Magíster en Bioquímica en el área de especialización en Bioquímica Clínica Aplicada / Memoria para optar al título profesional de Bioquímico / En los últimos años, las células troncales han surgido como una promisoria alternativa de terapia regenerativa en la búsqueda de nuevas estrategias para abordar distintas patologías que involucran un daño celular y la consecuente disfunción de un tejido u órgano. En el caso del sistema nervioso central, el recambio celular se encuentra sustentado sobre una población de células multipotentes denominadas células troncales neurales (CTN). Recientes estudios sugieren que este tipo células troncales está presente en la médula espinal, donde el nicho neurovascular jugaría un rol protagónico en la regulación funcional de CTN presentes a través de moléculas angiogénicas y su señalización. En este contexto, las angiopoyetinas (Angs) han sido relacionadas con mecanismos de neuroprotección y/o neurogénesis en zonas encefálicas, aunque se desconoce su eventual participación en médula espinal (ME). Sobre la base de estos antecedentes, esta tesis postula que “Angiopoyetina 1 (Ang1) estimula la diferenciación de CTN aisladas de médula espinal, de manera independiente a su receptor Tie2”. Para evaluar este postulado se generaron cultivos de neuroesferas a partir de ME de ratones, las cuales fueron validadas como modelo de CTN sobre la base de su potencial de proliferación y diferenciación. En estas neuroesferas se detectó la expresión del mRNA de Ang1, sin embargo fue imposible detectar el mRNA del receptor Tie2 tanto en condiciones proliferativas, como de diferenciación. Finalmente se estudió el eventual rol de Ang1 sobre las CTN, para lo cual se agregó Ang1 recombinante sobre los cultivos, y se evaluaron cambios en los patrones de expresión de los marcadores diferenciación. Los resultados obtenidos indican que las células tratadas con con Ang1 mantendrían la expresión, del marcador de troncalidad, SOX2, en comparación a células con el mismo tiempo de diferenciación, pero sin tratamiento. Paralelamente se observó una disminución de la diferenciación astrocítica, reflejada en la baja de la expresión de GFAP. Los resultados de este proyecto podrán entregar valiosa información respecto de los mecanismos involucrados en la regulación funcional de CTN en ME y constituir la base de estrategias dirigidas a la posible modulación de un evento de regeneración en este tejido. / Over the past few years, stem cells have emerged as one promissory alternative of regenerative therapy in the discovery of new therapies to overcome different pathologies than induce tissue or organ malfunction, due to cellular damage. In the case of central nervous system, cellular renewal is sustained by a population of multipotent cells known as neural stem cells (NSC). Recent studies suggest this type of cells are present on the spinal marrow, where the neurovascular center would have an important role on the regulation of the present NSC, through the signaling of angiogenic molecules. In this context, angiopoietins (Angs) have been related with mechanisms of neuroprotection and/or neurogenesis in encephalic zones, although their possible participation in the spinal marrow (SM) is unknown. Considering this background, this thesis postulates that “Agiopoietin 1 (Ang1) stimulates the differentiation of neural stem cells (NSC) isolated from spinal marrow, in a Tie2 receptor independent way”. To evaluate this assumption, neurospheres cultures were grown from mice SM, which were validated as a model of NSC due to their ability to proliferate and differentiate. On these neurospheres, the expression of Ang1 mRNA was detected, however, detection of Tie2 receptor mRNA was impossible, neither on proliferation or differentiation conditions. Finally, the possible role of Ang1 over NSC was studied. In order to do this, recombinant Ang1 was added to the obtained cultures and changes on expression patterns of neural differentiation markers were evaluated. The obtained results indicate that the Ang1 treatment would remain stemness, measure by SOX2 expression, in comparison to cells with the same time of differentiation, but without treatment. At the same time, a decrease in astrocytic differentiation was observed, reflected by the low expression of GFAP. The results of this project may deliver valuable information with respect of the possible mechanisms involved in functional regulation of NSC in SM and, constitute the foundations for directed strategies to the possible modulation of regeneration events on this tissue

Doctor en Bioquímica / La angiogénesis es la formación de nuevos capilares a partir de vasos preexistentes. La utilización de agentes capaces de inhibir este proceso podría ofrecer opciones terapéuticas para patologías dependientes del abastecimiento de nutrientes a través de la sangre, como el cáncer, obesidad, o desórdenes inflamatorios. Calreticulina (CRT) es una proteína multifuncional, altamente conservada, expresada en todas las células nucleadas. Se ha reportado que calreticulina humana (HuCRT) y su dominio N-terminal, vasostatina, interfieren con la angiogénesis inhibiendo la proliferación de células endoteliales y la interacción de éstas con laminina, una proteína de la membrana basal. Previamente, hemos descrito que CRT de T. cruzi (TcCRT), es antiangiogénica en el ensayo in vivo de membrana corioalantoídea de pollo. Este efecto se correlaciona con propiedades antineoplásicas reportadas para la infección tripanosómica con varias cepas del parásito. El objetivo de la presente Tesis fue contribuir al conocimiento de los mecanismos celulares que median el efecto antitumoral de la infección chagásica, centrándose en el posible papel de TcCRT, en virtud de posibles efectos antiangiogénicos expresados en modelos in vitro y ex vivo. Para ello se propusieron tres Hipótesis: 1. TcCRT manifiesta efectos antiangiogénicos in vitro y ex vivo en modelos de vertebrados, 2. El efecto antiangiogénico de TcCRT se explica, al menos en parte, por su interacción directa con células endoteliales, inhibiendo su proliferación, y 3. La actividad antiangiogénica de TcCRT se localiza en su dominio N-terminal (N-TcCRT), y su unión a laminina inhibe la adhesividad de células endoteliales a ésta. Los objetivos específicos propuestos para dar cuenta de estas hipótesis fueron: 1. Determinar si TcCRT y su dominio N-terminal inhiben la angiogénesis en ensayos in vitro y ex vivo, a partir de células endoteliales de cordón umbilical humano (HUVECs) y de anillos de aorta de rata, 2. Determinar si TcCRT se une a células endoteliales, 3. Estudiar el efecto comparativo equimolar de HuCRT, TcCRT y N-TcCRT sobre la proliferación de HUVECs, 4. Estudiar el efecto de TcCRT sobre la quimiotaxis de células endoteliales, 5. Determinar si TcCRT se une a laminina 6. Determinar si la interacción TcCRT/laminina inhibe la adhesión de HUVECs a esta última proteína y 7. Determinar el efecto de TcCRT sobre la expresión de genes reguladores del proceso angiogénico en HUVECs. Los ensayos ex vivo mostraron que TcCRT inhibe el crecimiento capilar en anillos aórticos de rata en forma dosis-dependiente. N-TcCRT (aa 20-191) también inhibió completamente el crecimiento capilar. TcCRT tuvo un efecto inhibitorio dosis-respuesta en experimentos de morfogénesis capilar in vitro, utilizando HUVECs. Comparaciones equimolares de TcCRT con su contraparte humana, mostraron que la molécula parasitaria y el dominio N-terminal, tienen un efecto inhibitorio claramente superior. Los dominios R (R-TcCRT) y S (S-TcCRT) de la proteína parasitaria (aa 136-281 y 159-281 respectivamente) no afectaron la morfogénesis capilar de HUVECs. Mediante experimentos de fluorescencia, demostramos que TcCRT se une y es internalizada por HUVECs y células de la línea endotelial EAhy926. La internalización es inhibida por fucoidina. TcCRT inhibió la proliferación de HUVECs en forma dosis y tiempo-dependiente. Este efecto es independiente de apoptosis. Cuando comparamos la acción de la molécula parasitaria y de su dominio N-terminal con la de la humana, sobre la proliferación de HUVECs, no encontramos diferencias significativas en condiciones equimolares. R-TcCRT no tuvo efecto en la proliferación de HUVECs. Mediante experimentos de migración, determinamos que TcCRT inhibe la migración de HUVECs y células EAhy926 en forma dosis-dependiente. En ELISA TcCRT, R-TcCRT y S-TcCRT, se unen a laminina en forma dosis-dependiente, pero en contraste con los resultados obtenidos con la molécula humana, esta interacción no afecta la adhesión de las células endoteliales a esta proteína. Finalmente, mediante experimentos de RT-PCR en tiempo real, determinamos que la incubación de HUVECs con TcCRT por 24 h, no activa la expresión de genes antiangiogénicos. En síntesis, en este trabajo demostramos un efecto antiangiogénico de TcCRT y su dominio Nterminal en células endoteliales arteriales y venosas de dos especies, Rattus rattus y Homo sapiens, en ensayos ex vivo e in vitro. Este efecto se correlaciona con la inhibición de la morfogénesis capilar, proliferación y migración de las células endoteliales, y también con la internalización de TcCRT en células endoteliales. Estas propiedades de TcCRT podrían explicar, al menos en parte, la resistencia relativa a ciertas agresiones por tumores sólidos inducida por infecciones tripanosómicas / Angiogenesis is the growth of new blood vessels from the pre-existing ones. The use of agents capable of inhibit this process would offer therapeutic options for pathologies dependent on blood supplied nutrients, such as cancer, obesity and inflammatory disorders. Calreticulin (CRT) is a multifunctional, highly conserved protein, expressed in every nucleated cell. It has been reported that human calreticulin (HuCRT), and its N-terminal domain, vasostatin, interferes with angiogenesis by inhibiting endothelial cell proliferation and their attachment to laminin, a basement membrane protein, by binding to it. Previously, we have described that T. cruzi calreticulin (TcCRT) is antiangiogenic in the in vivo chorioalantoid membrane chicken assay, which correlates with the reported anti-neoplasic properties for trypanosomic infection with several strains of the parasite. The aim of the present Thesis was to contribute furthermore to the knowledge of the cellular mechanisms that mediate the antitumoral effect of chagasic infection, focusing on the possible role of TcCRT, expressed in in vitro and ex vivo models. We proposed three Hypotheses: 1. TcCRT shows antiangiogenic effects in in vitro and ex vivo vertebrate models, 2. The TcCRT antiangiogenic effect is explained, at least partly, by its direct interaction with endothelial cells, inhibiting their proliferation, and 3. the antiangiogenic TcCRT activity is located on its N-terminal domain (NTcCRT), and its binding to laminin inhibits endothelial cell attachment. The proposed specific objectives were: 1. To determine if TcCRT and its N-terminal domain inhibits angiogenesis in in vitro and ex vivo assays, on human vein endothelial cells (HUVECs) and rat aortic rings, 2. To determine if TcCRT binds to endothelial cells, 3. To study the equimolar comparative effect of HuCRT, TcCRT and N-TcCRT on HUVECs proliferation, 4. To study the TcCRT effect on endothelial cell chemotaxis, 5. To determine if TcCRT binds to laminin, 6. To determine if TcCRT/laminin interaction inhibits endothelial cell attachment to laminin and 7. To determine the TcCRT effect on the expression of angiogenic genes in HUVECs. The ex vivo assays showed that TcCRT inhibits capillary growth on rat aortic rings, in a dosedependent manner. Complete capillary growth abrogation was also observed with N-TcCRT (aa 20- 191) incubation. TcCRT had a dose-response inhibitory effect in in vitro capillary morphogenesis experiments on HUVECs. When TcCRT and N-TcCRT were compared at equal molarities with HuCRT, the effects of the parasite derived molecules were clearly stronger than those of the human counterpart. The R (R-TcCRT) and S (S-TcCRT) domains of the parasite protein (aa 136-281 and 159-281 respectively) did not affect capillary morphogenesis. By fluorescence experiments we demonstrated that TcCRT binds and is internalized by HUVECs and EAhy926 endothelial cell line. The internalization was competed by fucoidan. TcCRT inhibited HUVECs proliferation in a dose and time-dependent manner. This effect is apoptosis independent. Non significant differences were observed in the proliferation inhibition capacity at TcCRT, N-TcCRT and HuCRT equimolar concentrations. R-TcCRT had no significant effect on HUVECs proliferation. HUVECs and EAhy cells migration was inhibited by TcCRT in a dose-response manner. TcCRT and its R and S domains bind to laminin in ELISA assays, but in contrast to the observed effects of the human molecule, this interaction does not impedes cell attachment to this protein. Finally by carrying out real time RTPCR experiments, we determined that HUVECs incubation with TcCRT for 24 h, does not activate the antiangiogenic gene expression. In synthesis, in this work we demonstrated an antiangiogenic effect of TcCRT and N-TcCRT on arterial and venous endothelial cells from two species, Rattus rattus and Homo sapiens, in ex vivo and in vitro assays. This effect correlates to capillary morphogenesis, proliferation and migration inhibition of endothelial cells, and also with TcCRT internalization to endothelial cells. These properties could explain, at least partly, the relative resistance to certain solid tumor aggressions induced by trypanosomic infections

Para que se produzcan procesos de proliferación celular, tanto en tejidos normales como tumorales, es necesaria la presencia de vasos sanguíneos. La formación de estos se realiza a través de un complicado proceso denominado angiogénesis y es estimulado fundamentalmente por el factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF), que es el más específico y potente, tanto para la angiogénesis como para la vasculogénesis. La aparición de una neoplasia ocurre como consecuencia de una alteración en el ciclo celular normal que lleva a una proliferación excesiva, y teniendo en cuenta que, uno de los aspectos críticos para el desarrollo de tumores sólidos es la formación de una fuente de irrigación sanguínea, tanto el conocimiento del crecimiento tisular como el de los procesos involucrados en la angiogénesis son fundamentales para enfrentar una de las principales causas de muerte en el hombre y en los animales domésticos, el cáncer. Por otro lado en la regeneración hepática, la formación de nuevos capilares a partir de la microvasculatura existente es un requerimiento fundamental, lo que convierte al hígado remanente a una hepatectomía parcial, en un excelente modelo experimental para estudiar algunos de los mecanismos involucrados en la cronobiología de la angiogénesis. En el presente trabajo de tesis se analiza la evolución de la expresión del VEGF, la síntesis de ADN y la actividad mitótica (AM) a lo largo de un periodo circadiano en los hepatocitos del ratón macho adulto durante la regeneración hepática y el efecto que ejerce la portación de un tumor maligno sobre dichos índices. Se utilizaron 252 ratones machos adultos que fueron sometidos a una hepatectomía parcial, la mitad de los cuales fueron además injertados con un tumor maligno. Estos animales se usaron para la realización de 3 experimentos: 1) estudio de la expresión del VEGF en ratones hepatectomizados portadores y no portadores del tumor; 2) estudio de la ADNs en ratones hepatectomizados portadores y no portadores del tumor y 3) estudio de la AM en ratones hepatectomizados portadores y no portadores del tumor. En cada experimento, los ratones fueron divididos en lotes de 6 a 8 animales y sacrificados cada 4 horas a lo largo de un período circadiano desde las 26 hasta las 50 horas poshepatectomía. En todos los casos se tomaron muestras de la porción triangular del lóbulo derecho del hígado que fueron procesadas con las técnicas histológicas adecuadas según los experimentos diseñados. Tanto para la detección de la expresión del VEGF como para la ADNs se utilizaron técnicas inmunohistoquímicas y para la evaluación de la AM se utilizó H-E. A partir de los registros individuales se estableció el índice de expresión del VEGF, ADNs y AM expresado en porcentaje. A partir de estos índices individuales se calculó la media aritmética ± error estándar de cada lote y de cada grupo. Estos datos se analizaron estadísticamente mediante el análisis de varianza (Anova), en caso de que las diferencias fueran significativas se realizó el Test de Tuckey. Los resultados correspondientes a los ratones hepatectomizados no portadores muestran la existencia de curvas circadianas tanto para la expresión del VEGF con un valor máximo a las 08/46 (hora del día/hora poshepatectomía) de 2.6±0.1; en la ADNs con un valor máximo a las 16/30 de 3.4±0.3 y en la AM cuyo valor máximo se produjo a las 12/50 de 2.3±0.01. La presencia del tumor injertado ES2 genera cambios detectables en las curvas circadianas de la expresión del VEGF, en la ADNs y AM de los animales hepatectomizados, provocando modificaciones en la distribución espacial y temporal de los valores correspondientes a los mismos. El valor máximo de expresión del VEGF se encontró a las 16/30, 8 horas después (00/38) se observó el de ADNs. Por su lado el valor máximo de AM se produjo 8 horas más tarde al mismo a las 08/46. Finalmente, se puede concluir que los factores de crecimiento producidos por las células del tumor maligno ES2, de ratones machos de la cepa C3HS hepatectomizados que son liberados a la circulación general, podrían reconocer al tejido regenerante con una alta tasa proliferativa como una metástasis y serían entonces los responsables de alterar el microambiente del tejido hepático determinando de esta forma cambios en la cronobiología de la síntesis de ADN, de la actividad mitótica y de la expresión del VEGF.

Tesis presentada para optar al grado de Doctora en Bioquímica / El cáncer ovárico epitelial (COE) representa el 90% de los cánceres de ovario. Esta enfermedad presenta un transcurso silencioso y por lo tanto una detección tardía; es altamente angiogénico y tiene una pobre respuesta a la terapia con una baja sobrevida. Existen varias hipótesis sobre la etiología del COE, una de ellas postula que los andrógenos estimulan la proliferación de células epiteliales del ovario dentro de los quiste de inclusión y también del epitelio transformado. Con el fin de dilucidar el mecanismo molecular por el cual los andrógenos contribuyen al desarrollo del carcinoma ovárico, se realizaron estudios relacionando los andrógenos con vías de señalización de moléculas como el factor de crecimiento transformante beta 1 (TGF-β1), el cual es un inhibidor de la proliferación celular. Además, existen reportes sobre el efecto de los andrógenos sobre factores pro-angiogénicos como NGF y VEGF. Estos antecedentes, sugieren que los andrógenos podrían estar participando de la génesis del cáncer y podrían ser responsables de cambios importantes en los niveles de expresión de moléculas como TGF-β1, NGF y VEGF. Por este motivo, se planteó la siguiente hipótesis; el andrógeno dihidrotestosterona (DHT) inhibe el efecto antiproliferativo de TGF-β1 e induce la expresión de factores angiogénicos, favoreciendo la proliferación celular y la angiogénesis en células de cáncer ovárico epitelial. El objetivo de este estudio fue evaluar la participación de DHT en la vía de señalización de TGF-β1 y en la expresión de factores angiogénicos en células de cáncer de ovárico epitelial. Para abordar este objetivo, la metodología fue diseñada en dos partes: 1.- experimentos ex-vivo, para lo cual se trabajó con muestras de ovario normal inactivo (OI) y cáncer ovárico epitelial pobremente diferenciado (COE) en donde se evaluó por IHQ los niveles de AR y de los receptores I y II (TGFBR1 y TGFBR2) de TGF-β1 por IHQ y W-B. 2.- experimentos in-vitro con dos líneas celulares, HOSE (células epiteliales de la superficie ovárica) y A2780 (células de cáncer ovárico epitelial), las cuales fueron estimuladas con 0, 10 y 100 nM de DHT, por 48 y 72 h para evaluar las mismas proteínas que se evaluaron en tejidos por las técnicas de ICQ y W-B. Además, se realizaron experimentos con siRNA del receptor de andrógenospara confirmar la acción de los andrógenos en cáncer ovárico epitelial. Adicionalmente, se evaluó el ciclo celular por citometría de flujo, así como también, se evaluó los niveles de p21 por WB Resultados de nuestro trabajo, indicarían un aumento de los niveles del AR y una disminución de los receptores I y II (TGFBR1 y TGFBR2) de TGF-β1 en COE versus OI. Estos resultados concuerdan con los obtenidos en las líneas celulares, donde también encontramos un aumento de los AR y una disminución de estas proteínas (TGFBR1 y TGFBR2) en la línea celular de cáncer ovárico epitelial A2780 versus la línea celular de epitelio normal de la superficie ovárica HOSE. Por otra parte, cuando estimulamos las células A2780 con DHT, observamos que los niveles de mRNA de TGF-β1 no fueron modificados por este andrógeno, sin embargo, los niveles de los receptores I y II de TGF-β1 disminuyeron significativamente (*p<0,05) a las 72 h con 100 nM de DHT. Estos resultados sugieren que el AR y TGF-β1 podrían participar en la regulación de la homeostasis tisular en el COE. Además, la disminución en los niveles de los receptores de TGF-β1 por efecto de DHT, sugiere que los andrógenos alterarían la vía de señalización de TGF-β1, lo que podría explicar el aumento en la proliferación celular de esta patología. El estudio del ciclo celular indicó que hay un aumento del porcentaje de células en fase S en las líneas celulares A2780, sin embargo, no se logró relacionar el efecto de DHT y TGF- β1 en la proliferación, probablemente por la cantidad de factores que están involucrados en este proceso. Por otra parte, se analizaron los niveles proteicos de p21 y se encontró que el tratamiento con DHT provocó una disminución en los niveles de p21, lo que podría relacionarse con una falla en la regulación del ciclo celular en células A2780, sin embargo, este efecto no se observó en las células HOSE. Finalmente, se analizó el efecto de DHT sobre los niveles de expresión de NGF y VEGF sin encontrar cambios en los niveles de mRNA y proteína de NGF en ninguna de las líneas celulares en estudio. Por otro lado cuando se analizó la secreción de VEGF, se observó una mayor secreción de este factor en células A2780 tratadas con DHT en comparación con las células HOSE en las mismas condiciones. En conclusión, los resultados obtenidos en tejido de COE y en la línea celular A2780 sugieren que la vía de señalización canónica de TGF-β estaría alterada en COE, donde los andrógenos podrían desempeñar un papel importante regulando negativamente la expresión de sus receptores (TGFBR1) lo que significaría que DHT al bloquear la vía de señalización canónica de TGF-β podría estar involucrado en la disminución de los niveles de p21. También es importante destacar que DHT tendría una participación importante en el proceso de angiogénesis, aumentando los niveles de VEGF, según lo encontrado en este trabajo. Estas fallas, entre otras, podrían contribuir a la progresión del cáncer de ovárico epitelial, siendo interesante dilucidar los mecanismos implicados en futuros estudios para contribuir con nuevas y efectivas terapias anti-carcinogénicas / Epithelial ovarian cancer (EOC) represents 90% of ovarian cancers. This disease has a silent course, a late detection. It is highly angiogenic and has a poor response to therapy, therefore a low survival. There are several hypotheses about the etiology of the EOC, one of them postulates that androgens stimulate the proliferation of epithelial cells within the ovary inclusion cyst and epithelium transformed. To elucidate the molecular mechanism by which androgens contribute to the development of ovarian cancer, studies were related the androgen with signaling pathway, such as transforming growth factor beta 1 (TGF-β1), which is a cell proliferation inhibitor. In addition, there are reports on the effect of androgens on pro-angiogenic factors such as VEGF and NGF. These facts suggest that androgens could be involved in the genesis of cancer and could be responsible for significant changes in expression levels of molecules such as TGF-β1, NGF and VEGF. For these reasons, the following hypothesis is raised; the androgen dihydrotestosterone (DHT) inhibits the antiproliferative effect of TGF-β1 and induces the expression of angiogenic factors promoting cell proliferation and angiogenesis in epithelial ovarian cancer cells. The objective of this study was to evaluate the participation of DHT in the signaling pathway of TGF-β1 and expression of angiogenic factors in cells of epithelial ovarian cancer. To address this goal, the methodology was designed in two parts: 1. ex-vivo experiments with samples of inactive normal ovary (IO) and poorly differentiated epithelial ovarian cancer (EOC) and 2. Experiments in vitro with two cell lines, HOSE (ovarian epithelial cell surface) and A2780 (epithelial ovarian cancer cells), which were stimulated with 0, 10 and 100 nM DHT for 48 and/or 72 h. To answer each of the objectives, conventional RTPCR, qPCR, blot, immunocytochemistry, immunohistochemistry and western were used. The results indicate an increase of AR levels and a decreased of TGF-β1 receptors I and II (TGFBR2 and TGFBR1) in EOC versus IO. These results are in agreement with those obtained in cell lines, where we also found an increase in AR and a decrease in TGF-β1 receptors (TGFBR1 and TGFBR2) in epithelial ovarian cancer cells A2780 versus HOSE cells. Moreover, when stimulate A2780 cells with DHT, the mRNA levels of TGF-β1 were not modified by this androgen, however, the levels of TGF-β1 receptors I and II decreased significantly (* p <0.05) at 72 h with 100 nM DHT. These results suggest that AR and TGF-β1 may be involved in regulating tissue homeostasis in the EOC. Furthermore, decreased levels of TGF-β1 receptors and the effect of DHT in TGF-β1 canonical sinaling pathway, suggests that androgen could increase cell proliferation in this pathology. The cell cycle studies indicated that there is an increase in the percentage of cells in S phase in the cell lines A2780, however, failed to relate the effect of DHT and TGF-β1 in proliferation, probably because the number of factors are involved in this process. Moreover, the protein levels of p21 were analyzed and was found that the DHT treatment caused a decrease in p21 levels, which could be related to a failure in cell cycle regulation in A2780 cells, this effect was not observed in the HOSE cells. Finally, the effect of DHT on NGF and VEGF expression levels was analyzed. No changes were observed in mRNA levels or of NGF protein levels in both cells lines studied. Furthermore when VEGF protein levels were analyzed, it was found that the secretion of this factor was greater in A2780 cells treated with DHT compared to HOSE cells under the same conditions. In conclusion, these results of tissue and cell line A2780 suggest that the TGF-β canonical signaling pathway would be altered in EOC where androgens may play a role downregulating expression of its receptors (TGFBR1) and this could potentially be involved in the reduction of p21 levels. Is also important highlight as found in this investigation, androgens have an important role in the angiogenesis process, increasing the levels of VEGF. These failures, among others, could contribute to the progression of epithelial ovarian cancer, it is interesting to elucidate the mechanisms involved in future studies to contribute with new and effective anti-carcinogenic therapies / Fondecyt; Fondap

Magíster en ciencias médicas y biológicas, mención fisiopatología / Introducción: varios estudios experimentales han mostrado que la ventilación mecánica puede inducir lesión pulmonar aún en pulmones previamente sanos, pero cuando estos presentan un síndrome de distrés respiratorio agudo de cualquier origen, parecen particularmente sensibles a los efectos nocivos de la ventilación mecánica. Por otra parte, factores de crecimiento angiogénicos como el factor de crecimiento endotelio vascular (VEGF) pueden modular la permeabilidad endotelial. Los procesos biológicos que median el aumento de la permeabilidad vascular posterior a un daño pulmonar inducido por la ventilación mecánica, y por ende el desarrollo de edema pulmonar, no son completamente conocidos. No existen estudios que hayan evaluado el impacto de la estrategia ventilatoria sobre los niveles de VEGF, ni su posible rol en el aumento de permeabilidad y el desarrollo de edema pulmonar. Objetivo: Determinar en un modelo de lesión pulmonar aguda, si comparado con animales sanos, existe alteración en los niveles de VEGF en plasma, tejido pulmonar y lavado broncoalveolar; si estos cambios se asocian a alteraciones de permeabilidad vascular, lesión y edema pulmonar; y si estas alteraciones pueden ser revertidas al emplear una estrategia ventilatoria ultraprotectora (volumen corriente 2 ml/kg de peso corporal) asociada a soporte vital extracorpóreo, comparado con una ventilación no protectora (volumen corriente 10 ml/kg de peso corporal). Resultados: no se observó diferencias en los niveles relativos de VEGF en el grupo de animales con lesión pulmonar aguda ventilados con una estrategia convencional y ultraprotectora más soporte vital extracorpóreo, en plasma al tiempo 0, 3 y 24 horas, y en el homogeneizado de tejido pulmonar, en comparación al grupo control (p<0.05). No se observó una asociación entre los niveles relativos de VEGF en el grupo de animales con lesión pulmonar aguda ventilados con una estrategia convencional y ultraprotectora más soporte vital extracorpóreo, en plasma (tiempo 0, 3 y 24 horas) y homogeneizado de tejido pulmonar, y los cambios en la concentración de proteínas en el lavado broncoalveolar, tasa peso húmedo/seco y daño pulmonar histológico (p<0.05). No se observó niveles relativos de VEGF, evaluados con la técnica de Western blot, en las muestras de lavado broncoalveolar. Conclusiones: la estrategia ventilatoria empleada no altera los niveles relativos del factor de crecimiento endotelio vascular en plasma y tejido pulmonar, en un modelo de cerdos con lesión pulmonar aguda inducida por lavados con solución salina repetidos y ventilación mecánica con alto volumen corriente. Además, los cambios observados en la permeabilidad vascular, daño y edema pulmonar no tienen una asociación con los niveles relativos del factor de crecimiento endotelio vascular en el plasma y tejido pulmonar. Sin embargo, existe un número importante de limitaciones técnicas que deben ser consideradas al momento de interpretar estos resultados, y que hacen necesario continuar investigando y desarrollando la metodología de trabajo para documentar resultados confiables, y que permitan un constructo teórico en relación a VEGF en este modelo de lesión pulmonar aguda.

OBJETIVO El objetivo nuestro proyecto de investigación es demostrar si la presencia de plasma rico en plaquetas (PRP) autólogo, que aporta varios factores de crecimiento en proporciones fisiológicas, en la interfase injerto tendinoso-hueso modifica el proceso de reparación de los tejidos locales en nuestro modelo experimental. MATERIAL Y MÉTODO Diseñamos un estudio de tipo experimental, longitudinal y prospectivo. Diez conejos albinos de Nueva Zelanda son intervenidos en sus 2 extremidades traseras, en una se realiza la técnica Experimental aplicando PRP y la otra sirve de control, sin aplicar PRP . Una vez intervenidos, los animales son divididos en 2 grupos de 5 de forma aleatoria. Un grupo es sacrificado a la 2ª semana y el otro a la 4ª semana postintervención. El área quirúrgica fue estudiada macroscópica, radiográfica, histológica e inmunohistoquímicamente. RESULTADOS El estudio macroscópico y radiográfico de las piezas muestra la presencia de un área de reacción ósea de mayor tamaño en la zona de entrada del tendón en el interior del túnel óseo en el grupo Experimental sacrificado a la 4ª sem. respecto al resto de grupos. Microscópicamente, en ningún corte histológico, tanto de los grupos Control como Experimental, se observa la línea de separación basófila, denominada tidemark190 entre el fibrocartílago mineralizado y el no mineralizado. Si se evidenció la aparición de una mayor cantidad de los elementos tisulares fibrosos, cartilaginosos y osteoides, y un mayor grado de ordenación celular en el fibrocartílago y sustancia osteoide en los grupos Experimentales respecto a sus correspondientes grupos Control. Además se observa la aparición de zonas de anclaje hueso-tendón en dos extremidades del grupo Experimental sacrificado a la 4ª sem., no encontradas en ningún caso Control. En el estudio inmunohistoquímico no apreciamos diferencias en el patrón de distribución del colágeno tipo II entre los distintos grupos, aunque si existe una mayor área de tinción de colágeno tipo II en los grupos Experimentales respecto a sus correspondientes grupos Control, ya que la cantidad de tejido fibrocartilaginoso, en sus variadas formas de presentación, también es mayor en los grupos que recibieron PRP. CONCLUSIONES El análisis de los resultados concluye que macroscópica, radiográfica y microscópicamente, este estudio demuestra que la administración de PRP como fuente de FC afecta al proceso de reparación del autoinjerto tendinoso dentro de un túnel óseo en nuestro modelo experimental. El PRP aceleró la curación, anticipando en el tiempo la aparición de elementos celulares y tisulares propios de fases posteriores del proceso de cicatrización, y además incrementó la cantidad éstos. / EFFECT OF PLATELET RICH PLASMA IN THE BIOLOGIC INCORPORATION OF A TENDON GRAFT IN A BONE TUNNEL Objective: To study the effect of the platelet rich plasma (PRP) in the biological process of tendon healing inside a bone tunnel Material y Methods: We designed an experimental, longitudinal and prospective research study. Ten animals were operated on their back legs (one as Experimental group and the other as Control group). In the Experimental group the tendon of the internal gastrocnemius muscle was cut, infiltrated with PRP, placed in a tibial bone tunnel filled with PRP, and finally, fixed by a bioabsorbable screw. The same procedure was practiced in the Control group without the use of PRP. Five rabbits were sacrificed on the second week and five on the fourth week after surgery. The legs were evaluated macroscopic, radiographic, histologic and immunohistochemically. Results: The macroscopic and radiographic study of the pieces shows the presence of a larger bone reaction area in the entrance of the tendon within the bone tunnel in the Experimental group sacrificed on the fourth week compared to other groups. Microscopically, the "tidemark" isn’t observed between mineralized and unmineralized fibrocartilage in any group . The Experimental group presents a statistically significant greater amount of chondroid tissue, osteoid tissue and trabecular bone, both the second and fourth week. We observe continuity zones between tendinous fibers and bone in some cases of the Experimental group on the fourth week . Immunohistochemically, no appreciable differences in the distribution pattern of type II collagen between the groups could be seen, although there is a greater area of staining in the Experimental group compared to their corresponding Control group Conclusion: The analysis of results and assessment of the comparison established between the research groups concludes that macroscopic, radiographic and microscopically, this study demonstrates that administration of PRP affects the repair process of tendon autograft in a bone tunnel in our experimental model. The PRP accelerated the healing time anticipating the emergence of cellular and tissue elements characteristic of later stages of the healing process, and also increased the amount of them.