To study biological systems through the specific labeling of biomolecules by chemical reactions has grown interest in the last few years. In order to perform chemical reactions in living systems, it is essential that these processes fulfill certain criteria: 1) to proceed under physiological conditions; 2) to be high yielding and show fast reaction rates; 3) to require simple reaction conditions, and 4) to be biocompatible with the myriad of functionalities within biological systems. Along this line, to incorporate an azide functionality (chemical reporter) in the biomolecule of interest allows its selective labeling through 1,3-cycloadditions with terminal (copper-catalyzed) or cyclic alkynes. Such reactions are termed as ‘click’ reactions and are very used to label a wide number of biomolecules. Sphingolipids (SLs), a large and diverse class of lipids, are structural components of eukaryotic cell membranes. Besides its structural roles, it has been discovered that some sphingolipids are bioactive molecules which regulate cellular responses such as proliferation, differentiation, apoptosis and cell death. Moreover, sphingolipids dynamically assemble with sterols to form lipid rafts which are intimately associated with cell signaling. All these discoveries have grown interest in the development of molecular and chemical tools to study the metabolism and localization of these molecules. In the present Doctoral Thesis, we designed and synthesized various sphingolipid probes, bearing an azide functionality at omega and C1 positions of sphingoid base. The sphingolipid probes possessing an azide at omega position also comprised variations at C1 and as well as different acyl chains in the amide linkage. This family of omega-azidosphingolipids turned out to be non-cytotoxic and to metabolize as natural sphingolipids in different cell lines. Likewise, we developed new methodologies to study sphingolipid metabolism and intracellular localization based on azide-alkyne cycloaddition reactions. First of all, we developed a new approach for the quantitative analysis of sphingolipids, based on the labeling of different populations of sphingolipids with various azadibenzocyclooctyne-derived tags through click reactions. We optimized the click reaction in cell extracts containing omega-azidosphingolipids, and next we labeled cell extracts with the various cyclooctyne tags. We were able to detect a large number of sphingolipid triazoles, arising from the click reactions, by UPLC-TOF with high sensitivity. Moreover, we developed a method for the labeling of omega-azidosphingolipids in live cells through the click reaction with a fluorescent dye. We first designed and prepared the fluorescent dye, based on an azadibencyclooctyne moiety linked to a fluorescein unit. We next evaluated the internalization of this dye in cell membranes, analyzing cellular fluorescence by flow cytometry. Finally, we labeled cells with the fluorescent dye, and we observed an increase of fluorescence in cells which had been pre-treated with omega-azidosphingolipids. Moreover, we nicely visualized the resulting fluorescent click adducts by confocal microscopy. In the last application of these sphingolipid probes, we developed a method for the visualization of fluorescent ceramides in artificial lipid membranes. We incorporated omega-azidoceramide and C1-azidoceramide probes into artificial membranes and next labeled them using a fluorogenic click reaction with a non-fluorescent naphtalimide. The resulting click adducts, which became fluorescent, were nicely visualized by confocal microscopy. This methodology might be an important approach for the localization of azidoceramides in membranes of live cells by fluorescence microscopy. / Los esfingolípidos son una amplia y diversa familia de lípidos, que cumplen papeles esenciales como componentes de las membranas celulares. Además, recientemente se ha descubierto que son moléculas bioactivas que actúan como mensajeros secundarios en la regulación de funciones celulares como proliferación, diferenciación, adhesión y muerte celular. Por otro lado, los esfingolípidos se asocian dinámicamente al colesterol, formando dominios lipídicos. Estos dominios están relacionados con un gran número de funciones celulares. Muchos procesos patológicos se pueden curar o prevenir actuando directamente sobre el metabolismo de los esfingolípidos y/o su interacción con sus dianas terapéuticas. Por este motivo, el diseño y síntesis de sondas lipídicas para el estudio del metabolismo y localización celular de estas especies es de gran interés. La funcionalidad azida es un chemical reporter que reacciona con alquinos terminales y cíclicos mediante cicloadiciones 1,3-dipolares. Mientras que la reacción con alquinos terminales requiere catálisis de cobre, con alquinos cíclicos no es necesaria. Estas reacciones, denominadas reacciones click, se caracterizan por ser selectivas, biocompatibles, rápidas, eficientes y, además, tienen lugar en condiciones fisiológicas. Son ampliamente utilizadas para el estudio de sistemas biológicos. En esta tesis doctoral, se ha diseñado y sintetizado una familia de esfingolípidos marcados (“sondas”) con una funcionalidad azida en la posición omega y C1. Se han realizado modificaciones en la posición C1 y en el enlace amida para obtener diferentes derivados. Con las “sondas” mencionadas previamente, se han desarrollado diferentes aplicaciones basadas en el uso de reacciones click. En primer lugar, se ha desarrollado una metodología para el análisis simultáneo de diferentes poblaciones de esfingolípidos, marcadas por reacción click con diferentes ciclooctinos. En segundo lugar, se ha diseñado y sintetizado un azadibenzociclooctino con una unidad de fluoresceína, para su uso en la conjugación de omega-esfingolípidos en células vivas. Para ello, se estudió la internalización de dicho ciclooctino fluorescente en membranas celulares, analizando cuantitativamente la fluorescencia mediante citometría de flujo. Seguidamente, células pre-tratadas con algunos de los omega-esfingolípidos fueron conjugadas con el ciclooctino fluorescente. La fluorescencia fue analizada por citometría de flujo y los omega-esfingolípidos conjugados fueron visualizados mediante microscopía confocal. Por último, también se ha desarrollado un método para la visualización de ceramidas en membranas artificiales mediante reacciones click fluorogénicas. Los aductos fluorecentes resultantes de la reacción click fueron visualizados mediante microscopía confocal.

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El verdadero impacto del tratamiento antivírico en pacientes críticos no estaba establecido en el inicio de la pandemia por gripe A (H1N1) del 2009 debido a la falta de estudios aleatorizados en este tipo de pacientes. Por ello, las autoridades sanitarias establecieron un conjunto de directrices y estrategias encaminadas a optimizar y estandarizar la terapia antivírica en los pacientes críticos que incorporaban la evidencia y conocimientos disponibles hasta ese momento. Se debía administrar tratamiento antivírico lo antes posible a todas las personas que requieran hospitalización, que tuvieran una enfermedad progresiva grave o que cursara con complicaciones, y esto debía hacerse con independencia del estado de salud previo o de los antecedentes de vacunación. Oseltamivir a dosis altas (150 mg/12 h) y con duraciones de tratamiento superiores a 10 días debía administrarse a pacientes con neumonía, especialmente en obesos (IMC>30) argumentando la existencia de mayor volumen de distribución. También se aconsejaba esta dosificación a pacientes graves, sobre todo si requerían ventilación mecánica invasiva. Estas pautas fueron aplicadas según decisiones de cada centro y de cada prescriptor con lo que existió una brecha entre las recomendaciones emitidas y la práctica habitual que tuvo lugar, dando lugar a una falta de actitud terapéutica homogénea y por ello un bajo grado de adherencia a los protocolos terapéuticos que pudo condicionar el pronóstico del paciente. 2 Objetivos La evaluación y comparación del grado de adherencia a los protocolos de tratamiento emitidos por las autoridades sanitarias durante la pandemia de gripe A (H1N1) del 2009 y del periodo post pandémico del 2010-2011 es por tanto el objetivo principal de esta trabajo. A su vez, son también objetivos de este estudio la descripción y análisis de los factores asociados a mortalidad durante la pandemia de gripe A (H1N1) 2009 y el periodo postpandémico del 2010-11 y la repercusión económica de la no adherencia al tratamiento recomendado. Material y métodos Análisis secundario a un estudio prospectivo, observacional y multicéntrico de dos cohortes de pacientes adultos con casos confirmados de gripe A (H1N1) 2009 e ingresados en unidades de críticos (UCI) de 148 hospitales españoles. Resultados Fueron recopilados los resultados de 1058 pacientes con datos completos e ingresados en las UCI con infección confirmada de gripe A (H1N1) e insuficiencia respiratoria graves, 661 (62,5%) del periodo pandémico del 2009 y 397 (37,5%) del periodo postpandémico del 2010-11. Los pacientes que ingresaron en las UCI españolas durante estos dos periodos, recibieron tratamiento antivírico empírico en un 72% y no fueron observadas diferencias estadísticamente significativas entre ambos periodos. Para la pandemia de gripe A (H1N1) del 2009 la media de días que transcurrieron desde el inicio de los síntomas al inicio del tratamiento antivírico fue de 4,7 (2,9) días, durante el periodo post pandémico del 2010-11, este tiempo fue significativamente superior 5,7 (3,6) días. Tan sólo un 23,9 % de los pacientes del periodo pandémico y un 15,8 % de los pacientes del periodo post pandémico del 2010-11 recibieron el tratamiento antivírico precoz (≤ 48 h del inicio de la sintomatología), periodo recomendado en las guías de tratamiento. La adherencia global en el estudio se situó en el 41,6% no existiendo diferencias estadísticamente significativas entre ambos periodos. Para el grupo de pacientes con criterios de mayor gravedad, existió una mayor adherencia a los protocolos de tratamiento durante el periodo de la pandemia del 2009 (54,4% vs. 36,4% p>0,001). Por el contrario para el grupo de pacientes, sin requerimientos de dosis y duración de 3 tratamiento elevadas, el grado de adherencia mejoró durante el 2010-11 (41,5% vs. 25,9% p=0,003). El total de pacientes fallecidos durante los dos periodos fue de 263 (24,9%). La mortalidad fue significativamente mayor en los pacientes del brote estacional del 2010-11, 119 (30%) vs. 144 (21,8%) en la pandemia del 2009 (p<0.001). El análisis multivariante confirmó que la enfermedad hematológica y la gravedad marcada por el APACHE II, fueron factores independientemente asociados a una peor evolución en ambos periodos evaluados. La adherencia al tratamiento fue un factor protector de muerte en ambos periodos y el tratamiento antivírico precoz lo fue también durante el periodo pandémico. El análisis económico de minimización de costes para el grupo de pacientes sin criterios de gravedad establece el coste global de la “No Adherencia” en 559.875 €. Esta cifra supone que un 21,58% de los costes globales sanitarios calculados durante la pandemia del 2009 y el periodo post pandémico podrían haber sido ahorrados mediante la adherencia a los protocolos. Por el contrario en el grupo de pacientes con criterios de gravedad, el análisis de coste efectividad establece el coste global de la “Adherencia” en 3.081.510 € y el coste-efectividad incremental en 71.190€. Conclusiones La adherencia al protocolo de tratamiento para los pacientes graves infectados por el virus de la gripe A (H1N1) fue globalmente baja aunque similar en ambos periodos evaluados. La falta de adherencia y el retraso en el inicio del tratamiento antivírico fueron variables asociadas a mortalidad en pacientes ingresados en UCI infectados por el virus de la gripe A (H1N1). Para el conjunto de pacientes sin criterios de gravedad, el no seguimiento del protocolo de tratamiento supuso un coste adicional del 21,58% en los costes globales sanitarios de ambos periodos. Para el grupo de pacientes mas graves, el coste-efectividad incremental de la adherencia al tratamiento por paciente se sitúa en 10.170 € por paciente

La tesi gira a l’entorn del estudi del quàdruplex de guanina i la síntesis i avaluació de lligands selectius a aquestes estructures. En el capítol 1 es descriu una metodologia per obtenir estructures de G‐quàdruplex molt estables. Aquesta metodologia permet introduir modificacions en una sola cadena o modificar la polaritat d’una cadena respecte les altres tres. En el segon capítol es presenta una revisió de les metodologies d’espectroscòpia de masses aplicades als G‐quàdruplex i s’estudia la formació de G‐quàdruplex induïda per co‐dissolvents. En el tercer capítol es descriu el complex format pel G‐quàdruplex telomèric humà amb unes acridines en avaluació preclínica, així com els estudis estructurals i d’estabilitat realitzats per RMN i per dinàmica molecular. Els altres capítols formen la part de la tesi dedicada al desenvolupament de nous lligands selectius a estructures de G‐quàdruplex amb interès biològic. Així doncs, en el quart capítol es descriu una nova estratègia per obtenir oligòmers d’acridina amb un esquelet de PNA i s’estudia les seves propietats d’unió a diverses estructures de DNA així com les seves propietats antitumorals. En el capítol 5 es determinen les propietats d’unió al DNA d’una sèrie completa d’oligòmers d’acridina i/o quindolina. També es realitza un estudi per RMN i per dinàmica molecular del complex format pel dímer de la quindolina i un G‐quàdruplex. En l’últim capítol es descriu un nou mètode per obtenir uns derivats d’acridina DACA, un inhibidor de la topoisomerasa I/II. Es van realitzar experiments de diàlisis competitiva, RMN i de viabilitat cel•lular per determinar‐ne les seves propietats d’unió al DNA a més de les seves propietats antiproliferatives. / The thesis is focused on G-quadruplex and the design, synthesis and evaluation of G-quadruplex ligands. In the first chapter we describe a method to prepare highly stable G-quadruplexes by linking four G-rich DNA strands to form a monomolecular G-quadruplex. This approach allows the introduction of specific modifications in only one of the strands or to prepare a quadruplex where one of the strands has a different polarity. In the second chapter we survey the state of the art mass spectrometry methodologies for investigating G-quadruplexes, and illustrated them with a new study on a simple model system: the dimeric G-quadruplex of the 12-mer telomeric DNA sequence d(TAGGGTTAGGGT). We also studied the G-quadruplex formation and the structural changes induced by organic co-solvents. In the third chapter, we developed the structural models of the complexes with the telomeric DNA G-quadruplex with 9-amino acridines based on NMR measurements and further examined by molecular dynamics simulations and free energy calculations. The others chapters are based on the development of new G-quadruplex ligands. Specifically we described the synthesis of oligomers containing two or three acridine units linked through 2-aminoethylglycine using solid-phase methodology. The cytotoxic properties and DNA affinity of these compounds were studied by cell viability and competitive dialysis studies. The DNA binding properties of 4-aminoproline oligomers functionalized with one, two or three units of acridine and/or quindoline have been analyzed by competitive dialysis in chapter five. A NMR/molecular dynamics study was performed on G-quadruplex sequence and the dimer carrying two quindolines. A model of the complex with the telomeric DNA quadruplex was also described. Finally, several acridine derivatives were synthesized and their anti-proliferative activity was determined. The DNA binding properties of these derivatives were analyzed by competitive dialysis and NMR titrations.

Esta Tesis Doctoral se presenta como Compendio de publicaciones. Los capítulos en los que se ha dividido la presente Tesis son los siguientes: Capítulo 1 – parte A: Enantioselective, Protecting Group-Free Synthesis of 1S-Ethyl-4-Substituted Quinolizidines Se ha descrito una síntesis enantioselectiva que no implica grupos protectores para acceder a la quinolizidina clave 6 a partir de la lactama bicíclica derivada de fenilglicinol 1. La adición de un reactivo organometálico a 6 ocurre de manera estereoselectiva para conducir a las quinolizidinas 1S-etil-4-sustituidas 4-epi-207I y 7-9. Siguiendo una secuencia sintética análoga, se preparó el compuesto 9a-epi-6. Sin embargo, la adición de reactivos de Grignard al compuesto 9a-epi-6 no ocurre de manera estereoselectiva. Capítulo 1 – parte B: A practical procedure for the removal of the phenylethanol moiety from phenylglycinol-derived lactams Las lactamas bicíclicas no racémicas derivadas de fenilglicinol se han relevado como intermedios clave en la preparación de compuestos nitrogenados enantiopuros. En este capítulo se describe la eliminación del inductor quiral de piperidonas sustituidas utilizando aire u oxígeno en medio básico. Capítulo 2: Synthesis of triheptanoin and formulation as a solid diet for rodents En el presente estudio se describe la síntesis eficaz de triheptanoina de elevada pureza a partir de glicerol y ácido heptanoico, en presencia de carbono sulfonado como catalizador. La triheptanoina se formula como un sólido estable para que constituya la base de una dieta cetogénica mediante la combinación de custro gentes de formulación comerciales; dos tipos de sílica, celulosa microcristalina y talco. La adecuación de la dieta se prueba en ratones C57BI/6 en un periodo de 15 días, comparando el estado general y el cambio de peso corporal. Capítulo 3: Toluene dioxygenase (TDO) mediated oxidation of halogen-substituted benzoate esters Una serie de esteres benzoicos metílicos sustituidos en o-, m- y p- se han sometido a hidroxilación enzimática via fermetación con E. coli JM109 8pDTG601A). Solo se metabolizaron los benzoatos sustituidos en orto. El 2-fluorobenzoato de metilo produjo regioselectivamente solo un diol mientras que el 2-cloro, 2-bromo y 2-iodobenzoato de metilo proporciona una mezcla de regioisómeros. Capítulo 4: Dauben–Michno oxidative transposition of allylic cyanohydrins Enantiomeric switch of (–)-carvone to (+)-carvone Cuando cianohidrinas alílicas se someten a la reacción de oxidación de Dauben-Michno a bajas temperaturas se accede a β-cianoenonas en buenos a excelentes rendimientos. El potencial de esta trasposición oxidativa se pone de manifiesto en enonas que contienen un plano latente de simetría como por ejemplo la conversión de la (-)-carvona en su enantiomero. / A dissertation submitted by Vladislav SEMAK to obtain a doctoral degree from University of Barcelona. This thesis was developed under the supervision of Dr. Carmen Escolano Mirón from Faculty of Pharmacy, University of Barcelona. This doctoral thesis is presented as a compendium of publications. The thesis is divided in four chapters: CHAPTER 1 – PART A: Enantioselective, Protecting Group-Free Synthesis of 1S-Ethyl-4-Substituted Quinolizidines (Amat, M.; Semak, V.; Escolano, C.; Molins, E.; Bosch, J. Org. Biomol. Chem. 2012, 10, 6866-6875.) A practical enantioselective protecting group-free four-step route to the key quinolizidinone 6 from phenylglycinol-derived bicyclic lactam 1 is reported. The organometallic addition reaction upon 6 takes place stereoselectively to give 1-ethyl-4-substituted quinolizidines 4-epi-207I and 7-9. Following a similar synthetic sequence, 9a-epi-6 is also accessed. However, the addition of Grignard reagents upon 9a-epi-6 proceeds in a non-stereoselective manner. In order to gain insight into the different stereochemical outcome in the two series, theoretical calculations on the iminium salts A and B have been performed. The study concludes that the addition of the hydride, which is the step that determines the configuration of the final products, occurs in a stereoelectronic controlled manner. CHAPTER 1 – PART B: A practical procedure for the removal of the phenylethanol moiety from phenylglycinol-derived lactams (V. Semak; C, Escolano; C. Arróniz; J. Bosch; M. Amat Tetrahedron: Asymmetry 2010, 21, 2542-2549.) Chiral non-racemic bicyclic lactams derived from phenylglycinol have been appointed as key building blocks for the preparation of enantiopure nitrogen compounds. The removal of the chiral inductor leading to substituted piperidones by using air or oxygen in basic media is presented in this chapter. CHAPTER 2: Synthesis of triheptanoin and formulation as a solid diet for rodents (Semak, V.; Semakova, J.; Halbaut, L.; Asó, E.; Ferrer, I.; Calpena, A.; Escolano, C.; Perales, J. C. Eur. J. Lipid Sci. Technol. 2012, 114, 889-895.) In the present study, we successfully synthesized triheptanoin to the highest standards of purity from glycerol and heptanoic acid, using sulfonated charcoal as a catalyst. Triheptanoin oil was then formulated as a solid, stable and palatable preparation using a ketogenic base and a combination of four commercially available formulation agents: hydrophilic fumed silica, hydrophobic fumed silica, microcrystalline cellulose, and talc. Diet compliance and safety was tested on C57Bl/6 mice over a 15-week period, comparing overall status and body weight change. CHAPTER 3: Toluene dioxygenase mediated oxidation of halogen-substituted benzoate esters (Semak, V.; Metcalf, T. A.; Endoma-Arias, M. A. A.; Mach, P.; Hudlicky, T. Org. Biomol. Chem. 2012, 10, 4407-4416.) A series of ortho-, meta-, and para-halogen-substituted methyl benzoate esters was subjected to enzymatic dihydroxylation via the whole-cell fermentation with E. coli JM109 (pDTG601A). Only ortho-substituted benzoates were metabolized. Methyl 2-fluorobenzoate yielded one diol regioselectively whereas methyl 2-chloro-, methyl 2-bromo- and methyl 2-iodobenzoates each yielded a mixture of regioisomers. Absolute stereochemistry was determined for all new metabolites. Computational analysis of these results and a possible rationale for the regioselectivity of the enzymatic dihydroxylation is advanced. CHAPTER 4: Dauben–Michno oxidative transposition of allylic cyanohydrins. Enantiomeric switch of (–)-carvone to (+)-carvone. (Hudlicky, J. R.; Werner, L.; Semak, V.; Simionescu, R.; Hudlicky, T. Can. J. Chem. 2011, 89, 535-543.) Allylic cyanohydrins were subjected to Dauben–Michno oxidation at low temperatures to provide β-cyanoenones in good to excellent yields. The potential of this oxidative transposition as a means of an enantiomeric switch of enones containing a latent plane of symmetry was tested by conversion of (–)-carvone to its enantiomer.

Els dolicols i poliprenols són alcohols polisoprenoides de cadena llarga implicats en processos com la síntesi de la paret cel.lular i la glicosilació de proteïnes. El primer pas específic de la seva via de síntesi és la addició seqüencial de IPP sobre el FPP per donar lloc al dehidrodolicol en una reacció catalizada per les cis-preniltransferases, anomenades dehidrodolicoldifosfat sintases. A pesar de la seva importància, la biosíntesi d'aquests compostos està molt poc estudiada, en especial en plantes. A partir d'una seqüència genòmica identificada prèviament en el genoma d'A. thaliana amb capacitat per codificar una dehidrodolicoldifosfat sintasa, s'ha clonal l'ADNc de la dehidrodoliquildifosfato sintasa 1 (AtDps1p) de A. thaliana. S'ha demostrat que la proteïna AtDps1p és una dehidrodolicol-PP sintasa funcional, ja que complementa el fenotip de termosensibilitat de la soca de llevat SNH23-7D mutant pel gen RER2, que codifica per una dehidrodolicol-PP sintasa, i restaura la síntesi de dolicols en aquesta soca. Mitjançant la generació de proteïnes de fusió amb la GFP i la seva expressió transitòria en cèl.lules epidèrmiques de ceba hem vist que la AtDps1p es localitza en el RE gracies al seu extrem N-terminal hidrofòbic, el qual és essencial per la funcionalitat de la proteïna. Mitjançant un anàlisi de Northern blot en diferents teixits d' A. thaliana hem demostrat que el gen s'expressa de forma feble en tos el teixits, excepte en les arrels on s'expressa intensament. La disponibilitat del genoma sencer d'A. thaliana ens ha permès identificar en el genoma de A. thaliana 8 genes addicionals amb capacitat per a codificar cis-preniltransferases.En els últims anys s'ha posat de manifiest l'existència d'una regulació coordinada del metabolisme de diferents espècies lipídiques, en especial del metabolisme d'esterols i esfingolípids. Encara que es desconeixen els mecanismes implicats en aquesta regulació, s'ha proposat que la proteïna Arv1 de llevat podria participar en aquest procés. Aquesta proteïna es localitza en el RE i l'aparell de Golgi i conté el domini AHD en el seu extrem aminoterminal, que inclou un possible dit de zinc. En aquesta Tesi s'han identificat dos genes (AtARV1 (At4g01510) y AtARV2 (At1g01020)) que codifiquen per a proteïnes Arv en A. thaliana. Mitjançant experiments de Northern blot, RT-PCR i la generació de plantes transgèniques que contenen una fusió traduccional dels promotors dels gens AtARV1 i AtARV2 s'ha observat que aquests gens s'expressen en teixitss que presenten una divisió i/o expansió cel.lular activa, i un metabolisme lipídic actiu. S'ha demostrat que ambdues proteïnes són funcionals mitjançant un assaig de complementació funcional de la soca de llevat YJN1756 mutant pel gen ARV1 i l'anàlisi del seu perfil lipídic Mitjançant la generació de proteïnes de fusió amb la GFP i la seva expressió transitòria en cèl.lules epidèrmiques de ceba hem vist que la AtArv1p i l AtArv2p es localitzen en el RE, peròque aquesta localització no és deguda al domini AHD. També s'ha demostrat que el subdomini C-terminal del domini AHD és essencial per a la funcionalitat de les proteïnes Arv. Finalment, s'ha vist que la inhibició de la síntesi d'esfingolípids amb miriocina i fumonisina afecta el flux de la via de síntesi d'esterols indirectament a través d'algún mecanisme post-traduccional en que estaria implicada la HMGR. / Lipidic metabolism in plants: Characterization of A. thaliana's dehidrodoliquil-PP synthase and Arv proteins Dolichols and poliprenols are long chain polyisoprenoid alcohols implicated in processes such as cell wall biosynthesis and protein glucosylation. The first commited step of its biosynthesis is the condensation of multiple IPP units over the FPP to synthesize dehidrodoliquil-PP in a chemical reaction catalized by cis-prenyltransferases. Despite its importance, the biosynthetic pathway and its regulation are still very poorly understood, specially in plants. Here, we have cloned the cDNA of Arabidopsis thaliana's dehidrodoliquil-PP synthase (AtDps1p), and we have shown that it's a functional cis-prenyltransferase, that localizes in the ER thanks to an hidrofobic N-terminal domain. This hidrofobic N-terminal domain is essencial for the biological functionality of the protein. We have also shown that AtARV1 gene is expressed in all the tissues in a very low level, with the exception of the roots where it's higly expressed. Finally, we have localized in Arabidopsis thaliana's genome 8 addicional genes that can codify for cys-prenyltransferases.During the last few years, a coordinated regulation of the metabolism of various lipids species, specially sterols and sphingolipids, have been shown. Although the molecular mechanisms of this coordinated regulation are currently unkonwn, it has been proposed that yeast's Arv1p protein can regulate the sterols intracelular distribution and upatke, and that it could play a role in the regulation of sterols and/or sphingolid metabolism. We have identified two genes (AtARV1 (At4g01510) and AtARV2 (At1g01020)) that codify for Arv proteins in Arabidopsis thaliana. Both genes are actively expressed in tissues with an active cell division and/or expansión, as well as in tissues with an active lipid metabolism. Both proteins are functional Arv proteins and localize in the ER. We have shown that the C-terminal subdomain of the AHD (Arv Homology Domain; that it's localized in the N-terminal end of Arv proteins) is essencial for the biological function of Arv proteins. Finally, we have also shown that the inhibition of the sphingolipid biosynthetic pathway, results in an indirect modification of the sterol biosynthetic pathway flow through a post-traduccional mechanism, involving at least the HMGR.

Research for new antivirals to treat Influenza A virus infections has gained importance during this last decade due to the imminent danger of an Influenza pandemic. For some years, several new strains of this virus have appeared worldwide causing small outbreaks with a notable relevance, for example the ‘avian flu’ (H5N1 in 2007; H7N9 in 2012) and ‘swine flu’ (H1N1 in 2009), that have triggered the assumption that a new pandemic is coming. There are several strategies to treat an Influenza A virus infection targeting some of its surface proteins. In this Thesis, several compounds inhibiting the M2 channel of the virus are designed, synthesized and evaluated. Our approach is based on the synthesis of amantadine’s analogues by ring expansion, contraction and rearrangement. Amantadine is a drug already approved by the FDA for the treatment of Influenza A virus and it is known to target the M2 channel. Although it is no longer in use, because the FDA has recommended against its use, due to the appearance of resistance, it possessed good activity and an acceptable pharmacological behaviour. Our main goal was to synthesize an analogue of amantadine that was able to overcome the resistant virus and provide a new therapeutic alternative to the already marketed neuraminidase inhibitors such as Oseltamivir and Zanamivir. Importantly, we took advantage of the wide expertise of our research group in synthesizing polycyclic compounds to start a new research field that was based on the application of these optimized synthetic routes to the Medicinal chemistry. We established some external collaboration in order to set up the milestones and to build the rationale of the current project. These new collaborations are the following: - Prof. Lieve Naesens research group in the Rega Institute for Medical Research in Leuven, Belgium. This group of virologist made the plaque reduction assays and the study of the mutants to establish the mechanism of action of the tested compounds. - Lawrence H. Pinto research group of the Northwestern University, Evanston, Illinois, USA. This group of biochemist made the patch clamp assay to check if our compounds targeted the M2 channel. - Prof. Javier Luque of Universitat de Barcelona, Barcelona, España. This group made the docking and molecular dynamics of our compounds. In the following figures, the general structures of the compounds synthesized in the current Thesis are shown. Several of them showing an outstanding activity that allowed us to publish in the most important journals of the Medicinal Chemistry field: It it worth to mention that, several compounds have shown better activity than the reference compound, Amantadine. The most distinguished compounds are the following: Compound 1, 2 and 3 showed a superior activity against H1N1 strain in the cell culture assay while being almost inactive in the patch clamp assay. Prof. Lieve Naesen’s research group tried to identify the mechanism of action of these compounds selecting the mutants of hemagglutinin under the pressure of our compounds, revealing that this protein was the target of the first cluster of molecules. Compound 4 and 5 showed an outstanding activity against the wild-type and V27A M2 channels of influenza A virus. Taken together, all of these results show that tuning the polycyclic scaffold of amantadine could be the way to overcome the already stated resistance. A second part of this current Thesis consisted in a collection of compounds that have activity against vaccinia virus. These compounds are analogues of Tecovirimat®, a compound that it is currently in phase III clinical trials. When we started this project, we wanted to explore the impact in the EC50 of changing the polycyclic scaffold of the Tecovirimat® molecule, a common tool used in Medicinal Chemistry. We synthesized nearly 40 compounds and we obtained activities similar to Tecovirimat®, although none of our molecules was better than the reference compound.

L’insomni és un trastorn caracteritzat per la insatisfacció en la qualitat i/o quantitat del son, que persisteix durant un considerable període de temps. És un son no reparador, amb conseqüències diürnes com la fatiga, la irritabilitat o la disminució de l’alerta, que afecta tant la vida social com laboral de l’individu. Dels diferents trastorns primaris del son, l’etiologia dels quals no és deguda a una malaltia mental, mèdica o a cap substància, l’insomni primari té una prevalença mitjana a la població del 30%. Històricament el tractament farmacològic de l’insomni ha tingut com a principal diana el receptor GABA(A). L’evolució dels hipnòtics que actuen sobre aquest receptor, ha aportat una millora en la seva eficàcia i seguretat. Tot i així, encara tenen efectes no desitjats com l’insomni de rebot, la dependència, l’amnèsia anterògrada o la tolerància. El nostre objectiu és trobar un candidat que millori els inconvenients dels hipnòtics actuals. Seguint una estratègia de cribratge, seleccionar un compost amb: 1) major selectivitat in vitro per la subunitat 1 del receptor GABA(A), implicada en el son, 2) activitat hipnòtica in vivo que no alteri l’arquitectura del son i 3) una absorció oral ràpida i vida mitjana adequada. Dels 1214 compostos que es van cribrar en total, dos van presentar una elevada selectivitat in vitro per la subunitat alfa-1 del receptor GABA(A) major que la del zolpidem, el fàrmac de referència més selectiu que hi ha actualment al mercat. Aquesta selectivitat in vitro dels compostos, es correlaciona amb la selectivitat in vivo, de manera que els compostos més selectius per la subunitat alfa-1 in vitro, són també els que indueixen sedació in vivo sense efectes no desitjats com la relaxació muscular associada a la subunitat alfa-2 del receptor GABA(A) Però l’efecte in vivo no depèn només de l’afinitat del compost pel receptor, sinó també del nombre de receptors que el compost ocupa al teixit diana i de la seva eficàcia intrínseca per activar-los i generar una resposta biològica. L’ocupació de receptors s’ha analitzat en estudis ex-vivo i s’ha relacionat amb l’efecte observat en els assaigs de comportament in vivo. Quan es determina l’ocupació ex-vivo del receptor GABA(A) per part dels compostos en determinades àrees del cervell, on predomina una determinada subunitat del receptor, els compostos amb més afinitat per la subunitat alfa-1 que indueixen sedació a dosi més baixa, també són els que per norma general requereixen menys dosi per assolir el 50% d’ocupació ex-vivo dels receptors a cerebel (on predomina la subunitat alfa-1 implicada en sedació). En el mateix sentit, els compostos menys afins per alfa-2 que requereixen una dosi més alta per induir relaxació muscular, són també els que per norma general assoleixen el 50% d’ocupació ex-vivo a medul•la (on predomina la subunitat alfa-2) a una dosi més gran. Les dades d’ocupació ex-vivo a cerebel corroboren l’afinitat dels compostos in vitro per la subunitat alfa-1 del receptor GABA(A). En base als resultats presentats en la present Tesi Doctoral, es conclou que s’ha generat i seleccionat un candidat que podria millorar els inconvenients dels hipnòtics actuals en els estudis preclínics. / Insomnia is defined as a condition of unsatisfactory quantity and/or quality of sleep, which persists for a considerable period of time, including difficulty falling asleep, difficulty staying asleep, or early final wakening. Is a non-restorative sleep which cause diurnal dysfunction and a decrease in the quality of life. Traditionally, insomnia therapy is focused on GABAA receptor. Hypnotic treatment based on GABAA receptor has experienced significant improvements in efficacy and safety. Nevertheless, it still causes side effects such as rebound insomnia, dependence and tolerance. Our goal is to identify a new therapeutic drug that improves the disadvantages of current hypnotics. We designed a screening strategy that allowed us to select a compound with: 1) greater in vitro  1 subunit-GABAA receptor selectivity, implicated in hypnosis, 2) hypnotic activity in vivo without modifying sleep architecture and 3) fast oral absorption and adequate half-life. Two compounds screened of a total of 1214 showed higher selectivity than zolpidem to the alpha-1 subunit of GABAA receptor. Nowadays, zolpidem is the most selective reference drug in the market. In vitro selectivity was well-correlated with in vivo selectivity, so the most selective 1-subunit compounds in vitro were those that also induced sedation in vivo without side effects, related to the GABAA receptor alpha -2 subunit, like muscle relaxation. Drug effect in vivo depends on its receptor affinity as well as the binding extent to its target (occupancy). Moreover, drug effect also depends on its intrinsic efficacy to activate the receptor and induce a biological response. An ex-vivo binding protocol was performed to assess receptor occupancy. The results of cerebellum ex-vivo occupancy corroborate the in vitro affinity of the compounds to the alpha -1 subunit of GABAA receptor. Based on these results, we concluded that we synthesized and selected a compound with a suitable profile to improve the disadvantages of current hypnotics in clinical use.

La dermatitis atópica canina es una enfermedad inflamatoria crónica de la piel que cursa con un incremento en la concentración sérica de IgE alérgeno-específicas. Una de las poblaciones celulares más implicadas en el inicio y el desarrollo de esta enfermedad son los mastocitos cutáneos. Los mastocitos son activados en el organismo tras la interacción de los alérgenos con las IgE unidas a su membrana y el consiguiente entrecruzamiento de los receptores de alta afinidad para las IgE (Fc&#61541;RI). De esta forma, se induce la desgranulación de los mastocitos y la liberación y síntesis de mediadores celulares que favorecen el desarrollo de la inflamación. En el hombre y en el ratón existen estudios que demuestran que las IgE tienen un papel regulador de la expresión de los receptores Fc&#61541;RI en la membrana de los mastocitos. Así, una concentración elevada de IgE induce la sobreexpresión de los receptores FceRI, y provoca la liberación por parte de los mastocitos de concentraciones mayores de mediadores inflamatorios que contribuyen al desarrollo de los procesos alérgicos.Hasta el momento, en el perro no existían datos al respecto, y sin embargo es una especie que sufre procesos alérgicos con una alta incidencia. Por ello, el presente estudio pretende evaluar de qué forma influyen las modificaciones en el nivel de IgE del microambiente del mastocito canino sobre su capacidad de liberación y síntesis de mediadores inflamatorios, en concreto de la histamina y el factor de necrosis tumoral (TNF-&#61537;).Durante este estudio se han llevado a cabo 3 fases:- En primer lugar, se ha conseguido la activación de los mastocitos cutáneos caninos a través de los receptores Fc&#61541;RI y se han desarrollado y puesto a punto técnicas para medir diferentes mediadores (histamina, TNF-a) liberados por estas células .- En segundo lugar se han investigado nuevos métodos para mantener viables los mastocitos caninos en cultivo, mediante la utilización de un factor de crecimiento (SCF) específico para estas células. Paralelamente, se ha evaluado la utilidad de la línea celular de mastocitos neoplásicos C2 como fuente celular alternativa en estos estudios.- Finalmente, se han analizado las consecuencias que presenta la exposición de los mastocitos a una concentración elevada de IgE sobre la liberación de la histamina y el TNF-a liberados, así como sobre la expresión de los receptores Fc&#61541;RI en su membrana.Los principales resultados fruto de la realización de este trabajo se pueden resumir en los siguientes puntos:- Los mastocito caninos cutáneos son capaces de liberar histamina y sintetizar TNF-a, tras su estimulación a través de los receptores Fc&#61541;RI. - Los mastocitos cutáneos caninos pueden ser mantenidos en cultivo mediante la adición de SCF como factor de crecimiento celular, conservando su capacidad secretora.- La co-estimulación de los mastocitos caninos con SCF y anti-IgE potencia de forma significativa la liberación de histamina y TNF-a.- La adición al medio de cultivo de los mastocitos de concentraciones altas de IgE provoca una sobreexpresión de los receptores Fc&#61541;RI en la membrana de estas células. Y ello se traduce en un aumento en la producción de TNF-a cuando estas células son estimuladas a través de sus receptores Fc&#61541;RI. / Canine atopic dermatitis is a chronic imflammatory and pruritic skin disease characterized by an increase in the concentration of allergen specific IgE in the serum of the patients. Skin mast cells play an important role in the pathogenesis of this disease. The binding of IgE to the IgE-high affinity receptor (Fc&#61541;RI) on mast cells membrane, and its subsequent crosslinking by an allergen, is the first step in the cascade of reactions leading to the release of MC proinflammatory mediators, in part responsible for the development of the disease.In addition to its crucial role in mast cell activation, IgE has been shown to regulate the Fc&#61541;RI expression on human and murine mast cell surface. An increase in the concentration of IgE can, therefore, lead to an overexpression of the Fc&#61541;RI receptors, causing an increase in the mediators released by the sensitized mast cells, that can contribute to the development of the allergic process. Although dogs suffer with a high incidence allergic processes, this phenomenon mediated by IgE had not been studied in this specie yet. The main goal of the present study was to analyze whether an increase in the IgE concentration of canine mast cell microenvironment can influence the mast cells mediators release (histamine and TNF-&#61537;&#61481; through an IgE-dependent stimulation.This study was carried out in 3 phases:- The first part consisted in setting up the technique to sensitize and activate mast cells through the Fc&#61541;RI receptor, and to measure the different mediators(histamine and TNF-&#61537;) released by these cells. - We then investigated new methods to maintain viable mast cells in vitro. For this purpose, cells were cultured with Stem Cell Factor (SCF) an specific mast cell growth factor. We also investigated the usefulness of a mastocytoma cell line (C2) as an alternative cell source to perform the experiments.- Finally, we analyzed whether the addition of IgE serum in the culture medium may influence mast cells histamine release and TNF-&#61537; production after an IgE-dependent stimulation, and also the Fc&#61541;RI expresión in mast cell membrane.The main results of the present study are the following:- Cutaneous mast cells are able to release histamine and synthesize TNF-&#61537; after an IgE mediated activation.- Cutaneous mast cells can be maintained in vitro by the addition of SCF to the cellular culture medium, maintaining its secretory activity.- The co-stimulation of mast cells with SCF and anti-IgE significantly potentiates the release of histamine and TNF&#61485;&#61537;.- The in vitro exposure of skin mast cells to increased serum IgE concentrations enhances their ability to release TNF-&#61537;&#61472;upon immunological stimulation.- The significant increase in the number of Fc&#61541;RI positive cells (MC) cultured with IgE-rich serum may reflect an up-regulation of the Fc&#61541;RI on the surface of these cells.

La Legislación de la Unión Europea establece límites muy rigurosos para la presencia de residuos de herbicidas derivados de la urea en aguas y en alimentos. Muchos de estos herbicidas son termolábiles y se descomponen durante el análisis por cromatografía de gases (CG), si bien se pueden determinar de manera indirecta a partir de los productos de degradación.El presente trabajo se propone como objetivos; estudiar el comportamiento de herbicidas derivados de la urea en CG con columnas capilares, evaluar su cuantificación en base a sus productos de degradación térmica, poner a punto un nuevo método de análisis en aguas y vegetales basado en la MEFS y la determinación por CG y aplicarlo al análisis de muestras reales.Para la consecución de los objetivos, se realizó un estudio bibliográfico de las propiedades físico-químicas y de las técnicas de extracción y de determinación, un estudio de los factores que influyen en el análisis por CG y en la MEFS desde matrices acuosas, se calcularon experimentalmente las constantes de distribución aparentes fibra/agua que rigen la MEFS y se aplicó la MEFS al análisis de residuos en aguas naturales y en muestras de vegetales.De los ensayos realizados se obtuvieron las siguientes conclusiones: Los herbicidas derivados de la urea se pueden determinar por CG con detectores de nitrógeno-fósforo, captura electrónica y espectrometría de masas a partir de sus productos de degradación térmica, formados en el inyector con buena sensibilidad y reproducibilidad.La temperatura del inyector es el factor más importante de todos los que influyen en la degradación térmica. La inyección a 300ºC facilita la degradación completa y reproducible de los herbicidas estudiados antes de su interacción con la fase estacionaria de la columna, por lo que es la temperatura elegida para llevar a cabo el resto de los análisis. El disolvente empleado en la inyección de fenilureas es muy importante, así se forman los ésteres carbámicos análogos con metanol y etanol y los isocianatos análogos con acetonitrilo, diclorometano y acetato de etilo mientras que metabenzotiazuron forma un benzotiazol, clorsulfuron una triazina y una fenilsulfonamida con independencia del disolvente empleado.La extracción en fase sólida con discos de octilsílice y posterior análisis de los extractos por cromatografía de gases permite la detección de los herbicidas seleccionados en aguas a concentraciones inferiores a 0'1 mg/L con recuperaciones speriores al 87%.La fibra de poliacrilato muestra mejor eficacia que las de polidimetilsiloxano para la extracción de los herbicidas permitiendo con un tiempo de extracción razonable (60min) alcanzar límites de detección inferiores a 0'1 mg/L.La MEFS con fibra de poliacrilato seguidas de CG permiten el análisis de los herbicidas seleccionados en aguas a concentraciones inferiores a 0'1 mg/L. En la MEFS, el aumento de la fuerza iónica y la dilución de la muestra disminuyen las interferencias de los ácidos húmicos en aguas y la de las partículas sólidas de origen vegetal en hortalizas, proporcionando límites de detección inferiores a los Límites Máximos de Residuos legislados para cebollas, patatas y zanahorias.La MEFS acoplada con la cromatografía de gases permite el análisis de ureas herbicidas en muestras de hortalizas a concentraciones muy por debajo de las exigidas en los Límites Máximos de Residuos Legislados. Una doble extracción realizada a pH 4 y a pH 11, es suficiente para conocer por separado los residuos que proceden de fenilureas herbicidas y los residuos de anilinas que son sus metabolitosLa MEFS acoplada con CG no emplea disolventes y permite realizar la extracción desde muestras acuosas y la determinación de manera automática. Su aplicación en alimentos con alto contenido en agua, abre muchas posibilidades de futuro en el campo del análisis de residuos de plaguicidas en alimentos. / Substituted ureas are an important group of pesticides that are used as herbicides (phenylureas and sulfonylureas) and insecticides (benzoylureas). Phenylurea herbicides (PUHs) are largely used in field applications for pre- and post-emergence weed control in a variety of crops. The main groups of phenylurea herbicides are the N-phenyl-N',N'-dialkylureas, N-phenyl-N'-methoxyureas and compounds containing a heterocyclic group. More recently a group of sulfonylurea herbicides (SUHs) has been developed. Multiresidue and single residue methods generally consist of the same basic steps, but multiresidue methods allow the determination of a large number of pesticides in a single analysis, reducing thus time and cost of analysis. The Maximum Admissible Concentration (MAC) of pesticides in drinking water, defined by European Community Directive as 0.1 mg L-1 for individual pesticides and 0.5 mg L-1 for the sum of pesticides posed certain demands to the analytical methods for pesticide residue determination. Gas chromatographic conditions for determining eight phenylurea æchlortoluron, diuron, fluometuron, isoproturon, linuron, metabenzthiazuron, metobromuron and monuronæ and one sulfonylurea æchlorsulfuronæ herbicides were assessed. Degradation products of herbicides formed in the injector were used for identification. Most phenylureas formed their respective carbamic acid methyl esters, metabenzthiazuron formed an aminobenzothiazol and chlorsulfuron formed an aminotriazine plus a phenylsulfonamide.On-column injections of standards at different temperatures (from -30ºC to 400ºC) using columns with four stationary phases (BPX70, BPX35, BP10 and BPX5) were evaluated to identify the best chromatographic behaviour. The best suited column was BP10-30m. The effect of other factors such as injection mode, injector design, sample volume and the solvent used were also investigated. Instrument detection limits (IDLs) ranged from 0.05 ng for chlorsulfuron to 3 ng for monuron with the NPD and, from 0.01 ng for chlorsulfuron to 5 ng for metabenzthiazuron with the ECD. The RSDs (n=4) were lower than 4% at the 12-25 ng level. The method was applied to analyse surface waters extracted with C18 Empore disks with recoveries higher than 85%. Down to 0.1 mg·L-1 of each herbicide could be determined. Chlortoluron was found (11.4 mg·L-1) in a water sample and its presence was confirmed by gas chromatography-mass spectrometry.Degradation products of chlorsulfuron, chlortoluron, diuron, fluometuron, isoproturon, linuron, metabenzthiazuron, metobromuron, and monuron formed in the gas chromatographic injector were used for identification of their respective herbicide. The spectra of the derived compounds were obtained with a quadrupole mass spectrometric detector working in scan mode (20-450 amu). The solvent used for phenylurea herbicide injection (ethanol, methanol, dichloromethane, and acetonitrile) had influence on the generated compounds. When methanol and ethanol were used as solvents, the major products formed from phenylureas were carbamic acid esters. When acetonitrile or dichloromethane were used, the main derivatives were phenylisocyanates. However, chlorsulfuron and metabenzthiazuron generated a triazine plus a phenylsulfonamide and a benzothiazolamine respectively regardless of the assayed solvent. Linuron and diuron showed the same behaviour and gave degradation products with the same mass spectra. The thermal reactions occurred instantaneously in the injector block favoured by the high selected temperature (300ºC).The derived compounds from urea herbicides can be determined using a BP10-30m column and a Selected Ion Registering (SIR) program based on two to three m/z ions as a way to sensitively detect the presence of urea herbicides in environmental extracts. With standards in methanol the instrumental detection limits ranged from 0.1 pg for chlorsulfuron (detected as 2-chlorobenzensulfonamide) to 1 pg for monuron and metobromuron (both detected as their analogous carbamic acid methyl esters). The RSD were below 9 % at the 5 ng·L-1 level. The response was linear (r > 0.9986) within the 5 ng·L-1 to 25 mg·L-1 range. The unequivocal identification of some phenylurea herbicides was not always possible because some herbicides having analogous structures such as diuron and linuron gave the same derivative.Under the proposed conditions matrix effects were low enough to permit calibration with samples proceeding from ecological (non-pesticide treated) crops. Twelve commercial samples of each carrots, onions and potatoes were analyzed and only three samples of potatoes contained residues of linuron at levels below MRL.