1. Objetivos: Evaluar el valor pronóstico de la resonancia magnética (RMC) de estrés con dipiridamol en pacientes con dolor torácico de perfil isquémico utilizando como base la cascada isquémica (CI). 2. Métodos: Incluimos en un registro prospectivo multicéntrico 1725 pacientes con dolor torácico isquémico sin síndrome coronario agudo, remitidos para realización de una RMC de estrés con dipiridamol. Se analizó la extensión (número de segmentos) con disfunción sistólica basal (DS-B), déficit de perfusión con el estrés (DP), disfunción sistólica inducida (DS-I) y realce tardío de gadolinio (RT) (anormal si >1 segmento). En base a la CI se definieron tres grupos de pacientes: C1 (sin evidencia de isquemia, n=1013, 59%), C2 (déficit de perfusión con el estrés, n= 520, 30%) y C3 (defectos de perfusión e hipocinesia inducida con el estrés, n= 192, 11%). Se censuraron los pacientes que sufrieron una revascularización tras la RMC de estrés (242 pacientes,14%) y se contabilizaron el número de eventos mayores (EV= mortalidad de causa cardiaca e infarto agudo de miocardio no fatal) 3. Resultados: Durante una mediana de seguimiento de 448 días se detectaron 64 EM (4%), incluyendo 39 muertes cardiacas y 25 infartos de miocardio. Los 4 índices de RMC se asociaron a mayor tasa de eventos mayores: DS-B 7%, DP 6%, DS-I 13%, RT 6% (p <0,001 en todos los casos). Teniendo en cuenta los tres subgrupos realizados en base a la CI, se demostró una tasa superior de eventos mayores en el grupo C3: C1 2%, C2 3,5% y C3 13,5% (C1 vs. C2: p=0,08; C2 vs. C3: p<0,0001). En un primer análisis multivariado en el que se introdujeron las 4 variables de RMC como variables continuas, los predictores independientes de eventos mayores fueron: edad (HR 1,04; p=0,01), sexo masculino (HR 1,81; p=0,05), diabetes mellitus (HR 1,93, p=0,01), infarto de miocardio previo (HR= 1,99, p= 0,01), volumen telesistólico ventrículo izquierdo (por cada 1 ml/m2) (HR 1,02 , p< 0,0001), DP (por segmento) (HR 1,09, p=0,01) y DS-I (por segmento) (HR 1,17, p<0,0001). En un segundo modelo se incluyeron los tres grupos de la CI y las variables predictoras independientes de EV fueron: edad (HR 1,03; p=0,02), diabetes mellitus (HR 1,75, p=0,04), infarto de miocardio previo (HR= 2,33, p= 0,001), volumen telesistólico ventrículo izquierdo (por cada 1 ml/m2) (HR 1,02 , p< 0,0001), pertenecer al grupo C3 (HR 9,51, p<0,0001). Conclusiones: La RMC de estrés con dipiridamol tiene utilidad pronóstica para predecir EM durante el seguimiento en pacientes remitidos para estudio de dolor torácico de perfil isquémico. El subgrupo de pacientes con una isquemia más severa (C3 = déficit de perfusión asociado a hipocinesia inducible con el estrés) presentan un riesgo más alto de sufrir un EM, en comparación con el resto de pacientes que se estudiaron por dolor torácico. / 1. Objectives: To evaluate the prognostic value of cardiac magnetic resonance (CMR) in patients with chest pain. 2. Methods: 1725 patients with chest pain, excluding those with an acute coronary syndrome, were included in a prospective multicenter registry. They underwent a stress CMR with dipyridamole. We analyzed the number of segments with basal systolic dysfunction (BS-D), perfusion deficit (PD), induced systolic dysfunction (IS-D), and late enhancement (LE) (abnormal >1 segment). We defined 3 groups on the basis of the ischemic cascade (CI): C1 (without ischemia, n=1013, 59%), C2 (PD, n=520, 30%) and C3 (PD and IS-D, n=192, 11%). Patients with a revascularization after CMR were censored (14%). Major events during follow up were recorded (ME= cardiac death or non-fatal myocardial infarction (MI)). 3. Results: 64 ME were detected (4%, median follow-up 448 days), including 39 cardiac deaths and 25 non-fatal MI. The 4 CMR indexes were associated to a bigger rate of ME: BS-D 7%, PD 6%, IS-D 13%, LE 6% (p<0.001). In the three subgroups of the IC we demonstrated a bigger ME rate in C3: C1 2%, C2 3,5% and C3 13,5% (C1 vs. C2: p=0,08; C2 vs. C3: p<0.0001). In a first multivariate analysis including the CMR indexes as continuous variables, the predictors of ME were: age (HR 1.04; p=0.01), masculine sex (HR 1.81, p=0.05), diabetes mellitus (HR 1.93, p=0.01), previous MI (HR= 1.99, p=0.01), left ventricle systolic volume (per 1 ml/m2) (HR 1.02, p<0.0001), PD (per segment) (HR 1.09, p=0.01) and IS-D (per segment) (HR 1.17, p<0.0001). In a second multivariate model with the three IC subgroups, the predictors of ME were: age (HR 1.03; p=0.02), diabetes mellitus (HR 1.75, p=0.04), previous MI (HR= 2.33, p= 0.001), left ventricle systolic volume (per 1 ml/m2) (HR 1.02 , p< 0.0001), group C3 (HR 9.51, p<0.0001). 4. Conclusions: Stress CMR with dipyridamole has prognostic value in patients with ischemic chest pain. The subgroup of patients with a severe ischemia (C3= perfusion deficit with induced systolic dysfunction) have the biggest risk of ME during follow-up.

El cordón umbilical es una estructura tubular que comunica al feto con la placenta. La aparición del enrollamiento del cordón alrededor del feto es un hallazgo frecuente en los partos, con una prevalencia de circulares de cordón al nacimiento del 15-25%, considerándose una situación fisiológica. Dada la frecuencia con que se comprueba la presencia de circulares de cordón, hay que considerar que no siempre ocasiona alteraciones durante el embarazo o el curso del parto, pero que en algunos casos cuando las circulares son múltiples y sobre todo cuando son ajustadas pueden dificultar el flujo sanguíneo y producir sufrimiento fetal, Las circulares de cordón pueden diagnosticarse mediante la realización de ecografía y Doppler (planos transversal y sagital del cuello) y estudios de monitorización fetal. Al mismo tiempo observamos que la presencia de circulares a lo largo del embarazo es variable, pues la existencia de circulares se encuentran ampliamente influenciada por los movimientos fetales, pudiendo desaparecer circulares que existían previamente o aparecer nuevas y aumentar el número de éstas. Existe gran controversia sobre su significación clínica. Aunque en la gran mayoría de casos no produce lesión alguna, se ha informado de que se asociaría con un incremento del número de registros cardiotocográficos patológicos, acidemia, líquido amniótico meconial, mayor índice de cesáreas, admisión en unidades pediátricas de cuidados intensivos y, posiblemente, mayor mortalidad perinatal. Existen muchos trabajos en la literatura que han evaluado la implicación de las circulares de cordón en el tercer trimestre de embarazo y parto. Nosotros pretendemos realizar un seguimiento de las circulares de cordón a lo largo de la gestación. Nuestro objetivo es establecer la incidencia de circulares de cordón en primer trimestre de gestación mediante ecografía Doppler y tridimensional y realizar control evolutivo de las mismas para establecer el pronóstico de estos casos. Realizamos un estudio longitudinal, prospectivo, descriptivo, de cohortes; en un grupo de 150 pacientes, seleccionadas por muestreo consecutivo, en la consulta de diagnóstico prenatal del Hospital Clínico Universitario de Valencia. El análisis estadístico se realizó con la aplicación estadística SPSS versión 18.0; obteniendo los siguientes resultados: 1. Mediante ecografía Doppler y tridimensional establecemos incidencia de circulares de cordón en primer trimestre siendo del 25.3%; 1 circular en 18,7%, 2 en 6% y 3 en 0.7%. 2 2- En posteriores controles ecográficos, existen circulares en el 16.8% en semana 20 y 18,2% en semana 32. 3. Al nacimiento existen circulares en el 29.3% de los partos. 4. Finalización del embarazo; partos vaginales 82,6%y cesáreas 16%; pero sólo 1,3% por sospecha de pérdida del bienestar fetal. 5. 1.3% de éxitus (dos casos) en semana 13 y 25, ambos con 2 circulares de cordón apretadas. 6. A mayor edad materna mayor probabilidad de circulares en semana 20, 32 y nacimiento. 7. Correlación significativa entre circulares de cordón en 1º trimestre y en semanas 20, 32 y al parto, pero las circulares de 1º trimestre no se correlacionan con peores resultados perinatales, salvo que persistan a lo largo del embarazo. 8. Circulares de cordón en semanas 20 y 32 se correlaciona con peores valores del pH. 9. Si circular al nacimiento; correlación estadísticamente significativa en función del número de circulares con el pH, APGAR, y tipo parto. 10. Al relacionar circulares de cordón a lo largo del embarazo con variaciones del registro cardiotocográfico, no encontramos diferencias estadísticas. En nuestro trabajo encontramos un paralelismo con las publicaciones previas, con resultados similares al resto de literatura contrastada, y añadimos una ampliación a la investigación al haber iniciado el estudio y seguimiento de las circulares de cordón desde el primer trimestre de gestación, con ayuda de la ecografía Doppler y tridimensional. / We have proposed a study on the circular cord, based on the diagnosis of nuchal cord on first trimester of gestation, and progress monitoring and prognosis of these cases, obtaining the following results: 1.- We have established the incidence of nuchal cord on the first trimester of pregnancy with three-dimensional and Doppler ultrasound, this being 25.3%, presence of a circular in 18.7%, 2 in 6% and only 3 in 0.7%. 2.- In the subsequent ultrasound scans, there are circular in 16.8% in week 20 and 18.2% in week 32 and at the time of birth in 29.3% of deliveries. 3 .- On the termination of pregnancy type of vaginal deliveries predominate 82.6%, with a cesarean rate of 16%, but among them only 1.3% the indication was suspected fetal welfare loss. And we have deaths in 1.3% (2 cases) in weeks 13 and 25, both with 2 circular cord tight, as the only finding. 4 .- There is significant correlation between the presence of nuchal cord around the fetal neck in the first quarter and then in weeks 20, 32 and childbirth, but the circular first quarter did not correlate with worse perinatal outcomes, except that persist throughout the pregnancy. 5.- The presence of nuchal cord at 20 and 32 weeks correlate with lower pH values (the higher number of circulars, worse cord pH). 6 .- There is a statistically significant correlation with the number of circular labor, the umbilical cord pH, Apgar score, and type of completion of delivery. 7 - By relating the presence of circular cord along the pregnancy with changes in the cardiotocographic record, we found no statistical differences.

Esta tesis doctoral presenta los resultados obtenidos del estudio epidemiológico observacional descriptivo, de corte transversal, con componente de seguimiento prospectivo y multicéntrico sobre la gastroenteritis aguda (GEA) debida a rotavirus realizado en 3 hospitales de la provincia de Valencia representativos de los tres niveles de atención hospitalaria (H. La Fe, H. Dr. Peset, H. Lluís Alcanyís).Además de estudiar la prevalencia de la GEA por rotavirus y la incidencia de GEA nosocomial por rotavirus junto a sus características demográficas, clínicas, genotípicas y económicas también se realizó la determinación de otros virus productores de GEA como adenovirus, astrovirus y calicivirus.La población de estudio incluyó aquellos niños con edades comprendidas entre 1-23 meses ingresados en las unidades de lactantes de los centros participantes durante el periodo de estudio (Octubre-06 a Marzo-07). Se realizó el seguimiento de la población desde el ingreso hasta las 72 horas posteriores al alta y se recogieron los datos pertinentes de todos los pacientes con síntomas de gastroenteritis aguda (GEA= al menos 1 deposición líquidas o 2 semilíquidas en un periodo de 24h), así como una muestra de heces para la determinación en laboratorio centralizado (sección de virus productores de gastroenteritis del Centro Nacional de Microbiología del Instituto de Salud Carlos III) de los diferentes genotipos G y P de rotavirus mediante RT-PCR y de otros virus productores de GEA.Con los resultados incluidos en esta tesis se dispone de más datos para dar respuesta a cuántos casos de rotavirus y otros virus productores de GEA se dan en nuestro entorno, qué genotipos circulan, cuándo se producen, con qué gravedad, cuántos originamos por la hospitalización y cuánto coste económico supone entre otras preguntas importantes y necesarias a la hora de valorar un problema para poder con posterioridad resolverlo. / This doctoral thesis presents the results obtained in an epidemiological descriptive observational and multicenter study in 3 hospitals (H. La Fe, H. Dr. Peset, H. Lluís Alcanyís), with prospective follow-up on acute gastroenteritis (AGE) due to rotavirus. The centres are representative of the three levels of hospital care in the province of Valencia ( Spain).This study estimates the prevalence of rotavirus AGE and the incidence of rotavirus nosocomial AGE, the demographic and clinical characteristics, the circulating genotipes and the economic impact of the disease. At the same time, other viruses which produce AGE, such as Adenovirus, Astrovirus and Calicivirus, are identified.The study population included those children aged between 1-23 months hospitalized in the breast-fed babies units in the participant centres during the study period (October-06 to March-07). The follow-up of the population was performed from the first day of hospitalization until 72 hours after discharge, and the pertinent information was gathered for all the patients with symptoms of acute gastroenteritis (AGE = at least 1 deposition liquid or 2 in a 24h period), as well as a feces sample for the determination of the different genotypes G and P of rotavirus by RT-PCR and other viruses in a centralized laboratory (National Center of Microbiology of the Institute of Health Carlos III).With the results included in this thesis, there is more information to assess how many cases of rotavirus and other viruses producers of AGE are in our environment, what genotypes circulate, when they emerge, with what severity, how many originated in the hospital and how much economic impact is felt. These and other important and necessary questions are addressed in order to contribute to the assessment and resolution of this problem.

Objetivos: Evaluar los efectos terapéuticos, investigar el mecanismo de acción de la micropunción estromal anterior en pacientes con queratopatía bullosa y realizar una correlación clínico-patológica en los pacientes a los que posteriormente se realice una queratoplastia. Desarrollar un modelo experimental de descompensación corneal en el conejo y estudiar en él, el efecto de la micropunción estromal anterior.Introducción .La queratopatía bullosa es una de las principales indicaciones de queratoplastia penetrante. Se caracteriza por un edema crónico y generalmente irreversible de la córnea. En las formas avanzadas se producen, debido a la deficiente función del endotelio, vesículas subepiteliales macroscópicas como consecuencia del paso de líquido hacia las capas anteriores de la córnea, quedando el fluido atrapado bajo el epitelio que es impermeable. Estas vesículas al romperse producen dolor, fotofobia y sensación de cuerpo extraño.La micropunción estromal anterior, es un procedimiento para paliar los síntomas de los pacientes que se encuentran a la espera de un transplante de córnea o para aquellos pacientes en los que por diversos motivos no está indicada la queratoplastia.Material y métodos: Realizamos la micropunción estromal anterior en 45 ojos de 45 pacientes con queratopatía bullosa. Se documentaron todos los pacientes fotográficamente previa y posteriormente al tratamiento. Se calculó el área de superficie corneal afectada por las bullas y su variación con el tratamiento. Se les realizó un cuestionario acerca del dolor y su sintomatología, antes y después del tratamiento. Se obtuvieron paquimetrías previas y posteriores a la realización de las micropunturas. En los pacientes, a los que con posterioridad se les realizó un transplante de córnea, realizamos el estudio del botón corneal, en especial de la zona de la micropuntura. En el modelo experimental, obtuvimos una descompensación corneal permanente con cloruro de benzalconio en ojos de conejo albino de laboratorio y tras realizarles una micropunción estromal anterior, los sacrificamos a intervalos de tiempo entre la primera semana y el tercer mes para estudiar el proceso evolutivo de cicatrización de la micropuntura.Resultados: La micropunción estromal anterior produce una disminución estadísticamente significativa del área de superficie corneal ocupada por las bullas (p<0.001). El análisis estadístico del cuestionario realizado a los pacientes demuestra una diferencia significativa (p<0.001), en cuanto a la mejoría de todos los parámetros que fueron evaluados: sensación de cuerpo extraño, severidad y duración de los episodios de dolor, fotofobia, requerimiento de analgésicos e insomnio. El espesor corneal se incrementó levemente. El estudio histológico de los 19 botones corneales mostró el epitelio adherido en la totalidad de las muestras aunque el grado de adhesión del epitelio al estroma era variable. En el 68% de los botones existía una adhesión muy firme mientras que en el 31% la adhesión del epitelio al estroma aparecía únicamente en las zonas de la micropunción. El tejido fibroso subepitelial, aparecía localizado en la zona de la micropunción en el 73.6 % de las muestras y en el 26 % aparecía de forma extensa. El estudio histológico en la córnea humana y en el conejo evidencia las proyecciones epiteliales en la zona de la micropunción dando lugar a anclajes temporales.Conclusiones: La micropunción estromal anterior reduce la formación de bullas y alivia el dolor en pacientes con queratopatía bullosa. / Bullous keratopathy is a corneal disease caused by endothelial decompensation secondary to multiple causes as trauma, glaucoma, endothelial dystrophy. The results are stromal edema and formation of epithelial or subepithelial bullae. Patients often suffer from pain, photophobia, epiphora and decreased vision. Penetrating keratoplasty is the treatment of choice for bullous kerathopathy. Patients awaiting keratoplasty, or patients in whom surgery is contraindicated or not eligible due to little or no potential for visual recovery, and patients with symptomatic bullous kerathopathy who have lost the motivation for another surgery after repeated graft failures are usually treated with an anterior stromal puncture to relief pain, photophobia and tearing.The use of anterior stromal puncture to treat recurrent corneal erosion is well documented. To date, the mechanisms to explain how anterior stromal puncture reduces pain and induces subepithelial fibrosis are not clear enough.We report 45 cases of bullous kerathopathy treated with anterior stromal puncture. A penetrating keratoplasty was done after in nineteen patients, as well as the histopathologic study of the corneal button.

INTRODUCCIÓN Y OBJETIVO.En la literatura se han utilizado pruebas dinámicas sobre el movimiento de flexoextensióndel tronco para distinguir de manera objetiva entre sujetos sanos y pacientescon dolor lumbar de causa inespecífica. No tenemos constancia de estudio alguno quehaya registrado de manera simultánea los patrones de movimiento lumbo-pélvico y laactividad neuromuscular de la musculatura extensora de la espalda mediante técnicas noinvasivas, y los haya comparado entre distintos grupos de pacientes con dolor lumbar yalteraciones específicas de la anatomía de la región lumbo-pélvica.MATERIAL Y MÉTODOSParticiparon 50 sujetos sin antecedentes de dolor y 50 sujetos con dolor lumbar, de entrelos cuales se obtuvieron los diferentes grupos específicos. Durante ciclos estandarizadosde flexo-extensión del tronco se analizaron, siempre mediante técnicas no invasivas:· el movimiento de la cadera y la columna lumbar, mediante un electrogoniómetro tipoIsotrak que proporciona los grados de flexión.· la actividad eléctrica del músculo erector spinae, mediante un electromiógrafoinalámbrico de superficie tipo MESPEC 4000.Todos los datos registrados estaban sincronizados. Tras procesarlos y normalizarlos, seobtuvieron una serie de variables: actividad mioeléctrica y grados de flexión lumbar yde cadera medios en cada etapa del movimiento; rangos máximos de flexión de tronco,cadera y columna lumbar; tiempos de mantenimiento de la flexión lumbar y de caderapor encima del 90% de su máximo; duración, inicio y final del fenómeno de flexiónrelajacióndel erector espinal; índices de relajación sobre la actividad mioeléctrica de laflexión, la extensión y la flexo-extensión.Se constató la normalidad de las variables mediante el test de Kolmogorov-Smirnov, yla repetibilidad en el día y entre días de las medidas mediante el Coeficiente deCorrelación Intraclase y el Error Estándar de la Medida. Para ello, diez sujetos controlrepitieron las pruebas quince días después. Las diferencias significativas entre losgrupos se obtuvieron mediante los test de t de Student independiente y ANOVA de unfactor, con el test de Bonferroni como prueba post-hoc.RESULTADOSLa mayoría de pacientes mantuvieron el fenómeno de flexión-relajación del músculoerector spinae. Las variables de movimiento de la cadera, en todos los grupos depacientes, fueron similares a las de los sujetos sanos, mientras que la máxima flexióndel raquis lumbar y el tiempo que el raquis lumbar mantiene una flexión mayor del 90%de su máximo fueron menores en todos los grupos de pacientes. En pacientes conhistoria de dolor lumbar inespecífico se observó una alteración del patrón demovimiento lumbar y de la activación del erector spinae: tiempo de relajación muscular,índices de relajación y patrón de actividad mioeléctrica. En pacientes conespondilolistesis, sólo se observaron alteraciones en el patrón de movimiento lumbar,mientras que en pacientes con hernia discal y espondilitis anquilosante, sólo seobservaron alteraciones en la activación del erector spinae.DISCUSIÓNNuestros resultados han mostrado estrategias de movimiento en la flexo-extensión deltronco, específicas de cada alteración anatómica de la región lumbar, y que protegeríanel raquis de las cargas lesivas. Estas estrategias podrían explicarse según la anatomía yneurofisiología de la región lumbo-pélvica, a través del desencadenamiento de reflejosespinales o supraespinales. El estudio de estas estrategias de movimiento, además deaportarnos resultados inéditos en la literatura, puede tener diversas aplicaciones clínicasen campos como el diagnóstico de causas de dolor lumbar, la evaluación de técnicas detratamiento, el seguimiento de la evolución del paciente o la detección de simuladores. / INTRODUCTION: Dynamic tests have been used to distinguish low back pain patientsfrom pain-free subjects. However, we couldn't find studies which compared lumbopelvicmotion and erector spinae activity patterns registered in a non-invasive waybetween different groups of patients with low back pain and specific alterations of thelumbo-pelvic anatomy.MATERIALS AND METHODS: 50 pain-free and 50 low back pain patients, withspecific groups of discal herniation, spondylolisthesis, bilateral sacroiliitis andankylosing spondylitis, were studied.Using non-invasive techniques the patterns of lumbo-pelvic motion andelectromyographic activity of the erector spinae were analyzed during standardizedtrunk flexion-extension cycles. All data were synchronized. Variables: averagemyoelectrical activity and degrees of lumbo-pelvic flexion at each stage of movement;maximum ranges of trunk, hip and spine flexion; time during which the subjects keptlumbar and hip flexion over 90% of their maximum; duration, start and end of erectorspinae relaxation; relaxation indexes of myoelectrical activity at flexion, extension andflexion-extension.Normal distribution and reliability of the variables were confirmed (Kolmogorov-Smirnov test, Intra-class Correlation Coefficient, Standard Error of Measurement).Statistically significant differences were shown by the Student t-test for independentmeasurements and one-factor ANOVA, with Bonferroni test for post-hoc testing.RESULTS: Most patients showed the flexion-relaxation phenomenon of the erectorspinae. Hip motion pattern showed no differences between any of the groups, whereasall patients' maximum ranges of lumbar flexion and times of lumbar flexion over 90%of its maximum in all the patients were lower than controls'. Unspecific low back painpatients showed alterations of lumbar motion and erector spinae activation patterns,whereas spondylolisthesis group showed only alterations of lumbar motion pattern anddiscal herniation and ankylosing spondylitis groups showed only alterations of erectorspinae activation.DISCUSSION: Our results show protective movement strategies during trunk flexionextension,specific of each lumbar anatomy alteration. Such strategies could beexplained according to the anatomy and neurophysiology of the lumbo-pelvic region, bymeans of spinal or supraspinal reflexes. Our method not only brings forwardunpublished data but also could have clinical applications: diagnose of low back paincauses, evaluation of treatment techniques, patients follow-up of simulators detection.

El trasplante de glía envolvente olfatoria (OEG) se ha convertido en una de las estrategias experimentales más prometedoras para reparar los diferentes tipos de lesión de la médula espinal de mamíferos. Estas células promueven la recuperación funcional y la regeneración axonal en ratas adultas con lesiones medulares traumáticas de diferente gravedad. En la primera parte de este trabajo nos hemos centrado en el estudio, in vivo, del efecto de la OEG de rata adulta como terapia reparadora en la fase subaguda (un mes post-lesión) y crónica (cuatro meses) de la lesión medular. Puesto que todavía no se ha encontrado ninguna estrategia reparadora que permita mejorar la situación de los pacientes con lesión de la médula espinal, existen muchos pacientes que se encuentran en fase crónica y que necesitan una terapia promotora de la regeneración en su estado. Además, si esta terapia aplicada en fase crónica llegara a su fase clínica, permitiría a los hospitales el poder realizar los trasplantes pasado un periodo y en el momento en que el paciente ya estuviera estabilizado. Por ello es necesario estudiar si las diferentes terapias que han sido aplicadas con éxito en la fase aguda de la lesión en experimentos animales, conservan su efectividad cuando son aplicadas en la fase crónica. Hemos demostrado que la OEG promueve tanto la recuperación funcional de ratas parapléjicas con sección medular completa, como la regeneración axonal de sus neuronas supraespinales, alcanzando el muñón caudal a la lesión, cuando el trasplante se retrasa hasta cuatro meses post-lesión. La recuperación funcional e histológica fue significativamente superior que en los animales no trasplantados, indicando que al menos durante 4 meses después de la lesión, las neuronas lesionadas conservan la capacidad de responder a estrategias promotoras del crecimiento. Además hemos diseñado un método de trazado que nos permite contabilizar todas aquellas neuronas supraespinales que fueron capaces de regenerar su axón a través de la zona de la lesión y de penetrar en el muñón caudal. Mediante esta técnica de trazado hemos detectado regeneración en neuronas del núcleo rojo, rafe, vestibular, de la formación reticular y del locus coeruleus, todos ellos involucrados en la iniciación y el mantenimiento de la postura durante la locomoción voluntaria. El hecho de poder retrasar los trasplantes de OEG hasta 4 meses sin observar pérdidas en su capacidad promotora de la regeneración, garantiza la disponibilidad del tiempo requerido para la extracción del bulbo olfatorio, la puesta en cultivo, propagación y preparación de la OEG para poder aplicar esta terapia de forma autóloga, permitiendo a su vez la estabilización de los pacientes en el caso de su traslado a la clínica. Además hemos diseñado un sistema de estabilización de la columna vertebral mediante puentes fabricados con cemento dental. Estos puentes resultaron ser inocuos, disminuyeron el porcentaje de animales que desarrolló escoliosis y promovieron cierto grado de recuperación funcional espontánea en animales que no recibieron trasplante de OEG. Sin embargo, esta recuperación siempre fue significativamente inferior a la que se observó en animales que recibieron trasplantes de OEG. Finalmente, otro de los objetivos fundamentales de este trabajo ha sido el estudio in vitro de la OEG de primate no-humano, por su mayor proximidad filogenética a los humanos, y su comparación con la de roedor, cuya capacidad promotora de la regeneración ya ha sido demostrada. En este trabajo se han presentado evidencias que muestran por primera vez, que la OEG se puede obtener a partir de bulbos olfatorios de primates adultos mediante bulbectomías unilaterales, y que un solo bulbo olfatorio proporciona suficiente OEG fenotípicamente adecuada para una terapia celular segura, mediante trasplantes autólogos o heterólogos en primates. / Olfactory bulb Ensheathing Glia (OB-OEG) promote functional recovery and histological repair when transplanted immediately after spinal cord injury. We have checked in rats, if OB-OEG transplantation is also efficient when transplanted at subacute and chronic injury stages after complete spinal cord transection. OB-OEG were grafted at either one (subacute) or four (chronic) months post-lesion. During seven months following transplantation, rats from both OEG-transplanted groups presented a significant progressive improvement of motor function in the climbing test, not observed in non-grafted animals. OB-OEG grafts were equally efficient at subacute or chronic stages. Quantitative analysis by peroxidase tracing revealed that, in transplanted animals, axons of brainstem spinal cord-projecting neurons grew beyond the caudal stump border. Axons from neurons located in red nucleus, reticular formation, locus coeruleus, vestibular and raphe nuclei crossed the scar and regenerated distally in the spinal cord. The number of regenerating neurons was significantly higher in every transplanted group (subacute and chronic) than in the non-transplanted one, but transplanted groups did not differ one another. A positive linear correlation was found between the functional recovery of the animals and the number of brainstem regenerating neurons. OB-OEG transplantation can be delayed up to four months. This provides enough time to obtain and grow OEG for autologous use and also for patient stabilization before transplantation. To provide insight into the feasibility of OB-OEG use in human therapy, we studied in other close primates the suitability of these cells for this purpose. We demonstrated that OEG can be obtained from olfactory bulbs of adult macaca monkeys. However, unlike from rodent, primate OB-OEG are non-senescent, exhibit longer lifespan, are less sensitive to culture shock, and preserve for 2.5 months in vitro a phenotype suitable for grafting. One single macaca olfactory bulb gives in short-term enough OEG to guarantee autologous transplantation at the acute stage, and moreover, after long-term cultures may yield 20 thousand million OEG for storage in banks of cells for further use. Therefore, adult olfactory bulbs from macacas constitute a reliable source of OEG for cell therapy, and autologous transplantation of these cells is a viable approach in adult primates.

El avance más importante producido en los últimos años para la comprensión y tratamiento del dolor ha sido el descubrimiento de un sistema neuronal endógeno de analgesia. Basbaum y Fields (1984) elaboraron una hipótesis acerca de cuál sería la estructura de este circuito endógeno de modulación de la información nociceptiva, que estaría formado por la sustancia gris periacueductal, varios núcleos de la porción rostral y ventromedial del bulbo (núcleo del rafe magno), y el asta posterior de la médula espinal. Han sido numerosos los estudios aparecidos en la literatura que han confirmado dicha hipótesis, aunque con la incorporación sucesiva de nuevos centros nerviosos supraespinales al circuito antinociceptivo original: el núcleo central de la amígdala, el núcleo del rafe dorsal, el locus coeruleus, el núcleo cuneiforme, la porción lateral del núcleo parabraquial (LPB), el área A7, el núcleo del tracto solitario, etc. De entre todos ellos, elegimos como objeto de estudio de la presente tesis doctoral la LPB, por ser la estructura central de los denominados circuitos parabraquiales, responsables de los componentes emocional, autonómico y neuroendocrino del dolor, y por estar estratégicamente situado, desde el punto de vista anatómico, para influir tanto en la transmisión como en el control del dolor. Concretamente, decidimos investigar el papel que la LPB podría jugar en el mecanismo de transmisión de estímulos dolorosos distintos, como el somático superficial y el visceral, así como, en el mecanismo de acción de diferentes fármacos analgésicos, como el metamizol y la morfina, utilizando como marcador de actividad neuronal la detección inmunocitoquímica de la proteína Fos, codificada por el proto-oncogén c-fos. De este modo, los objetivos que nos planteamos fueron los siguientes: 1) Evaluar el efecto que sobre la expresión de Fos en la LPB tendría la aplicación de un estímulo nociceptivo tanto somático superficial (test de la formalina) como visceral (test de las contracciones abdominales); 2) Evaluar el efecto que sobre la expresión de Fos en la LPB tendría la aplicación de un estímulo antinociceptivo, tanto opiáceo (10 mg/kg de morfina) como no opiáceo (500 mg/kg de metamizol); 3) Evaluar el efecto que sobre la expresión de Fos en la LPB tendría la aplicación de un estímulo antinociceptivo (morfina o metamizol) de forma previa a la aplicación de un estímulo nociceptivo (somático superficial o visceral). Como animal de experimentación empleamos ratas macho de la cepa Sprague-Dawley. Toda la experimentación se llevó a cabo siguiendo las recomendaciones éticas de Zimmermann (1983) para experimentación sobre dolor en animales conscientes, siendo todo el procedimiento aprobado por el Comité Ético de la Facultad de Medicina y Odontología de la Universitat de València. Del análisis de nuestros resultados podemos concluir que: 1) La LPB participa en el circuito nociceptivo somático superficial, principalmente por medio de los subnúcleos superior (slPB) y dorsal (dlPB); 2) La LPB participa en el circuito nociceptivo visceral, principalmente por medio del subnúcleo externo (elPB); 3) La LPB participa en el mecanismo de acción del metamizol, principalmente por medio de los subnúcleos externo (elPB) y central (clPB); 4) La LPB no participa en el mecanismo de acción de la morfina, al menos mediante la expresión del proto-oncogen c-fos. / One of the most important advances for the comprehension and treatment of the pain has been the discovery of an endogenous circuit of modulation of the nociceptive information. Recently, has been involved to the lateral parabrachial nucleus (LPB) in the above mentioned circuit, though its role in the transmission and / or modulation of the pain is not sufficiently clear. LPB is strategically placed, from the anatomical point of view, to influence both the transmission and the control of the pain. In the present study, we decide to investigate the role that the LPB might play in the mechanism of transmission of painful different stimuli, as the somatic superficial one (test of the formalina) and the visceral one (test of the abdominal contractions), as well as, in the mechanism of action of different analgesic drugs, as the metamizol (500 mg/kg) and the morphine (10 mg/kg), using the immunocytochemical detection of the protein Fos as a marker of neuronal activity. We used male Sprague-Dawley rats as experimental animal. We can conclude from our results that: 1) LPB plays a role in the somatic nociceptive circuit, principally by the superior (slPB) and dorsal (dlPB) subnucli; 2) LPB plays a role in the visceral nociceptive circuit, principally by the external subnucleus (elPB); 3) LPB plays a role in the mechanism of action of the metamizol, principally by the external (elPB) and central (clPB) subnucli; 4) LPB does not play a role in the mechanism of action of the morphine, at least by the expression of the c-fos proto-oncogen.

La composición proteica de los venenos de serpiente refleja el hecho de que éstos se originaron en etapas tempranas de la evolución de los reptiles escamosos, por reclutamiento y transformación por evolución acelerada de un número reducido de proteínas endógenas. Los venenos de los vipéridos poseen un arsenal de proteínas capaces de degradar la matriz extracelular e interferir en la cascada de coagulación, el sistema hemostático y la reparación de tejidos. Los proteomas de las serpientes Viperinae caracterizados hasta la fecha están constituidos por isoformas de unas pocas familias de proteínas, cuya abundancia relativa presenta gran variación interespecífica. Las proteínas mayoritarias de los venenos de las víboras y serpientes de cascabel se agrupan en enzimas (proteasas dependientes de serina, metaloproteasas dependientes de Zn2+ del grupo de las reprolisinas, isoenzimas del grupo II de fosfolipasas A2, L-amino acido oxidasa) y proteínas sin actividad enzimática (proteínas similares a lectinas dependientes de Ca2+ y disintegrinas). Las disintegrinas (40-100 AAs) son liberadas al veneno por procesamiento proteolítico de las metaloproteasas PII y actúan inhibiendo la adhesión de las integrinas a sus ligandos. Se clasifican en función de su longitud y número de enlaces disulfuro en monoméricas largas (~90 AAs, 7 SS), medias (~70 AAs, 6 SS) y cortas (~ 40 AAs, 4 SS) y diméricas (subunidades de ~ 63 AAs, 2 SS Inter.- y 4 SS intracatenarios). El objetivo general de esta Tesis Doctoral ha sido profundizar en el estudio de las bases moleculares de la diversificación estructural y funcional de la familia de las disintegrinas. Partimos de un esquema evolutivo basado en la pérdida sucesiva de enlaces disulfuro ("ingeniería de enlaces disulfuro") y la acumulación de mutaciones ("química combinatorial") en el bucle de inhibición de integrinas. La aplicación de técnicas proteómicas nos ha permitido determinar la composición proteica del veneno crudo de Sistrurus m. barbouri, Echis ocellatus y Bitis arietans. Para ello los venenos se fraccionaron por RP-HPLC y cada una de estas fracciones fue analizada por SDS-PAGE, secuenciación N-terminal, determinación de masa molecular, contenido en cisteínas libres, enlaces disulfuro y huella peptídica por espectrometría de masas MALDI-TOF, además de secuenciación de novo por espectrometría de masas en tándem (MS/MS). Así pudimos adjudicar cada pico obtenido tras la separación a 10-12 familias de proteínas conocidas. Con el objeto de comparar proteoma y transcriptoma e investigar la posible presencia de intermediarios evolutivos de las familias de disintegrinas no expresados en el veneno se han analizado librerías de ADNc de glándulas de venenos de Bitis arietans (Ba) y Echis ocellatus (Eo). En el caso de Ba identificamos un producto que presenta un dominio tipo disintegrina ECD con 16 cisteínas, conservando el enlace entre las CysXIII-CysXVI, pero que carece del dominio rico en cisteínas típico de las metaloproteasas PIII, lo cual indica que la deleción del dominio rico en Cys ocurrió con anterioridad a la pérdida del enlace disulfuro C13-C16. En Eo amplificamos precursores de disintegrinas diméricas, los cuales pertenecen a la clase "mensajeros cortos" (carecen del dominio metaloproteasa). La existencia de mensajeros que codifican para disintegrina no expresados en el veneno podría indicar la existencia de "fondos de reserva genómicos" de eventual relevancia para la adaptación a ecosistemas cambiantes. Además, mediante el análisis de la organización genómica de disintegrinas de las diferentes familias estructurales, hemos demostrado que la pérdida sucesiva de intrones forma parte de un mecanismo evolutivo de diversificación de las disintegrinas que conlleva una evolución acelerada y una minimización de las estructuras génica y proteica. / Venoms of Viperidae and Crotalidae snakes contain proteins that interfere with the coagulation cascade, the haemostatic system and tissue repair. The general aim of this thesis was elucidate the molecular details of the mechanisms leading to snake venom toxin diversification. We describe the application of the proteomic characterization of Echis ocellatus (Eo), Bitis arietans (Ba) and Sistrurus m. barbouri (Smb) venoms. Their protein composition was analyzed by RP-HPLC and SDS-PAGE of each separated protein fraction. The molecular mass and the number of cysteine residues/disulphide bonds were determined by MALDI-TOF mass spectrometry. Selected protein bands were subjected to in-gel tryptic digestion, peptide mass fingerprinting and de novo sequencing by MS/MS. Our results show that snake venoms are composed of proteins belonging to a few protein families, including enzymes (serine proteinases, Zn2+-dependent PI-PIV metalloproteases, group II phospholipase A2 isoenzymes) and proteins with no enzymatic activity as disintegrins, which are potent antagonist of integrins. To understand the genomic basis of the accelerated evolution of disintegrins we have undertaken the analysis of cDNAs encoding disintegrins from venom gland libraries of Eo and Ba and the genomic organization of disintegrin genes. The cDNA sequences coding for dimeric disintegrins lack the metalloproteinase domain and belong thus to the short-coding class. Analysis of two distinct messengers coding for the short disintegrin ocellatusin strongly argues for a common ancestry of short- and dimeric disintegrin subunits. We also report the cloning and sequence analysis of a novel and unique ECD-disintegrin-like domain from Ba. It contains the 16 cysteine residues that are conserved in all PIII disintegrin-like domains but lacks the cysteine-rich domain. On the other hand, comparison of the exon-intron organization revealed that the evolutionary pathway leading to the diversification of disintegrins also involved the miniminization of the gene organization by the successive removal of introns.

Entre las múltiples y variadas implicaciones fisiopatológicas del Estrés Oxidativo, lostrastornos cardiovasculares son, sin duda, uno de los objetivos prioritarios y motivo deinterés de un gran número de investigadores biomédicos.Uno de los principales factores de riesgo es el desarrollo de una serie de enfermedadesfrecuentes en nuestra población como son la hipertensión arterial y las dislipemias.Éstos trastornos, tienen una vinculación más o menos estrecha, directa o indirecta con elfenómeno que conocemos como estrés oxidativo y los 3 tipos de patologías poseenaumentados los niveles de EO de manera que se potencia el riesgo de aparición de eventoscardiovasculares.Objetivo de este estudio es comparar los niveles de EO en las diferentes patologíascardiovasculares seleccionadas (HTA con y sin Síndrome Metabólico asociado, HF y HFC)midiendo la respuesta de las células mononucleares frente al EO crónico a través de lamedida de los niveles de ARNm de las actividades antioxidantes en cada una de ellas.Dicho estudio comparativo se va a realizar mediante el análisis de los siguientesparámetros oxidativos en orina, plasma y en células circulantes de los grupos seleccionadosy el grupo control:1.- Estudio de los productos de oxidación, marcadores de EO y metabolitos relacionados(GSH, GSSG, 8-oxo-dG nuclear, mitocondrial y urinaria, MDA, proteínas carboniladas yniveles de NO3/NO2 .2.- Determinación de la actividad de los principales sistemas antioxidantes y prooxidante(SOD Cu-Zn y Mn, Cat, GPx, GSR y XO) .3.- Cuantificación de los niveles de ARNm por RT-PCR cuantitativo a tiempo real, de losgenes que codifican dichas actividades enzimáticas, además de OGG1 y G6PDH.CONCLUSIONES· 1) En las tres patologías, HTA, HF y HFC, los resultados obtenidos sugieren que elEO representa un mecanismo común y subyacente en la patogenicidad de dichosprocesos y posiblemente contribuya al desarrollo de complicacionescardiovasculares, si bien, el mecanismo bioquímico-molecular responsable delproceso oxidativo presenta características diferenciales entre ellas, así como laintensidad de respuesta al EO.· 2) Los niveles elevados de EO en estas patologías no dependen exclusivamente deun aumento en su producción ya que existe una menor actividad antioxidante. Ladisminución de los mecanismos antioxidantes se debe principalmente a:- Actividad reducida de los genes antioxidantes y del sistema GSH.- Menores niveles de ARNm, disminuyendo así su capacidad de producir enzimasy sistemas protectores frente a EO.· 3) Los pacientes de HTA sin tratamiento se encuentran peor protegidos frente aEO que los controles, a pesar de la activación de algunos sistemas antioxidantescomo el sistema Tiorredoxina y la enzima Manganeso Superóxido Dismutasa.· 4) Los pacientes de HTA con y sin síndrome metabólico asociado no presentandiferencias significativas entre sí, lo que nos confirma que es la HTA el factorasociado al estrés oxidativo, siendo indiferentes las otras características quedeterminan el diagnóstico de síndrome metabólico.· 6) La hipertensión arterial progresa con una marcada oxidación del materialgenético que se verifica por el aumento en la producción de la base modificada ymutagénica 8-oxo-dG como resultado del estrés oxidativo y de la disminución deenzima reparadora OGG1 en las células mononucleares de los pacientes hipertensos.· 7) De los marcadores analizados, la liberación de 8-oxo-dG en orina es el parámetromás representativo del estrés oxidativo en la hipertensión arterial.· 8) Los tres modelos de EO crónico analizados poseen un aumento en los niveles deEO pero distinta intensidad en su respuesta. Los pacientes se encuentrandesprotegidos frente al EO. / The main aim of this study is to compare the EO levels in some different cardiovasculardiseases, previously selected (control, HTA with and without an associate metabolicsyndrome, HF and HFC), by measuring the response of mononuclear cells against thechronicle EO through the RNAm level in the antioxidant activity of each one.This comparative study is carried out in different groups by the analyse of differentoxidative parameters in urine, plasma and circulated cells.1.- Study of oxidation products , EO markers and related metabolites.2.- Main antioxidant and prooxidant systems activity determination.3.- RNAm level quantification by a real time quantitative RT-PCR.CONCLUSIONS:1.- The results of the three pathologies (HTA, HF and HFC) propose that EO represents acommon and underlying mechanism in their pathologies process and probably itcontributes to develop cardiovascular complications, although the responsiblebiochemistry-molecular mechanism of the oxidative process shows many differentfeatures between them.2.- The high levels of EO in these pathologies do not exclusively depends on an increaseof its production because the oxidant activity is lower.3.- HTA patients without a treatment are worse protected against EO that the controledones, despite of the activation of some antioxidant systems like Tiorredoxine Systemand SOD Mn enzyme.4.- HTA patients with and without the associated metabolic syndrome do not showgreat differences between them, so it confirms that HTA is the associated factor to theoxidative stress.5.- The High blood pressure progresses with a high oxidation of the genetic material,that it is verified by the increase of the production of modify base and mutagenig 8-oxo-dG as a result of oxidative stress and the decrease of repairing enzyme OGG1 inthe mononuclear cells.6.- In analysed markers, the 8-oxo-dG liberation in urine is the most representativeparameter of oxidative stress in high blood pressure.7.- The three EO chronicle models analysed have an increase on EO level but differentintensity in their response so patients are unprotected against EO.

La pancreatitis aguda (PA) es un proceso inflamatorio del páncreas que puede afectartambién a otros órganos más distantes y que puede cursar como una forma leve ocomo una forma grave con aparición de complicaciones locales o sistémicas quepueden conducir al desarrollo de un fallo multiorgánico. En la PA se produce unainflamación local como fenómeno inicial, observándose la acumulación de neutrófilos,macrófagos y mastocitos en el páncreas; en cambio, existe poca información sobre laparticipación del eosinófilo en este proceso.El proceso de hematopoyesis en la médula ósea, así como la atracción y la activacióndel eosinófilo en los tejidos está mediado por citocinas y quimiocinas, moléculasmedidadoras liberadas por los leucocitos, células endoteliales y algunas célulastisulares, siendo la citocina IL-5 el principal factor de diferenciación y la quimiocinaeotaxina el factor quimiotrayente más selectivo del esonófilo.Nuestro estudio se propone evaluar la participación del eosinófilo en la pancreatitisaguda mediante el análisis de eotaxina e IL-5, citocinas implicadas en ladiferenciación, activación y migración del eosinófilo, a lo largo de la evolución de lapancreatitis aguda.Nuestros resultados muestran que el número de eosinófilos en sangre se incrementaprogresivamente desde el día del ingreso hasta el mes del episodio agudo, aunque nosupera los límites considerados normales. La concentración de IL-5 en suero seincrementa en los primeros días, recuperando el valor control a los 5 días del ingreso,comportamiento similar al de otras citocinas proinflamatorias, lo cual podría indicar queefectivamente se está produciendo una activación de la hematopoyesis del eosinófiloen el momento agudo. Sin embargo, la concentración de eotaxina se mantiene similaral control hasta pasados 2 días del ingreso, momento en el que inicia su incremento,que es máximo al mes del episodio agudo. Estos resultados sugieren la activación deleosinófilo en el tejido y su papel inmunoregulador en el proceso inflamatorio de lapancreatitis aguda. / Acute Pancreatitis (AP) is a pancreas inflammatory process that can affect to otherdistant organ. AP exhibits a wide variability in its severity, in most cases the course isfairly benign (mild AP) while in others it may progress to a more severe form (severeAP) with local complications or systemic -inflammatory response which can led tomultiple organ dysfunction syndrome. Local inflammatory response is an early event inAP and has been revealed neutrophils, macrophages and mast cells infiltrated inpancreas; however, there is no information about eosinophil participation in thisprocess.Eosinophil development from the bone marrow, trafficking into tissues and activationare mediated by a regulated process involving cytokines and chemokines, chemicalmediators secreted from leukocytes, endotelial cell and tissue resident cells. IL-5cytokine is the most selective for eosinophils differentiation and eotaxin has aselectively chemoattractant activity that regulates eosinophil trafficking.There are no studies about eosinophils role in inflammatory process of acutepancreatitis. Our study try to evaluate eosinophil responsability through the eosinophilsnumber quantification and eotaxin and IL-5 determination, cytokines involved indifferentiation, activation and survival eosinophil.Results show a progresive increase in eosinophils number from inclusion to monthfrom acute onset, whereas eosinophils number remain in normal range. Serum IL-5concentration increases at day 1 to 4, and become in normal values at day 5 after theinclusion, similar fact to other proinflammatory cytokines. This results are in line witheosinophil hematopoiesis activation in early phase. However, eotaxin concnetration issimilar to control from day 1 to day 2, and increases from day 4 to month. This resultssuggest eosinophil activation in tissue and an inmunoregulatory role in inflammatoryprocess of acute pancreatitis.