Título de Ingeniera en Biotecnología Molecular / La comprensión del funcionamiento del sistema nervioso humano se ha dificultado por la inaccesibilidad del tejido y la incapacidad de los modelos celulares y animales de recapitular su fisiología. Adicionalmente, el estudio de los mecanismos moleculares que subyacen al envejecimiento y a las enfermedades neurodegenerativas asociadas a él, se ha realizado históricamente utilizando animales jóvenes modificados genéticamente, que no han logrado reproducir con exactitud las patologías ni los fenotipos asociados a la vejez. Actualmente existen alternativas como la diferenciación de iPSC (del inglés induced pluripotent stem cell) o la reprogramación directa de células somáticas para obtener neuronas funcionales. Existe evidencia que la reprogramación directa permite que las células mantengan características asociadas a la edad de las células de inicio, lo que la convierte en una alternativa atractiva para el estudio del envejecimiento. Además de las estrategias de reprogramación directa basadas en la sobreexpresión de factores de transcripción, se han desarrollado alternativas como la reprogramación mediada por fármacos. Se ha reportado que es posible diferenciar directamente fibroblastos embrionarios de ratón (MEF, del inglés mouse embryonic fibroblast) a partir de un cóctel de fármacos (FICSB: Forskolina, ISX-9, CHIR990210, SB431542, I-BET151) que actúan sobre distintas vías de señalización y producen el cambio en el destino celular. Este seminario tiene como objetivo principal la estandarización de un protocolo de reprogramación directa aplicable a MEF y fibroblastos dermales murinos, que permitan caracterizar este proceso y desarrollar una prueba de concepto para posteriormente aplicar este protocolo a células derivadas de humanos. Con este objetivo, se realizaron cultivos primarios de MEF y la estandarización de un protocolo de obtención de fibroblastos dermales a partir de biopsias de piel de ratón. Se logró obtener poblaciones de MEF y de fibroblastos dermales, que son proliferativas y 2 susceptibles a la inducción neuronal. Posteriormente, las poblaciones obtenidas se sometieron a la reprogramación mediada por los fármacos FICSB y se obtuvieron neuronas inducidas. Se observó que las células experimentan cambios morfológicos drásticos, se determinó la eficiencia de la inducción a partir de la expresión de βIII-tubulina, que fue de aproximadamente 15% para los MEF. Se analizó mediante inmunocitoquímica la expresión de marcadores neuronales de citoesqueleto a los 7 y 12 días post inducción y se obtuvo que las neuronas inducidas a partir de MEF expresan los marcadores neuronales βIII-tubulina, pE-tubulina, MAP2 y tau-1, no obstante, su expresión es diferente a la que presentan las neuronas hipocampales primarias y no se observó expresión de marcadores de sinapsis, asociados a la madurez neuronal. Las inducciones sólo duraron 12-14 días debido a la alta tasa de muerte celular, por lo que se intentó disminuir la concentración de I-BET151, uno de los compuestos más citotóxicos del cóctel de fármacos. Se observó que, si bien aumenta la sobrevida, disminuye la eficiencia de la inducción. Adicionalmente, se comparó la eficiencia de la inducción entre MEF y fibroblastos dermales y se observó que los MEF son más susceptibles a la inducción neuronal. En conjunto, estos resultados aportan al desarrollo de una novedosa herramienta que nos permitirá estudiar el envejecimiento neuronal. / The comprehension of the human nervous system function so far has been difficult mainly due to the inaccessibility of the brain and live neurons and the lack of suitable animal and cellular models. Additionally, the study of the molecular mechanisms underlying aging and associated neurodegenerative diseases has been done historically in genetically modified young animal, that haven’t been able to reproduce these pathologies and other age-related phenotypes. There are strategies like iPSC differentiation or direct reprogramming to convert somatic cells into functional neurons. Moreover, directly reprogrammed cells retain aging-associated hallmarks and transcriptomic signatures, which make them an attractive alternative to study aging. Besides direct reprogramming based on ectopic expression of transcription factors, pharmacological approaches have been examined. Direct conversion of mouse embryonic fibroblasts (MEF) into functional neurons mediated by a small molecule cocktail (FICSB: Forskolin, ISX-9, CHIR990210, SB431542, I-BET151) has been reported, that targets different signaling pathways and allow the cell fate change. The main aim of this seminar is to standardize a direct reprogramming protocol in our laboratory that mediates MEF and mouse dermal fibroblasts conversion to induced neurons, to characterize the process and develop a proof of concept to eventually achieve direct reprogramming of human cells. First, we obtained primary MEF cultures and standardized a protocol to obtain dermal fibroblasts from mouse skin biopsies. We obtained proliferative MEF and dermal fibroblast populations, which are suitable for the neuronal induction protocol. Second, MEF and dermal fibroblast were treated with the induction medium and the small molecule cocktail and we obtained induced neurons (iN). We observed early and drastic morphological changes based on βIII-tubulin immunostaining and we estimated a 15% induction efficiency. Furthermore, other neuronal cytoskeleton markers expression were evaluated with 4 immunohistochemical analysis at day 7 and 12 post induction and we detected pE-tubulin, MAP2/tau-1 expression. Nevertheless, iN expression of these markers is lower than in primary neurons used as control and we did not detect synaptic markers expression, which are linked to neuronal maturation. To date, our chemical-based inductions have lasted 12-14 days due to high cell death rate during the reprogramming protocol. To promote higher cell survival and longer induction periods we decreased the I-BET151 concentration, which has been reported as the most cytotoxic compound of the cocktail. Indeed, we observed greater cell survival but also less efficiency. To evaluate the differences between MEF and dermal fibroblast induction we analyzed efficiency in both populations and observed that MEF are more likely to reprogram with this protocol. Together, these results contribute to developing a powerful strategy to study neuronal aging.

Orientador: James Venturini / Resumo: Paracoccidioidomicose (PCM) é uma micose sistêmica causada por fungos do gênero Paracoccidioides; suas principais formas clínicas são aguda/subaguda e crônica (FC). Restrita à América Latina, a PCM apresenta alta incidência no Brasil, Colômbia e Venezuela, especialmente entre os trabalhadores rurais. A maioria dos pacientes com a forma crônica da doença, mesmo após tratamento eficaz, apresentam sequelas, incluindo fibrose pulmonar (FP). Os problemas sociais, econômicos e psicológicos desencadeados pela FP são subestimados. Apesar da fibrogênese na PCM ser reconhecida como um processo precoce, seus mecanismos não estão totalmente conhecidos. Assim, o presente estudo tem por objetivo avaliar a influência de componentes dos isolados fúngicos e do hospedeiro sobre fibroblastos pulmonares. Foram utilizados fibroblastos pulmonares humanos da linhagem MRC-5 e fibroblastos pulmonares murinos, isolados de camundongos BALB/c. Fibroblastos foram cultivados in vitro com exoantígenos de isolados das espécies P. brasiliensis (Pb18 e Pb326) e P. lutzii (Pb01, Pb8334 e Pb66); gp43 purificada, e soros de pacientes com FC em diferentes momentos do tratamento (antes do tratamento, cura clínica, cura sorológica e cura aparente). Após 24 horas de cultivo, foram avaliadas a proliferação celular e produção de citocinas e fatores de crescimento por fibroblastos murinos e humanos. Nossos resultados demonstraram que componentes do fungo interferem em fibroblastos pulmonares, pela indução da proliferaç... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Mestre

Submitted by Alessandra Portugal (alessandradf@ioc.fiocruz.br) on 2013-10-01T22:07:36Z No. of bitstreams: 1 Andressa Moraes Guimarães da Silva.pdf: 6335373 bytes, checksum: a2c35eb3696b4a81ce4e63f9767befbf (MD5) / Made available in DSpace on 2013-10-01T22:07:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Andressa Moraes Guimarães da Silva.pdf: 6335373 bytes, checksum: a2c35eb3696b4a81ce4e63f9767befbf (MD5) Previous issue date: 2012 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A silicose é uma doença pulmonar, de caráter restritivo, causada pela inalação de partículas de sílica cristalina. Se caracteriza pela indução de uma inflamação crônica associada à intensa proliferação de fibroblastos e acúmulo exacerbado de componentes de matriz extracelular, e para a qual não há um tratamento eficaz. Os fibroblastos são considerados alvos cruciais em doenças de natureza fibrótica e o desenvolvimento de sistemas que permitam avaliar a reatividade destas células é de fundamental importância na busca por terapias anti-fibróticas. No presente estudo foi desenvolvido um sistema de cultura primária em 3D (esferóides), utilizando fibroblastos provenientes do pulmão de camundongos normais e silicóticos objetivando analisar comparativamente os aspectos morfológicos/funcionais de ambas as populações celulares. Os fibroblastos foram obtidos a partir da dissociação mecânica/enzimática dos pulmões de camundongos Swiss-Webster 7 dias após a instilação intranasal de salina (controle) ou sílica (10 mg/animal). Após a terceira passagem, as células foram cultivadas em placas de 96 poços, revestidas com agarose, na ausência ou presença de IL-13 (40 ng/mL), sendo os esferóides avaliados quanto a aspectos morfológicos (tamanho/diâmetro médio/constituição), e funcionais tais como: proliferação, produção de citocinas (TGF-b e quimiocinas (MCP-1)) e de colágeno. Através da análise por microscopia de luz invertida, verificamos que os esferóides contendo fibroblastos de animais normais e silicóticos mostraram progressiva diminuição do tamanho/diâmetro, e maior densidade, ao longo do tempo analisado (1 – 4 dias), com os silicóticos apresentando valores sempre superiores aos dos controles. A estimulação com IL-13 induziu claro aumento de tamanho/diâmetro em ambas as populações de esferóides. A análise por microscopia eletrônica de varredura (MEV) revelou haver diferenças morfológicas importantes entre os grupos normal e silicótico, no que tange ao formato e à constituição celular, com expressivo aumento no conteúdo de matriz extracelular detectado na condição de estimulação com IL-13. De forma interessante, foi observado que os esferóides silicóticos apresentaram níveis basais aumentados de proliferação celular e secreção de TGF-b, assim como de colágeno, em comparação aos dos controles. Tanto esferóides normais quanto silicóticos foram sensíveis à estimulação com IL-13, sendo verificado aumento equivalente na taxa de proliferação e nos níveis de TGF-b e MCP-1 em ambos os grupos. No que tange a produção de colágeno, os esferóides normais mostraram-se responsivos à IL-13 enquanto os silicóticos não. Em conjunto, nossos achados mostraram que os fibroblastos pulmonares de camundongos adultos são: (i) passíveis de serem cultivados em sistema de cultura 3D; (ii) responsivos à estimulação com IL-13 e que; (iii) os esferóides silicóticos apresentam características de ativação em comparação aos normais. Além disso, este modelo mostrou-se reprodutível e promissor quanto a possibilidade de utilização futura na busca por compostos com atividade antifibrótica. / Silicosis is a restrictive pulmonary disease caused by inhalation of crystalline silica particles, which is characterized by chronic inflammation associated with intense fibroblast proliferation and exacerbated accumulation of extracellular matrix components. There is no effective treatment for this disease. Fibroblasts are considered crucial cells in fibrosis, and the development of systems which lead to evaluate their reactivity is important in the search for anti-fibrotic therapy. In this study we aimed to establish a system of primary cell culture in 3D (spheroids) using lung fibroblasts from normal and silicosis mice, in order to perform a comparative analysis of morphological/functional aspects of both cell populations. Fibroblasts were obtained after mechanical/enzymatic dissociation of the lung tissue from Swiss- Webster mice, 7 days after intranasal instillation of saline (control) or silica (10 mg / animal). After the third passage, the cells were cultured in 96-well plates coated with agarose, in the absence or presence of IL-13 (40 ng/ml) and the spheroids were evaluated regarding the morphological (size/diameter/constitution) and functional parameters (proliferation and generation of cytokine (TGF-b), chemokine (MCP-1) and collagen. By means of inverted light microscopy, we noted that spheroids containing fibroblasts from normal and silicotic animals showed a progressive reduction in size/ diameter and increase in density when analyzed for 1 - 4 days of culture. Those from silicotic mice showed themselves bigger as compared to controls. Stimulation with IL-13 induced an increase in size/diameter of both cell populations. The analysis by scanning electron microscopy (SEM) revealed significant morphological differences between normal and silicotic groups, with a significant increase in the content of extracellular matrix being detected under condition of stimulation with IL-13. Interestingly, we observed that spheroids with cells from silicotic mice showed increased basal levels of cell proliferation and secretion of TGF-b and collagen as compared to the controls. Both spheroid populations were sensitive to IL-13 stimulation as attested by increased cell proliferation as well as TGF-b and MCP-1 levels. Increased collagen production was detected only in the case of normal cells. Altogether, our findings show that adult mouse lung fibroblasts grow in a 3D culture system, that they are responsive to IL-13 stimulation and that those from silicotic mice showed an activated phenotype as compared to the controls. Thus, this experimental model seems to be reproducible and promising in the case of searching for anti-fibrotic compounds.

Tesis Presentada a la Universidad de Chile para optar al Grado de Doctor en Farmacología / El inflamasoma NLRP3 es un complejo multiproteico ampliamente estudiado en el sistema inmune. Las investigaciones realizadas se han centrado, especialmente en estos últimos años, en su participación en el inicio y desarrollo de enfermedades crónicas no transmisibles. Este complejo se compone de tres proteínas diferentes: NLRP3 (receptor intracelular), ASC (proteína adaptadora) y caspasa-1 (enzima), y posee la peculiaridad de que su activación está comandada por dos diferentes señales. La primera señal corresponde a patrones moleculares asociados a daño (DAMPS) o a patógenos (PAMPS) que generan la activación de receptores de reconocimiento de patrones (PRR) ubicados en la membrana plasmática, como los receptores de tipo Toll (TLR). La activación de estos receptores, induce la síntesis de la citoquina blanco de caspasa-1: pro-IL-1β. La segunda señal son moléculas muy específicas que generan, indirectamente, la activación de NLRP3, lo que conlleva el reclutamiento de ASC y pro-caspasa-1 y la activación de caspasa-1, quedando esta enzima lista para escindir su blanco: pro-IL-1β a IL-1β. Una vez activada IL-1β, es secretada hacia el medio extracelular. La activación del inflamasoma a nivel cardiaco es un hecho poco comprendido. Se ha establecido que los fibroblastos cardíacos (FC) serían las células que activarían su propio inflamasoma NLRP3 y secretarían IL-1β hacia el medio extracelular en modelos de daño cardiaco. No obstante, se desconocen señales propias del corazón que generen la activación del inflamasoma. En este trabajo se plantea que Angiotensina II (Ang II) sería una señal 2 de activación del inflamasoma en FC. Este planteamiento surgió debido a que los FC presentan receptores de Ang II, los que activados llevan a un aumento citosólico de la concentración de Ca2+ (proveniente desde el retículo), evento que ha sido relacionado con la activación de NLRP3 en células inmunes. La hipótesis de este trabajo de tesis establece que Angiotensina II a través de la vía transduccional AT1R/PLC/IP3R/Ca+2 activa el inflamasoma NLRP3 en fibroblastos cardiacos, conduciendo a la escisión y secreción de IL-1β. Mientras que los objetivos se resumen en, investigar si las proteínas del inflamasoma NLRP3 y pro-IL-1β son expresadas en FC, estudiar si Ang II activa al inflamasoma NLRP3, a través de la cascada transduccional AT1R/PLC/IP3R/Ca+2 y evaluar si Ang II induce la escisión y secreción de IL-1β hacia el medio extracelular. A partir de cultivos primarios de FC de rata neonata, se estableció que los FC expresan los componentes del inflamasoma, y que éstos no son inducidos por lipopolisacárido (LPS) 1 μg/mL (señal 1). Asimismo, se determinó que pro-IL-1β presenta niveles basales muy bajos y que su expresión es inducida por LPS de manera tiempo dependiente. Se realizaron tres metodologías distintas para demostrar que Ang II 1 μM activa el inflamasoma: 1) Por inmunocitoquímica se demostró que existe colocalización de NLRP3 y ASC al estimular los FC con Ang II; 2) Por cuantificación de la actividad de caspasa- 1, se demostró que Ang II estimula la actividad de caspasa-1 respecto de los controles y 3) Por cuantificación de la secreción de IL-1β por ELISA, se demostró que Ang II estimula la secreción de IL-1β hacia el medio extracelular. Para dilucidar la cascada de señalización responsable de activar el inflamasoma, se intervino utilizando los inhibidores Losartán, U73122 y 2-APB, y el quelante de Ca2+ BAPTA-AM. A partir los resultados obtenidos se demostró que Ang II induce la activación de inflamasoma a través de la señalización comprendida por el receptor de angiotensina II tipo 1 (AT1), fosfolipasa C (PLC), receptor de inositol trifosfato (IP3R) y Ca2+. Adicionalmente, se demostró por silenciamiento génico de NLRP3 con siRNA y por el uso de un bloqueador irreversible de caspasa-1, YVAD, que el inflamasoma activado por Ang II sería el conformado por NLRP3 y caspasa-1. Finalmente, se pudo demostrar que la secreción de IL-1β inducida por Ang II, sería a través de un mecanismo no clásico de secreción de proteínas, donde estaría involucrado el transporte vesicular. Se concluyó que Ang II a través de la vía transduccional AT1R/PLC/IP3R/Ca+2 activaría el inflamasoma NLRP3 en FC, conduciendo a la secreción, por transporte vesicular, de IL-1β hacia el medio extracelular / The NLRP3 inflammasome is a multiprotein complex studied extensively in the immune system. The research has been carried out, especially in recent years, in its participation in the initiation and development of chronic non-communicable diseases. The NLRP3 inflammasome is consists of three different proteins: NLRP3 (intracellular receptor), ASC (adapter protein) and caspase-1 (enzyme), and has the peculiarity that its activation is commanded by two different signals. The first signal corresponds to damage associated molecular patterns (DAMPs) or pathogen (PAMPS) that generates the activation of pattern recognition receptor (PRR) located on the plasma membrane as Toll-like receptor (TLR). Activation of these receptors induces the synthesis of the target cytokine of caspase-1: pro- IL-1β. The second signals are very specific molecules that indirectly activate NLRP3, leading to the recruitment of ASC and pro-caspase-1 and activation of caspase-1, being this enzyme ready to cleave its target: pro-IL-β to IL-1β. Once activated IL-1β is secreted into the extracellular medium. Inflammasome activation at cardiac level is a little understood fact. It has been established that cardiac fibroblasts (CF) would activate its NLRP3 inflammasome and secrete IL-1β into the extracellular environment in models of heart damage. However, own heart signals that generate activation inflammasome are unknown. This study suggested that Ang II would be a signal 2 for the activation of the inflammasome in FC. This approach emerged because the CF express Ang II receptors, which lead to increase cytosolic Ca2 + concentration (coming from the reticle), a phenomenon that has been linked to the activation of NLRP3 in immune cells. The hypothesis of this thesis establishes that Angiotensin II through the signal transduction pathway AT1R/PLC/IP3R/Ca+2 activates the inflammasome NLRP3 in cardiac fibroblasts, leading to cleavage and secretion of IL-1β. While the objectives are summarized in, to investigate whether proteins inflammasome NLRP3 and pro-IL-1β are expressed in FC, to study whether Ang II activates the inflammasome NLRP3, through the signal transduction cascade AT1R/PLC/IP3R/Ca+2 and to evaluate whether Ang II induces excision and secretion of IL-1β into the extracellular environment. Previously, from primary cultures of neonatal rat CF, it was established that the CF express inflammasome components and that they are not induced by LPS (signal 1). It was also determined that pro-IL-1β has very low basal levels and that its expression is induced by LPS in a time-dependent manner. Three different methodologies to demonstrate that Ang II activates the inflammasome were performed.1) Immunocytochemistry showed that NLRP3 and ASC colocalizate after stimulating CF with Ang II. 2) Quantitation of caspase-1 activity was demonstrated that Ang II induces an increase in caspase-1 activity compared to controls. 3) Finally, the secretion of IL-1β was quantified by ELISA, demonstrating that Ang II induced IL-1β secretion to the extracellular medium. To elucidate the signaling pathway triggered by Ang II, the signaling was intervened using inhibitors: Losartan, U73122 and 2-APB; and the Ca2+ chelator BAPTA-AM. The results obtained demonstrated that Ang II induce the activation of the inflammasome through signaling conformed by the angiotensin II receptor type 1 (AT1), phospholipase C (PLC), inositol triphosphate receptor (IP 3 R) and Ca2+. Additionally, silencing NLRP3 with siRNA and using an irreversible inhibitor of caspase-1 YVAD, the inflammasome activated by Ang II is the conformed by NLRP3 and caspase-1. Finally, was demonstrated that the IL-1β secretion induced by Ang II, would be through a non-classical protein secretion mechanism, which would be involved the vesicular transport. We conclude that Ang II through the signal transduction pathway AT1R / PLC / IP3R / Ca+2 activates the NLRP3 inflammasome in CF, leading to the secretion of IL-1β by vesicular transport to the extracellular medium / Conicyt; Fondap; Fondecyt / 2017

O câncer de mama é o mais freqüente tipo de câncer entre mulheres e representa a segunda causa de morte dentre elas (após o câncer de pulmão). O deterioramento do perfil antioxidante (atividade de SOD e CAT) e/ou do reparo de DNA podem elevar os riscos de uma transformação maligna, devido ao acúmulo de mutações espontâneas em genes importantes nos processos tumorais. Neste trabalho, foram determinados (capítulo 1) os níveis de danos no DNA, endógenos e induzidos por peróxido de hidrogênio, em linfócitos de sangue periféricos de pacientes com câncer de mama, e também se analisou o perfil antioxidante do plasma desses indivíduos. Os resultados demonstraram claramente uma relação entre os níveis de danos endógenos no DNA e a atividade de SOD, onde altos níves de danos endógenos estão correlacionados com uma baixa atividade dessa enzima. Além disso, as pacientes apresentaram uma menor capacidade de reparo aos danos induzidos pelo peróxido de hidrogênio, quando comparados com os controles. Sabe-se que muitas drogas qumioterápicas (como doxorrubicina) têm como alvo o DNA, com isso a citotoxicidade desses agentes está diretamente relacionada com sua habilidade de causar danos no material genético. Os mecanismos de reparo de danos no DNA constituem um dos tópicos mais interessantes na biologia moderna, uma vez que as proteínas inseridas nesses processos podem estar envolvidas na manutenção da integridade genômica, assim como na resistência de certos tumores a estratégias de terapia antitumoral. O reparo por excisão de nucleotídeos (NER) é um mecanismo de reparo altamente conservado que envolve mais de 30 proteínas, dentre elas a proteína XPD, a qual é uma subunidade do complexo TFIIH, envolvido nos processos de transcrição e reparo. Assim, no capítulo 2, foi determinada a sensibilidade de três linhagens de fibroblastos humanos deficientes no gene XPD à doxorrubicina (DOX). Os resultados apresentados nesse capítulo mostraram a maior sensibilidade das linhagens XPD e XP/CS quando comparados com TTD e MRC5 (linhagem normal), assim como a indução de foci de γH2AX (indicativo de quebras de dupla fita) pela DOX de forma tempo dependente. Com os resultados obtidos nesse trabalho é possível enfatizar a utilização de linfócitos de sangue periférico para o monitoramento de genotoxicidade a terapias antitumorais, bem como sugerir a participação do NER no reparo de lesões causadas por DOX. / Breast cancer is the most common malignancy among women and it is the second cause of death among them (after lung cancer). Impaired antioxidant status and/or DNA repair may elevate the risk of malignant transformation of breast cells due to the accumulation of spontaneous mutations in target genes in tumor processes. In this work, we have determined (chapter 1) the DNA damage levels, either endogenous or induced by hydrogen peroxide, in peripheral blood lymphocytes of breast cancer patients, as well as the antioxidant status in the plasma of these individuals. The results clearly showed a relation between endogenous DNA damage levels and SOD activity, where high endogenous damage levels are correlated with low SOD activity. Moreover, the patients presented a lower DNA damage repair capacity to the damages induced by hydrogen peroxide than the controls. It is very well known that many chemotherapeutic drugs (like doxorubicin) target DNA and therefore the citotoxicity of these agents is directly related to their ability to cause DNA damage. The mechanisms of DNA damage repair are one of the most interesting topics in modern biology, since the proteins that take part in these processes can be involved in both the maintenance of genomic integrity and in the resistance of certain tumors to anti-tumoral strategies. Nucleotide Excision Repair (NER) is a highly conserved repair mechanism that involves more than 30 proteins, among them the XPD protein, which is a subunit of the TFIIH complex, involved both in transcription and repair. Thus, in chapter 2, we have determined the sensitivity of three different human fibroblasts deficient in XPD gene to doxorubicin (DOX). The results showed in this chapter demonstrated a higher sensitivity of XPD and XP/CS cell lines to DOX than TTD and MRC5 (normal cells), as well as the induction of γH2AX foci (indicative of double strand breaks) by DOX in a time-dependent manner. With the results obtained in this work it is possible to emphasizes the use of peripheral blood lymphocytes to monitoring genotoxicity to therapies, as well as to suggest the a role of NER in the repair of lesions caused by DOX.

O câncer de mama é o mais freqüente tipo de câncer entre mulheres e representa a segunda causa de morte dentre elas (após o câncer de pulmão). O deterioramento do perfil antioxidante (atividade de SOD e CAT) e/ou do reparo de DNA podem elevar os riscos de uma transformação maligna, devido ao acúmulo de mutações espontâneas em genes importantes nos processos tumorais. Neste trabalho, foram determinados (capítulo 1) os níveis de danos no DNA, endógenos e induzidos por peróxido de hidrogênio, em linfócitos de sangue periféricos de pacientes com câncer de mama, e também se analisou o perfil antioxidante do plasma desses indivíduos. Os resultados demonstraram claramente uma relação entre os níveis de danos endógenos no DNA e a atividade de SOD, onde altos níves de danos endógenos estão correlacionados com uma baixa atividade dessa enzima. Além disso, as pacientes apresentaram uma menor capacidade de reparo aos danos induzidos pelo peróxido de hidrogênio, quando comparados com os controles. Sabe-se que muitas drogas qumioterápicas (como doxorrubicina) têm como alvo o DNA, com isso a citotoxicidade desses agentes está diretamente relacionada com sua habilidade de causar danos no material genético. Os mecanismos de reparo de danos no DNA constituem um dos tópicos mais interessantes na biologia moderna, uma vez que as proteínas inseridas nesses processos podem estar envolvidas na manutenção da integridade genômica, assim como na resistência de certos tumores a estratégias de terapia antitumoral. O reparo por excisão de nucleotídeos (NER) é um mecanismo de reparo altamente conservado que envolve mais de 30 proteínas, dentre elas a proteína XPD, a qual é uma subunidade do complexo TFIIH, envolvido nos processos de transcrição e reparo. Assim, no capítulo 2, foi determinada a sensibilidade de três linhagens de fibroblastos humanos deficientes no gene XPD à doxorrubicina (DOX). Os resultados apresentados nesse capítulo mostraram a maior sensibilidade das linhagens XPD e XP/CS quando comparados com TTD e MRC5 (linhagem normal), assim como a indução de foci de γH2AX (indicativo de quebras de dupla fita) pela DOX de forma tempo dependente. Com os resultados obtidos nesse trabalho é possível enfatizar a utilização de linfócitos de sangue periférico para o monitoramento de genotoxicidade a terapias antitumorais, bem como sugerir a participação do NER no reparo de lesões causadas por DOX. / Breast cancer is the most common malignancy among women and it is the second cause of death among them (after lung cancer). Impaired antioxidant status and/or DNA repair may elevate the risk of malignant transformation of breast cells due to the accumulation of spontaneous mutations in target genes in tumor processes. In this work, we have determined (chapter 1) the DNA damage levels, either endogenous or induced by hydrogen peroxide, in peripheral blood lymphocytes of breast cancer patients, as well as the antioxidant status in the plasma of these individuals. The results clearly showed a relation between endogenous DNA damage levels and SOD activity, where high endogenous damage levels are correlated with low SOD activity. Moreover, the patients presented a lower DNA damage repair capacity to the damages induced by hydrogen peroxide than the controls. It is very well known that many chemotherapeutic drugs (like doxorubicin) target DNA and therefore the citotoxicity of these agents is directly related to their ability to cause DNA damage. The mechanisms of DNA damage repair are one of the most interesting topics in modern biology, since the proteins that take part in these processes can be involved in both the maintenance of genomic integrity and in the resistance of certain tumors to anti-tumoral strategies. Nucleotide Excision Repair (NER) is a highly conserved repair mechanism that involves more than 30 proteins, among them the XPD protein, which is a subunit of the TFIIH complex, involved both in transcription and repair. Thus, in chapter 2, we have determined the sensitivity of three different human fibroblasts deficient in XPD gene to doxorubicin (DOX). The results showed in this chapter demonstrated a higher sensitivity of XPD and XP/CS cell lines to DOX than TTD and MRC5 (normal cells), as well as the induction of γH2AX foci (indicative of double strand breaks) by DOX in a time-dependent manner. With the results obtained in this work it is possible to emphasizes the use of peripheral blood lymphocytes to monitoring genotoxicity to therapies, as well as to suggest the a role of NER in the repair of lesions caused by DOX.

Leucodistrofia metacromática (LDM) é uma doença autossômica recessiva causada pela deficiência da enzima arilsulfatase A (ARSA) que afeta primariamente o sistema nervoso central (SNC). Tratamentos em estudos incluem a terapia de reposição enzimática e o transplante de medula óssea, porém com limitações devido à barreira hemato-encefálica (BHE). Uma alternativa seria a implantação no cérebro de células encapsuladas superexpressando ARSA, simulando a reposição enzimática sem injeções repetidas e eliminando a necessidade de transpor a BHE. Baseado nisto, testamos a habilidade de células BHK encapsuladas superexpressando ARSA em corrigir a deficiência enzimática em fibroblastos de pacientes com LDM. Três grupos foram analisados: fibroblastos tratados com células BHK superexpressando ARSA (rBHK) imobilizadas em cápsulas de alginato (grupo CAPSULES), fibroblastos tratados com o sobrenadante de células rBHK não encapsuladas (grupo UPTAKE CONTROL) e fribroblastos tratados com as cápsulas vazias (grupo EMPTY). Fibroblastos não tratados e normais foram usados como controles. As rBHK foram obtidas por seleção clonal após transfecção com o vetor pTARSA-CMV2, por método de transferência gênica não viral. A atividade de ARSA foi medida após 1, 2, 3 e 4 semanas de tratamento, usando ensaio espectrofotométrico. A atividade de beta-gal foi usada como referência. A análise estatística foi realizada usando os testes ANOVA e Tukey post hoc. Fibroblastos normais têm uma atividade de ARSA de 23,9 +/- 2,01 nmol/h/mg prot. Fibroblastos não tratados apresentaram baixos níveis enzimáticos (2,22 +/- 0.17). O grupo EMPTY apresentou os mesmos níveis de ARSA que os fibroblastos não tratados. Os grupos CAPSULES e UPTAKE CONTROL demonstraram altos níveis de ARSA, respectivamente 23,42 +/- 6,39 e 42,35 +/- 5,20 (p<0,01 para todos os grupos), quando comparado aos fibroblastos não tratados. Clones de rBHK encapsulados demostraram um alto potencial como nova estratégia terapêutica no tratamento de LDM, alcançando níveis enzimáticos normais em fibroblastos humanos deficientes. Entretanto, mais estudos devem ser realizados usando modelo animal para corroborar nossos achados. / Metachromatic leukodystrophy (MLD) is an autosomal recessive disorder due to arylsulfatase A (ARSA) deficiency that affects primarily the Central Nervous Systems (CNS). Ongoing treatments include enzyme replacement therapy and bone marrow transplantation, both limited in their effects due to the blood-brain barrier. An alternative would be the implantation in the brain of encapsulated cells over expressing ARSA that would eliminate the need of repeated infusions and overcome the blood brain barrier. Based on that, we tested the ability of encapsulated BHK cells over expressing ARSA to correct enzymatic deficiency in fibroblasts from MLD patients. Three groups were analyzed: fibroblasts treated with ARSA-over expressing BHK cells (rBHK) trapped in alginate capsules (CAPSULES group), fibroblasts treated with supernatant of non-encapsulated rBHK (UPTAKE CONTROL) and fibroblasts treated with empty capsules (EMPTY group). Untreated and normal fibroblasts were used as controls. rBHK were obtained by clone selection after non viral transfection with pTARSA-CMV2. ARSA activity was measured after 1, 2, 3 and 4 weeks of treatment using spectrophotometric assay, and beta-gal was used as reference enzyme. Sattistical analysis was performed using ANOVA and Tukey’s test. Normal group showed an ARSA activity of 23.9 +/- 2.01 nmol/h/mg prot. MLD untrated had the lowest ARSA activity (2.22 +/- 0.17). EMPTY group ARSA activity was equal untreated fibroblasts (2.71 +/- 0.34). CAPSULES and UPTAKE CONTROL groups showed higher enzymatic levels, compared with to the MLD untreated, respectively 23.42 +/- 6.39 and 42.35 +/- 5.20 (p<0,01 for all groups). Encapsulated rBHK clones show potencial as a new therapeutic strategy for the treatment of MLD, reaching a normal enzyme levels in human MLD fibroblasts. However more studies are still needed using MLD animal model to corroborate our findings.

Memoria para optar al título de Químico Farmacéutico / Los fibroblastos y miofibroblastos cardiacos son elementos claves en el desarrollo del remodelado cardiaco después de un infarto agudo. Una regulación controlada del crecimiento de la población de fibroblastos y miofibroblastos es importante para una correcta cicatrización y mantención de la función cardiaca. Distintas evidencias muestran que los niveles de angiotensina II (Ang II) y del receptor de angiotensina II tipo 1 (AT1R) aumentan después del infarto agudo al miocardio. Por esto, falta saber que funciones pueden ser reguladas por Ang II en estas células post-infarto al miocardio cuando se sobre expresan dichos receptores. Nuestro modelo experimental consideró la sobre expresión del AT1R en miofibroblastos cardiacos de ratas neonatas (MCN) mediante el uso de adenovirus y determinar si Ang II modifica su comportamiento celular y la secreción de proteínas de la matriz extracelular (MEC). Nuestros resultados mostraron que Ang II aumentó la adhesión de las células a proteínas de matriz, como colágeno y fibronectina, y también produjo un aumento en la capacidad contráctil de MCN. Ang II no modificó la proliferación y migración celular, sin embargo, al sobre expresar el receptor AT1, observamos que Ang II disminuyó la viabilidad celular, la cual ocurrió luego de 48 h de transducción, afectando la migración, proliferación, contracción y adhesión celular. Por otra parte, Ang II estimuló la secreción de proteínas de matriz, colágeno tipo I y fibronectina, aumentando su expresión al sobre expresar el AT1R en MCN. Además se observó que Ang II disminuyó la actividad de metaloproteinasa-2 (MMP-2) en MCN que sobre expresan el receptor AT1, resultado que junto con el anterior nos indica que se favorece la deposición de proteínas de matriz, aumentando la secreción y disminuyendo su degradación. Los resultados obtenidos muestran que Ang II a través del AT1R regula en el miofibroblasto la secreción de proteínas de matriz, disminuyendo su degradación, promoviendo la adhesión a proteínas de la MEC y aumentando la contracción de MCN, todas funciones que apuntan a la reparación del tejido cardiaco después de un infarto / Cardiac fibroblasts and myofibroblasts are key elements of the development of cardiac remodeling after myocardial infarction. A tight regulation of fibroblast and myofibroblast growth is important to a correct wound healing and to maintain cardiac function. Several lines of evidence have showed an increase in angiotensin II (Ang II) and AT1R levels after myocardial infarction. Thus angiotensin II may play a pivotal role in the regulation of number and function of theses cells. Our experimental model considered over-expressing AT1R in neonatal rat cardiac myofibroblats (MCN) using adenovirus and to evaluate whether Ang II modifies cell behavior and extracellular matrix (ECM) proteins secretion. Our results show that the stimulation with Ang II increased the adhesion of the cells to ECM proteins, as collagen and fibronectin, and also produced an increase in MCN's contractile capacity. Ang II did not modify proliferation and cellular migration; nevertheless, in MCN over-expressing AT1R, we observe that Ang II diminished cellular viability, which happened after 48 h of transduction, affecting the migration, proliferation, contraction and cellular adhesion. On the other hand, Ang II promoted the secretion of ECM proteins, collagen type I and fibronectin, increasing their expression in MCN over-expressing the AT1R. In addition we observed that Ang II diminished the activity of metalloproteinase-2 (MMP-2) in MCN that over-express the AT1 receptor, and this together with the previous result, indicates that the deposition of ECM proteins is favored, increasing the secretion and diminishing their degradation. The obtained results demonstrate that the myofibroblast is a key piece in wound healing after myocardial injury, and that Ang II regulates great part of this process, via AT1 receptor, increasing the secretion of ECM proteins and diminishing their degradation, promoting the adhesion to ECM proteins and increasing MCN's contraction, all functions that point at the repair of the cardiac tissue after a heart attack

Leucodistrofia metacromática (LDM) é uma doença autossômica recessiva causada pela deficiência da enzima arilsulfatase A (ARSA) que afeta primariamente o sistema nervoso central (SNC). Tratamentos em estudos incluem a terapia de reposição enzimática e o transplante de medula óssea, porém com limitações devido à barreira hemato-encefálica (BHE). Uma alternativa seria a implantação no cérebro de células encapsuladas superexpressando ARSA, simulando a reposição enzimática sem injeções repetidas e eliminando a necessidade de transpor a BHE. Baseado nisto, testamos a habilidade de células BHK encapsuladas superexpressando ARSA em corrigir a deficiência enzimática em fibroblastos de pacientes com LDM. Três grupos foram analisados: fibroblastos tratados com células BHK superexpressando ARSA (rBHK) imobilizadas em cápsulas de alginato (grupo CAPSULES), fibroblastos tratados com o sobrenadante de células rBHK não encapsuladas (grupo UPTAKE CONTROL) e fribroblastos tratados com as cápsulas vazias (grupo EMPTY). Fibroblastos não tratados e normais foram usados como controles. As rBHK foram obtidas por seleção clonal após transfecção com o vetor pTARSA-CMV2, por método de transferência gênica não viral. A atividade de ARSA foi medida após 1, 2, 3 e 4 semanas de tratamento, usando ensaio espectrofotométrico. A atividade de beta-gal foi usada como referência. A análise estatística foi realizada usando os testes ANOVA e Tukey post hoc. Fibroblastos normais têm uma atividade de ARSA de 23,9 +/- 2,01 nmol/h/mg prot. Fibroblastos não tratados apresentaram baixos níveis enzimáticos (2,22 +/- 0.17). O grupo EMPTY apresentou os mesmos níveis de ARSA que os fibroblastos não tratados. Os grupos CAPSULES e UPTAKE CONTROL demonstraram altos níveis de ARSA, respectivamente 23,42 +/- 6,39 e 42,35 +/- 5,20 (p<0,01 para todos os grupos), quando comparado aos fibroblastos não tratados. Clones de rBHK encapsulados demostraram um alto potencial como nova estratégia terapêutica no tratamento de LDM, alcançando níveis enzimáticos normais em fibroblastos humanos deficientes. Entretanto, mais estudos devem ser realizados usando modelo animal para corroborar nossos achados. / Metachromatic leukodystrophy (MLD) is an autosomal recessive disorder due to arylsulfatase A (ARSA) deficiency that affects primarily the Central Nervous Systems (CNS). Ongoing treatments include enzyme replacement therapy and bone marrow transplantation, both limited in their effects due to the blood-brain barrier. An alternative would be the implantation in the brain of encapsulated cells over expressing ARSA that would eliminate the need of repeated infusions and overcome the blood brain barrier. Based on that, we tested the ability of encapsulated BHK cells over expressing ARSA to correct enzymatic deficiency in fibroblasts from MLD patients. Three groups were analyzed: fibroblasts treated with ARSA-over expressing BHK cells (rBHK) trapped in alginate capsules (CAPSULES group), fibroblasts treated with supernatant of non-encapsulated rBHK (UPTAKE CONTROL) and fibroblasts treated with empty capsules (EMPTY group). Untreated and normal fibroblasts were used as controls. rBHK were obtained by clone selection after non viral transfection with pTARSA-CMV2. ARSA activity was measured after 1, 2, 3 and 4 weeks of treatment using spectrophotometric assay, and beta-gal was used as reference enzyme. Sattistical analysis was performed using ANOVA and Tukey’s test. Normal group showed an ARSA activity of 23.9 +/- 2.01 nmol/h/mg prot. MLD untrated had the lowest ARSA activity (2.22 +/- 0.17). EMPTY group ARSA activity was equal untreated fibroblasts (2.71 +/- 0.34). CAPSULES and UPTAKE CONTROL groups showed higher enzymatic levels, compared with to the MLD untreated, respectively 23.42 +/- 6.39 and 42.35 +/- 5.20 (p<0,01 for all groups). Encapsulated rBHK clones show potencial as a new therapeutic strategy for the treatment of MLD, reaching a normal enzyme levels in human MLD fibroblasts. However more studies are still needed using MLD animal model to corroborate our findings.

O câncer de mama é o mais freqüente tipo de câncer entre mulheres e representa a segunda causa de morte dentre elas (após o câncer de pulmão). O deterioramento do perfil antioxidante (atividade de SOD e CAT) e/ou do reparo de DNA podem elevar os riscos de uma transformação maligna, devido ao acúmulo de mutações espontâneas em genes importantes nos processos tumorais. Neste trabalho, foram determinados (capítulo 1) os níveis de danos no DNA, endógenos e induzidos por peróxido de hidrogênio, em linfócitos de sangue periféricos de pacientes com câncer de mama, e também se analisou o perfil antioxidante do plasma desses indivíduos. Os resultados demonstraram claramente uma relação entre os níveis de danos endógenos no DNA e a atividade de SOD, onde altos níves de danos endógenos estão correlacionados com uma baixa atividade dessa enzima. Além disso, as pacientes apresentaram uma menor capacidade de reparo aos danos induzidos pelo peróxido de hidrogênio, quando comparados com os controles. Sabe-se que muitas drogas qumioterápicas (como doxorrubicina) têm como alvo o DNA, com isso a citotoxicidade desses agentes está diretamente relacionada com sua habilidade de causar danos no material genético. Os mecanismos de reparo de danos no DNA constituem um dos tópicos mais interessantes na biologia moderna, uma vez que as proteínas inseridas nesses processos podem estar envolvidas na manutenção da integridade genômica, assim como na resistência de certos tumores a estratégias de terapia antitumoral. O reparo por excisão de nucleotídeos (NER) é um mecanismo de reparo altamente conservado que envolve mais de 30 proteínas, dentre elas a proteína XPD, a qual é uma subunidade do complexo TFIIH, envolvido nos processos de transcrição e reparo. Assim, no capítulo 2, foi determinada a sensibilidade de três linhagens de fibroblastos humanos deficientes no gene XPD à doxorrubicina (DOX). Os resultados apresentados nesse capítulo mostraram a maior sensibilidade das linhagens XPD e XP/CS quando comparados com TTD e MRC5 (linhagem normal), assim como a indução de foci de γH2AX (indicativo de quebras de dupla fita) pela DOX de forma tempo dependente. Com os resultados obtidos nesse trabalho é possível enfatizar a utilização de linfócitos de sangue periférico para o monitoramento de genotoxicidade a terapias antitumorais, bem como sugerir a participação do NER no reparo de lesões causadas por DOX. / Breast cancer is the most common malignancy among women and it is the second cause of death among them (after lung cancer). Impaired antioxidant status and/or DNA repair may elevate the risk of malignant transformation of breast cells due to the accumulation of spontaneous mutations in target genes in tumor processes. In this work, we have determined (chapter 1) the DNA damage levels, either endogenous or induced by hydrogen peroxide, in peripheral blood lymphocytes of breast cancer patients, as well as the antioxidant status in the plasma of these individuals. The results clearly showed a relation between endogenous DNA damage levels and SOD activity, where high endogenous damage levels are correlated with low SOD activity. Moreover, the patients presented a lower DNA damage repair capacity to the damages induced by hydrogen peroxide than the controls. It is very well known that many chemotherapeutic drugs (like doxorubicin) target DNA and therefore the citotoxicity of these agents is directly related to their ability to cause DNA damage. The mechanisms of DNA damage repair are one of the most interesting topics in modern biology, since the proteins that take part in these processes can be involved in both the maintenance of genomic integrity and in the resistance of certain tumors to anti-tumoral strategies. Nucleotide Excision Repair (NER) is a highly conserved repair mechanism that involves more than 30 proteins, among them the XPD protein, which is a subunit of the TFIIH complex, involved both in transcription and repair. Thus, in chapter 2, we have determined the sensitivity of three different human fibroblasts deficient in XPD gene to doxorubicin (DOX). The results showed in this chapter demonstrated a higher sensitivity of XPD and XP/CS cell lines to DOX than TTD and MRC5 (normal cells), as well as the induction of γH2AX foci (indicative of double strand breaks) by DOX in a time-dependent manner. With the results obtained in this work it is possible to emphasizes the use of peripheral blood lymphocytes to monitoring genotoxicity to therapies, as well as to suggest the a role of NER in the repair of lesions caused by DOX.