Tableau d'honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2006-2007 / La famille des récepteurs nucléaires orphelins représente un regroupement de facteurs de transcription pour lesquels nous ne connaissons pas, à l'heure actuelle, de ligands endogènes. Parmi ces récepteurs nucléaires nous retrouvons la sous-famille Nur dont fait partie Nur77, une protéine dont la fonction fut étudiée in vitro et in vivo dans différents systèmes, particulièrement les systèmes immunitaire et endocrinien. Comme la grande majorité des gènes, Nur77 est aussi exprimé à l'intérieur du cerveau. Il a cependant ceci de distinctif, soit d'être retrouvé préférentiellement dans les structures cibles des systèmes dopaminergiques, notamment dans le striatum. Afin de clarifier son rôle dans la fonction de ces systèmes, nous avons d'abord étudié la régulation de son expression suivant différentes manipulations pharmacologiques et lésionnelles des structures dopaminergiques. En ayant recours à un modèle animal de la maladie de Parkinson, le rongeur hémiparkinsonien, nous avons identifié de façon précise les populations neuronales du striatum concernées par les changements dans la régulation de l'expression de ce gène, ceci suivant la déplétion sélective des neurones dopaminergiques nigro-striataux, puis à la suite d'un traitement de remplacement à la levo-dihydroxyphenylalanine (L-DOPA). En mettant à profit le génie génétique, nous avons également évalué l'impact de la délétion du gène codant pour ce récepteur nucléaire sur les mécanismes adaptatifs intrinsèques aux neurones du striatum en réponse à une atteinte de la fonction dopaminergique. Nous avons alors parallèlement observé les conséquences de cette délétion génétique sur la réponse locomotrice des souris hémiparkinsoniennes avant et après la thérapie de remplacement de L-DOPA. Les conclusions de ces différentes études suggèrent un rôle primordial du récepteur nucléaire Nur77 dans le maintien des mécanismes adaptatifs neuronaux responsable de l'homéostasie de la fonction dopaminergique dans le cerveau. / The orphan nuclear receptors family includes a group of transcription factors without any known endogenous ligand. Nur77 is one member of the Nur sub-family of orphan nuclear receptors. Its function was studied both in vitro and in vivo in different Systems, namely and particularly the immune and endocrine Systems. In the brain, its expression is found preferentially in target structures of dopaminergic Systems such as the striatum. In order to clarify its role in this structure, we studied Nur 7 7 regulation following pharmacological and surgical manipulation of the dopaminergic function in the brain. We use the hemiparkinsonian rat model of Parkinson's disease to identify neuronal populations of the striatum concerned by changes in Nur 7 7 expression pattern following selective dopamine depletion in the nigro-striatal pathway, and also following levo-dihydroxyphenylalanine (LDOPA) replacement therapy. Taking advantage of genetic engineering, we also assessed the consequences of Nur 7 7 gene deletion on adaptive mechanisms taking place in striatal neurons in response to alteration of dopaminergic function. Concomitantly, we studied the impact of this gene knockout on hemiparkinsonian mice's locomotor response, before and after L-DOPA replacement therapy. Our conclusions strongly suggest that the nuclear receptor Nur77 is essential to the expression of appropriate adaptive neuronal mechanisms that will maintain the integrity of dopaminergic function in the brain.

Compte tenu de la faible disponibilité de l’oxygène (hypoxie) en haute altitude, l’adaptation à ce milieu constitue un vrai défi pour les espèces adaptées au niveau de la mer. Aussi, le rat et la souris constituent un modèle pertinent pour la compréhension des facteurs qui contribuent à une bonne adaptation en haute altitude. En effet, les rats et les souris de laboratoire élevées à haute altitude durant plusieurs générations possèdent un phénotype différent: les souris présentent une plus importante ventilation, des valeurs d’hématocrite/ hémoglobine diminuées et une hypertension pulmonaire réduite. Ces différences indiquent une mauvaise adaptation des rats qui montrent également une importante mortalité en haute altitude. Néanmoins, les mécanismes impliqués dans cette différence entre ces deux espèces ne sont pas connus. Nous avons donc recherché dans un premier temps si les différences observées entre rats et souris sont également présentent au niveau de la mer, puis dans un second temps si cela avait un lien avec l'expression du senseur moléculaire d'oxygène HIF (Hypoxia Inducible Factor). Nous avons mené une étude au niveau de la mer (Québec, Canada - 98m) pour comparer les réponses ventilatoire et moléculaire entre les rats et les souris. Pour se faire, les animaux sont exposés pendant 6 heures à différents gradients d’oxygène : 21%, 15%, et 12% O2. La ventilation est mesurée par pléthysmographie à corps entier. La consommation d’oxygène (VO2) et la production de CO2 (VCO2) sont évaluées durant la même période d’exposition. Après 6 heures d’exposition, les animaux sont anesthésiés et le tronc cérébral rapidement prélevé pour effectuer une mesure de l’expression de HIF-1α à l’aide de la technique ELISA (Enzyme LinkImmunosorbent Assay). Comparé aux rats, les souris présentent une élévation du débit ventilatoire, une diminution de la VO2 et de la VCO2 et une augmentation de l’équivalant ventilatoire à l’O2 (Ve/VO2) et au CO2 (Ve/VCO2) durant l’exposition à 15 et 12% d’O2. De plus, l’expression de HIF-1α au niveau du tronc cérébral est plus élevée chez les souris en comparaison à celui des rats. En conclusion, la différence de la réponse ventilatoire à l’hypoxie peut être liée à la différence d’expression de HIF-1α au niveau du tronc cérébral. Ces resultantssuggèrent que les souris possèdent une prédisposition génétique permettant une réponse adaptée en milieu hypoxique et pouvant aisément expliquer la facilité que possède cette espèce à survivre et à établir sa colonie en haute altitude. Mot clés : Hypoxie, haute altitude, réponse ventilatoire à l’hypoxie, tronc cérébral, HIF. / Successful adaptation at high altitude is very challenging for sea level natives due to the low level of available oxygen (hypoxia). Rats and mice offer an interesting model to understand the factors that contribute to efficient adaptation to high altitude. Indeed, laboratory rats and mice that have been raised at high altitude for several generations have a different phenotype with mice showing higher ventilation, lower hematocrit/hemoglobin values, and lower pulmonary hypertension. These differences are clearly a failure of adaptation to high altitude in rats, as underlined by data showing high mortality in the colony of high altitude rats. However the underlying mechanisms behind these differences are poorly understood. We sought to address whether these differences are also apparent in mice and rats living at Sea level, and if they are related to different responses of the O2 molecular sensor HIF (Hypoxia Inducible Factor). To test these hypotheses, we chose to perform the study at sea level i.e. at Quebec City, Canada (98m) to compare the ventilatory and molecular responses in male rats and mice. The animals were exposed to different oxygen gradients 21%O2, 15 % O2 and 12% O2 for 6 hours. Ventilation was measured by whole bodyplethysmography, oxygen consumption (VO2) and CO2 production rate (VCO2) were also measured during the exposure. After the 6 hour’s exposure, the animals were anesthetised, and the brainstem quickly dissected, Brainstem HIF-1α expression was measured by Enzyme Link Immunosorbent Assay (ELISA). Compared to rats, mice had higher minute ventilation, lower VO2, VCO2, and higher ventilatory equivalent to oxygen and carbon dioxide, (Ve/VO2, Ve/VCO2) at 15% and 12% O2. In addition, mice also had higher brainstem HIF-1α expression compared to rats. We conclude that the differences in ventilatory responses to hypoxia at sea level might be due to differences in expression of HIF-1α in the brainstem. This suggests that mice have a genetic pre-disposition that ensure adequate response to hypoxia. This trait helps to explain that mice are able to survive and successfully establish natural colonies at high altitude. Key Words: Hypoxia, high altitude, hypoxic ventilatory response, Brainstem, HIF.

Chez les arbres, la formation du bois dépend de la différenciation d'un tissu vasculaire appelé xylème secondaire. Les parois cellulaires du xylème sont riches en lignines, ce qui leur confère rigidité et imperméabilité indispensables au transport de la sève brute et au maintien du port dressé. La xylogénèse requiert la coordination de l'expression de plusieurs centaines de gènes dans le temps et dans l'espace. Cette coordination est assurée au niveau transcriptionnel par différents médiateurs protéiques, parmi lesquels il y a des facteurs de transcription de la famille MYB-R2R3. Peu de gènes de cette sous famille ont été préalablement caractérisés chez les conifères. Mon travail de thèse a consisté dans un premier temps à identifier plusieurs gènes MYBR2R3 potentiellement impliqués dans la formation du xylème chez les conifères, en particulier chez le pin loblolly (Pinus taeda) et l'épinette blanche (Picea glauca), et à réaliser leur caractérisation moléculaire. Différentes analyses phylogénétiques ont permis de mettre en évidence des similarités et des différences significatives dans la structure de cette famille entre les gymnospermes et les angiospermes. L'expression de ces mêmes gènes a été quantifiée par RT-QPCR, ce qui a révélé que PgMYB2, 4 et 8 sont préférentiellement exprimés dans le xylème secondaire de l'épinette et que leurs transcrits s'accumulent dans le bois de compression. La deuxième partie de mon travail a visé la caractérisation fonctionnelle de deux MYB-R2R3 de pin (PtMYBl et 8) réalisée via leur surexpression constitutive chez des transformants stables d'épinette. Ces deux facteurs MYB induisent une lignification ectopique cependant plus intense avec PfMYB8, qui bloque le développement normal des racines et conduit à la mort des plantules in vitro. L'analyse du transcriptome des plantules transgéniques par biopuces à ADN a dévoilé entre autres, l'augmentation de l'expression des gènes de la synthèse des lignines. La dernière partie de ma thèse est consacrée à la caractérisation fonctionnelle de PtMYBM placé en parallèle sous le contrôle d'un promoteur constitutif et d'un promoteur préférentiel du xylème (gène codant l'alcool cinnamylique deshydrogénase). Les plantules transgéniques ont une synthèse accrue de plusieurs terpènes et produisent de nombreux transcrits potentiellement associés aux mécanismes de défense. / In trees, wood formation depends on the differentiation of a vascular tissue refered to as secondary xylem. Xylem cell walls are rich in lignins, which confer stiffness and impermeability, properties essential for the mechanical support of the tree and for the transport of water and minerals. Xylogenesis requires the coordinated expression of several hundred genes in time and space. The regulation of gene expression is controled at the transcriptional level by different protein mediators, including transcription factors of the R2R3-MYB family. Hitherto, very few genes of this sub-family have been characterized, specially in conifers. The first part of my thesis consists in the identification and molecular characterization of several genes belonging to this family and potentially involved in xylem formation in conifers, particularly in loblolly pine (Pinus taeda) and white spruce (Picea glauca). Phylogenetic analyses highlight the major similarities as well as significant differences in the MYB family structure between gymnosperms (trees) and angiosperms (herbaceous plants and trees). I used qRT-PCR to determine transcript levels of these genes and assess their expression profiles in spruce. The data showed that the spruce transcripts for PgMYB2, 4 and 8 accumulate preferentially in secondary xylem and are upregulated in compression wood. The second part of my work aimed the functional characterization of two pine R2R3-MYB (PtMYBl and 8) via their constitutive overexpression in stable spruce transformants. The overexpression of both of these MYB transcription factors led to ectopic lignification. However, the overexpression of PtMYB8 led to a more intense lignification; it also prevented normal root development leading to the death of the in vitro plantlets. Microarrays analyses of the transgenic plantlets showed that there was a significant upregulation of many lignin biosynthesis genes, among others. The final section of my thesis describes the functional characterization of PtMYB14 based on its overexpression with either a constitutive promoter or a xylem-preferential promoter (gene coding for the cinnanyl alcohol dehydrogenase). Both types of transgenics plantlets accumulated several terpenes compounds and produced numerous transcripts potentially involved in defence mechanisms.

L’hypertension artérielle pulmonaire (HTAP) est caractérisée par l’obstruction des artères pulmonaires, principalement due au phénotype pro-prolifératif/anti-apoptotique des cellules musculaires lisses de la paroi des artères pulmonaires (CMLAP). L’augmentation progressive des résistances vasculaires pulmonaires aboutit à une élévation de la pression pulmonaire qui va induire rapidement une insuffisance cardiaque droite et conduire au décès des patients à moyen terme. Plusieurs études ont démontré l’implication du facteur de transcription NFAT (nuclear factor of activated T cell) dans le maintien du phénotype pro-prolifératif/anti-apoptotique des CMLAP-HTAP. Cependant les voies de signalisation responsables de l’activation constitutive d’NFAT restent peu connues. Durant mon doctorat, j’ai étudié les mécanismes responsables de l’activation d’NFAT dans l’HTAP. Nous nous sommes intéressés au rôle des microARN et notamment à miR-204. Ainsi, les facteurs circulants augmentés dans HTAP, diminue l’expression de miR-204 via l’activation du facteur de transcription STAT3. Par un mécanisme de rétro-action positive, la diminution de miR-204 induit une suractivation de STAT3 aboutissant au phénotype pathologique. Ainsi, l’augmentation exogène de miR-204 permettrait de soigner l’HTAP in vitro et in vivo. Nous avons montré que miR-204 va également moduler l’expression de Runx2, facteur de transcription connu pour être impliqué dans la calcification. Dans les CMLAP-HTAP, la diminution de miR-204 est associée à une augmentation de l’expression de Runx2, connu comme un régulateur positif de l’activation du facteur de transcription HIF-1 impliqué dans l’HTAP. Ainsi la modulation de miR-204 affecte la prolifération et l’apoptose des CMLAP-HTAP par plusieurs axes de signalisation. Enfin, nous avons démontré l’implication du facteur de transcription Krüppel Like Factor 5 (KLF5) dans l’HTAP. La surexpression de KLF5 dans l’HTAP est secondaire à l’activation de STAT3, tandis que son inhibition diminue la prolifération et favorise l’apoptose des CMLAP-HTAP. In vivo, l’administration de siKLF5 renverse l’HTAP en diminuant les pressions pulmonaires, l’hypertrophie ventriculaire droite, la prolifération et augmentant l’apoptose des CMLAP des artères pulmonaires distales. Finalement, j’ai étudié différents aspects du développement de l’HTAP et notamment de l’activation de l’axe STAT3/NFAT. Nous avons pu mettre en évidence que cibler cette voie de signalisation par différents moyens (mimic miR-204, siRunx2, siSTAT3, siKLF5) semble une bonne stratégie pour traiter l’HTAP. Mots clés : l’hypertension artérielle pulmonaire, thérapeutique, prolifération, apoptose, microARN, facteur de transcription, réparation à l’ADN. / Pulmonary arterial hypertension (PAH) is characterized by the obstruction of the pulmonary arteries, mainly due to the pro-proliferative and anti-apoptotic phenotype of the pulmonary artery smooth muscle cells (PASMC). The progressive increase of pulmonary vascular resistance first leads to an increase of pulmonary pressure and then leads to a right heart failure, which generates patient’s death within few years. Many studies demonstrated the implication of the transcription factor NFAT (nuclear factor of activated T cell), which maintains the pro-proliferative and anti-apoptotic phenotype in PAH-PASMC. However, pathways that lead to the constitutive NFAT activation remain unclear. During my doctorate, I studied mechanisms responsible for the activiation of NFAT in HTAP. We study the role of the microRNA and more exactly to miR-204. Thus, the circulating factors, which are increased in PAH and which decreased miR-204 expression in PAH, via the transcription factor STAT3 activation. Through a positive regulation loop mechanism, the decrease of miR-204 induces an overactivation sustain of STAT3 leading to the pathologique phenotype. Thus, the exogenous increase of miR-204 could treat PAH in vitro as well as in vivo. We demonstrated that miR-204 is able to modulate the expression of the transcription factor Runx2 known to be implicated in calcification. In PAH-PASMC, the decrease of miR-204 is associated to an increase of Runx2 expression, known as positive regulator of the HIF-1 activation implicated in PAH. Thus miR-204 modulations affected the proliferation and apoptosis of PAH-PASMC through many molecular axes. Finaly we reveal the implication of the transcription factor Kruppel Like Factor 5 (KLF5) in PAH. The KLF5 overexpressed in PAH is associated to the STAT3 activation, wherease its inhibition decreased the proliferation and promoted apoptosis in PAH-PASMC. In vivo, si KLF5 reversed PAH by decreasing pulmonary pressures, right ventricular hypertrophy, proliferation and increasing apoptosis in PASMC from distal PA. Finally, I studied many aspects implicated in PAH development and especially the STAT3/NFAT axis activation. We showed that targeting this pathway using many technics (mimic miR-204, siRunx2, siSTAT3, siKLF5) seem to be an interesting strategy to treat PAH. Key words: Pulmonary arterial hypertension, therapeutic, proliferation, apoptosis, microRNA, and transcription factor.

Le cortex cérébral est composé d’un grand nombre de types de neurones organisés radialement en couches cellulaires et tangentiellement en aires corticales fonctionnellement distinctes. Son développement est régulé par des signaux fonctionnant comme morphogènes sécrétés par des centres organisateurs situés à la périphérie du télencéphale dorsal. Ces morphogènes contrôlent l’expression dans les progéniteurs corticaux de gènes codant pour des facteurs de transcription qui régulent la prolifération, la différenciation et la spécification des progéniteurs corticaux. Les cascades de gènes impliquées dans la mise en place du cortex cérébral dans lesquelles ces signaux et facteurs de transcription interviennent restent cependant actuellement mal connues.<p>Les gènes Dmrt3 et Dmrt5 appartiennent à une famille de gènes fortement conservée évolutivement codant pour des facteurs de transcription à doigt de zinc connus pour leur rôle dans le développement sexuel. Des résultats obtenus dans le laboratoire ayant montré que Dmrt5 joue un rôle crucial dans la neurogenèse au niveau du système olfactif chez le xénope, j’ai voulu savoir, dans un premier temps, si la fonction de Dmrt5 dans la neurogenèse était une fonction ancestrale. Pour répondre à cette question, j’ai recherché des gènes Dmrts chez une espèce de Cnidaire, Nematostella vectensis, et ai étudié leur expression au cours du développement. L’un d’entre-eux, NvDmrtB, est fortement exprimé dans le système nerveux et s’est avéré être requis pour la différenciation des cellules nerveuses chez N. vectensis, suggérant que les gènes Dmrts avaient déjà un rôle dans la neurogenèse dans l’ancêtre commun des Bilatériens et des Cnidaires.<p>Par ailleurs, d’autres travaux ont montré que chez la souris les gènes Dmrt5 et Dmrt3 sont exprimés dans le cerveau en développement au niveau du télencéphale dorsal. Afin d’approcher leur fonction dans le développement cortical, j’ai analysé leur expression au cours du développement embryonnaire, caractérisé les anomalies de développement du cortex cérébral des souris knockout Dmrt5-/- et Dmrt3-/- ainsi que des souris double knockout Dmrt3-/-;Dmrt5-/- et étudié leur régulation. Mes résultats ont montré que Dmrt3 et Dmrt5 sont coexprimés dans les progéniteurs corticaux en gradient avec un maximum d’expression du côté caudo-médian. J’ai également observé que l’absence de Dmrt5 induit une réduction de la taille des vésicules télencéphaliques et que les structures de la partie caudo-médiane du cortex telles que le plexus choroïde et l’hippocampe sont altérées ainsi que les aires visuelle et somato-sensorielle. Au niveau moléculaire, mes résultats ont montré que Dmrt5 est requis pour l’expression de différents gènes codant pour les signaux Wnt et Bmp sécrétés au niveau de la région caudo-médiane des vésicules télencéphaliques, et qu’il contrôle négativement Pax6 et positivement Emx2, des déterminants respectivement de l’identité rostro-latérale et caudo-médiane du cortex cérébral. Bien que la taille des vésicules télencéphaliques n’apparaisse pas affectée chez les souris Dmrt3-/-, l’expression de différents composants de la voie Wnt et celle d'Emx2 et Pax6 est légèrement altérée, comme chez les souris Dmrt5-/-. Chez les souris double knock-out Dmrt3-/-;Dmrt5-/-, une réduction de la taille du cortex et des altérations de l’expression des gènes similaires et plus sévères que celle des souris Dmrt5-/- ont été observées. Nous avons également mis en évidence que l’expression de Dmrt3 est réduite chez les souris Dmrt5-/- et que inversement celle de Dmrt5 est légèrement augmentée chez les souris Dmrt3-/-. Enfin, nous avons observé que l’expression de ces deux gènes est dépendante du facteur de transcription Gli3 et que seul l’expression de Dmrt3 requiert les facteurs de transcription Pax6 et Emx2.<p>Ensemble, nos résultats indiquent que les facteurs de transcription Dmrt5 et Dmrt3 contrôlent le développement de la partie caudo-médiane du cortex, Dmrt5 agissant en amont de Dmrt3. Ils suggèrent également que ces facteurs y joueraient des rôles partiellement redondants en régulant l’expression de cibles communes tels les gènes Wnt3a et Pax6.! / Doctorat en sciences, Spécialisation biologie moléculaire / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Les neurones exprimant l'hormone de mélano-concentration (MCH) sont observés dans l'hypothalamus postérieur de tous les vertébrés, de la lamproie à l'Homme. Ces neurones sont impliqués dans diverses fonctions comme le cycle veille/sommeil ou la prise alimentaire. Ils forment une population non homogène et au moins deux sous-populations sont reconnues, chez le rat. La première sous-population est composée de neurones nés au 11ème jour de vie embryonnaire (E11) qui projettent massivement sur les régions les plus postérieures du système nerveux central. La seconde est générée à E12/E13 et les neurones la caractérisant projettent sur les régions les plus antérieures du cerveau et expriment le peptide CART (cocaine and amphetamine regulated transcript) et le récepteur NK3 (neurokinine). L'objectif de notre travail était de comprendre l'origine de ces deux sous-populations. Pour cela, nous avons utilisé des approches histologiques, moléculaires et in vitro. Les neurones à MCH sont parmi les premiers neurones à naître et à différencier leur phénotype chimique le long d'une région longitudinale définie par une prolifération intense, appelée " cell cords " par Keyser en 1972. Cette bande longitudinale est caractérisée par l'expression de gènes comme Sonic Hedgehog (Shh), Nkx2.1, Nkx2.2 et a été récemment renommée " diagonale intrahypothalamica " ou ID. La différenciation des neurones à MCH dépend de l'expression du facteur morphogène Shh et ces neurones expriment Nkx2.1 et Nkx2.2, facteurs de transcription régulés positivement par Shh. Les neurones de la première sous-population envoient des projections le long du premier tractus longitudinal à se mettre en place, le tractus postopticus (tpoc). Ceux issus de la deuxième sous-population se différencient concomitamment au développement des régions télencéphaliques et leurs projections changent de direction pour innerver les régions antérieures du cerveau sous la dépendance de protéines de guidage axonal, Nétrine1 et Slit2. Nétrine1 permet d'attirer les axones MCH exprimant le récepteur DCC précocement vers la moelle épinière et plus tardivement vers le télencéphale alors que Slit2 contraint les axones MCH exprimant Robo2 à sortir de l'hypothalamus. L'étude du modèle " MCH " permet de mettre en lumière un changement d'organisation précocement au cours du développement dans l'axe longitudinal du prosencéphale. La bande longitudinale d'expression des facteurs de transcription Shh, Nkx2.2 peut être perçue comme une extension rostrale de la colonne neurogénique médiane déjà décrite chez des espèces d'invertébrés possédant une symétrie bilatérale. Les neurones générés le long de cette colonne le sont très tôt au cours du développement. / Neurons expressing melanin-concentrating hormone (MCH) are observed in the vertebrate posterior hypothalamus, from lampreys to humans. These neurons are involved in various functions such as sleep/wake cycle or food intake. They form a non-homogeneous population and at least two sub-populations are indentified in the rat. The first sub-population is composed of neurons born on the 11th embryonic day (E11) that project heavily on posterior regions of the central nervous system. The second is characterized by neurons born at E12/E13, projecting in anterior regions of the brain and expressing the peptide CART (cocaine and amphetamine Regulated Transcript) and the NK 3 receptor (neurokinin). The aim of this study was to understand the origin of these two sub-populations. For this, we used histological, molecular and in vitro approaches. MCH neurons are among the first neurons to be born and to differentiate their chemical phenotype along a longitudinal region defined by intense proliferation and called " cell cord " by Keyser in 1972. This longitudinal band is characterized by the expression of genes such as Sonic Hedgehog (Shh), Nkx2.1, Nkx2.2 and was recently named " diagonal intrahypothalamica " or ID. Differenciation of MCH neurons depends on expression of the morphogenetic factor Shh and these neurons express Nkx2.1 and Nkx2.2, transcription factors upregulated by Shh. The neurons of the first sub-population send projections along the tractus postopticus (tpoc), which is the first longitudinal tract to develop. Neurons of the second sub-population differentiate concomitantly to the development of the basal forebrain and their projections innervate anterior brain regions. Our results obtained in vitro showed that Netrin1 attracts MCH axons and that this reponse is mediated by DCC. Slit2 repulses MCH axons and this reponse is mediated by the Robo2 receptor. Overall, our study of the development of the MCH system shed light on an organizational change in the longitudinal axis of the forebrain during early development : a primary longitudinal organization characterized by the longitudinal expression of Shh and Nkx2.2 and the path of the tractus postopticus in the diencephalon and mesencephalon. MCH neurons of the first sub-population develop during this stage. Then, as the basal telencephalon extends and expresses Netrin1, the medial forebrain bundle differentiates, inducing a change in the main axis of the forebrain ; meanwhile MCH neurons of the second sub-population appear. MCH sub-populations reflect distinct developmental stages of the forebrain.

Comment le plan d’organisation d’un organisme est-il mis en place est une question centrale de la biologie du développement. Les séquençages complets de plusieurs génomes de métazoaires ont montré qu’un nombre restreint de molécules régulatrices soutiennent la diversité des plans d’organisation des animaux, suggérant que ces molécules sont utilisées de manière répétée dans des contextes différents. Cela soulève la question de la diversité d’action : comment ces molécules acquièrent-elle une diversité fonctionnelle ? De plus, la plupart des molécules régulatrices partagent des motifs (fonctionnels/structuraux) communs, soulevant la question de la spécificité : comment des molécules partageant des propriétés biochimiques similaires contrôlent-elles des programmes développementaux spécifiques ?Mon équipe d’accueil s’intéresse à ces questions en utilisant les facteurs de transcription Hox de la Drosophile comme paradigme d’étude.Durant ma thèse, j’ai développé trois lignes de recherches : (1) J’ai adapté la technique de complémentation bi-moléculaire de fluorescence (BiFC) de visualisation des interactions protéines-protéines à l’embryon de drosophile en développement.(2) J’ai employé la BiFC pour disséquer la formation des complexes Hox-protéines PBC. Mes résultats remettent en question le paradigme établit : (a) en soulignant la multiplicité des modes d’interaction Hox-PBC existants, (b) en démontrant que cette diversité peut être source de spécificité d’action.(3) La BiFC a ensuite été exploitée dans un crible par approche gènes candidats pour identifier de nouveaux partenaires des protéines Hox. / My current laboratory aims to tackle the issue of specificity and diversity of regulatory molecules, taking the Drosophila Hox transcription factors as a paradigm for the analysis. During my PhD, I developed three connected research lines.Project 1: Visualization of protein interactions in living Drosophila embryos by the BiFC assayOur results establish the general suitability of BiFC for revealing and studying protein interactions in their physiological context during the rapid course of Drosophila embryonic development.Project 2: Investigation of Hox/PBC complex formation in vivo using BiFC Our findings challenge the current paradigm of Hox/Pbx complex assembly: (a) highlighting the existence of alternative modes of Pbx recruitment, (b) demonstrating that unique Hox-PBC interaction modes can provide specific regulatory function in absence of DNA-binding selectivity.To achieve this project BiFC was also performed with vertebrate Hox proteins in chicken embryos.Project 3: Realization of a candidate interaction screen based on BiFC to identify novel Hox protein partners in vivo(a) We have revealed that Hox proteins establish specific interactions with different subunits of the general mediator complex. These results constituted one of the rare studies making a direct link between the Hox regulators and components of the basal transcriptional machinery, in a physiological context.(b) We have discovered that Hox proteins can interact with importin proteins. This result allows us to assess the importance of controlling the nuclear localization of Hox proteins for controlling their regulatory activities during embryogenesis.

Les facteurs de transcription FLI-1 et SPI-1/PU.1 appartiennent à la famille ETS et reconnaissent le même motif sur l’ADN GGAA. Leur activation est observée de manière récurrente dans les érythroleucémies murines induites par le virus de Friend. Ces observations suggèrent un rôle crucial de ces deux facteurs dans la transformation de la lignée érythrocytaire potentiellement par la dérégulation de gènes cibles communs. Mon travail de thèse a consisté à tester la contribution de ces deux facteurs au phénotype des cellules érythroleucémiques et à rechercher les gènes cibles directs communs.Nous avons pu montrer que FLI-1 et SPI-1/PU.1 ont des contributions additives au phénotype des cellules érythroleucémiques surexprimant les deux facteurs. Par une approche transcriptomique, nous avons identifié une grande proportion de gènes cibles directs communs à FLI-1 et à SPI-1/PU.1 impliqués dans différentes étapes de la biogenèse des ribosomes. La déplétion de ces facteurs induit une réduction de la biogenèse des ribosomes qui n’induit pas de stress ribosomique stabilisant p53. Néanmoins, nous avons mis en évidence une contribution spécifique de RPL11, un médiateur essentiel du stress ribosomique, à la différenciation des cellules érythroleucémiques induites par l’absence de ces facteurs.Nous avons mené en parallèle l’inventaire par ChIP-Seq des sites de recrutement de FLI-1 et de SPI-1/PU.1 sur le génome entier de 3 lignées érythroleucémiques indépendantes. Cette stratégie nous a permis de montrer que les régions de recrutement communes sont la conséquence de la proximité de consensus spécifiques et distincts et du recrutement de FLI-1 et de SPI-1/PU.1 sur leur propre consensus. / The transcription factors FLI-1 and SPI-1/PU.1 belong to the ETS family and recognize the same DNA motif GGAA. Their activation is recurrently observed in murine erythroleukemia induced by Friend virus. These observations suggest a crucial role of these two factors in erythroid lineage transformation potentielly by deregulating common target genes. My thesis work consisted of testing both factors contribution to the phenotype of erythroleukemia cells and of searching for common direct target genes.We showed that FLI-1 and SPI-1/PU.1 have additive contributions to the phenotype of erythroleukemia cells overexpressing both factors. By a transcriptomic approach, we identified a high proportion of common direct target genes of FLI-1 and SPI-1/PU.1 involved in ribosome biogenesis at different levels. The déplétion of these factors induced a decrease of ribosome number which doesn’t induce a ribosomal stress leading to the p53 stabilization. However, we highlighted a specific contribution of RPL11, an essential ribosomal stress médiator, in erythroleukemia cell differentiation induced by depletion of both factors. In parallel, we mapped at whole génome scale by ChIP-Seq the recruitment site of FLI-1 and SPI-1/PU.1 in 3 independent erythroleukemia cell lines. This strategy allowed us to show that the common recruitment régions are the conséquence of a very close association of clearly distinct and specific consensus binding sites for FLI-1 and SPI-1/PU.1 and that each of those factor sis recruited to its own consensus.

Les cellules entéroendocrines sécrétrices d’hormones représentent 1% de l’épithélium intestinal mais sont des régulateurs essentiels du métabolisme énergétique et l’altération de leur différenciation provoque de graves pathologies métaboliques. Leur différenciation est régie par une cascade de régulations transcriptionnelles qui est encore peu décrite, particulièrement chez l’homme. L’objectif de ce projet de thèse était d’évaluer l’implication de plusieurs facteurs de transcription préalablement identifiés chez la souris (NGN3, RFX6, ARX, PAX4) dans la différenciation entéroendocrine humaine. Pour ce faire, ces gènes ont été inactivés par la technique CRISPR/Cas9 dans des cellules souches pluripotentes induites humaines (hiPSCs), qui ont ensuite été différenciées in vitro en organoïdes intestinaux (HIOs). Les analyses des HIOs déficients pour NGN3 ne permettent pas de conclure quant à un rôle dans la différenciation entéroendocrine mais indiquent une altération de la régionalisation du tissu formé chez les mutants. RFX6 semble important pour la différenciation et/ou la fonction des cellules entéroendocrines, bien que sa fonction précise n’ait pas pu être déterminée. / Hormone-producing enteroendocrine cells represent 1% of the intestinal epithelium but are key regulators of the energetic metabolism and alteration of their differentiation is associated with severe metabolic disorders. Enteroendocrine differentiation is governed by a transcriptional regulatory cascade that is poorly described, especially in humans. This thesis project aimed to evaluate the implication of several transcription factors, previously identified in mice (NGN3, RFX6, ARX, PAX4), in human enteroendocrine differentiation. To do so, these genes were disrupted with the CRISPR/Cas9 system in human inducible pluripotent stem cells (hiPSCs), which were then differentiated in intestinal organoids (HIOs). Preliminary analysis of NGN3-deficient HIOs did not allow a firm conclusion regarding NGN3 implication in enteroendocrine differentiation but showed a tissue regionalization alteration. RFX6 seems important for the differentiation/function of enteroendocrine cells, although its precise function is still to be determined.

Le blé tendre, Triticum aestivum, est une des céréales les plus cultivées dans le monde. Le changement climatique qui se développe actuellement contraint fortement les cultures et altère leur rendement. La compréhension des mécanismes de réponse du blé tendre aux stress abiotiques est donc une problématique d’actualité. Plusieurs grandes familles de facteurs de transcription, dont la famille NAC,interviennent dans le développement de la plante et dans sa réponse aux stress environnementaux. Cette thèse, structurée en 3 volets, est ciblée sur l’étude de la famille NAC chez le blé tendre : les TaNAC. Dans un premier temps, nous avons étudié la structuration génomique et phylogénétique des 488 membres de la famille TaNAC, recensés à partir de la base de données la plus récente du blé tendre.Nous avons aussi étudié l’histoire évolutive de cette famille, qui a été marquée par des événements de duplication et de rétroposition. Enfin, une analyse de sa diversité allélique a permis d’identifier des gènes qui présentent des SNP montrant une forte association avec des paramètres d’accumulation des protéines de réserve dans le grain. Le deuxième chapitre de cette thèse a porté sur l’étude de l’expression de ces 488 gènes TaNAC dans plusieurs organes et en réponse aux stress thermique et sécheresse. Une analyse globale a été réalisée à partir de données bio-informatiques, suivie d’une étude in planta de l’expression d’une sélection de 23 gènes. Les profils d’expression obtenus ont révélé l’existence de 4 gènes TaNAC, encore jamais décrits dans la littérature et qui interviennent dans le développement du grain de blé tendre mais aussi dans sa réponse adaptative à plusieurs stress abiotiques. Le troisième volet de cette thèse a donc porté sur la caractérisation génétique, moléculaire et physiologique de ces 4 facteurs de transcription TaNAC. Ils appartiennent à un clade rassemblant des séquences présentant des similitudes génomique et structurale. De plus, ils sont localisés dans le noyau et leurs profils d’expression sont similaires, avec toutefois un niveau variable entre gènes et entre homéologues pour chaque gène. En réponse à un stress thermique modéré, ce profil d’expression est accéléré au cours du développement du grain ; le stade 120°Cj étant le stade clé qui montre la plus grande différence d’expression de ces gènes entre les conditions contrôle et stressée. Pour des raisons techniques, la production de plantes transgéniques sur- et sous-exprimant ces gènes n’a pas permis de valider l’implication de ces 4 TaNAC dans le développement du grain et en réponse à la température. Une analyse de génétique d’association a toutefois permis de mettre en évidence un lien entre des marqueurs moléculaires situés dans ces gènes et l’accumulation des protéines de réserve.Globalement, les résultats obtenus ont montré que des membres de la famille TaNAC sont impliqués dans le développement du blé tendre et dans sa réponse aux stress abiotiques. Plus particulièrement, 4 facteurs de transcription TaNAC semblent jouer un rôle clé dans l’accumulation des protéines dans le grain en réponse à un stress thermique modéré. / Bread wheat, Triticum aestivum, is one of the most cultivated cereal in the world. The climate change that is currently developing strongly constrains crops and impairs their yield. Understanding the wheat response mechanisms to abiotic stresses is therefore a current issue. Several major families of transcription factors, including the NAC family, are involved in the plant development and its response to environmental stresses. This thesis, structured in three parts, is focused on the study of the NAC family in bread wheat (TaNAC).First, we studied the genomic and phylogenetic structure of the 488 members of the TaNAC family identified from the latest database of bread wheat. We also studied the evolutionary history of this family, which was marked by duplication and retroposition events. Finally, an analysis of its allelic diversity allows us to identify genes with SNP showing a strong association with storage protein accumulation parameters in the grain. In a second part, we studied the expression of these 488 TaNAC genes in several organs and in response to heat and drought. An overall analysis was performed using bioinformatic data, followed by an in planta study of the expression of a selection of 23 genes. The expression profiles revealed that four TaNAC genes, never described in the literature, are involved in the wheat grain development but also in its adaptive response to several abiotic stresses. In a third part, we focused on the genetic, molecular and physiological characterization of these four TaNAC transcription factors. They belong to a clade gathering sequences with genomic and structural similarities. Moreover, they are localized in the nucleus and their expression profiles are similar, with a variable level between genes and between homeologs for each gene. In response to moderate heat stress, this expression profile is accelerated during grain development and a key stage at 120°Cj was identified, it shows the greatest difference in genes expression level between control and stressed conditions. For technical reasons, the production of transgenic plants over- and under-expressing these genes did not validate the involvement of these 4 TaNAC in grain development and in its temperature response. An association genetic analysis, however, showed a link between molecular markers located in these genes and the storage proteins accumulation. Overall, the results showed that members of the TaNAC family are involved in the bread wheat development and its response to abiotic stresses. In particular, four TaNAC transcription factors appear to play a key role in grain protein accumulation in response to a moderate heat stress.