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Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2010-2011 / Comme dans le cancer, les maladies vasculaires à remodelage (MVR) sont caractérisées par un déséquilibre métabolique appelé paradoxe de Warburg (glycolyse augmentée par rapport à l'oxydation du glucose), une augmentation de cytokines circulantes et de facteurs de croissance comme TNF "tumor necrosis facton" et PDGF "platelet derived growth factor" favorisant la prolifération et la résistance à l'apoptose des cellules musculaires lisses vasculaires (CMLV). Les mécanismes permettant la durabilité de ce phénotype demeurent inconnus. Dans le cancer, ces anomalies résultent en partie de l'activation inappropriée du facteur de transcription HIF-1 "hypoxia inducible factor 1". Comme TNF et PDGF sont acceptés comme activateurs de HIF-1, nous avons émis l'hypothèse que l'activation de HIF-1 joue un rôle critique dans le mécanisme pathophysiologique des MVR. En utilisant des approches multidisciplinaires et translationnelles, nous avons démontré chez des CMLV d'artère carotide humaine que PDGF et TNF favorisent le paradoxe de Warburg, leur prolifération et leur résistance à l'apoptose. In vivo, nous avons démontré dans les artères carotides de rat que l'inhibition de HIF-1 par la transfection d'un ARN interférence localisé ou par l'injection d'un inhibiteur de TNF prévenaient le remodelage post-angioplastie de l'artère carotide. Nos découvertes démontrent pour la première fois l'implication de HIF-1 dans le processus de remodelage et nous proposons HIF-1 comme une nouvelle cible thérapeutique des MVR. Finalement, comme les MVR et le cancer possèdent plusieurs similarités, nos découvertes ne sont pas restreintes aux maladies vasculaires et ouvrent de nouvelles avenues dans la recherche du cancer.

Il existe une variabilité interindividuelle de la relation dose - effet chez les patients atteints de maladies inflammatoires rhumatismales traités par les inhibiteurs du Tumor Necrosis Factor-alpha (TNF-a). Dans la première partie de cette thèse, la physiopathologie du TNF-a dans le processus inflammatoire est présentée. Ensuite, le travail se concentre sur la relation concentration-effet en utilisant la modélisation pharmacocinétique-pharmacodynamique (PK-PD) modèles. À la fin, après une discussion sur les biomarqueurs d'imagerie, la thèse traite de l'utilité d'une nouvelle technique permettant de détecter la réponse précoce au traitement, à savoir la tomographie par émission de positons (TEP). En résumé, ce travail décrit la relation PK-PD dans les maladies inflammatoires rhumatismales traitées par anticorps monoclonaux en utilisant les marqueurs cliniques et biologiques, et démontre également l'influence de fortes concentrations d'anticorps monoclonaux pour la maintenance au traitement. La TEP est une technique prometteuse pour identifier la réponse précoce aux antagoistes du TNF-a. / There is an interindividual variability of the dose - response relationship in patients with inflammatory rheumatic diseases treated by Tumor Necrosis Factor-alpha (TNF-a) inhibitors. In the first part of this thesis, the pathophysiology of TNF-a in inflammatory processes is presented. Then, the work focuses on the concentration-effect relationship using pharmacokinetic-pharmacodynamic (PK-PD) models. At the end, after discussion on imaging biomarkers, the thesis discusses the usefulness of a new technique to detect the early response to treatment, namely the positron emission tomography (PET). In summary, this work describes the PK-PD relationship in rheumatic inflammatory diseases treated by monoclonal antibodies using clinical and biological markers and demonstrates also the influence of high concentrations of monoclonal antibodies on maintenance to treatment. PET is a promising technique to identify early response to TNF-a antagonists.

De nombreuses études suggèrent que l'inflammation joue un rôle important dans l'initiation et le développement du processus d'athérosclérose. Certains individus, tels que les résistants à l'insuline, les obèses et les diabétiques, présentent un niveau d'inflammation chronique plus élevé que les individus en santé et sont plus à risque de développer une maladie cardiovasculaire (MCV). D'autre part, le phénomène postprandial est considéré comme un processus athérogène. En effet, les individus ayant une lipémie postprandiale exagérée, capable d'induire une réponse inflammatoire, sont plus susceptibles de souffrir de MCV. Le présent mémoire porte sur l'étude des variations postprandiales des cytokines inflammatoires chez des individus en santé et, plus précisément, sur les différences sexuelles dans les variations plasmatiques des marqueurs inflammatoires interleukine-6 (IL-6), facteur de nécrose tumoral alpha (TNF-a) et protéine C-réactive (CRP) suite à l'ingestion d'un repas riche en lipides. Une augmentation significative des concentrations plasmatiques d'IL-6 a été notée en période postprandiale chez les deux sexes, mais était plus importante chez la femme comparativement à l'homme. De plus, une baisse transitoire des concentrations plasmatiques de TNF-a a été observée autant chez l'homme que chez la femme tandis que la concentration plasmatique de CRP est demeurée stable suite à l'ingestion du repas. Ces résultats suggèrent qu'il existe des différences dans le profil inflammatoire des hommes et des femmes suite à un repas riche en lipides et que l'augmentation de l'inflammation lors de cette période pourrait contribuer à augmenter le risque de MCV.

La sclérose latérale amyotrophique (SLA) est une maladie mortelle caractérisée par la dégénénérescence des neurones moteurs. La majorité des cas de SLA ont une origine sporadique (SLAs) et les autres sont des cas familiaux (SLAf) étant hérités génétiquement. Une portion des cas de SLAf est associée à des mutations dans le gène codant pour la Cu/Zn superoxyde dismutase (SOD1). La microgliose est une caractéristique pathologique observée dans les tissus des patients atteints de maladies du système nerveux incluant la SLA. La microgliose et la réponse inflammatoire dans le SNC peuvent avoir des effets bénéfiques ou néfastes. Ainsi, l'activation microgliale dans la pathologie de la SLA pourrait promouvoir la survie neuronale mais aussi causer ou exacerber la dégénérescence des motoneurones. Pour déterminer le rôle des microglies et des médiateurs inflammatoires dans la dégénérescence des motoneurones causée par des mutations dans la SOD1, nous avons utilisé les souris 5001 mutantes, modèles de la SLA. Dans un premier temps (chapitre 2), afin de déterminer le rôle de la cytokine TNF-a dans la SLA, nous avons généré des souris exprimant les mutants 5001 G37R ou 5001 G93A dans un contexte où l'expression du TNF-a a été supprimée (souris knock-out). Dans une seconde approche (chapitre 3), par cytométrie de flux, nous avons caractérisé les populations de cellules microgliales dans la moelle épinière des souris transgéniques mutantes 5001 G93A. Dans cette étude, nous avons démontré que l'augmentation du nombre de cellules microgliales dans ce modèle murin est largement attribuable à la prolifération de celles-ci. Subséquemment, nous avons utilisé des souris transgéniques CD11b-TKmut-30, chez lesquelles les microglies en prolifération peuvent être sélectivement éliminées, afin de déterminer le rôle des microglies en prolifération dans la SLA causée par des mutations dans la SOD1. Dans une dernière étude, nous avons tenté d'induire un phénotype neuroprotecteur aux cellules microgliales via l'administration de la cytokine macrophage colony stimulating factor (M-CSF) chez des souris transgéniques 5001 G37R et chez des souris chimériques 5001 G37R ayant subi une transplantation de moelle osseuse sauvage.

La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est une maladie liée à l'X caractérisée par la détérioration progressive des muscles en raison de l'absence de la protéine dystrophine. Les muscles atteints chez l'homme ou dans des modèles animaux (souris mdx) présentent une fibrose, accumulation excessive de protéines de la matrice extracellulaire. Parmi les facteurs induisant la fibrose se trouvent le Facteur de Croissance de Transformation de type β (TGF-β) et le Facteur de Croissance du Tissu Conjonctif (CTGF). Ce dernier est une cible de la voie de signalisation médiée par TGF-β/SMAD et est responsable des effets profibrotiques de TGF-β. La régulation de l'expression de CTGF médiée par TGF-β dans les cellules musculaires est peu connue. Nous décrivons ici un nouvel élément de liaison SMAD situé dans la région 5’UTR du gène de CTGF, important pour l'expression de CTGF médiée par le TGF-β dans des myoblastes. De plus, nos résultats suggèrent que d'autres sites de liaison du facteur de transcription présents dans le 5’UTR du gène de CTGF sont importants pour cette expression.Par ailleurs, le Facteur de Nécrose Tumorale (TNF) est une cytokine inflammatoire présente dans les muscles atteints de DMD et est responsable de la nécrose du muscle et de l'infiltration de cellules inflammatoires. Nous montrons que l’expression du récepteur soluble TNFRI par électrotransfert (ET) dans le muscle tibialis anterior de la souris atténue l'inflammation, les dommages et la fibrose dans le muscle squelettique des souris mdx, et provoque une augmentation de la force musculaire. Par conséquent, nous proposons l'ET comme thérapie efficace anti-TNF pour le traitement de dystrophies musculaires. / The Duchenne Muscular Dystrophy (DMD) is an X-linked disease characterized by progressive damage in the muscle due to the absence of the dystrophin protein. Fibrosis, the excessive accumulation of extracellular matrix (ECM) proteins, is also present in the muscle of DMD patients and several animal models (such as the mdx mice). Among the factors that induce fibrosis are Transforming Growth Factor type β (TGF-β) and Connective Tissue Growth Factor (CTGF), the latter being a target of the TGF-β/SMAD signaling pathway and is the responsible for the profibrotic effects of TGF-β and are augmented in fibrosis tissues. Little is known about the regulation of the expression of CTGF mediated by TGF-β in muscle cells. In here, we described a novel SMAD Binding Element (SBE) located in the 5’ UTR region of the CTGF gene important for the TGF-β mediated expression of CTGF in myoblasts. In addition, our results suggest that additional transcription factor binding sites present in the 5’ UTR of the CTGF gene are important for this expression. On the other hand, the Tumor Necrosis Factor (TNF) is an inflammatory cytokine that is present in DMD muscles and is responsible for muscle necrosis and inflammatory cell infiltration. In this study, we show that the increased expression of the soluble TNF Receptor I by electrotransfer (ET) in the tibialis anterior muscle attenuates inflammation, damage and fibrosis in the skeletal muscle of the mdx mice. In addition, we found increased muscle strength in the mdx mice. Therefore, we propose that ET could be used as an efficient anti-TNF therapy for treating muscle dystrophies.

La dysfonction endothéliale est associée à plusieurs pathologies, dont l'hypertension artérielle et l'insuffisance rénale chronique. Elle se caractérise par un déséquilibre dans la production des facteurs vasodilatateurs, vasoconstricteurs et de certaines cytokines. Chez le rat en insuffisance rénale chronique, la production du monoxyde d'azote (NO) est diminuée alors que la production de l'angiotensine II (Angll), de l'endothéline-1 (ET-1), du transforming growth factor-f31 (TGF-pl) et du tumor necrosis factor-a (TNF-a) est a ugmentée. Le rôle exact de ces facteurs endothéliaux et de ces cytokines dans le développement de l'hypertension artérielle en insuffisance rénale chronique reste à élucider. À l'aide d'un inhibiteur de la synthèse du NO, nous avons développé un nouveau modèle d'hypertension maligne chez le rat. Nous avons démontré que le traitement avec le Nu-nitro-L-arginine-méthyl ester (L-NAME) induit une hypertension maligne dose-dépendante et des dommages vasculaires et rénaux caractéristiques de la néphroangiosclérose maligne chez le rat Harlan Sprague-Dawley. Nous avons démontré que le traitement de l'hypertension artérielle contribue à ralentir la progression de l'insuffisance rénale chronique et que le blocage des récepteurs ATi de l'AnglI permet d'obtenir une protection tissulaire à long terme. Nous avons également observé que la neutralisation du TNF-a prévient l'hypertension artérielle, l'inflammation et la fibrose rénale chez le rat rendu urémique par réduction de la masse rénale. Ces effets sont associés à une diminution de l'activation du NF-KB et de l'expression de MCP-1, ICAM-1 et VCAM-1 et de la production rénale du TGF-f31 et de 1ET-1. L'ensemble de ces résultats suggèrent que le TNF-a joue un rôle important dans l'inflammation, les dommages rénaux et l'hypertension artérielle associés à l'insuffisance rénale chronique.

Le but de ce travail était de mieux comprendre les mécanismes de régulation influençant le recrutement des macrophages cérébraux et leur activation dans différentes affections du système nerveux central. À cette fin, trois objectifs ont été définis : (1) Mettre en évidence le rôle du TNF dans l'infiltration et l'activation des macrophages dans un modèle de démyélinisation induit par la cuprizone; (2) Identifier les précurseurs sanguins des macrophages périvasculaires du cerveau et le rôle de l'angiopoïétine-2 dans leur recrutement suite à une endotoxinémie; (3) Définir le rôle du récepteur GPR84 lors de la réponse microgliale dans un modèle murin de la maladie d'Alzheimer. L'identification des différents facteurs pouvant influencer le phénomène de démyélinisation est un enjeu majeur de la recherche sur la sclérose de plaques. Dans cette maladie et dans les modèles animaux associés, l'expression de TNF par les macrophages cérébraux suggérait que la cytokine pro-inflammatoire jouerait un rôle dans le recrutement des macrophages dérivés du sang et de la microglie. Afin de déterminer quelles fonctions jouaient le TNF et ses récepteurs TNF-R1 et TNF-R2 sur les macrophages cérébraux, nous avons utilisé des souris chimériques dont le système hématopoïétique exprimait la GFP, et nous les avons traitées avec la toxine cuprizone pour reproduire un modèle de démyélinisation. Nous avons montré que les macrophages étaient très fortement recrutés depuis la périphérie et activés dans le SNC, mais selon un mécanisme indépendant du TNF. De plus, chez des souris déficientes en TNF traitées avec la cuprizone, l'étendue de la démyélinisation n'était pas diminuée par rapport aux souris contrôles. Finalement, par la technique d'hybridation in situ, il a été prouvé que le TNF n'était pas exprimé dans le cerveau dont la démyélinisation était provoquée par la cuprizone. Le système nerveux est infiltré de façon continue par les macrophages périvasculaires dérivés du système sanguin. Les précurseurs immédiats de ces cellules n'ont pas encore été identifiés et les mécanismes gouvernant leur recrutement sont encore largement méconnus. Dans cette étude, nous apportons la preuve que les monocytes CD68+GR1" pouvaient se différencier en macrophages périvasculaires chez des souris souffrant d'endotoxinémie. Après leur adhésion à l'endothélium, ces monocytes rampaient, adoptaient une morphologie dite en bâtonnet lors de leur passage dans les capillaires, pouvaient proliférer et former de longues protubérances cytoplasmiques. Ils étaient recrutés en grand nombre lors d'une endotoxinémie grâce à la combinaison de molécules vasorégulatrices, incluant le TNF, l'interleukine-ip et l'angiopoïétine-2. Après quelques heures, quelques unes de ces cellules traversaient l'endothélium afin d'accroître la population de macrophages périvasculaires du SNC. L'élimination des monocytes adhérents et des macrophages périvasculaires nouvellement recrutés pouvait être provoquée par l'injection d'une protéine de fusion couplant un peptide-Fc et un anti-angiopoïétine-2. Cette seconde étude permet ainsi une meilleure compréhension du comportement monocytaire à l'interface sang-cerveau et fournit une nouvelle façon de contrer leur infiltration dans le tissu nerveux en conditions inflammatoires. Le GPR84 est un récepteur transmembranaire couplé aux protéines G récemment identifié comme étant exprimé de façon sélective par la microglie chez des souris souffrant d'endotoxinémie ou d'encéphalomyélite autoimmune expérimentale, mais sa fonction demeure inconnue. Nos travaux rapportent que le GPR84 est également exprimé par les cellules microgliales entourant les plaques amyloïdes chez les souris transgéniques APP/PS1, un modèle de la maladie d'Alzheimer. Les symptômes d'une endotoxinémie ou de l'EAE ne différaient pas chez des souris déficientes en GPR84, mais un déclin cognitif plus précoce et plus sévère était observé chez les souris APP/PS1 déficientes en GPR84. Dans le cerveau de ces dernières, le nombre de microglies global ainsi que par plaque était diminué; toutefois, aucune différence de dépôt d'amyloïde n'était observée. Nous en concluons dans cette troisième étude que le GPR84 joue un rôle dans le recrutement des cellules microgliales lors de certaines conditions inflammatoires et que son absence réduit la capacité de la microglie à protéger partiellement le cerveau contre la P-amyloïde toxique sans pouvoir l'éliminer. L'ensemble de ces

Le glaucome est la principale cause de cécité irréversible dans le monde. Chez les patients atteints de cette pathologie, la perte de la vue résulte de la mort sélective des cellules ganglionnaires (CGR) de la rétine ainsi que de la dégénérescence axonale. La pression intraoculaire élevée est considérée le facteur de risque majeur pour le développement de cette maladie. Les thérapies actuelles emploient des traitements pharmacologiques et/ou chirurgicaux pour diminuer la pression oculaire. Néanmoins, la perte du champ visuel continue à progresser, impliquant des mécanismes indépendants de la pression intraoculaire dans la progression de la maladie. Il a été récemment démontré que des facteurs neuroinflammatoires pourraient être impliqués dans le développement du glaucome. Cette réponse est caractérisée par une régulation positive des cytokines pro-inflammatoires, en particulier du facteur de nécrose tumorale alpha (TNFα). Cependant, le mécanisme par lequel le processus neuroinflammatoire agit sur la mort neuronale reste à clarifier. L’hypothèse principale de ce doctorat propose que les facteurs pro-inflammatoires comme le TNFα et la phosphodiestérase 4 (PDE4) interagissent avec les mécanismes moléculaires de la mort neuronale, favorisant ainsi la survie et la protection des CGRs au cours du glaucome. Dans la première partie de ma thèse, J’ai utilisé un modèle in vivo de glaucome chez des rats Brown Norway pour montrer que l’expression du TNFα est augmentée après l'induction de l'hypertension oculaire. L'hypothèse spécifique de cette étude suggère que les niveaux élevés de TNFα provoquent la mort des CGRs en favorisant l'insertion de récepteurs AMPA perméables au calcium (CP-AMPAR) à la membrane cytoplasmique. Pour tester cette hypothèse, j’ai utilisé un inhibiteur sélectif de la forme soluble du TNFα, le XPro1595. L'administration de cet agent pharmacologique a induit une protection significative des somas et des axones des neurones rétiniens. L'évaluation de la perméabilité au cobalt a montré que le TNFα soluble est impliqué dans l'insertion de CP-AMPAR à la membrane des CGRs lors du glaucome. L’exposition des neurones à une pression oculaire élevée est à l’origine de la hausse de la densité membranaire des CP-AMPARs, grâce à une diminution de l’expression de la sous-unité GluA2. La présence de GluA2 au sein du récepteur ne permet pas l’entrée du calcium à l’intérieur de la cellule. L'administration intraoculaire d’antagonistes spécifiques des CP-AMPARs promeut la protection des somas et des axones des CGRs. Ces résultats montrent que les CP-AMPARs jouent un rôle important dans la pathologie du glaucome. Dans la deuxième partie de ma thèse, j’ai caractérisé l'effet neuroprotecteur d’un inhibiteur de la PDE4, l’ibudilast, dans notre modèle de glaucome. L'hypothèse spécifique s’oriente vers une atténuation de la réponse neuroinflammatoire et de la gliose par l’administration d’ibudilast, favorisant ainsi la protection neuronale. Les résultats montrent que dans les rétines glaucomateuses, l’ibudilast diminue la gliose et l'expression de plusieurs facteurs tels que le TNFα, l'interleukine-1β (IL-1β), l’interleukine-6 (IL-6) et le facteur inhibiteur de la migration des macrophages (MIF). Chez les rats glaucomateux, nous avons observé une expression notable de PDE4A dans les cellules de Müller, qui est en corrélation avec l'accumulation de l’AMP cyclique (AMPc) dans ces cellules après un traitement d’ibudilast. Finalement, nous avons démontré que la protection des CGRs via l’administration d’ibudilast est un mécanisme dépendent de l’AMPc et de la protéine kinase A (PKA). En conclusion, les résultats présentés dans cette thèse identifient deux mécanismes différents impliqués dans la perte des CGRs au cours du glaucome. Ces mécanismes pourraient fournir des perspectives potentielles pour le développement de nouvelles stratégies de traitement du glaucome. / Glaucoma is the leading cause of irreversible blindness worldwide. Loss of vision in glaucoma results from the selective death of retinal ganglion cells (RGCs) and axonal degeneration. Elevated intraocular pressure (IOP) is the major risk factor for developing glaucoma, and current therapies have focused on pharmacological or surgical strategies to lower IOP. However, visual field loss continues to progress in spite of effective pressure control, indicating that mechanisms other than elevated IOP contribute to disease progression. Recent data demonstrate a neuroinflammatory component in glaucoma, characterized by upregulation of proinflammatory cytokines, most notably tumor necrosis factor α (TNFα). However, the mechanism by which the neuroinflammatory response acts on RGC death needs to be clarified. The main hypothesis of this thesis is that targeting pro-inflammatory factors including TNFα and phosphodiesterase-type 4 (PDE4), interferes with molecular mechanisms that contribute to RGC death and this will thus successfully promote neuronal protection. In the first part of my thesis, I used an in vivo glaucoma model in Brown Norway rats to show that TNFα is upregulated early after induction of ocular hypertension. The specific hypothesis of this study is that high levels of TNFα promote RGC death by mediating the membrane insertion of Ca2+-permeable AMPA receptors (CP-AMPARs). I blocked TNFα function with XPro1595, a selective inhibitor of soluble TNFα. Administration of XPro1595 effectively protected RGC soma and axons. The cobalt permeability assay was used to show that soluble TNFα triggers the membrane insertion of CP-AMPAR in RGCs of glaucomatous retinas. This CP-AMPAR activation is caused by the downregulation of GluA2 which occurs when neurons are exposed to elevated IOP. Finally, intraocular administration of specific CP-AMPAR antagonists promoted RGC soma and axon protection. Taken together, these results show that CP-AMPARs play an important role in in the pathology of glaucoma. In the second part of my thesis, I characterized the neuroprotective effect of ibudilast, an inhibitor of PDE4, in the Brown Norway glaucoma model. We hypothesized that ibudilast promotes neuron protection by attenuating gliosis and the neuroinflammatory response. The results show that in glaucomatous retinas, ibudilast attenuates gliosis and the expression of TNFα, interleukin-1β (IL-1β), interleukin-6 (IL-6) and macrophage migration inhibitory factor (MIF). Interestingly, elevated IOP leads to substantial expression of PDE4A in Müller cells, which correlates with the accumulation of cAMP in these cells after ibudilast treatment. Lastly, ibudilast promoted RGC soma and axons protection through the activation of the cAMP/PKA pathway. In conclusion, the findings presented in this thesis identify two different mechanisms underlying RGC loss in glaucoma. These mechanisms can potentially provide new insights to develop novel strategies for the treatment of glaucoma

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