Le raisin (Vitis vinifera L.) est un fruit charnu non climactérique d’importance économique majeure. De nombreux paramètres, comme la taille, le métabolisme des acides organiques et des sucres, l’équilibre hydrique et la synthèse de métabolites secondaires, affectent la « qualité » de la baie. Les signaux affectant la reprogrammation du métabolisme cellulaire et l’expression des gènes codant des protéines clefs du développement et du mûrissement incluent les hormones et l’accumulation des sucres, présents à des taux variables au cours du développement de la baie. La régulation transcriptionnelle est l’élément essentiel qui contrôle ces modifications majeures. A ce jour, dans le contexte de la régulation du développement du raisin, très peu d’acteurs moléculaires ont pu être clairement caractérisés. Les travaux réalisés dans le cadre de cette thèse ont donc eu pour objectif de mieux comprendre cette régulation par l’identification et la caractérisation de facteurs de transcription régulés transcriptionnellement par le saccharose et exprimés au cours du développement de la baie de raisin. Parmi les cinq facteurs de transcription identifiés, trois n’ont pu être étudiés que de manière préliminaire et deux, VvCEB1 et VvABF2, ont fait l’objet d’une caractérisation plus approfondie. VvCEB1 (Vitis vinifera Cell Elongation bHLH) est exprimé préférentiellement dans la baie de raisin au cours de la phase de maturation. Une approche par transgénèse chez la Vigne et la Tomate montre que la surexpression de ce facteur de transcription affecte à la fois le développement des embryons de Vigne et des fruits de Tomate, en modifiant notamment le nombre et la taille des cellules qui les constituent. Une analyse transcriptionnelle réalisée à partir de ce matériel biologique confirme le rôle de VvCEB1 dans la stimulation de l’expansion cellulaire et suggère l’implication de l’auxine. VvABF2 est régulé transcriptionnellement par l’ABA, une hormone clef impliquée dans les processus de maturation des fruits non climactériques. Les transcrits VvABF2 s’accumulent majoritairement pendant l’étape de maturation. Une approche transcriptomique sur génome complet de Vigne et réalisée à partir de suspensions cellulaires embryogènes surexprimant VvABF2, traitées ou non par l’ABA souligne la stimulation de l’expression des gènes codant les enzymes liées à la maturation du raisin. En effet, des gènes des voies de biosynthèse des composés phénoliques et du ramollissement sont affectés. Enfin, l’analyse phénotypique de plants de Tomate surexprimant VvABF2 renforce l’hypothèse liant ce facteur de transcription au ramollissement : à partir du stade "turning" un ramollissement accéléré du fruit est observé.Prise dans son ensemble cette thèse contribue à une meilleure compréhension des mécanismes de signalisation moléculaires impliqués dans le développement d’un fruit charnu non climactérique. / Grapevine (Vitis vinifera L.) is the most economically important fruit crop in the world. The quality of this non climacteric fruit depends on numerous parameters such as size, organic acids and sugar metabolisms, water balance, and secondary metabolism. During fruit development and ripening, hormones and sugars can act as signals affecting cellular metabolism and expression of key regulatory genes. Up to now, little is known about the gene networks involved in these processes and therefore very few of these regulatory genes have been characterized.The aim of this PhD work was to get a better insight in the mechanisms involved in grape berry development through the identification and characterization of sugar-dependent transcription factors (TFs) that were expressed during fruit development. We identified five TFs, and fully characterized two of them: VvCEB1 and VvABF2.VvCEB1 (Vitis vinifera Cell Elongation bHLH) is preferentially expressed in the berry at the onset of ripening and during the ripening stage. Overexpression of VvCEB1 in grapevine and tomato affected both grape embryo development and plant organ size by modifying their cell number and cell size. A transcriptional analysis performed on these transgenic lines confirmed that VvCEB1 stimulates cell expansion and suggests the involvement of the phytohormone auxin.VvABF2 is transcriptionally regulated by abscisic acid (ABA), a phytohormone known to play a crucial role in non-climacteric fruit ripening. VvABF2 transcripts accumulated more abundantly during the ripening stage. A whole-genome based transcriptomic approach performed on VvABF2-overexpressing grape cells treated or not with ABA emphasizes the up-regulation of genes linked to fruit ripening processes. Indeed, genes encoding enzymes involved in the biosynthesis of phenolic compounds and in softening were affected. Finally, phenotypic analysis of VvABF2-overexpressing tomato fruits reinforces the link between this transcription factor and fruit softening. Indeed, from the “turning” stage, an accelerated fruit softening was observed in the transgenic fruits.Taken together, this PhD work contributed to a better understanding of the molecular mechanisms involved in the ripening of non climacteric fleshy fruit.

Le sujet de cette thèse est l’étude de la régulation de l’expression du facteur de transcription LEAFY COTYLEDON 2 (LEC2), qui est un, régulateur clé du développement de la graine d’Arabidospsis thaliana. La graine offre un mode de propagation et de protection des espèces végétales à graines, indispensable à leur survie. La graine est l’élément de base de l’agriculture, en tant que semence, et de l’alimentation humaine, aussi bien sous forme brute que sous forme transformée (farines, huiles…). Elle a aussi de très nombreuses applications industrielles dans l’industrie et les biocarburants. Le développement de la graine, comme beaucoup d’étapes nécessaires à la vie de la plante, est controlé par des phénomènes complexes, incluant des facteurs de transcription. LEC2, ainsi que 2 autres facteurs de transcription de type B3 (FUSCA 3 et ABI3) et un facteur à domaine de fixation CAAT (LEAFY COTYLEDON 1), sont les quatre facteurs clés du développement de la graine d’Arabidospsis thaliana, appelés AFLs (ABI3, FUS3, LEC1, 2). Les gènes AFLs s’expriment spécifiquement dans l’embryon et sont fortement réprimés dans les parties végétatives, par de multiples mécanismes impliquant, entre autre, des facteurs de transcription et des acteurs plus généraux modifiant la structure de la chromatine. Bien que la régulation de LEC2 ait déjà été largement étudiée, les mécanismes précis de répression ainsi que l’activation de ce gène, sont encore méconnus.Le travail présenté est basé sur un travail de délétion de promoteurs, qui a révélé l’existence de 3 boîtes de régulation, essentielles à une activité correcte du promoteur de LEC2. Deux boîtes, dont une correspondrait à une boîte de fixation de facteurs MADS et une à une boîte GAGA dans la séquence transcrite non traduite de LEC2, sont essentielles à l’activité du promoteur. La 3ème séquence, d’une longueur de 50pb, est nécessaire à la répression de LEC2 dans les parties végétatives par des mécanismes épigénétiques. La corrélation de la présence de cette boîte avec un enrichissement dans la marque H3K27me3 au locus nous a permis de rapprocher cette séquence de répression d’une PRE (Polycomb response element) de type végétal. / The aim of this work is to study the regulation of the transcription factor LEAFY COTYLEDON 2, which is a key regulator of seed developpement in Arabidopsis thaliana.Seeds have essential functions in the environnement for plant propagation and as embryo protective tools. Furthermore, numerous products issued from the agriculture or involved in human food (e.g. cereals, oil, flour) are based on seeds. Several industrial apllications depend, as well, on this organ such as oil production for human consumption, additives for some industrial processes, or biofuel synthesis.Seed developemental phases are dependant of a complex regulatory network composed in major part with transcription factors, that were found to be central components of plant evolution and domestication.LEC2, FUS3, ABI3 (three B3 type factors) and LEC1 (a CATT binding factor) are named AFL (ABI3, FUS3, LEC1, 2) genes, and are key regulators of Arabidopsis seed development. AFL genes are specifically expressed in embryo and repressed in vegetatives tissues. This repression has been principally studied in germinating seedlings and was shown to be caused by a set of transcription factors and chromatin structure modifiers.Beside the fact that LEC2 regulation has been extensively studied within the past few years, it was known that other mechanisms of repression and activation were still to be discovered. The work carried out on LEC2 presented here, mainly based on an extensive promoter deletion analysis, has allowed the discovery of three essential nucleotidic sequences necessary for a proper LEC2 promoter activity. The two first regulatory sequences are similar to a MADS box binding element and a GAGA binding site, and were found to be essentials for LEC2 promoter activity. The third sequence (named RLE for Repression of LEC2 Element) is 50bp long and lead to the repression of LEC2 promoter activity after onset of seed germination. A very strong correlation between RLE and the enrichment of H3K27me3 mark deposition at specific loci, suggests this sequence is the first PRE-like (Polycomb response element) element identified in plants.

Botrytis cinerea est un champignon nécrotrophe et polyphage capable de provoquer la pourriture grise sur plusieurs centaines d’espèces végétales. Les pertes engendrées par cette maladie sont importantes à travers le monde notamment sur des espèces économiquement importantes comme la tomate, la fraise ou encore la vigne. Parmi les facteurs de virulence identifiés chez B. cinerea se trouvent deux toxines non-hôte spécifiques. Il s'agit du sesquiterpène botrydial et du polycétide acide botcinique. Même si leur rôle redondant dans la nécrotrophie a été démontré, les mécanismes qui gouvernent l’expression des clusters responsables de leur synthèse (respectivement BOT et BOA) restent inconnus. Dans ce contexte, l’objectif de mon projet de thèse était de caractériser les différents mécanismes qui régulent le métabolisme secondaire chez B. cinerea. Je me suis particulièrement intéressé aux clusters BOT et BOA ainsi qu’à un troisième cluster (PKS7) qui, d’après le phénotype d’un mutant d’insertion (ADN-T), pourrait être impliqué dans la nécrotrophie. Grâce à la disponibilité du nouvel assemblage du génome de la souche modèle B05.10, un gène candidat codant un facteur de transcription (FT) putatif a pu être identifié à proximité du cluster BOT. La caractérisation de ce gène a permis de démontrer le rôle majeur de la protéine (BcBot6) dans l’activation des gènes Bcbot et la production subséquente de botrydial. De même, la caractérisation de Bcboa13, un gène codant un FT putatif présent au sein du cluster BOA, a permis de démontrer le rôle de régulateur positif de BcBoa13 envers les gènes Bcboa. A la différence des clusters BOT et BOA, le cluster PKS7 ne contient pas de gène codant pour un potentiel FT spécifique. Afin de confirmer le rôle du métabolite putatif produit par ce cluster et d’identifier sa structure chimique, l’inactivation du gène clé codant une PKS-NRPS (Bcpks7) a été réalisée et des analyses métaboliques ont été initiées. Finalement, la présence au sein des clusters BOT et BOA de nombreux transposons ayant subi des mutations de type RIP (Repeat-Induced Point mutations) ainsi que la position sub-télomérique des clusters BOA et PKS7 nous a amené à nous intéresser au rôle de la structure chromatinienne dans la régulation de ces clusters. Dans ce cadre, trois mutants délétés dans des gènes codant des modificateurs chromatiniens putatifs (les histones méthyltransférases BcDim-5 et BcKmt6 et la protéine hétérochromatinienne BcHp1) ont été générés. L’expression des gènes clés des clusters BOT, BOA et PKS7 chez les mutants Bcdim-5, Bchp1 et Bckmt6 suggère que différents mécanismes chromatiniens interviennent pour le contrôle des clusters BOT et BOA d’une part et du cluster PKS7 d’autre part. L’ensemble des résultats obtenus pendant cette thèse apporte une contribution majeure à la compréhension des mécanismes de régulation spécifiques mais aussi de ceux en lien avec la structure chromatinienne de la production de métabolites phytotoxiques impliqués dans la nécrotrophie chez B. cinerea. / Botrytis cinerea is a necrotrophic polyphagous fungus able to induce the gray mold disease on hundreds of plant species. The resulting losses are important worldwide notably on economically important crops such as tomato, strawberry or grapevine. Among the virulence factors identified in B. cinerea stand two non-host specific toxins: the sesquiterpene botrydial and the polyketide botcinic acid. Although their redundant role in necrotrophy has been shown, the mechanisms governing the clusters responsible for their synthesis (respectively BOT and BOA) remain unknown. In this context, the aim of my PhD project was to characterize the different mechanisms that regulate secondary metabolism in B. cinerea. I particularly focused on BOT and BOA clusters as well as on a third one (PKS7) which, according to the phenotype of an insertion-based mutant (T-DNA), could be involved in necrotrophy. Thanks to the newly assembled genome of the B05.10 wild type strain, a candidate gene encoding a putative transcription factor (TF) could be identified near the BOT cluster. The characterization of this gene allowed pointing out the major role of the protein (BcBot6) in the activation of Bcbot genes and in the subsequent botrydial production. Similarly, the characterization of Bcboa13, a putative TF-encoding gene present into the BOA cluster, allowed demonstrating the positive regulatory role of BcBoa13 on Bcboa genes. Unlike the BOT and BOA clusters, the PKS7 one does not contain any putative TF-encoding gene. In order to confirm the role of the putative metabolite produced by this cluster and to identify its chemical structure, the inactivation of the PKS-NRPS key enzyme-encoding gene (Bcpks7) was conducted and metabolic analyses were initiated. Finally, the presence of many RIP(Repeat-Induced Point mutations)-inactivated transposons within BOT and BOA clusters as well as the subtelomeric location of BOA and PKS7 clusters raised our interest about the role of chromatin structure on those clusters regulation. In this context, three mutants inactivated into putative chromatin modifiers encoding-genes (the histone methyltransferases BcDim-5 and BcKmt6 and the heterochromatin protein BcHp1) were generated. The expression analysis of the key genes of the BOT, BOA and PKS clusters suggests different chromatin-based mechanisms that intervene for the BOT and BOA cluster on one side and on the PKS7 cluster on another. Altogether, the results generated during this PhD project are a major contribution to the comprehension of pathway-specific as well as chromatin-based mechanisms that regulate the production of necrotrophy-involved phytotoxins by B. cinerea.

L’hématopoïèse est initiée à partir de cellules souches hématopoïétiques et aboutit à la production continue et contrôlée des cellules sanguines matures. Runt-related transcription factor 1 (RUNX1) code pour un facteur de transcription qui joue un rôle clé dans l'hématopoïèse. Des dérégulations de RUNX1 sont fréquemment associées à des cancers hématologiques, en particulier dans les leucémies aiguës lymphoblastiques à précurseurs B chez l'enfant (LAL-B). De plus, son activité transcriptionnelle est contrôlée par le recrutement de cofacteurs. Pour comprendre le mécanisme impliqué dans le contrôle de l’activité transcriptionnelle de RUNX1 nous avons réalisé des immunoprécipitations de RUNX1 couplées à de la spectrométrie de masse et identifié Far Upstream Element binding protein 1 (FUBP1) comme un partenaire protéique potentiel de RUNX1. FUBP1 est un régulateur multifonctionnel impliqué dans divers processus cellulaires. Il a notamment été décrit récemment comme essentiel à l’expansion et à l’auto-renouvellement des cellules souches hématopoïétiques. Par ailleurs, une surexpression du gène et des mutations potentiellement oncogéniques ont été décrits dans des cas de leucémies lymphoblastiques. Nous avons montré, grâce à la technique de PLA (Proximity Ligation Assay) que nous avons optimisé sur cellules non-adhérentes, que FUBP1 est un nouveau cofacteur de RUNX1 et qu’ils peuvent faire partie d’un même complexe régulateur dans les lymphoblastes pré-B humains. Par des expériences de ChIP couplées à du séquençage, nous avons localisé les régions de la chromatine sur lesquelles étaient fixées RUNX1 et FUBP1 de façon commune. Nous avons identifié l’oncogène c-KIT comme un gène cible commun et nous avons caractérisé deux régions régulatrices fixées par RUNX1, FUBP1 et des marques d’activation de la chromatine, au niveau du premier intron de c-KIT : une à +700 pb et l’autre au niveau d’un enhancer à +30 kb. De plus, nous avons déterminé les motifs de liaison de RUNX1 et FUBP1 essentiels pour l'activation de l’enhancer. Enfin nous avons démontré que la surexpression de FUBP1 et RUNX1 conduit à une augmentation de l’expression de c-KIT en ARNm et en protéine, augmente une des voies activées par c-KIT en présence de son ligand, favorise la prolifération cellulaire in vitro et in vivo et rend les cellules moins sensibles à un inhibiteur de c-KIT. En conclusion, nous avons démontré que FUBP1 est un nouveau partenaire de RUNX1 et qu’ensembles, ils activent la transcription de l’oncogène c-KIT en se fixant sur un enhancer commun, favorisant ainsi la prolifération cellulaire. Par conséquent, puisque FUBP1 et RUNX1 sont surexprimés dans certains types de leucémie, des altérations de cette régulation pourraient participer à l'apparition ou au maintien de leucémies. Nos résultats ouvrent donc de nouvelles perspectives sur la compréhension du contrôle de l’activité transcriptionnelle de RUNX1 et sur les hémopathies malignes associées à des dérégulations de RUNX1, FUBP1 ou c-KIT. / Hematopoiesis is initiated from hematopoietic stem cells and results in the continuous and controlled production of mature blood cells. RUNX1 (Runt-related transcription factor 1) encodes a transcription factor playing a key role in hematopoiesis. Abnormal functions of this protein are implicated in blood cancer, notably in pediatric B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia (BCP-ALL). Moreover, its transcriptional activity is controlled by the recruitment of cofactors. To unravel the mechanisms behind the regulation of RUNX1 transcriptional activity, we performed RUNX1 specific immunoprecipitation experiments followed by mass spectrometry and identified the Far Upstream Element Binding Protein 1 (FUBP1) as a potential cofactor of RUNX1. FUBP1 is a multifunctional regulator involved in diverse cellular processes. FUBP1 has recently been described to be essential for expansion and self-renewal of hematopoietic stem cells and to function as a potential cancer driver gene in lymphoblastic leukemia. We have shown, with a proximity ligation assay that we have optimized in non-adherent cells, that FUBP1 is a new cofactor of RUNX1 and that these two proteins can be part of the same regulatory complex in human pre-B lymphoblasts. By chromatin immunoprecipitation combined with sequencing, we have localized common chromatin regions bound by RUNX1 and FUBP1. We have identified the oncogene c-KIT as a common target gene, and characterized two regulatory regions bound by both RUNX1, FUBP1 and active histone marks, within the first c-KIT intron: one at +700 bp and the other on an enhancer at +30 kb. Moreover, we have determined RUNX1 and FUBP1 binding sites essential for the enhancer activation. Finally, we have demonstrated that RUNX1 and FUBP1 overexpression in a pre-B cell line increases the expression of c-KIT both at mRNA and protein levels, exacerbates one of the c-KIT downstream pathways, promotes cell proliferation in vitro and in vivo and renders cells more resistant to a c-KIT inhibitor. In conclusion, we have demonstrated that FUBP1 is a new cofactor of RUNX1 and that they activate the transcription of the c-KIT oncogene by binding on a common enhancer, thus promoting cell proliferation. Therefore, since FUBP1 and RUNX1 are overexpressed in some types of leukemia, alterations in this regulation may contribute to the onset or maintenance of leukemias. These new findings open new perspectives on understanding the control of RUNX1 transcriptional activity, and on leukemias related to RUNX1, FUBP1 or c-KIT deregulations.

L'expression des facteurs de transcription sigma, leurs gènes d'intérêts placés sous leurs contrôles et la croissance ont été évalués chez Escherichia coli K12 MG1655 après un passage d'un milieu liquide riche à des matrices solides de Brain Heart Infusion gélosées (BFH), du Cooked Meat Medium (CMM) et de boeuf haché pour suivre l'état physiologique des bactéries sur les aliments. De plus, le transcriptome d'E. coli, soumis à différents traitements thermiques, a été analysé par biopuce dans le but d'identifier des biomarqueurs permettant de déterminer à quel moment la cellule n'est plus en mesure de s'adapter au traitement thermique. Des listes de gènes différentiellement exprimés entre les traitements thermiques ont été obtenues. L'ensemble de ces gènes se répartit en six profils distincts d'expression (clusters) dont l'analyse servira à mieux comprendre l'impact physiologique de divers traitements thermiques et les stratégies développées par la bactérie pour y faire face.

Élément essentiel du système dioptrique de l'œil, la cornée joue aussi un rôle important de protection du globe oculaire. Toutefois, sa localisation la prédispose à plusieurs blessures de diverses origines. 11 peut alors en résulter une lésion importante nécessitant son remplacement. Le but ultime du programme de recherche est donc de reconstruire, selon la méthode d'auto-assemblage, une cornée humaine afin de l'utiliser comme modèle expérimental et éventuellement comme greffon pour des patients. Cependant, plusieurs aspects importants devaient faire l'objet d'études approfondies avant l'utilisation clinique afin d'évaluer le potentiel de réussite à long terme des greffes sur les patients. Le premier objectif spécifique de cette thèse consistait à étudier la grande hétérogénéité dans les capacités prolifératives des cellules épithéliales de cornées humaines (CECH) obtenues de différents donneurs. Cette étude démontre que ces variations sont liées à des altérations dans les niveaux d'expression des facteurs de transcription appartenant à la famille Sp. De plus, ces fluctuations semblent liées à la progression des CECH vers leur différenciation terminale. Finalement, une stratification adéquate des cellules épithéliales sur les équivalents cornéens coïncide avec un retard dans le pic d'expression des protéines Spl et Sp3. Nous disposons ainsi d'un moyen permettant d'identifier rapidement les populations cellulaires les plus appropriées pour la production des tissus reconstruits. Le deuxième objectif spécifique était de s'assurer que l'épithélium de nos cornées reconstruites puisse réépithélialiser des plaies éventuelles après la greffe. Pour ce faire, un modèle de guérison de plaies cornéennes in vitro a été développé à partir des cornées reconstruites. En plus de s'être assuré de la régénération des substituts cornéens à la suite d'une blessure, ce modèle a également permis de montrer que durant la réépithélialisation, la migration des cellules épithéliales suit un patron qui est semblable à celui rapporté lors de la guérison de blessures cornéennes humaines in vivo. Ce modèle présente aussi des aspects histologiques semblables au tissu d'origine ainsi que l'expression des constituants de la matrice extracellulaire et des sous-unités d'intégrines. Il permet également de quantifier le taux de réépithélialisation, qui est significativement accéléré en présence de la fibrine ou de l'EGF. Enfin, pour ce qui est du troisième objectif spécifique, il était important d'évaluer si l'origine des cellules utilisées lors de la fabrication des cornées in vitro influençait l'épaisseur de l'épithélium obtenu, caractéristique essentielle à une bonne acuité visuelle. Les observations recueillies nous ont permis de démontrer que l'origine des cellules du mésenchyme et des cellules épithéliales influence grandement, en plus de l'aspect macroscopique, l'histologie des tissus reconstruits et que ces changements dans la différenciation et la stratification des cellules épithéliales sont contrôlés par des facteurs solubles. Une différence significative dans l'expression d'IL-6 a été détectée entre les fibroblastes cornéens et dermiques. Les résultats montrent également que la cornée reconstruite est en mesure d'absorber les rayons ultraviolets de façon similaire à la cornée in situ. Tous ces travaux ouvrent la voie à de nombreuses autres recherches et laissent entrevoir une application clinique des cornées reconstruites à moyen terme. / The cornea is an essential part of the dioptric System of the eye. Furthermore, it also has a significant role in the protection of the eyeball. However, its location predisposes it to several wounds of various origins. In such cases, serious injuries may ensue requiring the replacement of the cornea. The main objective of the research program is base on the reconstruction, with the self-assembly method, of a human cornea in order to perform experimental studies and eventually graft it on patients. However, several aspects of this subject had to be carefully examined before any clinical use, in order to evaluate the success of long-term corneal graft on patients. The first specific objective of this thesis was to study the heterogeneousness in the proliferative capacities of the human corneal epithelial cells (HCECs), obtained from various donors, was initially studied. This work shows that these variations were related to changes in the levels of expression of transcription factors belonging to the Sp family. In fact, these factors were highly expressed during one passage and then totally disappeared as cells terminally differentiated. Proper stratification of HCECs on reconstructed tissue substitutes could be obtained only with cells that also had a delayed peak of Spl/Sp3 expression when cultured in vitro. We thus have a mean to identify quickly the cell lines most adapted for the production of reconstructed tissues. The second specific objective was to make sure that the epithelium of the reconstructed corneas could reepithelialize following a wound, after grafting. For this purpose, an in vitro corneal wound healing model was developed from the reconstructed corneas. We show that corneal substitutes regenerate after wounding. During reepithelialization, epithelial cell migration followed a consistent wave-like pattern similar to that reported for human corneal wound healing in vivo. This model showed an histological appearance similar to the native tissue as well as expression of basement membrane components and the integrin subunits known to be main actors during the wound healing process. It also allowed us to quantify the reepithelialization rate, which was significantly accelerated in the presence of fibrin or EGF. Finally, for the third specific objective, we determined whether the origin of the cells used during the production of in vitro corneas had any effect on the thickness of the epithelium obtained, an essential characteristic of a good vision. The results indicated that the origin of fibroblasts and epithelial cells influences largely the macroscopic aspect as well as the histology of reconstructed tissues, and that these changes in the differentiation and stratification of epithelial cells are controlled by soluble factors. A significant difference in the expression of IL-6 was detected between corneal and skin fibroblasts. Our results also unravel that the reconstructed cornea has similar UV-absorption characteristics to that of the normal human cornea. Our research will lead to other experimental studies on human cornea. Moreover, clinical application of reconstructed corneas are anticipated in the future.

Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2010-2011 / Comme dans le cancer, les maladies vasculaires à remodelage (MVR) sont caractérisées par un déséquilibre métabolique appelé paradoxe de Warburg (glycolyse augmentée par rapport à l'oxydation du glucose), une augmentation de cytokines circulantes et de facteurs de croissance comme TNF "tumor necrosis facton" et PDGF "platelet derived growth factor" favorisant la prolifération et la résistance à l'apoptose des cellules musculaires lisses vasculaires (CMLV). Les mécanismes permettant la durabilité de ce phénotype demeurent inconnus. Dans le cancer, ces anomalies résultent en partie de l'activation inappropriée du facteur de transcription HIF-1 "hypoxia inducible factor 1". Comme TNF et PDGF sont acceptés comme activateurs de HIF-1, nous avons émis l'hypothèse que l'activation de HIF-1 joue un rôle critique dans le mécanisme pathophysiologique des MVR. En utilisant des approches multidisciplinaires et translationnelles, nous avons démontré chez des CMLV d'artère carotide humaine que PDGF et TNF favorisent le paradoxe de Warburg, leur prolifération et leur résistance à l'apoptose. In vivo, nous avons démontré dans les artères carotides de rat que l'inhibition de HIF-1 par la transfection d'un ARN interférence localisé ou par l'injection d'un inhibiteur de TNF prévenaient le remodelage post-angioplastie de l'artère carotide. Nos découvertes démontrent pour la première fois l'implication de HIF-1 dans le processus de remodelage et nous proposons HIF-1 comme une nouvelle cible thérapeutique des MVR. Finalement, comme les MVR et le cancer possèdent plusieurs similarités, nos découvertes ne sont pas restreintes aux maladies vasculaires et ouvrent de nouvelles avenues dans la recherche du cancer.

Les gènes Hox codent pour des facteurs de transcription orchestrant l'identité antéro-postérieure du plan corporel des animaux à symétrie bilatérale. La souris Hoxa5-/- a permis de démontrer que ce gène joue un rôle primordial dans la spécification des squelettes axial et appendiculaire, ainsi que dans l'ontogénie de plusieurs organes. À l'aide d'une approche de transgenèse et de délétions successives de la séquence intergénique Hoxa4-Hoxa5, j'ai identifié deux éléments régulateurs responsables de l'expression du gène Hoxa5 dans les systèmes respiratoire et digestif: un fragment d'ADN NcoI-SacI de 163-pb possédant une activité de type activatrice et dirigeant l'expression au niveau du poumon, de l'estomac et de l'intestin, de même qu'un fragment XbaI- BssHII de 259-pb, nécessaire à une expression complète du gène Hoxa5 au niveau du système digestif. Des expériences de retard sur gel (EMSA) et d'immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) m'ont permis de démontrer la liaison du facteur de transcription YY1 à ces deux séquences d'ADN. En mutant ses sites de liaison dans un contexte de transgenèse, j'ai mis en évidence le rôle de YY1 comme activateur transcriptionnel du gène Hoxa5 dans les organes. Il s'agit d'ailleurs d'un des rares exemples où la protéine YY1 ne réprime pas l'expression des gènes Hox. J'ai également appliqué la technique de ChIP pour confirmer que les facteurs de transcription à boîte homéo CDX4 et HOXB9 se lient tous les deux au fragment d'ADN AvrII-Eco47III de 164-pb situé à l'intérieur de l'élément MES. J'ai donc montré que la protéine HOXB9 participe à restreindre caudalement l'expression du gène Hoxa5 au niveau de la prévertèbre 10, supportant ainsi le concept de prévalence postérieure. De plus, j'ai généré deux lignées de souris transgéniques exprimant la recombinase Cre sous le contrôle de deux combinaisons de séquences régulatrices identifiées du gène Hoxa5. Ces lignées ont été caractérisées et fournissent de nouveaux outils utiles pour étudier la fonction de différents gènes dans certains tissus le long de l'axe antéro-postérieur. Enfin, le locus Hoxa5 produit 4 trasncrits de 1.8, 5.0, 9.5 et 11-kb de longueur se chevauchant et pouvant produire une protéine in vitro. Cependant, j'ai démontré que seul le court transcrit de 1.8-kb, correspondant aux deux exons connus du gène Hoxa5, génère une protéine associée à la fonction du gène in vivo. Les différents résultats obtenus seront présentés et discutés. / Hox genes encode transcription factors, which orchestrate bilaterian anteroposterior patterning. Using Hoxa5-/- mice as model, we have demonstrated that this gene plays a key role in axial and appendicular skeletal patterning as well as in the formation of several organs such as the respiratory and digestive tracts. Using a transgenesis approach and successive deletions in the Hoxa4-Hoxa5 intergenic region, I have identified two distinct regulatory elements responsible for Hoxa5 expression in respiratory and digestive tracts: a 163-bp NcoI-SacI DNA fragment having enhancer activity that drives expression in lung, stomach and intestine, and a 259-bp XbaI-BssHII fragment necessary for a complete Hoxa5 digestive tract expression. Electrophoretic mobility shift (EMSA) and chromatin immunoprecipitation (ChIP) assays have demonstrated the capacity of the YY1 transcription factor to bind these two DNA sequences. By mutating its binding sites in a transgenesis context, I have highlighted the transcriptional activator role of the YY1 protein in Hoxa5 organ expression, which is very interesting since few examples of Hox gene activation by YY1 are reported in the literature. I have also generated two transgenic mice lines expressing the Cre recombinase under the control of two combinations of identified regulatory sequences. These lines have been charaterized and provide useful genetic tools to study gene function in specific tissues along the anteroposterior axis. I have also applicate ChIP technology to demonstrate the in vivo binding of CDX4 and HOXB9 homeobox transcription factors to the 164-bp AvrII-Eco47III DNA fragment included in the MES regulatory element. Consequently, I have shown that the HOXB9 protein caudally participates to restrict the Hoxa5 gene expression at the level of prevertebra 10, which supports the posterior prevalence concept. Finaly, the Hoxa5 locus encompasses 4 overlapping transcripts of 1.8, 5.0, 9.5 and 11.0-kb that can produce a HOXA5 protein in an in vitro context. However, I have demonstrated that only the short transcript of 1.8-kb corresponding to the two known Hoxa5 gene exons is transcribed into an in vivo HOXA5 protein associated to the gene function. Data will be presented and discussed.

Lors d'un stress, les cellules eucaryotes activent des mécanismes de défense afin de s'adapter aux conditions extrêmes et de survivre. Ces mêmes mécanismes peuvent être exploités par les cellules cancéreuses pour survivre au stress thérapeutique. La réponse intégrée au stress (ISR) est une réaction cellulaire qui joue un rôle crucial dans l'adaptation des cellules face à différents stress notamment en régulant la transcription et la traduction de nombreux gènes cibles spécifiques. Durant cette réponse, les cellules stressées réduisent aussi leur métabolisme général, entre autres en inhibant la traduction des ARNm, et économisent ainsi l'énergie nécessaire pour réparer les dommages causés par le stress. En conditions de stress, la traduction générale des ARNm est inhibée principalement au niveau de son étape d'initiation. Un des mécanismes clés induisant l'inhibition de l'initiation de la traduction est la phosphorylation du facteur d'initiation de la traduction eIF2a (eukaryotic translation initiation factor 2a). Bien que cette phosphorylation d'eIF2a, induite par le stress, entraine une inhibition globale de la synthèse protéique, elle induit d'une part la formation d'entités cytoplasmiques à ARN appelées granules de stress mais elle favorise également la traduction spécifique des ARNm spécifiques codant pour des facteurs de réponse au stress, dont le facteur de transcription ATF4. Ce facteurjoue un rôle clé lors de la réponse au stress soit en activant les voies de survie ou au contraire en favorisant celles de mort cellulaire. Ces fonctions opposées d'ATF4 dans la réponse cellulaire au stress dépendent largement de son niveau d'expression. Ainsi, nous avons cherché à caractériser le(s) mécanismes(s) de régulation de l'expression d'ATF4 lors de stress thérapeutiques au sein de cellules cancéreuses. Nous avons montré l'implication des granules de stress (GS) dans la régulation de l'expression de l'ARNm d'ATF4 lors d'un stress thérapeutique engendré par le traitement avec l'agent chimiothérapeutique sorafenib au sein de cellules d'hépatocarcinomes. Cette régulation implique la séquestration d'une fraction de l'ARNm d'ATF4 dans les GS induites par le traitement avec la sorafenib, prévenant sa surexpression létale ; ceci permet de maintenir un niveau d'expression d'ATF4 basal mais nécessaire à la survie des cellules cancéreuses. Afin de caractériser le(s) mécanisme(s) responsable(s) de l'expression basale d'ATF4, permettant la résistance des cellules cancéreuses aux traitements thérapeutiques, un RNA pull-down utilisant des fragments d'ARN biotinylés d'ATF4 a l'aide d'extraits de cellules cancéreuses soumises à un stress thérapeutique a été réalisé. L'analyse par ii spectrométrie de masse des complexes protéiques associés aux fragments d'ARN d'ATF4 biotinylés a permis l'identification d'une dizaine de protéines qui pourraient interagir avec l'ARNm d'ATF4, dont l'ARN hélicase DDX3. Nous avons observé que DDX3 promeut au niveau traductionnel l'expression d'AFT4. Des tests d'interaction protéine-protéine montrent que DDX3 est un composant du complexe d'initiation de la traduction eIF4F. L'interaction entre DDX3 et le complexe eIF4F est potentiellement médiée par le facteur eIF4G, qui est également nécessaire à la traduction d'ATF4 induite en condition de stress. Enfin, la diminution de l'expression d'ATF4 au sein de cellules issues d'hépatocarcinomes résistants via la déplétion de DDX3 sensibilise les cellules cancéreuses à la mort induite par le traitement avec la sorafenib. Cette étude caractérise de nouveaux mécanismes de régulation de l'expression du facteur ATF4 qui se produit lors de stress et qui pourraient être ciblés afin de prévenir la chimiorésistance. / During physiological or environmental stress, cells activate defense mechanisms to survive. These same mechanisms may be exploited by cancer cells to survive therapeutic stresses. The integrated stressresponse (ISR) is one of the cell responses that play a crucial role in the adaptation of cells to various stresses such as the transcriptional and translational régulation of many specific target genes. During this cell response, stressed cells reduce their general metabolism in part by inhibiting mRNA translation, thereby saving energy needed to repair stress-induced damages. Under stress conditions, the regulation oftranslation occurs mainly at its initiation step through the phosphorylation of the translation initiation factor eIF2a. While this phosphorylation, induced by stress, causes a global inhibition ofprotein synthesis, it induces on the one hand the formation of cytoplasmic RNA entities called stress granules (GS) but it also promotes the preferential translation of specific mRNAs coding for stress response factors. Among those, ATF4 is a master transcription factor that orchestrates gene expression during various stresses including those involved in cancer, by either activating survival pathways or on the contrary promoting those of cell death. These opposite ATF4 functions in the cellular stress response depend largely on its expression level linked to its translational regulation by the phosphorylation of eIF2a. Thereby, we sought to characterize the mechanisms(s) that regulate the expression ofATF4 during therapeutic stresses in cancer cells. We described the implication of stress granules in the regulation of ATF4 expression during stress induced by the treatment with sorafenib, a chemotherapeutic agent used to treat hepatocellular carcinoma (HCC). This novel mechanism involves the formation of stress granules that sequester a fraction of ATF4 mRNA in its repressed form, thus preventing its lethal overexpression. This resulted in a basal level of ATF4 expression which is necessary for the survival of cancer cells. Then, in order to characterize the mechanism(s) (e.g. RNAbinding proteins and translation initiation factors such as eIF4G) responsible for the basal translation of ATF4 mRNA allowing the resistance of cancer cells to therapeutic treatments, we performed a biotinylated RNA-pulldown assay with cancer cells extracts subjected to sorafenib. Mass spectrometry analyses of the protein complexes associated with ATF4 biotinylated-RNA fragments led to the identification ofthe DEAD-boxRNA helicase DDX3, as potential interactor with ATF4 mRNA. By combining depletion experiments with various biochemical assays (e.g. luciferase assays), we showed that DDX3 drives sorafenib-induced iv ATF4 mRNA expression at the translational level. Protein-interaction assays identified DDX3 as a component of the translation initiation complex eIF4F. The interaction between DDX3 and the eIF4F complex is potentially mediated by eIF4GI, which we found to be required forsorafenib-induced ATF4 expression. Furthermore, reducing ATF4 expression in resistant HCC cellsthrough DDX3 depletion sensitizes cancer cellsto Sorafenib-induced cell death. Thus, this study identified new regulatory pathways of ATF4 factor that could be targeted to prevent drug resistance in cancer cells and improve the conventional therapies.

Les bactéries lactiques contribuent à la qualité des produits laitiers fermentes par leurs activités enzymatiques. Cette activité est reflétée en partie par le transcriptome, qui représente l'ensemble des gènes exprimés en ARN. Le but de cette recherche est donc d'estimer l'activité de Lactococcus lactis ssp. cremoris par suivi de l'expression des gènes lors de l'étape de la fermentation du lait de fromagerie. Pour étudier les transcriptomes, une technique de RAP-PCR fluorescente a été développée puis appliquée à un ferment mixte composé de trois souches de lactocoques. Les résultats de cette technique montrent que le lait UHT présente un bon compromis entre hygiène et altération thermique des constituants. Dans le lait entier, le CO2 interagit avec les ferments en changeant leur profil de transcription, cette influence n'apparait pas dans le lait écrémé pasteurisé. Comparativement à l'ajout d'une base, l'agitation du lait carboné est une bonne méthode pour réduire l'influence du CO2 sur le ferment. Lors d'une fermentation de type Cheddar, le profil de transcription d'un ferment mixte est très influencé par un excès de NaCl et par un manque d'activité de la présure. La RAP-PCR fluorescente peut identifier les souches par leurs profils d'ARN et analyser les particularités d'une association bactérienne. Selon les conditions observées, le ferment mixte composé par trois souches de Lactococcus lactis ssp. cremoris (LL074, LL225 et LL390) est formé d'une association stable de deux souches : LL225 avec LL390 alors que la souche LL074 est éliminée. La souche LL225 apparait la plus réactive en réagissant identiquement par la modulation de certains gènes en présence des souches LL074 ou LL390. Une modulation de la transcription de certains gène de la souche de LL390 apparait en présence de la souche LL225 mais aucune en présence de LL074, LL390 ne faisant que dominer cette souche. L'association des souches LL225 avec LL390 se fait en rapport égal et induit une modulation de leurs gènes aussitôt que les souches sont en présence. Les données ont été validées en analysant la transcription de gènes par RT-PCR en temps réel et par di-sondes FRET adjacentes et sont en adéquation avec les incompatibilités entre souches dues aux types de proteinases de membrane. L'activité d'un ferment mixte lors d'une fabrication de type Cheddar est donc influencée par le type de lait utilisé et par une dynamique d'association entre les souches.