L’histiocytose langerhansienne (HL) est la plus fréquente des histiocytoses, liée à l’accumulation de cellules pathologiques de phénotype langerhansien. La découverte de la mutation somatique BRAFV600E dans environ 50% des cas à ouvert un nouveau champ d’investigation pour tirer bénéfice de ce statut moléculaire pour la prise en charge des patients.Tout d’abord, nous avons montré l’efficacité des inhibiteurs de BRAF sans rapporter de résistance dans les formes actives d’HL, en particulier dans les formes multisystémiques avec atteinte des organes à risque (MS OR+) du nourrissons, confirmant le rôle driver de cette mutation dans l’HL. Toutefois, après l’arrêt du traitement administré durant 2 à 6 mois, de nombreuses récidives ont été constatées.Ensuite, nous avons montré que pour les enfants atteints d’HL, la mutation BRAFV600E était significativement associée aux formes MS OR+, retrouvée dans 87,8% de ces cas. Comparés aux patients non mutés BRAF, les patients avec la mutation BRAFV600E présentaient un taux de résistance plus élevé à la chimiothérapie de première ligne velbé - corticoïde (21,9% contre 3,3%), un taux plus élevé de réactivation à 5 ans (42,8% contre 28,1%) et un taux de séquelles supérieur (27,9% contre 12,6%).Par ailleurs, nous avons montré que, pour les HL BRAFV600E mutées, la quantification de BRAFV600E dans l’ADN libre circulant par PCR digitale en gouttelette était un biomarqueur pertinent pour les cas d’HL MS OR+ et les présentations résistantes au traitement de première ligne.Enfin, après un criblage de points chauds mutationnels d’une série d’échantillons tissulaires d’HL ayant permis de mettre en évidence un cas avec la mutation somatique PIK3CAE542K, 9 couples d’échantillons tumeur/constitutionnel ont été étudiés par séquençage d’exome. Cela nous a permis de mettre en évidence une mutation récurrente (n=2) de BRAF au niveau du site d’épissage 5’ (donneur) de l’intron 12. Selon l’analyse de l’ARN, cette mutation conduirait à l’insertion de 3 acides aminés (LLR) dans le domaine kinase de la protéine mutée, dont l’analyse fonctionnelle est en cours. / Langerhans cell histiocytosis (LCH) is the most common type of histiocytosis owing to accumulation of pathologic CD1a+ CD207+ histiocytes. The identification of BRAFV600E in more than half of patients with LCH has launched a new field of investigation to study potential patient’s management benefits and implications from this molecular status.First, in BRAFV600E mutated LCH, we reported the effectiveness of BRAF inhibitors. Efficacy with no resistance to vemurafenib was reported in all cases with active LCH disease, especially for multi-system LCH with risk organ (MS RO+) involvement, confirming the driver status of this mutation in LCH. However, after discontinuation of this treatment administered during 2-6 months, many recurrences were observed.Then, we showed that children with BRAFV600E mutated LCH manifested more severe disease, comprised 87.8% of patients with MS RO+ involvement. Compared to patients with wild-type BRAF, patients with BRAFV600E more commonly displayed resistance to combined vinblastine and corticosteroid therapy (21.9% vs. 3.3%), showed a higher 5-year reactivation rate (42.8% vs. 28.1%) and had more long-term permanent consequences (27.9% vs. 12.6%).Moreover, we showed that BRAFV600E quantification in circulating cell-free DNA by droplet digital PCR is a relevant biomarker to monitor response to therapy for MS RO+ LCH and RO- LCH children who failed to respond to first line chemotherapy.Finally, after the screening of LCH biopsy (n=86) for the BRAF, KRAS, NRAS and PI3KCA most common mutations, leading to highlight one case with the PIK3CAE542K somatic mutation, 9 paired tumor-normal samples from children with LCH were analyzed by whole exome sequencing. Data showed a new BRAF recurrent mutation (n=2) in the 5′ splice sites of the intron 12. According to RNA analysis, this mutation would lead to the insertion of 3 amino acids (LLR) in the smaller N-terminal lobe of the BRAF kinase domain. Functional analysis is ongoing.

Bc. Klára Horáčková DIPLOMA THESIS Mechanisms of immune dysregulation leading to inflammatory bowel disease Abstract Inflammatory bowel disease (IBD) is a complex disorder characterized by chronic inflammation of the gastrointestinal tract. Classical IBD is a multifactorial disease with adulthood or later-childhood onset. However, children with very early onset IBD (VEO-IBD, before 6 years of age) are a specific cohort, whose pathology can be caused by severe genetic defects in genes connected to immune homeostasis in the gut. We aimed to identify the causal genetic variants in 20 pediatric patients diagnosed with IBD (age of onset from 3 to 154 months) using whole exome sequencing (WES). We evaluated several bioinformatical approaches for WES data analysis. This included a comparison of two methods of variant identification using VarScan2 or GATK4-based tools. Furthermore, we compared 4 gene lists ("virtual panels") for variant filtering, one of which was compiled purposefully for this thesis. We identified and validated via segregation analysis 5 causal variants in 4 genes (DUOX2 compound heterozygote, FOXP3, NLRP3 and NOD2) accounting for 20 % of the cohort. NOD2 (p.A755V) variant has already been reported in IBD cases, while DUOX2 (p.R1216W + p.A1131T), FOXP3 (p.H400L) and NLRP3 (p.V200M) were newly...

Les ataxies forment un groupe de maladies neurodégénératives qui sont caractérisées par un manque de coordination des mouvements volontaires. Mes travaux ont porté sur une forme d'ataxie à début tardif (LOCA), après l’âge de 50 ans. Les principales caractéristiques cliniques sont: atrophie cérébelleuse à l’IRM (88%), dysarthrie (81%), atrophie du lobe frontal (50%) et nystagmus (52%). La ségrégation dans les familles de cette ataxie est en faveur d’une transmission récessive. Afin d'identifier le gène responsable de LOCA, nous avons recruté 38 patients affectés d'une forme tardive d'ataxie, issus du SLSJ, des Cantons de l’Est ou d’autres régions du Québec. Un premier criblage du génome a été effectué avec des marqueurs microsatellites sur une famille clé. Une analyse de liaison paramétrique nous a suggéré une liaison au chromosome 13 (4.4Mb). Une recherche d’un haplotype partagé entre 17 familles LOCA a diminué la taille de l'intervalle candidat à 1.6Mb, mais l’haplotype s’est avéré fréquent dans la population canadienne-française. Un second criblage du génome avec des marqueurs SNP nous a permis d’évaluer par cartographie d’homozygotie la possibilité qu’une mutation fondatrice partagée dans des sous-groupes de malades. Plusieurs stratégies d'analyse ont été effectuées, entre autre par regroupement régional. Aucun loci candidats ne fut identifié avec confiance. Nous avons donc combiné les données de génotypage avec le séquençage exomique afin d'identifier le gène responsable. L'analyse de six individus atteints nous a permis d'obtenir une liste de variants rare contenant quatre gènes potentiels. Cette analyse doit se poursuivre pour identifier le gène responsable de LOCA. / Ataxias are a heterogeneous group of neurodegenerative diseases and are characterized by a lack of voluntary movements. My Master's project was on a late-onset ataxia (LOCA), after 50 years of age. The main clinical features are: cerebellar atrophy on MRI (88%), dysarthria (81%), frontal lobe atrophy (50%) and nystagmus (52%). Disease segregation in the family is suggestive of a recessive transmission. In order to identify the causal gene of LOCA, we have recruited 38 patients affected by a late-onset ataxia, originated from SLSJ, Eastern townships or other region in Quebec. A first genome scan was done with microsatellite markers on an informative family. Parametric linkage analysis suggested linkage on chromosome 13 (4.4Mb). Haplotype sharing analysis on 17 families reduced the candidate interval to 1.6Mb, but this haplotype was found to be frequent in the French-Canadian population. A second genome scan with SNPs markers allowed us to performed homozygozity mapping and look for founder mutations in subgroup of patients. Many strategies were performed, including regional clustering. No candidate loci were identified with confidence. We decided to combine the genotyping analysis results with exome sequencing to uncover the causative gene. The analysis on six affected individuals allowed us to obtain a rare variants list with four putative genes. More analysis is needed to identify the gene responsible for LOCA.

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Le système immunitaire est particulièrement dépendant des mécanismes de réparation de l’ADN, en effet le développement du système immunitaire adaptatif nécessite certains mécanismes de réparation de l’ADN, lors de la recombinaison V(D)J et lors de la commutation de classe des immunoglobulines. De plus, le système hématopoïétique est par sa nature très sensible aux lésions spontanées de l’ADN. Il existe chez l’homme de nombreux déficits immunitaires directement liés à un défaut de réparation de l’ADN. L’identification du gène responsable est importante pour un conseil génétique familial approprié et pour la prise en charge médicale. Nous avons accès aujourd’hui à de puissants outils de dépistage génétique grâce au séquençage à haut débit et la liste des gènes responsables d’un déficit immunitaire s’allonge de plus en plus en rapidement. La première partie de ce travail porte sur la mise au point d’un nouvel outil de dépistage rapide des déficits de la réparation de l’ADN, en particulier dans le cas de déficit immunitaires. Ce test est fondé sur l’observation d’un biais du répertoire du TCRdes lymphocytes T circulants lorsque les thymocytes ont une durée de vie diminuée, or un défaut de réparation de l’ADN entraîne une diminution de la survie thymocytaire. Nous avons mis au point deux techniques, par biologie moléculaire et par cytométrie en flux, pour détecter un éventuel biais du répertoire du TCRα et évaluer la pertinence de ce test dans les déficits immunitaires liés à un défaut de réparation de l’ADN. Un biais a notamment été détecté dans les cas de déficit en facteur du NHEJ et en ATM. Nous avons également établi en collaboration avec le service d’Immunologie Clinique de l’hôpital Saint-Louis une cohorte de patients atteints de déficit immunitaire commun variable (DICV) dont la présentation clinique est évocatrice d’un défaut de réparation de l’ADN. Une série de test fonctionnels de dépistages de déficit de la réparation de l’ADN ainsi que des analyses génétiques (CGH array, séquençage complet de l’exome) ont été fait chez ces patients afin d’identifier de nouveaux gènes impliqués dans les DICV. Parmi les 18 patients analysés, dans 5 cas on retrouve une sensibilité cellulaire accrue aux agents génotoxiques et chez 15 patients, un gène candidat a été identifié. Ces résultats sont encore préliminaires et la caractérisation génétique et fonctionnelle des mutations identifiées sera poursuivie par notre équipe. Pour finir, nous avons entrepris l’exploration génétique et fonctionnelle de deux mutations identifiées chez une jeune patiente atteinte de déficit immunitaire combiné (CID) associé à un syndrome lymphoprolifératif et une auto-immunité, et chez qui une hypersensibilité cellulaire à la Mitomycine C, agent pontant de l’ADN, a été détectée. La première mutation a été identifiée dans le gène ELKS qui code pour un facteur impliqué dans la réparation de l’ADN. La complémentation fonctionnelle de ce gène prouve l’implication de cette mutation dans l’hypersensibilité des cellules de la patiente à la MMC. Nous avons développé un modèle murin KO conditionnel de ce gène dans les cellules hématopoïétiques qui n’a pas montré de défaut de développement du système immunitaire. La deuxième mutation identifiée se situe dans le gène BACH2 codant pour un répresseur transcriptionnel très impliqué dans le développement du système immunitaire. Les souris KO pour ce gène ont un phénotype proche du déficit immunitaire décrit chez cette patiente. Les investigations de cette mutation sont en cours chez elle et chez les membres de sa famille également porteurs de la mutation. / The immune system is particularly dependent on DNA damage response (DDR) pathways. The development of the adaptive immune system requires certain DDR mechanisms, in particular during the V(D)J recombination and during class switch recombination (CSR), furthermore, the hematopoietic system is very sensitive to spontaneous DNA lesions. Therefore, there are many immune deficiencies in human directly related to a DDR deficiency. The identification of the responsible gene is important for appropriate genetic counseling. Today, we have access to powerful genetic screening tools, in particular next generation sequencing (NGS) and the list of genes responsible for immune deficiency is growing rapidly. The first part of this work focuses on the development of a new screening tool for DDR defects, in particular in the case of immune deficiency, and evaluation of clinical interest. This test is based on the observation of a bias of the TCRα repertoire in circulating T lymphocytes when thymocytes lifespan is diminished and we know that DDR defect causes decreased thymocyte survival. We have developed two techniques, by molecular biology and by flow cytometry, to detect a potential bias of the TCRα repetoire and assess the suitability of this test in some immunodeficiencies linked to a DDR defect. A significant bias was detected in the case of ATM and NHEJ factor deficiency. Furthermore, we have established a cohort of patients suffering from common variable immunodeficiency (CVID) with a clinical presentation highly suggestive of DDR defect, in collaboration with the Clinical Immunology Service of Hôpital Saint-Louis (Paris). Functional test for DDR defect and genetic analysis (CGHarray, whole exome sequencing) were performed in these patients to identify new genes involved in CVID. Among the 18 patients analyzed until now, five cases of cellular sensitivity to genotoxic agents have been detected and a candidate gene was identified in 15 of them. These results are still preliminary and our team will pursue genetic and functional characterization of the identified mutations. Finally, we undertook genetic and functional exploration of two mutations identified in a young patient with combined immunodeficiency (CID) associated with a lymphoproliferative disease and autoimmunity, and in whom a cellular hypersensitivity to mitomycin C, a DNA crosslinking agent, was detected. The first mutation was identified in the ELKS gene, which codes for a factor involved in DNA repair. Functional complementation of this gene demonstrates the involvement of this mutation in the hypersensitivity of patient’s cells to MMC. We have developed a conditional knockout mouse model of this gene in hematopoietic cells that did not show any defect in development of the immune system. The second mutation was identified in BACH2 gene encoding a transcriptional repressor involved in the development of the immune system. Knockout mice for this gene have a similar phenotype to the immune deficiency described in this patient. Investigations on this mutation are ongoing in the patient and among family members that also carry the mutation.

Le système immunitaire est particulièrement dépendant des mécanismes de réparation de l’ADN, en effet le développement du système immunitaire adaptatif nécessite certains mécanismes de réparation de l’ADN, lors de la recombinaison V(D)J et lors de la commutation de classe des immunoglobulines. De plus, le système hématopoïétique est par sa nature très sensible aux lésions spontanées de l’ADN. Il existe chez l’homme de nombreux déficits immunitaires directement liés à un défaut de réparation de l’ADN. L’identification du gène responsable est importante pour un conseil génétique familial approprié et pour la prise en charge médicale. Nous avons accès aujourd’hui à de puissants outils de dépistage génétique grâce au séquençage à haut débit et la liste des gènes responsables d’un déficit immunitaire s’allonge de plus en plus en rapidement. La première partie de ce travail porte sur la mise au point d’un nouvel outil de dépistage rapide des déficits de la réparation de l’ADN, en particulier dans le cas de déficit immunitaires. Ce test est fondé sur l’observation d’un biais du répertoire du TCRdes lymphocytes T circulants lorsque les thymocytes ont une durée de vie diminuée, or un défaut de réparation de l’ADN entraîne une diminution de la survie thymocytaire. Nous avons mis au point deux techniques, par biologie moléculaire et par cytométrie en flux, pour détecter un éventuel biais du répertoire du TCRα et évaluer la pertinence de ce test dans les déficits immunitaires liés à un défaut de réparation de l’ADN. Un biais a notamment été détecté dans les cas de déficit en facteur du NHEJ et en ATM. Nous avons également établi en collaboration avec le service d’Immunologie Clinique de l’hôpital Saint-Louis une cohorte de patients atteints de déficit immunitaire commun variable (DICV) dont la présentation clinique est évocatrice d’un défaut de réparation de l’ADN. Une série de test fonctionnels de dépistages de déficit de la réparation de l’ADN ainsi que des analyses génétiques (CGH array, séquençage complet de l’exome) ont été fait chez ces patients afin d’identifier de nouveaux gènes impliqués dans les DICV. Parmi les 18 patients analysés, dans 5 cas on retrouve une sensibilité cellulaire accrue aux agents génotoxiques et chez 15 patients, un gène candidat a été identifié. Ces résultats sont encore préliminaires et la caractérisation génétique et fonctionnelle des mutations identifiées sera poursuivie par notre équipe. Pour finir, nous avons entrepris l’exploration génétique et fonctionnelle de deux mutations identifiées chez une jeune patiente atteinte de déficit immunitaire combiné (CID) associé à un syndrome lymphoprolifératif et une auto-immunité, et chez qui une hypersensibilité cellulaire à la Mitomycine C, agent pontant de l’ADN, a été détectée. La première mutation a été identifiée dans le gène ELKS qui code pour un facteur impliqué dans la réparation de l’ADN. La complémentation fonctionnelle de ce gène prouve l’implication de cette mutation dans l’hypersensibilité des cellules de la patiente à la MMC. Nous avons développé un modèle murin KO conditionnel de ce gène dans les cellules hématopoïétiques qui n’a pas montré de défaut de développement du système immunitaire. La deuxième mutation identifiée se situe dans le gène BACH2 codant pour un répresseur transcriptionnel très impliqué dans le développement du système immunitaire. Les souris KO pour ce gène ont un phénotype proche du déficit immunitaire décrit chez cette patiente. Les investigations de cette mutation sont en cours chez elle et chez les membres de sa famille également porteurs de la mutation. / The immune system is particularly dependent on DNA damage response (DDR) pathways. The development of the adaptive immune system requires certain DDR mechanisms, in particular during the V(D)J recombination and during class switch recombination (CSR), furthermore, the hematopoietic system is very sensitive to spontaneous DNA lesions. Therefore, there are many immune deficiencies in human directly related to a DDR deficiency. The identification of the responsible gene is important for appropriate genetic counseling. Today, we have access to powerful genetic screening tools, in particular next generation sequencing (NGS) and the list of genes responsible for immune deficiency is growing rapidly. The first part of this work focuses on the development of a new screening tool for DDR defects, in particular in the case of immune deficiency, and evaluation of clinical interest. This test is based on the observation of a bias of the TCRα repertoire in circulating T lymphocytes when thymocytes lifespan is diminished and we know that DDR defect causes decreased thymocyte survival. We have developed two techniques, by molecular biology and by flow cytometry, to detect a potential bias of the TCRα repetoire and assess the suitability of this test in some immunodeficiencies linked to a DDR defect. A significant bias was detected in the case of ATM and NHEJ factor deficiency. Furthermore, we have established a cohort of patients suffering from common variable immunodeficiency (CVID) with a clinical presentation highly suggestive of DDR defect, in collaboration with the Clinical Immunology Service of Hôpital Saint-Louis (Paris). Functional test for DDR defect and genetic analysis (CGHarray, whole exome sequencing) were performed in these patients to identify new genes involved in CVID. Among the 18 patients analyzed until now, five cases of cellular sensitivity to genotoxic agents have been detected and a candidate gene was identified in 15 of them. These results are still preliminary and our team will pursue genetic and functional characterization of the identified mutations. Finally, we undertook genetic and functional exploration of two mutations identified in a young patient with combined immunodeficiency (CID) associated with a lymphoproliferative disease and autoimmunity, and in whom a cellular hypersensitivity to mitomycin C, a DNA crosslinking agent, was detected. The first mutation was identified in the ELKS gene, which codes for a factor involved in DNA repair. Functional complementation of this gene demonstrates the involvement of this mutation in the hypersensitivity of patient’s cells to MMC. We have developed a conditional knockout mouse model of this gene in hematopoietic cells that did not show any defect in development of the immune system. The second mutation was identified in BACH2 gene encoding a transcriptional repressor involved in the development of the immune system. Knockout mice for this gene have a similar phenotype to the immune deficiency described in this patient. Investigations on this mutation are ongoing in the patient and among family members that also carry the mutation.

La déficience intellectuelle (DI) définit un groupe de conditions génétiquement hétérogènes caractérisées par l’apparition de troubles cognitifs précoces chez l’enfant. Elle affecte 1-3% de la population dans les pays industrialisés. La prévalence de la DI est beaucoup plus élevée ailleurs dans le monde, en raison de facteurs sociodémographiques comme le manque de ressources dans le système de santé, la pauvreté et la consanguinité. Des facteurs non-génétiques sont mis en cause dans l’étiologie de la DI ; on estime qu’environ 25% des cas de DI sont d’origine génétique. Traditionnellement, les bases moléculaires de la DI ont été investiguées par des analyses cytogénétiques, les approches de cartographie génétique et le séquençage de gènes candidats ; ces techniques de génétiques classiques sont encore mises à rude épreuve dans l’analyse de maladies complexes comme la DI. La DI liée à l’X a été particulièrement étudiée, avec plus d’une centaine de gènes identifiés uniquement sur le chromosome X. Des mutations hétérozygotes composites sont mises en évidence dans la DI autosomique, dans le contexte d’unions non-consanguines. L’occurrence de ce type de mutations est rare, chez des individus non-apparentés, de sorte que les mutations dominantes de novo sont plus courantes. Des mutations homozygotes sont attendues dans les populations consanguines ou marquées par un effet fondateur. En fait, les bases moléculaires de la DI autosomique ont été presqu’exclusivement étudiées dans le contexte de populations avec des forts taux de consanguinité. L’origine de la DI demeure encore inconnue dans environ 60 % des cas diagnostiqués. En l’absence de facteurs environnementaux associés à la DI chez ces individus, il est possible d’envisager que des facteurs génétiques non identifiés entrent en jeu dans ces cas de DI inexpliqués. Dans ce projet de recherche, nous voulions explorer l’origine génétique de la DI, dans vingt familles, où une transmission de la maladie selon un mode autosomique récessif est suspectée. Nous avons mis de l’avant les techniques de séquençage de nouvelle génération, afin de mettre en évidence les déterminants génétiques de la DI, à l’échelle du génome humain. En fait, nous avons priorisé la capture et le séquençage de l’exome; soient la totalité des régions codantes du génome humain et leurs sites d’épissage flanquants. Dans nos analyses, nous avons ciblé les variants qui ne sont pas rapportés trop fréquemment dans différentes bases de données d’individus contrôles, ces mutations rares cadrent mieux avec une condition comme la DI. Nous avons porté une attention particulière aux mutations autosomiques récessives (homozygotes et hétérozygotes composites) ; nous avons confirmé que ces mutations ségréguent avec une transmission récessive dans la famille à l’étude. Nous avons identifié des mutations dans des gènes pouvant être à l’origine de la DI, dans certaines des familles analysées ; nous avons validé biologiquement l'impact fonctionnel des mutations dans ces gènes candidats, afin de confirmer leur implication dans la pathophysiologie de la DI. Nous avons élucidé les bases moléculaires de la DI dans huit des familles analysées. Nous avons identifié le second cas de patients avec syndrome de cassure chromosomique de Varsovie, caractérisé par des dysfonctions de l’ARN hélicase DDX11. Nous avons montré qu’une perte de l’activité de TBC1D7, une des sous-unités régulatrice du complexe TSC1-TSC2, est à l’origine de la pathologie dans une famille avec DI et mégalencéphalie. Nous avons mis en évidence des mutations pathogéniques dans le gène ASNS, codant pour l’Asparagine synthétase, chez des patients présentant une microcéphalie congénitale et une forme progressive d’encéphalopathie. Nous avons montré que des dysfonctions dans la protéine mitochondriale MAGMAS sont mises en cause dans une condition caractérisée par un retard prononcé dans le développement associé à une forme sévère de dysplasie squelettique. Nous avons identifié une mutation tronquant dans SPTBN2, codant pour la protéine spinocerebellar ataxia 5, dans une famille avec DI et ataxie cérébelleuse. Nous avons également mis en évidence une mutation dans PIGN, un gène impliqué dans la voie de biosynthèse des ancres de glycosylphosphatidylinositol , pouvant être à l’origine de la maladie chez des individus avec épilepsie et hypotonie. Par ailleurs, nous avons identifié une mutation - perte de fonction dans CLPB, codant pour une protéine chaperonne mitochondriale, dans une famille avec encéphalopathie néonatale, hyperekplexie et acidurie 3-méthylglutaconique. Le potentiel diagnostic des techniques de séquençage de nouvelle génération est indéniable ; ces technologies vont révolutionner l’univers de la génétique moléculaire, en permettant d’explorer les bases génétiques des maladies complexes comme la DI. / Intellectual disability (ID) regroups greatly heterogeneous conditions that are characterized by early-onset cognitive impairment. ID affects about 1-3% of Western populations; but its prevalence is much higher in deprived regions of the world where socio-demographic factors like poor healthcare, lack of resources and parental consanguinity prevail. Non-genetic factors are involved in the etiology of ID; approximately 25% of ID cases are of genetic origin. Traditionally, the molecular basis of ID have been assessed through cytogenetic analyses, genetic mapping and candidate gene approaches. These classical genetic tools are still put to the test in the study of complex diseases like ID. Until recently, X-linked ID cases were the main focus of studies on ID with more than hundred ID genes identified only on the X chromosome. Compound heterozygous mutations are identified in autosomal forms of ID, in the context of non-consanguineous unions. However, the occurrence of such mutations is rare in outbred populations, so that dominant de novo mutations are most common in unrelated individuals. Homozygous mutations are expected in consanguineous unions or in populations marked by a founder effect. In fact, the molecular bases of autosomic recessive ID have been almost exclusively studied in populations with high consanguinity rates. ID remains unsolved in more than 60% of patients. In the absence of environmental factors associated with ID in these individuals, it is possible to consider that unidentified genetic factors are involved in these unexplained ID cases. In this research project, we used next generation sequencing technologies to highlight the genetic causes of ID in twenty families were an autosomal recessive mode of inheritance is expected. We prioritized the use of whole-exome sequencing, namely all coding exons in the genome of this individual. In our analyses, we filtered out variants that were too common in control individuals to describe a rare condition like ID. We focussed our attention on rare autosomic recessive varaiants (homozygous and compound heterozygous), these mutations were confirmed by Sanger re-sequencing to segregate with an autosomal recessive mode of inheritance in the family. We identified mutations in candidate genes for ID in some of the family analysed, we validated the functional impact of the mutations in these genes to confirm their involvement in the pathophysiology of ID in the family studied. We explained the molecular basis of ID in eight of the families studied. We identified the second case of Warsaw-Breakage-Syndrome, a rare genetic disorder characterised by dysfunction of the RNA helicase DDX11. We showed that disruption in TBC1D7, a functional subunit of the TSC1-TSC2 protein complex, cause ID and megalencephaly. We demonstrated that ASNS, the Asparagine Synthetase gene, is defective in patients with congenital microcephaly and progressive encephalopathy. We showed that the gene coding for the mitochondrial protein MAGMAS is involved in the pathophysiology of a condition characterised by developmental delay and severe skeletal dysplasia. We identified a truncating mutation in SPTBN2, encoding for the spinocerebellar ataxia 5 proteins, in a family with ID and spinocerellar ataxia. We also identified a mutation in a gene involved in the biosynthetic pathway of glycosylphosphatidylinositol anchors; the mutation in PIGN may cause the epilepsy and hypotonia features observed in the affected individuals of that family. Finally, we identified a loss of function mutation in CLPB, coding for a mitochondrial chaperone, in individuals with severe encephalopathy, hypereklexia and 3-methylglutaconic aciduria. The diagnostic potential of next generation sequencing technologies is undeniable. These technologies will revolutionize the world of molecular genetics; they will help deciphering the molecular basis of complex diseases like ID.

Notre travail s’est intéressé à l’albinisme oculocutané en étudiant ses aspects clinico- moléculaires. Malgré l’analyse approfondie des gènes connus d’albinisme oculocutané, 15 % des patients restent sans mutation identifiée indiquant que les mutations sont situées dans des régions géniques non analysées par les techniques classiques de diagnostic moléculaire, ou qu’il existe d’autres gènes d’albinisme oculocutané. Nous avons établi une base de données clinico- biologiques décrivant les caractéristiques de plus de 400 patients analysés. Des outils de diagnostic moléculaire ont été développés à la recherche de mutations situées dans les introns et les régions régulatrices et de réarrangements géniques. Différentes stratégies ont également été utilisées pour rechercher des gènes candidats. La puce à façon a permis l’identification de grands réarrangements dans les gènes TYR, OCA2 et SLC45A2 et un réarrangement complexe du gène OCA2 chez 2 patients non apparentés. L'analyse de gènes candidats nous a permis d'identifier, chez 5 patients non apparentés présentant un albinisme oculocutané non syndromique, des mutations dans le gène SLC24A5, très récemment associé à l’AOC6. Le séquençage d’exome de 6 patients a mis en évidence des gènes candidats pour lesquels des analyses complémentaires sont poursuivies afin de confirmer leur implication dans la pathogenèse de l’AOC.Les résultats de ce travail permettent de redéfinir les aspects cliniques et moléculaires de l’AOC, d’identifier de nouveaux mécanismes moléculaires à l’origine de l’AOC ainsi que des gènes candidats dont la fonction dans le développement pigmentaire reste à élucider. L’identification de nouveaux gènes impliqués dans l’AOC pourrait permettre de mieux comprendre et de mieux prendre en charge les patients avec un AOC. / Our work focused on oculocutaneous albinism (OCA) by studying its clinical and molecular aspects. Despite a thorough analysis of the known genes involved in oculocutaneous albinism, 15% of patients remain without diagnostic at the molecular level indicating that mutations are located in unexplored regions and are undetected by standard techniques or that other genes are involved in albinism. We established a clinicomolecular database describing more than 400 patients and developped molecular tools in order to improve molecular diagnostic including a custom high resolution array-CGH dedicated to the four OCA genes (TYR, OCA2, TYRP1 and SLC45A2). We also used different strategies to identify new genes. Array-CGH allows us to detect large deletion in TYR, OCA2 and SLC45A2 and a complexe rearrangement in OCA2 in 2 unrelated patients. We identified, in 5 patients presenting with a non syndromic OCA, mutations in SLC24A5, recently associated with OCA6. Exome sequencing of 6 different patients allows us to identify candidate genes, for which further studies are required to confirm their involvement in OCA pathogenesis. The results of this work allowed us to delineate clinical and genetics aspects of more than 400 OCA patients and to identify new molecular mechanisms leading to OCA and candidates genes for which exact nature of their functions has to be understood. Giving the complexity of pigmentary system development and its regulation, identification of new genes leading to OCA could help to better understand OCA and take care of patients

Mutações nos genes envolvidos na embriogênese hipofisária já foram descritas relacionadas a quadros isolados de deficiência hormonal múltipla e/ou associado a fenótipos extra-pituitários. As mutações encontradas em humanos foram descritas em genes envolvidos na embriogênese hipofisária e cujos fenótipos foram gerados em animais a partir de nocaute, servindo de ponto de partida para sua busca em pacientes com fenótipo similar. Essa estratégia é conhecida como busca por gene candidato, e é feita pela técnica de sequenciamento tradicional Sanger. Na última década, com o avanço de novas tecnologias de sequenciamento, diversos genes foram associados ao hipopituitarismo, principalmente utilizando-se a metodologia de exoma. Contudo, ainda há uma grande parcela dessa população sem diagnóstico molecular, como evidenciado em um levantamento na literatura por Fang e colaboradores e cuja tendência foi observada no ambulatório de Endocrinologia do Desenvolvimento do Hospital das Clínicas, onde apenas 14% dos pacientes tiveram o seu diagnóstico molecular determinado. Com isso, as tecnologias de sequenciamento de última geração, passaram a ser uma ferramenta promissora para determinação molecular dos fenótipos dos pacientes. Logo, alguns pacientes em seguimento no ambulatório de endocrinologia do desenvolvimento tiveram o exoma sequenciado, e uma análise das métricas do sequenciamento evidenciou regiões de cobertura muito baixa, o que não permitiu a conclusão sobre a presença ou ausência de variantes nessas regiões. Entre essas regiões estão os genes SOX2 e SOX3, os quais possuem variantes conhecidas causadoras do fenótipo. Esse trabalho tem como objetivo analisar a cobertura dos genes envolvidos na embriogênese hipofisária assim como os relacionados ao hipopituitarismo congênito em quatro diferentes kits de preparação de biblioteca para exoma, a fim de identificar a melhor metodologia para um diagnóstico molecular dos pacientes alem determinar variantes especificas da população brasileira na região de interesse através de busca no site ABraOM. Foram analisados 76 genes em um total de 119 amostras separadas em três grupos, sendo o primeiro grupo de amostras HapMap, o segundo de um paciente com hipopituitarismo e sua mãe e o terceiro de amostras brasileiras aleatórias. Os kits utilizados foram NimbleGen (Roche), Nextera (Illumina), SureSelect e SureSelect+UTR (Agilent). Para isso, foram utilizados diversos programas de bioinformática, tendo entre eles o FASTQC, BWA, GATK, Annovar, Qualimap e bedTools. Análises da qualidade do sequenciamento, assim como a taxa de mapeamento e duplicação mostraram que as amostras utilizadas apresentavam qualidades adequadas e similares entre si para a análise. De acordo com os resultados obtidos em relação a cobertura, o kit da NimbleGen apresenta uma queda em sua cobertura dos genes de interesse em relação a sua capacidade de cobertura do exoma global, algo que pode ser devido à alta taxa de GC na região de interesse, uma vez que a capacidade do kit nessas regiões é deficiente em relação aos demais. Os genes com piores coberturas em todas as quatro tecnologias foram os genes HES5, que apesar de fazer parte da embriologia hipofisária, não possui variante relacionada ao fenótipo em humanos, e o SOX3 que, apesar de ter muita baixa cobertura na NimbleGen, é bem coberto na SureSelect. Isso corrobora com a análise de capacidade de cobertura em regiões com alta taxa de GC. Somado a isso observou-se que a população brasileira tem 885 variantes únicas e exclusivas. Concluímos, portanto, que o kit SureSelect, da Agilent, tem o melhor desempenho na região de interesse, assim como no exoma global, sendo o indicado para estudos em coortes de hipopituitarismo e a população brasileira possui variantes únicas inerentes a ela / Mutations in the genes involved in pituitary embryogenesis have been described related to isolated cases of multiple hormonal deficiency and/or associated with extra-pituitary phenotypes. Mutations found in humans were described in genes involved in pituitary embryogenesis by generating phenotypes knockout animals, serving as the starting point for their search in patients with similar phenotype. This strategy is known as gene candidate search and is performed by the traditional Sanger sequencing technique. In the last decade, with the advancement of new sequencing technologies, several genes have been associated with hypopituitarism, mainly using the exome methodology. However, there is still a large portion of this population without molecular diagnosis, as evidenced by a survey in the literature by Fang et al., This trend was also observed in the outpatient clinic of Developmental Endocrinology of Hospital das Clínicas, where only 14% of the patients had their molecular diagnosis. With this, high throughput sequencing technologies have become a promising tool for the molecular determination of patients\' phenotypes. Therefore, we sequenced the exome of some of our patients, and an analysis of the sequencing quality showed very low coverage regions, which harms the researcher\'s ability to reach a conclusion regarding presence or lack of variants in these regions. Among these regions are the SOX2 and SOX3 genes, which have many variants that are known to cause the phenotype. This work aims to analyze the coverage of the genes involved in pituitary embryogenesis as well as those related to congenital hypopituitarism in four different exome library preparation kits in order to identify the best methodology for a molecular diagnosis of the patients and to determine specific variants of the Brazilian population in the region of interest by searching the ABraOM website. A total of 76 genes were analyzed in a total of 119 samples in three groups: the first group of HapMap samples, the second of a patient with hypopituitarism and his mother, and the third group of random Brazilian samples. The kits used were NimbleGen (Roche), Nextera (Illumina), SureSelect and SureSelect + UTR (Agilent). For this, several bioinformatics programs were used, among them FASTQC, BWA, GATK, Annovar, Qualimap and bedTools. Sequencing quality analysis, as well as the mapping and duplication rate, showed that the samples used presented adequate and similar qualities for the comparison. According to the results obtained in relation to the coverage, the NimbleGen kit shows a drop in its coverage of the genes of interest in relation to its capacity to cover the global exome, something that may be due to the high GC rate in the region of interest, once the capacity of the kit in these regions is not as good as the others. The genes with the worst coverage in all four technologies were the HES5 gene, which despite being part of the pituitary embryology, have no phenotype-related variant in humans, and SOX3 which, despite having very low coverage in NimbleGen, is well covered on SureSelect. This corroborates the analysis of coverage capacity in regions with a high GC rate. In addition to this it was observed that the Brazilian population has 885 unique and exclusive variants. Therefore, we conclude that the Agilent\'s SureSelect kit has the best performance in the region of interest, as well as in the global exome, being recommended for studies in hypopituitarism cohorts, and that the Brazilian population has unique variants inherent to it

L'épilepsie est une affection neurologique chronique qui se définit par la répétition de crises épileptiques, signe de l'hyperactivité paroxystique d'un groupe de neurones corticaux. Ces dernières années, plusieurs gènes responsables d'épilepsies monogéniques ont été mis en évidence. Notre travail avait pour objectif l'identification d'anomalies génétiques responsables ou favorisants certaines formes d'épilepsies de l'enfant. Ce travail est composé de quatre études complémentaires. La première était l'exploration pangénomique d'une cohorte de 47 patients porteurs d'épilepsie à paroxysme rolandique (EPR) par CGH array, à la recherche de variations de nombre de copies (CNV) récurrentes. Nous avons ainsi pu mettre en évidence plusieurs CNVs emportant des gènes impliqués dans l'épilepsie, dont PRRT2 et GRIN2A. La deuxième reposait sur la même approche appliquée à une cohorte de 8 patients tunisiens présentant des spasmes infantiles. Elle a permis d'identifier une délétion 9q34.3 emportant le gène EHMT1, responsable du syndrome de Kleefstra et une duplication 15q13.1, région impliquée dans des troubles du neurodéveloppement. Pour la troisième étude, nous avons comparé deux techniques de capture pour séquençage à haut débit d'un panel de gènes impliqués dans les épilepsies de l'enfant, à partir des échantillons de 24 patients épileptiques. Cette approche nous a permis de mettre au point un logiciel d'analyse de couverture, que nous avons nommé DeCovA. Lors de la dernière étude, nous avons appliqué une stratégie de séquençage d'exome en trio pour explorer 10 patients porteurs des spasmes infantiles. Nous avons ainsi pu mettre en évidence des variants pathogènes de novo chez quatre patients,impliquant les gènes KCNQ2, SCN1A, NR2F1 et ALG13. Nos résultats confirment ainsi la place importante de la génétique et l'intérêt majeur des nouvelles technologies dans l'exploration étiologique des épilepsies de l'enfant / Epilepsy is a chronic neurological disorder characterized by repeated epileptic seizures, a sign of cortical neurons paroxysmal hyperactivity. In recent years, several monogenic genes involved in epilepsy have been identified. The aim of our work is to identify new genetic abnormalities responsible for childhood epilepsies. This work is divided into four complementary studies. First, we searched copy number variation (CNV) by pangenomic exploration of a cohort of 47 patients with Rolandic epilepsy (RE) using CGH array. We identified several CNVs carrying genes involved in epilepsy, including PRRT2 and GRIN2A (genes). Secondly, the same approach was applied to a cohort of 8 Tunisian patients with infantile spasms. It allowed the identification of a 9q34.3 deletion includingEHMT1, implicated in Kleefstra syndrome and a 15q13.1 duplication, known to be involved in neurodevelopment disorders. For the third study, we compared two library-building methods for a gene-targeted panel for the diagnosis of Monogenic childhood epilepsies, in a cohort of 24 epileptic patients. This approach allowed us to develop a coverage analysis software, which we named DeCovA. In the last study, we used a trio-based exome-sequencing approach to look for de novo mutations in 10 patients with infantile spasms. We found de novo pathogenic variants in four patients, involving KCNQ2, SCN1A, NR2F1, and ALG13. Our results confirm the increasing role of genetics and the major interest of new technologies in the etiological exploration of childhood epilepsy