEs and SsoPox, a mutational database was designed in order to transfer the highly performant active site of PTE into the hyperstable scaffold of SsoPox. This strategy led to variants displaying up to 2,000-fold increase against OPs as compared to wild-type enzyme. The variants efficiency was demonstrated in vivo using an original animal model planarian, allowed to enhance survival rate as well as mobility and regeneration capacity.

Les protéines sont synthétisées essentiellement à partir d'acides aminés L. Cependant, les acides aminés D sont naturellement présents dans notre organisme. Il existe plusieurs mécanismes de régulation pour limiter leur présence. Il peut y avoir un intérêt bio-technologique à introduire des acides aminés D dans les protéines pour leur conférer des fonctions chimiques nouvelles. Les protéases, chargées de dégrader les peptides, reconnaissent moins bien les protéines possédant de tels acides aminés. Dans notre cas, présenter la tyrosine sous son énantiomère D donnerait un avantage par rapport aux protéases. En effet, un peptide qui aurait des acides aminés D, resterait plus longtemps actif dans un organisme. La tyrosyl-ARNt synthétase (TyrRS) a déjà été utilisée pour l'incorporation de plus d'une trentaine d'analogues de la tyrosine dans les protéines. Cette enzyme possède déjà une activité naturelle pour la D-tyr, mais celle ci est très faible. L'objectif du présent travail est de l'améliorer par une méthode d'évolution dirigée iin silico. Cette méthode consiste à muter aléatoirement une protéine puis à sélectionner les mutants qui ont les propriétés désirées, mimant les mécanismes de l'évolution naturelle. L'évolution dirigée textit{in silico} a déjà été utilisée pour l'ingénierie d'un grand nombre de protéines. On utilise pour cette étude le programme d'évolution dirigée développé au laboratoire qui procède à une optimisation itérative de la séquence et de la structure. Des mutations ont été retenues par cette méthode et proposées aux expérimentalistes du laboratoire de biochimie pour des validations expérimentales. Ils ont conclut que plusieurs mutants présentent une activité faible mais mesurable pour la D-Tyrosine. L'étude a été étendue à d'autres résidus proches de l'ammonium de la L-Tyr. Nous avons identifié d'autres positions qui pourraient être intéressantes à muter. L'étude, faite dans un premier temps avec le ligand tyrosine, a été ensuite améliorée en considérant le ligand Tyrosyl adénylate (tyrAMP). C'est l'intermédiaire qui va interagir avec l'ARNt pour former l'ARNt-Tyr . Le L-TyrAMP et le D-TyrAMP ont tous deux été modélisés avec la TyrRS d'Escherichia coli. Toutes ces modélisations ont conduit à une liste de séquences mutantes qui ont été prédites comme favorables à la liaison du D-TyrAMP. Chacune des séquences obtenues pour les deux synthétases a ensuite fait l'objet d'une étude plus approfondie visant à déterminer la spécificité pour le ligand D-TyrAMP. Suite à cela, nous avons sélectionné une dizaine de séquences de TyrRS mutantes d'Escherichia coli afin de réaliser des calculs de dynamique moléculaire. Nous avons utilisé les ressources du super calculateur du CINES (Centre Informatique Nationale de l'Education Supérieur) pour faire des études de dynamique moléculaire. Une meilleure estimation de l'affinité de ces différents mutants pour le D-TyrAMP a été atteinte. Un autre but de la thèse était d'améliorer notre protocole de Protein Design en adoptant un champ de force tout atome et un modèle de solvant plus sophistiqué. Pour le solvant, le modèle de Born généralisé que nous avons implémenté dans le protocole est basé sur la théorie de Poisson-Boltzmann, avec un continuum diélectrique qui entoure la protéine. Les validations sur des peptides tests ont été concluantes. L'évolution dirigée de la TyrRS de Bacillus Stearothermophilus sert de validation à ce protocole car des mesures expérimentales pour une quinzaine de mutants sont disponibles.

Par l'accumulation de mutations bénéfiques lors de cycles successifs de mutagénèse, l'évolution dirigée offre un cadre rationnel pour l'amélioration des protéines à vocation industrielle. Elle permet une exploration large de l'espace possible des séquences ainsi que leurs capacités fonctionnelles. Elle est cependant lourde à mettre en oeuvre et nécessite des moyens importants. Des approches in silico font usage d'un jeu minimal de données expérimentales et utilisent la modélisation statistique combinée à des algorithmes d'apprentissage machine. Elles ont été développées pour explorer de façon heuristique l'espace possible des séquences et de la fitness et d'identifier les mutations et interactions entre résidus les plus intéressantes. C'est l'objet de cette thèse qui explore la construction et l'application de modèles statistiques s'appuyant sur des jeux minimaux de données expérimentales pour relier fitness, ou activité, à la séquence biologique des variants. L'étude s'articule autour d'un choix crucial d'une méthode de numérisation, de descripteurs de la séquence et de méthodes de régression. La méthode ProSAR de R. Fox (2005) et les limites de son applicabilité sur des jeux de données expérimentales ont été étudiées. De nouvelles méthodes ont aussi été développées, prenant en compte les propriétés physico-chimiques des acides aminés et leurs périodicités. Elle a permis de découvrir de nouveaux descripteurs reliant la séquence à l'activité et propose des approches innovantes qui ont la capacité de traiter des cadres biologiques très divers, même lorsque peu de données biologiques sont disponibles. / Via the accumulation of beneficial mutations through successive rounds of mutations, directed evolution offers a rational framework for the amelioration of protein of industrial interest. It enables the large exploration of the sequence space and fitness. However, they are wet-lab intensive and may reveal to be time consuming and costly. In silico approaches using minimal sets of experimental data and statistical models combined with machine learning algorithms have been developed to explore heuristically the sequence space and to identify the effect of the potential epistatic interactions between residues on protein fitness. This work focused on the construction and application of statistical models relying on minimal experimental datasets to study protein sequence to activity relationships (ProSAR). In particular, the choices of appropriate numerical encoding methods, of descriptors extracted from protein sequences and of regression methods were investigated. The original ProSAR method from R. Fox (2005) and the limits of its applicability on experimental datasets have been studied. New methods that consider physico-chemical features of amino acids and their periodicities have been explored. This study unveils novel descriptors of the sequence-activity relationship and provides innovative approaches that can deal with very diverse biological datasets, even when few biological data are available.

Élargir le répertoire de composés accessibles dans le domaine des Glycosciences est d’un intérêt majeur pour la communauté des biologistes du fait que ces composés, oligosaccharides et glyco-conjugués, sont impliqués dans diverses fonctions biologiques, aussi bien au niveau structurel, qu’énergétique voire même signalétique jouant un rôle primordial dans les interactions inter- ou intracellulaires. L’assemblage, la modification ou la déconstruction de ces glyco-structures complexes est possible grâce à l’action d’enzymes, parmi lesquelles l’on retrouve les CAZymes (Carbohydrate Active enZymes). Ces enzymes font partie du répertoire de la base de données CAZy, incluant les Glycoside Hydrolases (GHs) qui représentent le groupe le plus important et ayant pour fonction biologique principale l’hydrolyse des liens glycosidiques. Cependant, un certain nombre de GHs possède aussi la capacité de catalyser des réactions de synthèse (transglycosylation) en tant qu’activité secondaire mineure, voire en tant qu’activité principale pour un nombre restreint d’entre elles, qui sont alors appelées transglycosylases. Sachant que ces deux types de comportements peuvent se retrouver au sein d’une même famille de GH (donc étroitement liés sur le plan évolutif), la découverte et la compréhension des déterminants moléculaires qui ont été développés par les GHs au cours de leur évolution pour permettre cette partition d’activité, entre hydrolyse et transglycosylation, est d’une importance capitale pour le domaine de la synthèse chimio-enzymatique et des Glycosciences de manière plus générale.Ce travail de thèse décrit une proposition de synthèse pour apporter une réponse à cette question fondamentale via une revue critique de la littérature sur le sujet. Sur le plan expérimental, a été réalisée l’évolution moléculaire d’une enzyme spécifique des pentoses, l’α-L-arabinofuranosidase de Thermobacillus xylanilyticus (TxAbf) de la famille GH51, vers les premières transarabinofuranosylases de type ‘non-Leloir’. Cette évolution itérative a été développée en utilisant un panel d’outils d’ingénierie enzymatique combinant des approches aléatoire, semi-rationnelle, de prédiction in silico suivie de recombinaison dans un processus d’évolution dirigée global. Une analyse fine des mutants générés sur le plan mécanistique en lien avec la partition hydrolyse/transglycosylation mène à des conclusions en accord avec la proposition de synthèse issue de la revue de la littérature sur le sujet. Sur un plan plus appliqué, ces nouveaux biocatalyseurs ont ensuite été mis en oeuvre dans des voies de synthèse chimio-enzymatiques pour la préparation de composés furanosylés de structure contrôlée. Le transfert d’L-arabinofuranosyles permet la génération d’arabinoxylo-oligosaccharides (AXOS) ainsi que la conception d’oligosaccharides non naturels, tel que des galactofuranoxylo-oligosaccharides ou des arabinofuranogluco-oligosaccharides. Dans son ensemble, ce travail de recherche constitue les premières étapes clés du développement de méthodes de synthèse chimio-enzymatique plus élaborées pour la conception d’arabinoxylanes artificiels. Dans le contexte actuel de transition vers une bio-économie, reposant sur des concepts tels que ceux de la bioraffinerie ou de la chimie verte, nous espérons que les outils de glycosynthèse développés au cours de ces travaux trouveront leur application dans la valorisation des pentoses issus de la biomasse. La synthèse à-façon d’arabinoxylooligo- et polysaccharides présente nombre de valorisations possibles allant de la préparation de prébiotiques à la conception de matériaux bio-inspirés en passant par la synthèse de modèles de parois végétales. / Widening the spectrum of available compounds in the field of Glycosciences is of utmost importance for the entire biology community, because carbohydrates are determinants of a myriad of life-sustaining or threatening processes. The assembly, modification or deconstruction of complex carbohydrate-based structures mainly involves the action of enzymes, among which one can identify Carbohydrate Active enZymes (CAZymes). These enzymes form part of the CAZy database repertoire and include Glycoside Hydrolases (GHs), which are the biggest group of CAZymes, whose main role is to hydrolyze glycosidic linkages. However, some GHs also display the ability to perform synthesis (transglycosylation), an activity that mostly manifests itself as a minor one alongside hydrolysis, but which is the only activity displayed by a rather select group of GHs that are often called transglycosylases. Understanding how transglycosylases have resulted from the process of evolution is both intringuing and crucial, because it holds the key to the creation of tailored glycosynthetic enzymes that will revolutionize the field of glycosciences.In this thesis, an extensive review of relevant scientific literature that treats the different aspects of GH-catalyzed transglycosylation and glycosynthesis is presented, along with experimental results of work that has been performed on a family GH-51 α-L-arabinofuranosidase, a pentose-acting enzyme from Thermobacillus xylanilyticus (TxAbf). The conclusions of the literature are presented in the form of a hypothesis, which describes the molecular basis of the hydrolysis/transglycosylation partition and thus provides a proposal on how to engineer dominant transglycosylation activity in a GH. Afterwards, using a directed evolution approach, including random mutagenesis, semi-rational approaches, in silico predictions and recombination it has been experimentally possible to create the very first ‘non-Leloir’ transarabinofuranosylases. The mechanistic analysis of the resultant TxAbf mutants notably focusing on the hydrolysis/transglycosylation partition reveals that the results obtained are consistent with the initial hypothesis that was formulated on the basis of the literature review.To demonstrate the applicative value of the experimental work performed in this study, the TxAbf mutants were used to develop a chemo-enzymatic methodology that has procured a panel of well-defined furanosylated compounds. Enzyme-catalyzed transfer of arabinofuranosyl moities can be used to generate arabinoxylo-oligosaccharides (AXOS), but the design of non-natural oligosaccharides, such as galactofuranoxylo-oligosaccharides or arabinofuranogluco-oligosaccharides is also possible. Overall, the work presented constitutes the first steps towards the development of more sophiscated methodologies that will procure the means to synthesize artificial arabinoxylans, with a first proof of concept being presented at the very end of this manuscript.In the present context of the bioeconomy transition, which relies on technologies such as biorefining and green chemistry, it is expected that the glycosynthetic tools that have been developed in this work will be useful for the conversion of pentose sugars obtained from biomass. The synthesis of tailor-made arabinoxylo-oligo- and polysaccharides may lead to a variety of potential applications including the production of prebiotics, surfactants or bio-inspired materials and, more fundamentally, the synthesis of artificial models of plant cell wall.