Submitted by CAUÊ BENITO SCARIM null (cauebenitos@gmail.com) on 2016-03-09T00:04:25Z No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇÃO - SCARIM, C.B. 2016. pdf.pdf: 4196211 bytes, checksum: 3b69f8889922b703bfe72101d8c90041 (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Paula Grisoto (grisotoana@reitoria.unesp.br) on 2016-03-09T18:45:58Z (GMT) No. of bitstreams: 1 scarim_cb_me_arafcf.pdf: 4196211 bytes, checksum: 3b69f8889922b703bfe72101d8c90041 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-03-09T18:45:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 scarim_cb_me_arafcf.pdf: 4196211 bytes, checksum: 3b69f8889922b703bfe72101d8c90041 (MD5) Previous issue date: 2016-02-15 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A tripanosomíase americana ou doença de Chagas é uma zoonose endêmica em 21 países das Américas do Sul e Central, apontada como uma grave doença parasitária resultante da infecção pelo parasito hemoflagelado denominado Trypanosoma cruzi que utilizam insetos triatomíneos como vetores. Existem dois fármacos para o tratamento dessa enfermidade, o nifurtimox (NFX) e o benznidazol (BNZ), ativos apenas na fase aguda da doença, sendo que no Brasil apenas o BNZ é comercializado. Em busca de novas alternativas para o tratamento, destaca-se o hidroximetilnitrolfural (NFOH), ativo contra as formas tripomastigotas e amastigotas em ensaio in vitro e in vivo. O objetivo deste trabalho foi realizar ensaios in vivo em camundongos Balb/c, na fase crônica da doença de Chagas. Neste sentido foi padronizado o ensaio em fase crônica, utilizando a cepa Y de T.cruzi, com inóculos de 102 formas tripomastigotas. Os animais foram tratados durante 60 dias com NFOH e BNZ seguido de imunossupressão induzida por dexametasona durante 14 dias. Ao final do protocolo os animais foram eutanasiados, pesados, realizado as análises bioquímicas (TGO, TGP, CK–MB, e GGT) e histopatológica. Os resultados demonstraram que nos animais tratados com NFOH e BZN não foi observada a reativação da parasitemia após a imunossupressão, enquanto no controle positivo houve reativação em 55,5% dos animais. Os ensaios bioquímicos não demonstraram alteração nos valores em todos os grupos. Os pesos relativos bem como a análise macroscópica do coração, vesícula biliar, baço e rins do grupo NFOH foram similares ao grupo controle negativo enquanto o grupo BZN foi semelhante ao grupo controle positivo. Na analise histopatológica, o grupo NFOH apresentou apenas a presença de um amastigota em um coração dentre oito animais (1/8) enquanto o grupo BZN foi observado presença de um à dois ninhos em quatro corações (4/8) e no fígado (1/8) comparados com o controle positivo, em que observou-se a presença e inúmeros ninhos amastigotas no coração (5/9) e também no fígado (2/9). Foi observada, também, a presença de ninhos de amastigotas em torno do plexo intestinal do grupo controle positivo (1/9), mas ausente no grupo NFOH, sugerindo que o NFOH é um potencial candidato a fármaco para utilização em fase crônica da doença de Chagas. / A tripanosomíase americana ou doença de Chagas é uma zoonose endêmica em 21 países das Américas do Sul e Central, apontada como uma grave doença parasitária resultante da infecção pelo parasito hemoflagelado denominado Trypanosoma cruzi que utilizam insetos triatomíneos como vetores. Existem dois fármacos para o tratamento dessa enfermidade, o nifurtimox (NFX) e o benznidazol (BNZ), ativos apenas na fase aguda da doença, sendo que no Brasil apenas o BNZ é comercializado. Em busca de novas alternativas para o tratamento, destaca-se o hidroximetilnitrolfural (NFOH), ativo contra as formas tripomastigotas e amastigotas em ensaio in vitro e in vivo. O objetivo deste trabalho foi realizar ensaios in vivo em camundongos Balb/c, na fase crônica da doença de Chagas. Neste sentido foi padronizado o ensaio em fase crônica, utilizando a cepa Y de T.cruzi, com inóculos de 102 formas tripomastigotas. Os animais foram tratados durante 60 dias com NFOH e BNZ seguido de imunossupressão induzida por dexametasona durante 14 dias. Ao final do protocolo os animais foram eutanasiados, pesados, realizado as análises bioquímicas (TGO, TGP, CK–MB, e GGT) e histopatológica. Os resultados demonstraram que nos animais tratados com NFOH e BZN não foi observada a reativação da parasitemia após a imunossupressão, enquanto no controle positivo houve reativação em 55,5% dos animais. Os ensaios bioquímicos não demonstraram alteração nos valores em todos os grupos. Os pesos relativos bem como a análise macroscópica do coração, vesícula biliar, baço e rins do grupo NFOH foram similares ao grupo controle negativo enquanto o grupo BZN foi semelhante ao grupo controle positivo. Na analise histopatológica, o grupo NFOH apresentou apenas a presença de um amastigota em um coração dentre oito animais (1/8) enquanto o grupo BZN foi observado presença de um à dois ninhos em quatro corações (4/8) e no fígado (1/8) comparados com o controle positivo, em que observou-se a presença e inúmeros ninhos amastigotas no coração (5/9) e também no fígado (2/9). Foi observada, também, a presença de ninhos de amastigotas em torno do plexo intestinal do grupo controle positivo (1/9), mas ausente no grupo NFOH, sugerindo que o NFOH é um potencial candidato a fármaco para utilização em fase crônica da doença de Chagas. / CNPq: 164872/2015-9 / CAPES: 40300005

Camundongos C3H/HePAS infectados com Trypanosoma cruzi Sylvio X10/4 desenvolvem cardiomiopatia chagásica crônica semelhante aquela observada em pacientes portadores da doença de Chagas. A análise das células que infiltram o coração na fase crônica mostra uma maior frequência de leucócitos e maior expressão de PD-1 e PD-L1, moléculas inibitórias do sistema imune. Visando restaurar a resposta, tratamos camundongos primeiramente com anticorpos anti-PD-L1 e posteriormente com anticorpos anti-PD-L1 e anti-PD-1 em diferentes experimentos, que falharam em exercer uma diferença significativa na patologia cardíaca, parasitemia do sangue ou do coração associado ao aumento da resposta imune. Para fornecer co-estímulo além de bloquear interações inibitórias, realizamos o tratamento com anti-PD-1 e anti-PD-L1 associado a T. cruzi irradiado, que aumentou a patologia cardíaca e a bradicardia, assim como diminuiu a parasitemia sanguínea, sem mudanças no perfil das células T. O bloqueio das interações inibitórias associado ao desafio e ao co-estímulo das células T, leva a uma piora no funcionamento cardíaco associado à diminuição da parasitemia nos camundongos crônicos. / C3H/HePAS mice infected with T. cruzi Sylvio X10/4 parasites develop a chronic cardiomyopathy like the observed in human chagasic patients. Flow cytometry analysis of heart-infiltrating cells in chronically infected mice revealed higher leukocyte frequency with increased PD-1 and PD-L1 expression. In order to restore the immune response, mice were treated with anti-PD-L1 or with anti-PD-L1 and anti-PD-1, but neither exerted effects at heart pathology and parasitemia nor restored T cell response. Hence, we evaluated the possibility of using irradiated T. cruzi challenge to provide parasite antigen and co-stimulatory signaling to exhausted cells. Thus, association of anti-PD-1 and anti-PD-L1 treatment with irradiated T. cruzi challenge increased heart pathology and bradycardia as well as reduced blood parasitemia. Additionally, the treatment does not change T cell phenotype. Blocking both inhibitory interactions and provide antigen with co-stimulation seems to cause a loss in heart function despite decreasing parasitemia.

Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais / Chagas disease, an American trypanosomiasis caused by Trypanosoma cruzi, was discovered by Carlos Chagas in 1909, and presents a broad spectrum of clinical manifestations, including the acute and chronic phases. The latter is divided into three main forms: digestive, cardiac and indeterminate. The purposes of this study were to evaluate the immunoreactivity profile of recombinant peptides selected against purified human IgG from chronic chagas disease patients by Phage Display, to assess differential recognition patterns in the immune response among disease clinical forms, and to select mimotopes with potential use in diagnostics. The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was conducted with all 50 clones obtained after four rounds of selection. The trials were performed with phages supernatant. In order to evaluate the specific antibody response, plaque reduction tests were performed with clones that showed better performance in ELISAs. ELISA tests showed that the immune profile of some clones suggested the tendency of patients with the indeterminate form to develop cardiac or digestive form. Phage display approach has generated specific mimotopes that present differential recognition patterns of the immune response between the cardiac and digestive clinical forms of Chagas disease, and these mimotopes may become potential targets for vaccine development and for differential diagnostics of clinical forms. / A doença de Chagas foi descoberta e descrita por Carlos Chagas em 1909, e representa uma importante doença parasitária crônica causada pelo protozoário flagelado Trypanosoma cruzi. Depois de adquirida, a tripanossomíase americana pode apresentar-se sob duas fases: aguda e crônica, sendo esta dividida em três formas principais: indeterminada, digestiva e cardíaca. Objetivamos avaliar o perfil imunorreativo de peptídeos recombinantes selecionados contra IgG humana purificada de pacientes com as formas cardíaca, digestiva e indeterminada da fase crônica da doença de Chagas por Phage Display, a fim de avaliar a possibilidade de um padrão diferenciado de resposta imunológica entre as três formas da doença e buscar clones com potencial diagnóstico. Os ELISAs foram realizados com todos os 50 clones distintos obtidos pelos quatro ciclos de seleção, utilizando-se sobrenadante dos fagos como antígenos no sistema de captura. Além disso, foi realizado teste de redução em placas com os clones com melhor desempenho de reatividade nos ELISAs, a fim de demonstrar a especificidade de ligação dos anticorpos com esses epítopos. Os testes realizados demonstraram que o perfil imunorreativo de alguns clones sugere a propensão de indivíduos portadores da forma indeterminada a evoluírem para a forma cardíaca ou digestiva da doença, além de demonstrarem clones potenciais para o diagnóstico diferencial entre as formas cardíaca e digestiva, bem como epítopos para detecção geral da doença de Chagas. / Mestre em Ciências da Saúde

0 objetivo deste trabalho foi definir se a carga parasitaria na fase aguda da doenga de Chagas experimental afeta a parasitemia, a patologia e a resposta imune na fase cr6nica. Para obtengelo de diferentes cargas parasitoirias na fase aguda, camundongos A/J foram infectados corn 103 OU 105 formas tripomastigotas de T. cruzi e analisados urn ano depois. Os animais cr6nicos infectados corn 105 formas tripomastigotas apresentaram maior nivel de parasitemia residual, maior intensidade de inflamagclo no coragtio e no moscuio esquel6tico e maior grau de ativa95o do sistema imune do que os animais infectados corn 103 formas. Em reiagclo aos parametros imuno16gicos analisados, observou-se nos animais infectados corn 105 formas: i) expansio das populag6es B220-CD5- e CD8\'; ii) freq0@ncia maior de blastos nas populag6es linfocit@rias B220\', CD8\' e CD4\'; iii) mudanga acentuada nas c61ulas CD4+ para o fen6tipo CD4+CD45RBI-ow, indicando urn aumento das c61ulas efetoras elou de mem6ria; iv) freqGC=ncias elevadas de blastos CD4+CD45RB Hig\' e CD4+CD45RB Low; vi) nomero superior de c61ulas secretoras de lg principaimente IgG2a; v) niveis superiores de anticorpos IgG2a e IgGl especificos e vii) maior produgclo de IFN-Y e de IL-4. Estes resultados indicam que a carga parasitaria na fase aguda da infecggto influencia a ativagclo do sistema imune e o desenvolvimento da patologia na fase cr6nica da doenga de Chagas. / The objective of this project is to evaluate if the parasite load in the acute phase experimental Chagas\' disease affects the parasitemias, the pathology and the immune response in the chronic phase. To obtain low- and high-parasite loads in the acute phase of the disease, AlJ mice were infected with 103 or 105 T. cruzi trypomastigotes of the Y strain, and treated on day 6 with Benzonidazol. One year later, chronic mice were screened for subpatent parasitemias, tissue pathology and immune response. Mice infected with the high parasite inoculum showed higher levels of chronic parasitemias, heart and striated muscle inflammation and activation of the immune system when compared to mice infected with the low¬dose inoculum. Concerning the activation of the immune system, the main findings in high-dose infected mice were: i) increased numbers of splenocytes, with preferential expansion of CD8+ and B220-CDS- cells, many of them bearing a macrophage phenotype; ii) higher frequencies of B (B220+), CD4+ and CD8+ large lymphocytes; iii) a shift of CD4+ cells towards a CD4SRBLow phenotype; iv) increased frequencies of both CD4SRBLow and CD4SRBHigh large CD4+ cells; v) augmented numbers of total Ig-secreting cells, with predominance of IgG2a¬producing cells, and; vi) increased production of IFN-y and IL-4. In addition, these mice presented lower IgM and higher IgG2a and IgG1 parasite-specific serum antibody levels. Our results indicate that the parasite load at the acute phase of T. cruzi infection influences the activation of the immune system and development of Chagas pathology at the late chronic phase of the disease.

0 objetivo deste trabalho foi definir se a carga parasitaria na fase aguda da doenga de Chagas experimental afeta a parasitemia, a patologia e a resposta imune na fase cr6nica. Para obtengelo de diferentes cargas parasitoirias na fase aguda, camundongos A/J foram infectados corn 103 OU 105 formas tripomastigotas de T. cruzi e analisados urn ano depois. Os animais cr6nicos infectados corn 105 formas tripomastigotas apresentaram maior nivel de parasitemia residual, maior intensidade de inflamagclo no coragtio e no moscuio esquel6tico e maior grau de ativa95o do sistema imune do que os animais infectados corn 103 formas. Em reiagclo aos parametros imuno16gicos analisados, observou-se nos animais infectados corn 105 formas: i) expansio das populag6es B220-CD5- e CD8\'; ii) freq0@ncia maior de blastos nas populag6es linfocit@rias B220\', CD8\' e CD4\'; iii) mudanga acentuada nas c61ulas CD4+ para o fen6tipo CD4+CD45RBI-ow, indicando urn aumento das c61ulas efetoras elou de mem6ria; iv) freqGC=ncias elevadas de blastos CD4+CD45RB Hig\' e CD4+CD45RB Low; vi) nomero superior de c61ulas secretoras de lg principaimente IgG2a; v) niveis superiores de anticorpos IgG2a e IgGl especificos e vii) maior produgclo de IFN-Y e de IL-4. Estes resultados indicam que a carga parasitaria na fase aguda da infecggto influencia a ativagclo do sistema imune e o desenvolvimento da patologia na fase cr6nica da doenga de Chagas. / The objective of this project is to evaluate if the parasite load in the acute phase experimental Chagas\' disease affects the parasitemias, the pathology and the immune response in the chronic phase. To obtain low- and high-parasite loads in the acute phase of the disease, AlJ mice were infected with 103 or 105 T. cruzi trypomastigotes of the Y strain, and treated on day 6 with Benzonidazol. One year later, chronic mice were screened for subpatent parasitemias, tissue pathology and immune response. Mice infected with the high parasite inoculum showed higher levels of chronic parasitemias, heart and striated muscle inflammation and activation of the immune system when compared to mice infected with the low¬dose inoculum. Concerning the activation of the immune system, the main findings in high-dose infected mice were: i) increased numbers of splenocytes, with preferential expansion of CD8+ and B220-CDS- cells, many of them bearing a macrophage phenotype; ii) higher frequencies of B (B220+), CD4+ and CD8+ large lymphocytes; iii) a shift of CD4+ cells towards a CD4SRBLow phenotype; iv) increased frequencies of both CD4SRBLow and CD4SRBHigh large CD4+ cells; v) augmented numbers of total Ig-secreting cells, with predominance of IgG2a¬producing cells, and; vi) increased production of IFN-y and IL-4. In addition, these mice presented lower IgM and higher IgG2a and IgG1 parasite-specific serum antibody levels. Our results indicate that the parasite load at the acute phase of T. cruzi infection influences the activation of the immune system and development of Chagas pathology at the late chronic phase of the disease.