O processo de interferência de RNA refere-se ao silenciamento pós transcricional seqüência-específico de genes em animais e plantas capaz de ser promovido por dsRNA homólogo à seqüência do gene silenciado. Este processo pode ser aplicado como terapia, que apresenta como vantagens a especificidade pelos alvos escolhidos, a possibilidade de tratar uma enorme gama de doenças genéticas, além do fato de ser muito potente e eficaz. Contudo, o principal desafio consiste em manter a estabilidade dos siRNAs nos fluidos biológicos, visto que estes são bastante susceptíveis à excreção renal e a degradação por RNAses. Com isso, reforça-se a necessidade de sistemas de liberação adequados, que sejam capazes de manter a estabilidade dos siRNAs por tempo suficiente para que atinjam os órgãos alvo da terapia e promover sua liberação sustentada. De particular interesse são determinadas proteínas e peptídeos de transdução (PTDs) que podem ser ligados a fármacos hidrofílicos e assim tornam possível com que estes atravessem membranas. Neste sentido, muitos sistemas carreadores não-virais tem sido estudados para a veiculação de siRNA, sendo de cunho inovador o desenvolvimento de sistemas de liberação nanoestruturados baseados em cristais líquidos funcionalizados com peptídeos de transdução de membrana para a veiculação tópica de siRNAs. Desta forma, nanopartículas de cristais líquidos de fase hexagonal contendo ou não os aditivos catiônicos polietileimina (PEI) e oleilamina (OAM) foram funcionalizadas com peptídeos de transdução de membranas TAT (TAT) ou penetratin (PNT). Os sistemas obtidos foram complexados com siRNA por interação eletrostática e caracterizados através de medidas de tamanho de partícula/ polidispersividade, potencial zeta e eficiência de complexação. A citotoxicidade dos sistemas foi avaliada em fibroblastos L929 pelo ensaio do MTT e por citometria de fluxo e a avaliação da transfecção in vitro foi realizada por citometria de fluxo e por microscopia de fluorescência. Os sistemas contendo PEI ou OAM apresentavam potencial zeta positivo e foram capazes de complexar o siRNA adicionado na concentração de 10 ?M. Os estudos em culturas celulares demonstraram que os sistemas contendo ácido oleico (AO) foram mais eficientes quanto à transfecção em células de fibroblastos L929 e esta eficiência de transfecção foi aumentada com a funcionalização com o peptídeo TAT. A partir daí, os sistemas selecionados foram avaliados quanto a penetração cutânea in vivo. Os sistemas nanodispersos formados por MO/AO/PEI proporcionaram uma maior liberação de siRNA na pele e a eficiência de supressão de TNF-alfa em modelo animal de inflamação cutânea foram maiores que formulações controle. Com isso, demonstrou-se que os sistemas desenvolvidos são promissores para a futura aplicação na terapia gênica tópica de doenças cutâneas inflamatórias. / The RNA interference process refers to the sequence-specific posttranscriptional silencing of genes in animals and plants capable of being promoted by dsRNA that are homologous to the sequence of the silenced gene. This process can be applied as therapy, which presents advantages such as the specificity to the chosen targets, the possibility to treat a variety of genetic diseases, besides being very potent and efficacious. However, the major hurdle consists in keeping the siRNAs stability in the biological fluids, because they are susceptible to renal clearance and degradation by RNAses. Thus, there is the need for suitable delivery systems, capable of maintaining the stability of siRNAs for sufficient time so they can reach the target organ in the therapy and promote sustained release. Of particular interest are certain proteins and peptides transduction domains (PTDs) that can be connected to hydrophilic drugs and thus make it possible to cross cell membranes. Within this context, many non-viral vectors have been studied for siRNA vehiculation which makes innovative the present study because it aims at the development of nanostructured delivery systems based on liquid crystals functionalyzed with membrane transduction peptides for the topical vehiculation of siRNAs. Thus, hexagonal phase liquid crystal nanoparticles containing or not the cationinc polyethylenimine (PEI) and oleylamine (OAM) were functionalyzed with membrane transduction peptides TAT (TAT) or penetratin (PNT). The obtained systems were complexed with siRNA by eletrostatic interaction and characterized for particle size, polidispersity, zeta potential and complexation efficiency. The cytotoxicity of the formulations was performed with L929 fibroblasts by MTT assay and flow cytometry and the in vitro transfection was evaluated by flow cytometry and fluorescence microscopy. The systems containing PEI or OAM presented positive zeta potential and could complex siRNA at the concentration of 10 ?M. The cell culture studies demonstrated that the systems containing oleic acid (OA) were the most efficient to transfect L929 cells and the transfection efficiency was enhanced with the functionalization with the TAT peptide. Thereafter, the selected systems were evaluated for the in vivo skin penetration. The nanosdispersed systems composed of MO/OA/PEI functionalyzed with TAT resulted in a higher siRNA penetration and release in the skin, promoting higher TNF alfa supression in animal model of cutaneous inflammation, compared to the control formulations. Hence, we demonstrated that the developed systems are promising for the treatment of inflammatory skin diseases.

Equinodermos são bem conhecidos pelas suas grandes capacidades regenerativas, principalmente em processos mais complexos como a reposição de membros e órgãos. Porém pouco se sabe sobre processos aparentemente mais simples como a cicatrização. Tem sido descrito que um dos principais mecanismos envolvidos neste evento é o remodelamento da matriz extracelular e que existem células responsáveis por isto. Entretanto, vários detalhes do processo e do exato papel destas células ainda não são muito claros. Neste trabalho, foram estudados os estágios do processo de cicatrização em Holothuria grisea Selenka, 1867 (Holothuriidae). A lesão foi induzida através de uma incisão perfurando a parede do corpo do animal até alcançar a cavidade celomática. Através de análises histológicas, foram acompanhadas as mudanças estruturais e os mecanismos celulares que ocorrem no intervalo de doze horas a trinta dias após a injúria. Foi observado que houve um rápido fechamento da ferida através da síntese de novas fibras de colágeno, e que fibroblastos e duas populações de esferulócitos estão envolvidos neste processo. São discutidas as prováveis funções destes tipos celulares e possíveis diferenças funcionais entre os esferulócitos. / Echinoderms are well known by their regenerative capabilities, mostly in complex events such as the reconstruction of internal organs or entire body parts. However, the knowledge on apparently simpler processes such as wound healing is relatively scarce. It has been described that extracellular matrix remodeling is the main mechanism, and it involves participation of different cells populations. However, the specific function of these cell types is still under debate. In this work, the wound healing process in Holothuria grisea Selenka, 1867 (Holothuriidae) was studied. The lesion was made by an incision through the body wall up to the coelomic cavity. The local changes in cell types and the reorganization of the extracellular matrix were accompanied from 12 hours to 30 days after the injury. Soon after the wound, the organism responded with a localized contraction, followed by cell migration and synthesis of new collagen fibers. Four different cell types were observed, including two different types of spherulocytes. The probable functions of these cells are discussed.

A biomodificação radicular empregando ácido cítrico tem sido utilizada visando à reinserção dos tecidos periodontais a raízes expostas à doença periodontal. Entretanto, a grande diversidade metodológica entre os estudos ainda não possibilitou o estabelecimento de um protocolo amplamente aceito quanto à concentração e tempo de aplicação do ácido. Assim, 32 dentes extraídos por doença periodontal avançada forneceram 63 fragmentos radiculares que, após raspagem manual, foram divididos nos seguintes grupos de tratamento: Grupo AC-10-90: desmineralização com ácido cítrico a 10% em pH 1, durante 90 segundos; Grupo AC-10-120: desmineralização com ácido cítrico a 10% em pH 1, durante 120 segundos; Grupo AC-10-180: desmineralização com ácido cítrico a 10% em pH 1, durante 180 segundos; Grupo AC-50-90: desmineralização com ácido cítrico a 50% em pH 1, durante 90 segundos; Grupo AC-50-120: desmineralização com ácido cítrico a 50% em pH 1, durante 120 segundos; Grupo AC-50-180: desmineralização com ácido cítrico a 50% em pH 1, durante 180 segundos; Grupo C (controle): lavagem com soro fisiológico. Sobre as superfícies tratadas foram cultivados fibroblastos do ligamento periodontal humano por 24, 48 e 72 horas. A ampliação dos túbulos dentinários, morfologia celular e a porcentagem das superfícies radiculares recobertas por células foram avaliadas em microscopia eletrônica de varredura. As imagens microscópicas das superfícies recobertas por células foram comparadas pelo teste não paramétrico de Kruskal-Wallis seguido pelo teste de Dunn e na ampliação dos túbulos pelo teste de variância a dois critérios (ANOVA) complementado pelo teste de Tukey, em 5% de significância, ambos realizados por um programa computadorizado comparando os resultados entre os grupos. A Com exceção do grupo C, em todos os grupos houve aumento crescente da cobertura da superfície radicular por fibroblastos com o tempo. A maior área de cobertura foi apresentada pelo grupo AC-10-90 (98,82±2,57%) às 24 horas e essa diferença foi significante (p<0,001) em comparação aos grupos AC-50-90 (64,94±20,60%), AC-50-180 (56,59±35,42%) e C (0,06±0,24%). Nas demais comparações de tempo de aplicação e tempo de cultura, predominou a superioridade dos grupos tratados por ácido cítrico a 10% sobre os de 50%, porém, sem significância estatística. Todos os grupos teste foram significantemente superiores aos controle em todos os tempos de cultura. O menor valor médio para o diâmetro dos túbulos dentinários expostos pelos tratamentos foi apresentado pelo grupo AC-10-90 (4,55±0,69 &#x3BC;m) que diferiu significantemente (p<0,001) dos grupos AC-10-120 (5,33±0,95 &#x3BC;m), AC-10-180 (5,54±1,56 &#x3BC;m) e AC-50-180 (5,56±1,22 &#x3BC;m). Esse último apresentou a maior ampliação, porém sem diferença significante em relação aos demais grupos. Os fibroblastos apresentaram-se mais espalhados, achatados e com menor definição de limites nos grupos tratados com ácido cítrico a 10% do que nos de 50%, cujas células apresentavamse fusiformes e arredondadas. Concluiu-se que o ácido cítrico a 10% por 90 segundos produziu superfície mais favorável à proliferação celular com características morfológicas de estágios mais avançados de diferenciação e área de cobertura superficial por fibroblastos mais extensa no período inicial de cultura do que na concentração de 50%. A ampliação dos túbulos dentinários pareceu não influenciar a cobertura superficial por fibroblastos. Estudos subsequentes devem investigar a influência das propriedades químicas do agente biomodificador radicular para contribuir para a elucidação das diferenças produzidas no comportamento celular. / The root biomodification employing citric acid has been used in order to reattach periodontal tissues to root surface exposed to periodontal disease. However, the methodological diversity among studies has not allowed the establishment of a widely accepted protocol as the concentration and time of acid application. Thus, 32 teeth were extracted due to advanced periodontal disease, so that 63 root fragments were provided. After scaling and root planning, the fragments were divided into the following treatment groups : AC-10-90 group: demineralization with 10% citric acid at pH 1 for 90 seconds; AC-10-120 group: demineralization with 10% citric acid at pH 1 for 120 seconds; AC-10-180 group: demineralization with 10% citric acid at pH 1 for 180 seconds; AC-50-90 group: demineralization with 50% citric acid at pH 1 for 90 seconds; AC-50-120 group: demineralization with 50% citric acid at pH 1 for 120 seconds; AC-50-180 group: demineralization with 50% citric acid at pH 1 for 180 seconds; group C (control) : rinsing with saline solution. On the treated surfaces, fibroblasts from human periodontal ligament were cultured by 24, 48 and 72 hours. The enlargement of the dentinal tubules, cell morphology and the percentage of root surface covered by cells were evaluated by scanning electron microscopy. Those microscopic images from the root surfaces covered by cells were compared by the nonparametric Kruskal-Wallis test followed by Dunn\'s test and the enlargement of tubules by two variance (ANOVA) complemented by the Tukey test, both performed by a computer program comparing the results between the groups, at 5% significance. With the exception of group C, all groups showed increasing coverage of the root surface by fibroblasts over time. The largest area of coverage was presented by AC-10-90 (98.82±2.57%) at 24 hours and this difference was significant (p <0.001) compared to AC-50-90 (64.94±20.60%), AC-50-180 (56.59±35.42%) and C (0.06±0.24%). In other comparisons the application time and culture time groups treated with citric acid at 10% were superior to groups of 50%, without statistical significance. All test groups were significantly better than the control ones at all times of culture. The shortest average diameter of dentinal tubules exposed by the treatments was presented by AC-10-90 (4.55±0.69 &#x3BC;m) group that differed significantly (p<0,001) from AC-10-120 (5 groups 33±0.95 &#x3BC;m), AC-10-180 (5.54±1.56 &#x3BC;m) and AC-50-180 (5.56±1.22 &#x3BC;m). This last showed the highest enlargement, but without significant difference compared to the other groups. The fibroblasts were more spread, flattened and had less identifiable limits in the groups treated with citric acid 10% than those in 50% which cells had become rounded and spindle. It was concluded that the demineralization with 10% citric acid for 90 seconds produced more favorable surface to cell proliferation, more morphological characteristics of later stages of differentiation and larger surface area coverage by fibroblasts in the initial periods of culture than any of the groups treated with 50% citric acid. The enlargement of dentinal tubules did not seem to influence the surface coverage by fibroblasts. Subsequent studies should investigate the influence of the chemical properties of the root conditioner agent on the root surfaces in order to contribute to the elucidation of the differences produced in the cell behavior.

Submitted by Caroline Xavier (caroline.xavier@pucrs.br) on 2017-05-04T16:56:07Z No. of bitstreams: 1 DIS_PATRICIA_LAZZAROTTO_BELLICANTA_COMPLETO.pdf: 1443666 bytes, checksum: 536295a41c399cfa2da6b360bf54a344 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-05-04T16:56:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DIS_PATRICIA_LAZZAROTTO_BELLICANTA_COMPLETO.pdf: 1443666 bytes, checksum: 536295a41c399cfa2da6b360bf54a344 (MD5) Previous issue date: 2016-04-26 / Introduction: The inherent characteristics of plasticity of human fibroblast cells makes it an important tool for evaluating the effects of microgravity at a cellular level. This study analyzed the behavior of human skin fragment fibroblasts in a simulated microgravity environment. Methods: Human fibroblast cells in the 8th and 17th passage, cultured under standard incubator conditions at 37? C with 5% CO2, were submitted to simulated microgravity in a 3D-clinostat for a period of 24h and 40h. After exposure, both passage cells were analyzed and compared with the control group (1G) in population doubling assays, tests of passage and microscopic analysis, as well as PCR analysis for detection of variations in the gene expression related to the cell cycle (p21, p16). Results: Before microgravity exposure, cells belonging to the 17th passage presented characteristics of cells in an apoptotic state. After 24h and 40h of microgravity, the cells of both groups showed themselves to be more confluent and elongated. PCR analysis demonstrated that p21 expression was decreased while p16 increased. In addition, PCR analysis showed a difference in expression of p21 and p16 genes between the 24h and 40h samples. Discussion: The present research showed cells to be more confluent and elongated after microgravity exposure, a characteristic of cells with fewer passages, suggesting alterations in their cytoskeleton. This result was confirmed by PCR analysis where a decrease in p21 expression was demonstrated. This result corroborates previous findings that among 588 genes tested, the p21 gene presented a negative expression. Conversely, the p16 gene showed a positive expression. Since both the p21 and p16 genes are related to the cell cycle, these results suggest the hypothesis of important changes having occurred in the cellular cytoskeleton and, consequently, a probable alteration in the production of cell cycle regulatory proteins (cyclins). Furthermore, RT-PCR analysis demonstrated a difference in p21 and p16 gene expression between the 24h and 40h samples, indicating the need for a more detailed comparison between the exposure times. Also pluripotency markers were found, Oct4 and Nanog, which suggests alterations in plasticity levels. / Introdu??o: As caracter?sticas da plasticidade inerentes das c?lulas de fibroblastos humanos os tornam uma ferramenta importante para avaliar os efeitos da microgravidade em um n?vel celular. Este estudo analisou o comportamento dos fibroblastos fragmento de pele humanas em um ambiente de microgravidade simulada. M?todos: c?lulas de fibroblasto humanos em 8a e 17a passagem, cultivadas em condi??es normais em incubadora a 37? C com 5% de CO2, foram submetidos ? microgravidade simulada em um clinostato-3D por um per?odo de 24h e 40h. Ap?s a exposi??o, as c?lulas de cada passagem foram analisadas e comparadas com o grupo de controle (1G) ensaios de prolifera??o celular (population doubling), ensaios de passagem e an?lise microsc?pica, bem como a an?lise de PCR para a detec??o de varia??es na express?o de genes relacionados com o ciclo celular (p21, p16). Resultado: Antes da exposi??o microgravidade, c?lulas pertencentes ? passagem 17? apresentaram caracter?sticas de c?lulas num estado apopt?tico. Depois de 24h e 40h de microgravidade, as c?lulas de ambos os grupos se mostraram mais confluentes e alongadas. A an?lise de PCR demonstrou que a express?o de p21 foi diminu?da enquanto p16 aumentou. Al?m disso, a an?lise PCR mostrou a diferen?a na express?o de genes p21 e p16 entre as amostras 24h e 40h. Discuss?o: A presente pesquisa mostrou que as c?lulas de 17? passagem tornaram- se mais confluentes e alongadas ap?s a exposi??o microgravidade, uma caracter?stica das c?lulas com menor n?mero de passagens, sugerindo altera??es no seu citoesqueleto . Este resultado foi confirmado por an?lise de PCR, onde foi demonstrado uma diminui??o na express?o de p21. Esse resultado confirma descobertas anteriores de que entre 588 genes testados, o gene p21 apresentou uma express?o negativa. Por outro lado, o gene p16 mostrou uma express?o positiva. Uma vez que ambos os genes P21 e P16 est?o relacionadas com o ciclo celular, estes resultados sugerem a hip?tese de altera??es importantes tenham ocorrido no citoesqueleto celular e, consequentemente, uma prov?vel altera??o na produ??o de prote?nas reguladoras do ciclo celular (ciclinas). Al?m disso, a an?lise de RT-PCR demonstrou uma diferen?a na express?o do gene p21 e p16 entre as amostras 24h e 40h, indicando a necessidade de uma compara??o mais detalhada entre os tempos de exposi??o. Foram tamb?m percebidas altera??es no n?vel de plasticidade dos fibroblastos de 17? passagem e 8? passagem, devido a express?o de marcadores de pluripot?ncia Oct4, Nanog.

O objetivo deste estudo foi estabelecer cultura primária de células derivadas da granulação óssea (GO) de seres humanos para determinar seu padrão de crescimento in vitro e determinar os efeitos biológicos de três membranas reabsorvíveis feitas de colágeno (BioGide®, GenDerm®, CollaTape®) em culturas de fibroblastos gengivais humanos (FGH) e células da granulação óssea (GO). Foram coletadas amostras de tecido ósseo presente no alvéolo de cicatrização de dois pacientes adultos saudáveis sistemicamente com indicação de cirurgia periodontal regenerativa pela técnica do enxerto ósseo em neoformação. Imediatamente após a coleta, as amostras foram transportadas ao laboratório de cultura de células para estabelecimento da cultura primária. As células foram cultivadas em atmosfera úmida, contendo 5% CO2 a 37oC. A curva de crescimento das células foi determinada por meio de contagem de células viáveis. Após a caracterização da curva de crescimento, foram realizadas a caracterização da amostra por meio de determinação da atividade de fosfatase alcalina e de mineralização. Posteriormente, os efeitos de três diferentes tipos de membranas colágenas sobre a proliferação de células GO e FGH foram investigados por meio do teste MTT. As amostras foram divididas em oito grupos: (1) células FGH em meio DMEM (C-FGH); (2) células FGH em meio DMEM condicionado com membrana GenDerm (GD-FGH); (3) células FGH em meio DMEM condicionado com membrana BioGide (BG-FGH); (4) células FGH em meio DMEM condicionado com membrana ColaTape (CT-FGH); (5) células GO em meio DMEM (C-GO); (6) células GO em meio DMEM condicionado com membrana GenDerm (GD-GO); (7) células GO em meio DMEM condicionado com membrana BioGide (BG-GO); (8) células GO em meio DMEM condicionado com membrana CollaTape (CT-GO). O teste de proliferação celular mostrou que houve aumento significativo (p< 0.05; ANOVA para medidas repetidas) do número de células vitais presentes na cultura nos dias 3 (90,8%), 5 (132,50%), 7 (137,50%) e 10 (227,50%) em relação ao controle (dia 0). Foram observadas atividade de fosfatase alcalina e de mineralização in vitro. Houve aumento do número de células FGH e GO viáveis em todos os grupos (p< 0.05; ANOVA para medidas repetidas). Houve maior efeito proliferativo nas células FGH e GO nos grupos GD e CT, com diferenças estatisticamente significantes entre os grupos (p< 0.05; Mann Whitney) apenas no período de 96 horas. Esses achados sugerem que as células GO apresentam alta atividade de proliferação e síntese, sendo compatíveis com células de linhagem osteoblástica. Duas membranas colágenas testadas exerceram maior ação proliferativa tardia sobre osteoblastos, indicando sua eficácia na regeneração dos tecidos periodontais. / The aim of this study was to establish primary culture of cells derived from human bone granulation tissue (GO) in order to determine its growth pattern in vitro and the biological effects of three absorbable collagen membranes (BioGide®, GenDerm®, CollaTape®) in human gingival fibroblasts (FGH) and human bone granulation (GO) cell cultures. Samples of bone tissue present at healing sockets of two systemically healthy adults with indication of periodontal regenerative therapy by the newly forming bone were collected. Immediately after, samples were transported to the laboratory of cell culture to the establishment of primary cultures. Cells were cultivated in humid atmosphere with 95% CO2 at 37oC. Cells growth pattern were determined by counting of viable cells. After characterization of growth pattern, samples were characterized according to alkaline phosphatase activity and mineralization detected by alizarin red. Afterwards, the effects of three different types of collagen membranes on GO and FGH cells were investigated by MTT test. Samples were divided into eight groups: (1) FGH cells in DMEM (C-FGH); (2) FGH in DMEM conditioned by GenDerm® membrane (GD-FGH); (3) FGH in DMEM conditioned with BioGide® (BG-FGH); (4) FGH in DMEM conditioned by CollaTape® (CT-FGH); (5) GO cells in DMEM (C-GO); (6) GO cells in DMEM conditioned by GenDerm® (GD-GO); (7) GO cells in DMEM conditioned by BioGide® (BG-GO); (8) GO cells in DMEM conditioned by CollaTape® (CT-GO). Cell proliferation test showed a significant (p< 0.05; ANOVA for repeated measures) increase in the number of vital cells present in the culture at days 3 (90.8%), 5 (132.50%), 7 (137.50%) and 10 (227.50%) compared to control (dia 0). It was observed alkaline phosphatase activity and mineralization in vitro. There was an increase in the number of FGH and GO viable cells at all groups (p< 0.05; ANOVA for repeated measures). Greater proliferative effect at FGH and GO cells at GD and CT groups, with significant differences between groups (p< 0.05; Mann Whitney) only at 96 hs. Two of the collagen membranes tested exerted greater late proliferative effects on osteoblasts, suggesting its efficacy in the regeneration of periodontal tissues.

Atualmente é crescente o número de pacientes utilizando drogas que visam a alteração da remodelação óssea. Doenças como osteoporose e tumores ósseos têm possibilidade de tratamento com a utilização dos antirreabsortivos. Entretanto tais medicamentos apresentam, entre outros, um efeito colateral muito nocivo: a osteonecrose dos maxilares (ONM), que consiste em uma lesão rara, mas grave, da mandíbula ou maxila caracterizada por necrose óssea exposta. O denosumab é uma droga antirreabsortiva que possui um mecanismo de ação diferente do encontrado nos bisfosfonatos (BFs), medicação amplamente usada e anterior ao denosumab, entretanto já mostra efeitos colaterais similares aos BFs em relação à ONM e para ambos os medicamentos a fisiopatogenia da doença ainda não está esclarecida pela literatura Este trabalho teve como objetivo avaliar o efeito de diferentes concentrações do denosumab sobre a viabilidade, proliferação e migração de fibroblastos em cultura. Foram utilizados fibroblastos de mucosa bucal humana linhagem FMM1. Após serem submetidos aos testes de citotoxicidade com concentrações do denosumab variando de 10- 3?g a 10 - 7?g os fibroblastos não apresentaram quaisquer alterações quanto aos quesitos avaliados. Foi possível concluir que o denosumab não é citotóxico para fibroblastos em cultura. ecrose dos maxilares Fibroblastos / The number of patients using drugs that target the manipulation of bone remodeling is currently increasing. Bone volume diseases such as osteoporosis and tumors have the possibility of treatment with the use of antiresorptive medications. However, these drugs, among others, may present a very harmful side effect: osteonecrosis of the jaw (ONJ), which consists of a rare but severe injury characterized by exposed bone necrosis. The denosumab is an antiresorptive drug that presents a different mechanism of action found in bisphosphonates (BPs) and shows similar side effects to BPs regarding ONJ. BPs are a class of medication widely used and prior to denosumab. In both drugs the pathophysiology of the disease it is still not clear. This study aimed to evaluate the effect of denosumab in different concentrations on the viability, proliferation and migration of fibroblasts in culture. Were used human oral mucosa fibroblasts FMM1. After being subjected to denosumab concentrations ranging from 10-3?g to 10-7?g fibroblasts did not show any changes to the variables evaluated. It was possible to concluded that denosumab is not cytotoxic to fibroblasts in culture.

Orientador: Debora Aparecida Pires de Campos Zucari / Banca: Paula Rahal / Banca: Alessandra Vidotto / Resumo: As neoplasias mamárias são os tumores mais comuns nas mulheres e fêmeas caninas. Fibroblastos associados ao câncer (CAFs) são células abundantes no microambiente tumoral, capazes de intermediar respostas inflamatórias atuando na diferenciação e progressão tumoral. A melatonina está associada a mecanismos de ação com efeitos oncostáticos e oncoprotetores, e atua na redução da formação de fibroblastos circundantes no câncer de mama. Os objetivos desse estudo foram verificar a ação da melatonina nas linhagens tumorais mamárias metastáticas humana e canina (MDA-MB-231 e CF-41) bem como em co-cultivo com CAFs primários na viabilidade celular e na expressão de proteínas envolvidas nos processos de angiogênese, inflamação e apoptose, buscando o entendimento da interação destas proteínas nas principais vias de sinalização atuantes no processo tumorigênico. A viabilidade celular foi verificada pelo ensaio MTT e a expressão proteica pelo Membrane Antibody Array após o tratamento com melatonina. Verificou-se que 1 mM de melatonina reduziu a viabilidade celular em ambas as linhagens, CAFs humanos e caninos e em seus co-cultivos (p < 0,05). A análise proteica semiquantitativa, após tratamento com melatonina, mostrou redução da expressão de sete proteínas pró-angiogênicas e aumento das proteínas TIMP-1 e IL-6 nas células MDA-MB-231 e redução de IL-6 e MCP-1 e aumento da leptina, TGF-β, trombopoietina e VEGF na co-cultura (p < 0,05). Houve redução de dezenove proteínas pró-inflamatórias e aumento da citocina I-309 nas células MDA-MB-231 (p < 0,05). No co-cultivo, seis proteínas pró-inflamatórias apresentaram-se menos expressas e as proteínas IL-4, MCP-3 e SCF aumentaram sua expressão (p < 0,05). Das proteínas pró-apoptóticas, doze aumentaram a expressão e houve redução da caspase-3 nas células MDA-MB-231 (p < 0,05). Na co-cultura, houve aumento das proteínas BIM, HPS27 e IGF-1R e redução de... / Abstract: Mammary tumors are the most common tumors among women and female dogs. Fibroblasts associated with cancer (CAFS) are the most abundant cells in the tumor microenvironment, able to mediate inflammatory responses acting in the differentiation and tumor progression. Melatonin is associated with mechanisms of action with oncostatics effects and oncoprotectors, and works to reduce the formation of surrounding fibroblasts in breast cancer. The objectives of this study were to assess the action of melatonin on mammary tumor cell lines human and canine metastatic (MDA-MB-231 and CF-41) and in co-culture with primary CAFS on cell viability and expression of proteins involved in the processes of angiogenesis, inflammation and apoptosis searching for the understanding of proteins interaction in the main signaling pathways active in the tumorigenic process. Cell viability was assessed by MTT assay and the semi-quantitative protein analysis by Membrane Antibody Array after treatment with melatonin. It was found that 1 mM of Melatonin reduced cell viability in both cell lines, human and canine CAFS and their co-culture (p <0.05). The semi-quantitative protein analysis after melatonin treatment showed a reduction of the expression of seven pro-angiogenic proteins and increased TIMP-1 and IL-6 protein in MDA-MB-231 cells and reduced IL-6 and MCP-1 and increased leptin, TGF-β, VEGF and thrombopoietin in the co-culture (p <0.05). Nineteen pro-inflammatory cytokine protein were reduced and I-309 increased in MDA-MB-231 cells (p <0.05). In the co-culture, six pro-inflammatory proteins were underexpressed and the IL-4, MCP-3 and SCF proteins were increased the expression (p <0.05). Twelve pro-apoptotic proteins increased and decreased expression of caspase-3 in MDA-MB-231 cells (p <0.05). In the co-culture, an increase of BIM, HPS27 and IGF-1R proteins and TNF-RII reduction was observed (p <0.05)... / Mestre

Enxertos gengivais livres são importantes para garantir condições necessárias para o estabelecimento da homeostasia do periodonto de proteção. O processo de inflamação não ocorre por igual em todos os tecidos conjuntivos do organismo e os fibroblastos têm a capacidade de reagir a estímulos agressivos por meio de liberação de diversas citocinas, que desempenham importante função na formação do infiltrado inflamatório. Até o presente trabalho, não há relatos na literatura acerca da comparação do comportamento dos fibroblastos que compõem a mucosa palatina não marginal e dos fibroblastos provenientes de enxerto gengival livre (EGL) marginal em resistir aos estímulos agressores que ocorrem na doença periodontal. Dessa forma, a proposta do presente trabalho foi investigar se os fibroblastos da mucosa palatina não marginal mudariam seu perfil de secreção de citocinas quando enxertados na margem gengival. Foram coletadas biópsias da mucosa palatina no momento da cirurgia de EGL (período inicial) e após 4 meses (período final) no momento da cirurgia para recobrimento radicular. Os fibroblastos foram cultivados e estimulados com LPS de Porphyromonas gingivalis (Pg) e de Escherichia coli (Ec) por 24h e 48h para avaliação comparativa da expressão de citocinas e mediadores do reparo tecidual, como: IL-6, IL-8/CXCL8, MIP-1&#x3B1;/CCL3, TGF-&#x3B2;, VEGF e CXCL16. As citocinas foram quantificadas no sobrenadante das células por meio de ensaio imunoenzimático (ELISA). Para a citocina IL-6, os fibroblastos da mucosa palatina não marginal mantiveram o mesmo perfil de secreção quando enxertados na área gengival marginal; para MIP-1&#x3B1; a secreção se mostrou aumentada de forma estatisticamente significativa pelos fibroblastos obtidos do enxerto gengival marginal após 48h de estímulo por Pg em comparação com os fibroblastos da área palatina não marginal; a secreção de IL-8 pelos fibroblastos da mucosa palatina não marginal foi maior em resposta ao desafio por LPS de Pg e os fibroblastos obtidos do enxerto gengival marginal exibiram secreção até mesmo sem o estímulo de LPS; apenas os fibroblastos do enxerto gengival marginal apresentaram secreção de TGF-&#x3B2;, mesmo na ausência de estímulo por LPS; a secreção de VEGF e CXCL16 não foi detectada pelos fibroblastos analisados. Conclui-se que os fibroblastos provenientes de uma mucosa palatina não marginal parecem se adaptar às condições locais quando enxertados na área gengival marginal, oferecendo evidência de sua participação efetiva na produção de mediadores inflamatórios importantes para o processo de homeostasia do periodonto marginal. / Free gingival grafts are important to ensure conditions for the establishment of homeostasis of the periodontal soft tissues. The process of inflammation does not occur the same way in all connective tissues and fibroblasts have the ability to respond to aggressive stimuli through the release of various cytokines, which play an important role in the inflammatory infiltrate formation. In literature, there are no studies comparing the behavior of fibroblasts from palatal mucosa (not marginal) and fibroblasts from marginal free gingival graft (FGG) regarding their resistance towards periodontal disease aggressive stimuli. Thus, the purpose of this study was to investigate whether fibroblasts from the palatal mucosa behave differently when grafted to the gingival margin considering their mechanism of cytokine secretion. Biopsies from the palatal mucosa were collected at the time of FGG surgery (initial period) and after 4 months (final period) when surgery for root coverage was performed. The fibroblasts were cultured and stimulated with LPS of Porphyromonas gingivalis (Pg) and Escherichia coli (Ec) for 24 and 48 hours in order to make a comparative evaluation of cytokines and mediators of tissue repair expression, such as IL-6, IL-8/CXCL8, MIP-1&#x3B1;/CCL3, TGF-&#x3B2;, VEGF and CXCL16. Cytokines were measured in the cell supernatant by enzyme immunoassay (ELISA). For cytokine IL- 6, fibroblasts from palatal mucosa maintained the same secretion pattern when grafted to the gingival margin; for MIP-1&#x3B1; the secretion was significantly increased by fibroblasts from the marginal gingival graft after 48 hours of stimulation with Pg when compared to palatal mucosa fibroblasts; IL-8 secretion by palatal mucosa fibroblasts did not increase in response to Pg LPS challenge and fibroblasts from marginal gingival graft showed secretion even without the stimulus of LPS; only fibroblasts from marginal gingival graft showed secretion of TGF-&#x3B2;, even in the absence of LPS stimulation; VEGF and CXCL16 secretion by fibroblasts was not detected. It was concluded that fibroblasts from palatal mucosa seem to adapt to local conditions when grafted to the gingival margin area, providing evidence of its effective participation in the homeostasis of marginal periodontium through the production of important inflammatory mediators.

Orientador: Carlos Alberto de Souza Costa / Co-orientador: Fernanda Gonçalves Basso / Banca: Gelson Luis Adabo / Banca: Carla Raquel Fontana Mendonça / Resumo:A idadedo indivíduo e a presença de inflamação podem influenciar o metabolismo celular, retardando o processo de reparo tecidual. Diferentes tratamentos, como a laserterapia de baixa potência (LBP) e a aplicação de fatores de crescimento são capazes promover bioestimulação celular através do aumento de sua proliferação e metabolismo. O objetivo deste estudo foi avaliar as atividades de fibroblastos obtidos da gengiva de indivíduos jovens e idosos (Estudo 1), a capacidade de resposta destas células expostas ao fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) (Estudo 2), bem como o efeito da LBP ou do fator de crescimento epidérmico (EGF) sobre a viabilidade e metabolismo destas células em cultura (Estudo 3). Culturas primárias de fibroblastos de gengiva de 6 pacientes (3 jovens - J; e 3 idosos - I) foram obtidas e semeadas em meio de cultura completo (DMEM), de acordo com cada protocolo proposto. No Estudo 1, fibroblastos em DMEM completo foram cultivados em placas de 24 compartimentos pelos períodos de 24, 48 ou 72 horas e submetidos a análise da viabilidade celular (MTT, n=36), produção de proteína total (PT, n=36) e síntese de colágeno Sirius Red (SR, n=36). No Estudo 2, após 24 horas do cultivo celular em placas de 96 compartimentos, o meio de cultura completo foi substituído por DMEM sem soro fetal bovino (SFB) acrescido ou não de TNF-α (100 ng/mL) e mantido em contato com as células por 24 horas adicionais. Então, as células foram analisadas quanto a produção de espécies reativas de oxigênio (EROs, n=36), produção de óxido nítrico (NO, n=36) e síntese de quimiocina CCL5 (ELISA, n=36). No Estudo 3, fibroblastos cultivados em placas de 24 compartimentos foram tratados com EGF (100 μM) ou irradiados com laser de baixa potência (LASERTable, InGaAsP - 780 ± 3nm; 25mW). A viabilidade celular (Alamar Blue®, n=12), migração celular (Wound Healing, n=12)...(Resumo completo clicar acesso eletrônico) / Abstract: The age as well as the presence of inflammation can influence the cellular metabolism, slowing the tissue healing process. Different therapies, such as the application of growth factors and low level laser therapy (LLLT) are capable of biostimulating cells by increasing their proliferation and metabolism. The aim of this study was to evaluate: the functions of gingival fibroblasts obtained from young and elderly individuals (Study 1); the response of these cells exposed to tumor necrosis factor alpha - TNF-α (Study 2); and the effect of LLLT or epidermal growth factor - EGF on the viability and metabolism of these connective cell type (Study 3). Primary culture of gingival fibroblasts of 6 patients (3 young - Y and 3 elderly - E) were collected and cultured in complete culture medium (DMEM). In the Study 1 fibroblasts were seeded in 96-well plates in complete DMEM containing 10% of fetal bovine serum (FBS) for 24, 48 or 72 hours and subjected to evaluation of cell viability (MTT, n=36), total protein production (TP, n=36) and collagen synthesis (SR, n=36). In the Study 2, after 24-hour cell seeding, the complete DMEM was replaced by DMEM without FBS supplemented or not with TNF-α (100 ng/mL) which was kept in contact with cells for additional 24 hours. Then, the production of reactive oxygen TNF-α species (ROS, n=36), nitric oxide (NO, n=36) and synthesis of CCL5 chemokine (ELISA, n=36) were assessed. In the Study 3 fibroblasts were seeded in 24-well plates for 24 hours, and then exposed to EGF (100 μM) or submitted to low power laser irradiation (LASERTable device, InGaAsP - 780 ± 3nm; 25mW). Cell viability (Alamar Blue®, n=12), cell migration (Wound Healing, n=12), collagen synthesis (SR, n=12), and synthesis of vascular endothelial growth factor - VEGF (ELISA, n=12) were assessed 72 hours after the treatments. The data were statistical...(Complete abstract electronic access below) / Mestre

Orientador : Vera Lucia Borges Isaac / Banca: Pedro Alves da Rocha Filho / Banca: Marcos Antonio Corrêa / Banca: Gislaine Ricci Leonardi / Banca: Vania Rodrigues Leite e Silva / Resumo: É sabido que a maior consequência causada pela radiação ultravioleta gerada pela luz solar é o fotoenvelhecimento e o desenvolvimento de cânceres cutâneos por meio da ação dos radicais livres gerados na pele. A utilização, pela população, de uma formulação, de uso tópico, que auxilie na prevenção do envelhecimento precoce e de doenças causadas pelos radicais livres à pele humana teria imenso impacto, pois promoveria benefícios estéticos, que influenciariam diretamente a saúde psicológica do usuário e preveniriam a fotocarcinogênese. Este fato se torna ainda mais importante em um país tropical como o Brasil, onde a incidência de radiação UV tem se tornado cada vez maior, assim como o desenvolvimento de cânceres de pele na população. Este trabalho teve como objetivo realizar ensaios que comprovem a eficácia e a segurança de um fitocosmético contendo extrato de goiaba (Psidium guajava L.), além de descrever respostas celulares promovidas pelo tratamento com este extrato. No que diz respeito à eficácia deste produto, foram explorados os efeitos quimioprotetores, que podem ser obtidos com o emprego deste extrato e os efeitos relacionados à melhoria do aspecto da pele envelhecida. Em relação à segurança, foram realizadas análises in vivo e utilizados métodos alternativos, visando a substituição do emprego de animais. De acordo com os estudos realizados, o extrato de Psidium guajava L. é citotóxico apenas em concentração bastante superior à concentração ativa, com uma margem de segurança satisfatória. Nas concentrações sugeridas para efeito cosmético, o extrato vegetal não é mutagênico e não causou irritação dérmica, ocular e, nem mesmo comedogenicidade, quando aplicado em coelhos. Além disso, o extrato de Psidium guajava L. revelou atividade inibidora sobre os efeitos deletérios do peróxido de hidrogênio em modelos experimentais in vitro e in vivo, é capaz de estimular a ... / Abstract: It is known that the major consequence caused by the ultraviolet radiation generated by sunlight is photoaging and the development of skin cancers through the action of free radicals generated on the skin. The use by the population of a topical formulation aiming to prevent the premature skin aging and diseases caused by free radicals to human skin would be of great value. It also should provide aesthetic benefits that directly influence the psychological health of the user and would prevent photocarcinogenesis. This fact becomes even more important in a tropical country like Brazil, where the incidence of UV radiation has become increasingly larger, as well as the development of skin cancers in the population. This research aimed to performe assays to prove the efficacy and safety of a phytocosmetic containing guava (Psidium guajava L.) extract, and also, describe cellular responses observed with the treatment with this extract. With regard to the efficacy of this product, the chemoprotectors effects that can be obtained with the use of this extract and the improvement on the aged skin that could be obtained with the treatment with it were explored. In relation to the assessment of the safety of this phytocosmetic, in vivo and alternative methods to the use of animals were conducted. According to the results, the Psidium guajava L. extract is cytotoxic only at concentrations higher than the active concentration of this compound, exhibiting a satisfactory margin of safety. At the concentrations suggested for the cosmetic effect, the plant extract is not mutagenic and did not cause dermal, ocular, or even comedogenicity irritation when applied to rabbits. Moreover, the extract of this fruit was able to inhibit the deleterious effects of hydrogen peroxide in in vitro and in vivo experimental models, was able to induce the fibroblasts proliferation and collagen biosynthesis and is capable of reducing hyperpigmentation produced by overexposure... / Doutor