Esta tese trata do desenvolvimento de métodos bioanalíticos, baseados na técnica de eletroforese capilar, para duas aplicações distintas: a análise de complexos formados pela ligação entre proteínas e DNA e detecção e monitoramento de hidrólise de GTP catalisada por enzimas. No primeiro capítulo descreve-se uma investigação sobre a viabilidade de ensaios tipo EMSA (?electrophoretic mobility shift assay?) em chips com microcanais para eletroforese. Os fatores de transcrição purificados c-Jun(AP1) e p-50(NFkB) foram usados nos estudos de ligação a sondas de DNA fita dupla contendo as seqüências consenso de ligação dos fatores AP1, NFkB e AP2. As sondas de DNA sintéticas continham como modificação a marcação com o corante fluorescente Cy5 ligado à extremidade 5?, sendo que as mesmas seqüências não marcadas foram usadas para experimentos de competição. Ensaios tipo EMSA em chip puderam ser realizados em cerca de 2 h com baixo consumo de amostra e sem a necessidade de usar marcação com material radioativo. A sondas de DNA e os complexos formados nas reações de ligação foram analisados no Bioanalyzer usando tanto o procedimento padrão para a análise de DNA quanto um protocolo modificado. Nesta modificação não foi usado corante de intercalação mas 4,9 nM de Cy5-dCTP que foi adicionado ao gel, permitindo apenas a detecção de DNA previamente marcado. Apesar da necessidade de ajustes no método para cada proteína testada, foi mostrado o potencial de se substituir o método de EMSA em gel por métodos baseados em eletroforese em chip. Um experimento de competição foi realizado com sucesso mostrando a ligação do fator de transcrição p-50 à sonda contendo a seqüência consenso NFkB. Este experimento foi considerado como prova de princípio para a hipótese estudada. No segundo capítulo relata-se o desenvolvimento de um método para a detecção e monitoramento in vitro de atividade nucleotídeo-trifosfatase. O método que se mostrou robusto e reprodutível foi aplicado para investigar a atividade GTPase de uma proteína recombinante contendo o domínio catalítico de uma septina humana SEPT4 / Bradeiona (GST-rDGTPase). O exemplo de aplicação demonstra que a técnica de eletroforese capilar pode substituir o método tradicionalmente usado com marcação radioativa para detecção de atividade GTPase inclusive em estudos de cinética enzimática. Os parâmetros cinéticos determinados para a GST-rDGTPase foram: vmax = 1.7 μ M min-1 ± 0.1 and Km = 1.0 mM ± 0.3; kcat = 9 x 10-3 SM-1. O efeito de co-fatores como Mg2+ and Mn2+ também foi estudado. O método analítico descrito também se mostrou útil para a análise de di- e trifosfatos de outros nucleotídeos. / This Thesis concerns on the development of capillary electrophoresis-based bioanalytical methods for two distinct applications: DNA-protein binding analysis and monitoring of enzyme-catalyzed GTP hydrolysis. In the first chapter, the feasibility of on-chip electrophoretic mobility-shift assays (EMSA) is investigated. Purified transcription factors c-Jun(AP1) and p-50(NFkB) were used for binding studies to dsDNA probes containing the consensus sequences from AP1, NFkB and AP2 regulatory sequences. DNA probes were modified at the 5?-end with the Cy5 and unlabeled oligos were used for competition experiments. On-chip-EMSA could be carried out within ca. 2 h with low sample consumption and no need to handle radioactive material. Both, the dsDNA probes and the shifted oligos from binding reactions were analyzed on the ?2100 Bioanalyzer? using either, the standard procedure for DNA analysis or a modified protocol, in which no intercalating dye was used. Instead, 4.9 nM Cy5-dCTP was added to the gel matrix allowing the detection of only Cy5-labeled DNA. Despite the need of specific adjustments for each protein, we have shown the potential for replacing slab gel-based EMSA for on-chip methods. A competition experiment to show sequence specific binding of the transcription factor p-50 to the consensus sequence NFkB is presented as a proof of principle. In chapter II, a capillary electrophoresis-based method for in vitro detection and monitoring of nucleotide-triphosphatase activity is described. This robust and reproducible method was used to investigate GTPase activity of a recombinant protein construct containing the catalytic domain of Human SEPT4 /Bradeion ? (GST-rDGTPase). The application example demonstrates that the capillary electrophoresis technique can replace classical radioactive methods for GTPase activity assays and may be used as a routine analytical tool. Enzyme kinetics of GST-rDGTPase was studied and yielded the following kinetic parameters: vmax = 1.7 μM min-1 ± 0.1 and Km = 1.0 mM ± 0.3; kcat = 9 x 10-3 s-1. In addition the effect of co-factors such as Mg2+ and Mn2+ in the catalytic activity was investigated. The described analytical method was also shown to be useful to analyze di- and triphosphated forms of other nucleotides.

INTRODUÇÃO: O hipopituitarismo está associado, em cerca de 40% dos casos, à ectopia da neuro-hipófise observada em imagem por ressonância magnética (RM). Nestes pacientes a visualização da haste ocorre predominantemente nos que têm deficiência isolada de GH (DIGH), enquanto a não visualização da mesma está mais associada à deficiência hipofisária múltipla (DHM). A etiologia deste quadro, no entanto, permanece indeterminada na maioria dos pacientes. A elevada freqüência de parto pélvico e de complicações neonatais sugere uma causa traumática, enquanto que relatos de casos familiares, associação com outras patologias do SNC e descrição de mutações nos genes HESX1, LHX4 e SOX3 apontam para uma causa genética. O LHX4 é um fator de transcrição envolvido na embriogênese hipofisária fundamental para a formação da bolsa de Rathke definitiva. O LHX4 está localizado no cromossomo 1q 25, possui 6 éxons e estende-se por mais de 45 kb de DNA genômico. A única mutação publicada neste gene em humanos é a IVS4-1G>C, associada a um fenótipo caracterizado por baixa estatura, deficiências de GH, TSH e ACTH, neuro-hipófise ectópica e malformação Arnold-Chiari tipo I. O objetivo do estudo é analisar as regiões exônicas e éxon-íntron do LHX4 e caracterizar o perfil hormonal, correlacionando com os achados de RM, em 63 pacientes com hipopituitarismo associado a neurohipófise ectópica. MÉTODOS: Os pacientes foram submetidos à avaliação hormonal e por imagem através de ressonância magnética. A análise molecular incluiu amplificação do gene por PCR, seqüenciamento automático e uso de enzima de restrição. RESULTADOS: A visualização da haste ocorreu em 21 pacientes; destes, 10 (48%) apresentaram DIGH. A não visualização da haste foi mais associada a DHM, o que ocorreu em 40 (95%) dos 42 pacientes. Não encontramos diferença significativa quando comparamos pacientes com haste visualizada e não visualizada quanto à freqüência de partos vaginais em apresentação pélvica, à freqüência de malformações do SNC e à posição precisa da neuro-hipófise ectópica. Identificamos 6 variações alélicas no gene LHX4 em nossos pacientes: GGT>GGC, no códon 21; GAC>GAT, no códon 128; AAC>AAT, no códon 150; AGC>AGT, no códon 230; GGA>GGT, no códon 283 e AAT>AGT no códon 329 (N329S), esta já descrita como polimorfismo no GenBank. Nenhuma das outras variações determina troca de aminoácidos, altera o sítio de \"splice\" ou se correlaciona com um padrão de deficiência hormonal característico. As variações alélicas nos códons 21, 128 e 150 foram caracterizadas como polimorfismos. Não foi possível estabelecer uma relação entre as variações alélicas e o fenótipo dos pacientes. CONCLUSÃO: Mutações no LHX4 são causas raras de hipopituitarismo / INTRODUCTION: Ectopic posterior pituitary lobe (EPL) is observed using magnetic resonance imaging (MRI) scans in about 40% of patients with hypopituitarism. In these patients, the pituitary stalk is visualized mainly in patients with isolated GH deficiency (IGHD), whilst it is not visualized predominantly in patients with combined pituitary hormone deficiency (CPHD). Nevertheless, the etiology of EPL remains undetermined in most of the patients. A traumatic etiology is proposed for this figure, which presents a high frequency of breech delivery and perinatal damages. On the other hand, a genetic cause is suggested by associations to other CNS abnormalities and reports of gene mutations in HESX1, LHX4 and SOX3, as well as familial cases. LHX4 is a transcription factor implicated in pituitary embryogenesis which is essential to definitive Rathke\'s pouch development. It is located in chromosome 1q25, has 6 exons and is stretched out for more than 45 kb of genomic DNA. The only documented human mutation in this gene, IVS4-1G>C, is associated to a phenotype characterized by short stature, GH, TSH and ACTH deficiencies, EPL and Arnold-Chiari type I malformation. The aim of this study is to analyze exonic and exon-intron regions of LHX4 gene and characterize the hormonal deficiency profiles, establishing relationships to MRI findings in 63 patients with hypopituitarism associated to EPL. METHODS: All patients were submitted to hormonal evaluation and MRI scans. The molecular analysis included amplification of the gene using PCR, direct automatic sequencer and digestion with restriction enzymes. RESULTS: The pituitary stalk was visualized in 21 patients; of these, 10 (48%) exhibited IGHD. The stalk was not visualized in 42 patients, most of them with CPHD (95%). We did not find a statistical difference, when patients with and without visualized pituitary stalk were compared, regarding breech deliveries, CNS malformations and exact position of EPL. We identified 6 allelic variations in LHX4 gene: GGT>GGC in codon 21, GAC>GAT in codon 128, AAC>AAT in codon 150, AGC>AGT in codon 230, GGA>GGT in codon 283 and AAT>AGT in codon 329 (N329S), this already related as a polymorphism in GenBank. None of the former variations determine amino acid changes, nor splicing site changes, not even are related to a typical profile of hormonal deficiency. The allelic variations in codons 21, 128 and 150 were described as polymorphisms. It was not possible to establish a relationship between the allelic variations and the phenotype. CONCLUSION: LHX4 gene mutations are rare causes of hypopituitarism

Os fatores de transcrição da família MarR atuam como sensores diretos de sinais intracelulares e regulam vários processos em bactérias, incluindo virulência e degradação de compostos aromáticos. Neste trabalho, identificamos de modo global os fatores de transcrição da família MarR envolvidos na virulência do patógeno oportunista de humanos Chromobacterium violaceum. Usando mutagênese por troca alélica, geramos mutantes nulos não polares para doze dos quinze reguladores da família MarR encontrados no genoma de C. violaceum. Em ensaios de virulência, quando injetados por via intraperitoneal em camundongos BALB/c, os mutantes ?CV_0210 (?ohrR), ?CV_0577 e ?CV_2726 foram menos virulentos, enquanto o mutante ?CV_1776 foi mais virulento, quando comparados à linhagem selvagem. Para os demais nove mutantes MarR não houve diferença na virulência. Para definir o regulon de alguns destes reguladores da família MarR, os perfis de expressão gênica foram determinados por ensaios de microarranjo de DNA e Northern blot para as linhagens mutantes ?CV_0210 (?ohrR), ?CV_1776, ?CV_1810 e ?CV_2726, para a linhagem selvagem superexpressando CV_2726 e para a linhagem selvagem em estresse oxidativo com hidroperóxido de cumeno (CHP). O regulon do repressor CV_1810 compreendeu dois operons divergentes, que codificam enzimas que possivelmente metabolizam compostos aromáticos, mas produtos do catabolismo destes compostos não funcionaram como ligantes capazes de antagonizar a repressão de CV_1810 no gene CV_1801. O regulon do ativador CV_2726, definido como quatorze genes comuns diferencialmente expressos em ensaios na ausência e na condição de superexpressão do gene CV_2726, revelou poucos genes (cstA) com potencial de estar envolvidos no fenótipo de menor virulência do mutante ?CV_2726. Os reguladores CV_0577 e CV_1776 foram alocados na subfamília UrtR de resposta a urato e provavelmente influenciam a virulência de C. violaceum com regulons sobrepostos. O regulon de CV_1776 abrangeu dezenas de genes, muitos deles relacionados ao catabolismo de aminoácidos, mas há poucos candidatos a fatores de 10 virulência clássicos (pecM, escU). Alguns genes do catabolismo/utilização de purinas (CV_0578 e CV_3771) foram regulados tanto por CV_1776 quanto por CV_0577 e responderam a presença de urato. O perfil transcricional da resposta adaptativa de C. violaceum a CHP, um ligante que oxida o regulador OhrR, revelou aumento na expressão de genes relacionados à detoxificação de peróxidos (enzimas antioxidantes e sistemas redutores de tiol), degradação da porção aromática do CHP (oxigenases) e proteção contra estresses secundários (reparo de DNA, choque térmico, limitação de ferro e nitrogênio). O regulon de OhrR revelou-se pequeno, incluindo dois genes com expressão aumentada, CV_0209 (ohrA) e CV_0208 (possível diguanilato ciclase), e três genes com expressão diminuída (hemolisina, quitinase e colagenase) no mutante ?ohrR. Assim, a virulência atenuada do mutante ?ohrR deve estar relacionada ao aumento da produção do segundo mensageiro cíclico di-GMP (c-diGMP) e à diminuição da expressão de enzimas degradativas extracelulares. Em conclusão, definimos a resposta transcricional à CHP, identificamos potenciais fatores de virulência, como a diguanilato ciclase, no regulon OhrR, e mostramos que C. violaceum utiliza os fatores de transcrição da família MarR CV_0577, CV_1776, CV_2726 e OhrR para modular sua virulência. / Transcription factors belonging to the MarR family act as direct intracellular sensors of signals and control many processes in bacteria, including virulence and degradation of aromatic compounds. In this work, we identify and characterize MarR family transcription factors controlling virulence in Chromobacterium violaceum, an opportunistic pathogen of humans. Using allelic exchange mutagenesis, we generate non-polar null mutants for twelve of the fifteen MarR family regulators found in the C. violaceum genome. In virulence tests, when introduced by intraperitoneal injection in BALB/c mice, the ?CV_0210 (?ohrR), ?CV_0577 and ?CV_2726 mutant strains were less virulent, while the ?CV_1776 was more virulent, when compared to the wild-type strain. The other nine MarR mutants showed no difference in virulence tests. To define the regulon of some MarR family transcription factors, the gene expression profiles were determined by DNA microarray analysis and Northern blot assays for the ?CV_0210 (?ohrR), ?CV_1776, ?CV_1810 and ?CV_2726 mutant strains, for the wild-type strain overexpressing CV_2726 and for the wild-type strain exposed to oxidative stress generated by cumene hydroperoxide (CHP). The CV_1810 is a repressor of a regulon that comprised two divergent operons encoding enzymes that possibly metabolize aromatic compounds, but catabolic products of these compounds did not function as ligands capable of antagonizing the repression of CV_1810 on the CV_1801 gene. The regulon of the activator CV_2726, defined as fourteen differentially expressed genes commonly found in assays in the absence and overexpression of the CV_2726 gene, revealed few genes (cstA) with potential to be involved in the phenotype of lower virulence of the ?CV_2726 mutant strain. Regulators CV_0577 and CV_1776 were allocated in the urate-responsive UrtR subfamily and probably afect the virulence of C. violaceum with overlapping regulons. The CV_1776 regulon contains dozens of genes, many of them related to amino acid catabolism, but there are few candidates for classical virulence factors (pecM, escU). Some genes related to catabolism/utilization of purine (CV_0578 and CV_3771) were 12 regulated by both CV_1776 and CV_0577 and responded to the presence of urate. The transcriptional profile of the adaptive response of C. violaceum to CHP, a ligand that oxidizes the OhrR regulator, revealed the upregulation of genes related to the detoxification of peroxides (antioxidant enzymes and thiol-reducing systems), degradation of the aromatic moiety of CHP (oxygenases), and protection against other secondary stresses (DNA repair, heat shock, iron limitation, and nitrogen starvation responses). The OhrR regulon was shown to be small, including two upregulated genes, CV_0209 (ohrA) and CV_0208 (putative diguanylate cyclase), and three downregulated genes (hemolysin, chitinase, and collagenase) in the ?ohrR mutant. Thus, the attenuated virulence of the ?ohrR mutant might be related to the increased production of the second messenger cyclic di-GMP (c-di-GMP) and the decreased expression of extracellular enzymes required for tissue dissemination, in this mutant strain. In conclusion, we have defined the transcriptional response to CHP, identified potential virulence factors such as diguanylate cyclase as members of the OhrR regulon, and shown that C. violaceum uses the transcription factors of the MarR family CV_0577, CV_1776, CV_2726 and OhrR to modulate its virulence.

As vias de sinalização celular por meio de moléculas são um dos principais meios de controle funcional de um organismo. O entendimento das funções de moléculas sinalizadoras facilita a compreensão das vias metabólicas de um organismo, assim possibilitando uma melhor compreensão de vários eventos biológicos e também de várias doenças. A sinalização pelo ácido retinóico (AR), e seus derivados, é responsável pelo controle de várias funções, por exemplo: crescimento celular, diferenciação celular, formação da retina, desenvolvimento cardíaco e também relacionado a várias patologias como diabetes, obesidades, cânceres, e doenças cardiovasculares. A ação do ácido retinóico é controlada em dois níveis: no metabolismo de síntese/degradação e na sua utilização na sinalização para a expressão gênica. A maquinaria que controla o metabolismo inclui as enzimas de síntese do AR (aldeído desidrogenase ALDH) e as enzimas de degradação do AR (Cyp26), que controlam a distribuição espaço-temporal do AR durante a embriogênese. As ALDHs são enzimas NAD(P)+ dependentes, que oxidam uma ampla gama de aldeídos para os seus correspondentes ácidos carboxílicos, sendo ALDH1A2 a principal enzima na transformação de retinal em ácido retinóico. A maquinaria da sinalização celular por AR contém os receptores nucleares controlados por AR (RARs) que estão envolvidos com o controle da transcrição gênica. Os mecanismos de controle de expressão mais comuns são os que ocorrem na fase transcricional. Um desses mecanismos envolve proteínas que se ligam às regiões promotoras de transcrição, representadas por trechos de DNA que geralmente estão localizados próximo à região de início da transcrição, mas que também podem estar a centenas ou até milhares de pares de bases desse início. Essas proteínas modulam a maquinaria transcricional, podendo ativá-la ou inibi-la. A associação de várias técnicas como a biologia molecular, bioinformática, filogenia, análises estruturais de biomoléculas, mecânica molecular e métodos termodinâmicos tem se mostrado uma poderosa abordagem para compreensão de sistemas biológicos simplificando e agilizando o desenvolvimento do conhecimento científico. Nessa direção, esse estudo desenvolveu duas análises: a primeira estudando a evolução das funções das enzimas ALDH, utilizando-se de técnicas de genômica combinatória, filogenia, bioinformática, estrutura de biomoléculas e de biologia do desenvolvimento, tentando compreender o modo como as ALDHs, que apresentam as seqüências de aminoácidos bastante similares, puderam divergir para gerar funções diversas como a destoxificação e a sinalização. Para este estudo foram analisados os genomas de 487 organismos em busca de seqüências de ALDHs e também o genoma do organismo modelo Branchiostoma floridae. Foram obtidas 190 seqüências que foram utilizadas em uma análise filogenética para tentar compreender a função primordial e também para definir grupos de aminoácidos candidatos a marcadores das diferentes famílias de ALDHs. Essas 190 seqüências também foram modeladas estruturalmente e analisada a forma e o volume do canal onde se aloja o aldeído a ser oxidado. A partir dessas informações foi possível prever que as ALDHs passaram das funções ancestrais de controle do padrão corporal para algo mais abrangente como funções protetoras. A segunda análise, utilizando-se das estruturas tridimensionais dos fatores de transcrição ligados ao DNA em diferentes posições e submetendo esses complexos a processos de mecânica molecular, cálculos termodinâmicos e análises das ligações de hidrogênio para tentar prever os mais prováveis sítios de interação entre os receptores e o DNA. O modelo escolhido para essa análise foram os fatores de transcrição regulados por ácido retinóico o RAR e RXR utilizando a região promotora do gene RARE-2 para avaliar as mais prováveis regiões de ligação desses fatores. Para esse estudo foram construídos 71 complexos proteína-DNA que foram submetidos a processos de mecânica molecular e cálculos termodinâmicos. A partir dessas informações foi possível prever uma região de maior afinidade entre o fator de transcrição e o DNA. As análises de ligações de hidrogênio possibilitaram definir exatamente a região de interação entre os fatores de transcrição e o DNA, e também descrever as interações moleculares responsáveis pela especificidade da interação. / Cellular signaling paths through molecules are one of the main processes of functional control of an organism. The comprehension of signaling molecules functions enables one to understand the metabolic pathways of an organism, along with related biological events and several diseases. The signaling through retinoic acid (RA) and its secondary products is responsible for controlling several functions, such as cellular growth and differentiation, retinas formation and cardio development, and is also related to several pathologies such as diabetes, obesity, cancers and cardiovascular disorders. There are two levels of control of retinoic acid activity: synthesis/degradation metabolism and its use in gene expression signaling. The machinery that controls the metabolism includes RAs synthesis (aldehyde dehydrogenase ALDH) and degradation (Cyp26) enzymes, which control the space-temporal distribution of RA during the embryogenesis. The ALDHs are NAD(P)+ dependent enzymes that oxidize many types of aldehydes into the related carboxylic acids, being the ALDH1A2 the main enzyme involved in the process of transformation of retinal into retinoic acid. The machinery of cellular signaling through RA contains the nuclear receptors controlled by RA (RARs) that are involved in the control of gene transcription. The most common mechanisms of expression control are the ones that occur during the transcriptional phase. One of these mechanisms involves proteins that bind to the transcription promoter regions, represented by DNA sequences that are usually located close to the region where the transcription starts, but can also be hundreds or thousands of base pairs apart from the starting point. These proteins modulate the transcriptional machinery, being responsible for both its activation and inhibition. The association of several techniques as molecular biology, bioinformatics, phylogeny, structural analysis of biomolecules, molecular mechanics and thermodynamic methods has been shown as a powerful tool for the understanding of biological systems, simplifying and speeding up the production of related scientific knowledge. Facing this direction, the present study developed two analyses. The first one studied the evolution of ALDH enzymes functions, using the techniques of combinatory genomic, phylogeny, bioinformatics, structure of biomolecules and developmental biology, in the attempt of understanding how the ALDHs could diverge and acquire different functions as detoxification and signaling, despite the fact that they have very similar aminoacid sequences. For this study, ALDHs sequences were searched for in the genome of 487 organisms plus the model organisms, Branchiostoma floridae. All 190 sequences obtained were used in a phylogenetic analysis, in the attempt of understanding the primordial function of the enzyme and defining possible groups of conserved aminoacids in the different families of ADLHs. These 190 sequences were also structurally modeled and the shape and volume of the channel where the aldehyde is placed to be oxidized were analyzed. Based on this information, it became possible to predict that the ALDHs moved from ancestral functions of corporal pattern control to a wider spectrum of protection functions. For the second analysis we submitted the complex formed by tridimensional structures of the transcriptional factors bond to DNA in different positions to processes of molecular mechanics, thermodynamic calculi and analysis of the hydrogen bonds, in order to predict the most probable sites of interaction between the receptors and the DNA. The model chosen for this analysis were the transcription factors regulated by retinoic acid, RAR and RXR, using the promoter region of the gene RARE-2 to assay the most probable binding regions of these factors. For this study, 71 protein-DNA complexes were built and submitted to processes of molecular mechanics and thermodynamic calculi. Based on the resulting data, it became possible to predict a region of greater affinity between the transcription factor and the DNA. The analyses of hydrogen bonds enabled us to define the exact region where the interaction between the transcription factor and the DNA takes place and also enabled us to describe the molecular interactions responsible for the specificity of this interaction.

Orientador: Michel Georges Albert Vincentz / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-09T01:42:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Silveira_AmandaBortolini_M.pdf: 20873886 bytes, checksum: 0c34c8a141f7bb11f8f3176ba7a976e0 (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: O crescimento e o desenvolvimento dos organismos são baseados na capacidade celular de expressão gênica diferencial que resulta, principalmente, do controle da taxa de iniciação da transcrição por fatores reguladores de transcrição (FTs). FTs do tipo Basic Leucine QQjJer(bZIP) fQram descritos em todos os eucariotos. Seu domínio conservado é constituído de uma região de ligação ao DNA rica em aminoácidos básicos, flanqueada a um zíper de leucinas responsável pela dimerização. Em angiospermas, os bZIPs são reguladores importantes de processos específicos como fotomorfogênese, desenvolvimento de órgãos, elongação celular, controle do balanço de carbono/nitrogênio, mecanismos de defesa, via de sinalização de hormônios e sacarose, controle osmótico e florescimento. Mostramos que os genomas de Arabidopsis thaliana e Orysa sativa codificam para um conjunto completo e não redundante de 76 e 113 fatores bZIP respectivamente, que foram organizados em 11 grupos de proteínas evolutivamente relacionadas e 33 Possíveis Grupos de Genes Ortólogos (PoGO) de mono e eudicotiledôneas, o que deve permitir racionalizar o processo de caracterização funcional destes fatores em angiospermas. O Grupo C, que inclui genes homólogos ao lócus de regulação Opaco-2 (02) de milho, está organizado em três PoGOS, que possivelmente desempenham três funções ancestrais de angiospermas. Em Arabidopsis estas três possíveis funções ancestrais estão representadas por quatro genes (bZIP' 02 !1omologous, Bzo2h), Bzo2h3/AtbZIP63 (PoGO C1), Bzo2h1/AtbZIP10 e Bzo2h4/ AtbZIP25 (PoGO C2) e Bzo2h2/AtbZIP9 (PoGO C3). Visando um melhor conhecimento sobre a evolução das funções dos fatores bZIP de angiospermas do Grupo C, iniciamos a caracterização funcional de~tes quatro reguladores, focando principalmente em AtbZIP9, um gene único representativo de uma função ancestral de angiospermas e cujo papel ainda é desconhecido. Notamos que a expressão de AtbZIP9 é restrita as células do floema e regulada por glicose, ácido abscísico e citocinina, sugerindo que este gene integra as vias de sinalização destes sinais metabólicos e hormonais no floema. Abordagens de genética reversa como RNAi, knockout e superexpressão não permitiram elucidar de maneira clara a atuação de AtbZIP9 no ciclo de vida de Arabidopsis, indicando que mecanismos de regulação pós-transcricional e/ou redundância genética atuam sobre este gene. Visando dar continuidade e ampliar o estudo funcional de AtbZIP9, foram obtidas linhagens transgênicas de Arabidopsis expressando versões modificadas deste gene que codificam para proteínas ativadoras constitutivas fortes da transcrição. Estas novas versões de AtbZIP9 são teoricamente capazes de ativar de maneira constitutiva a expressão dos genes alvos de AtbZIP9, contornando assim, as dificuldades decorrentes da análise de famílias gênicas que apresentam redundância funcional. Quando comparados a plantas selvagens, transformantes primários para ativadores constitutivos fortes apresentaram diversas alterações de morfologia foliar, além de mudanças metabólicas e fisiológicas como acúmulo de compostos fenólicos em folhas, sintomas de morte celular e senescência. A análise destes transformantes ainda sugere uma possível participação de AtbZIP9 no controle do desenvolvimento do sistema vascular de raízes e folhas. Suspeitamos que as alterações de morfologia foliar e fisiologia observadas possivelmente representem conseqüências de mudanças nas propriedades funcionais de transporte do floema, decorrentes de defeitos no processo de diferenciação e organização das células do cilindro vascular / Abstract: Transcriptional regulatory factors (TFs) play an important role in controlling growth and development of ali organisms. bZIPs TFs have been described in ali eukaryotes and are characterized by a basic aminoacid rich DNA binding domain and a leucine zipper, responsible for dimerization. bZIPs have been reported to act in several different plantspecific processes such as organ development, cell elongation, defense mechanism, hormones and sucrose signalization, light response, control of nitrogen/carbon balance, osmotic control and flowering. We showed that Arabidopsis thaliana and Orysa sativa genomes encode a complete and non-redundant set of 76 and 113 bZIP transcription factors, respectively, which were divided into 11 unique groups of homologous genes. More detailed phylogenetic analysis led to the identification of 33 Possible Groups of Monocot and Eudicot Orthologous Genes (PoGO), which allows rationalizing functional studies in angiosperms. Group C, which includes genes homologous to the maize Opaque-2 locus, is formed by three PoGOs, suggesting that this group represents three ancestral functions among angiosperms. In Arabidopsis these three possible ancestral functions may be represented by the bZIP Qpaque-2. homologous genes (Bzo2h), Bzo2h3/AtbZIP63 (PoGO C1), Bzo2h1/AtbZIP10 and Bzo2h4/AtbZIP25 (PoGO C2) and Bzo2h2/AtbZIP9 (PoGO C3). To get insight into the evolution pattern and function of Group C members, we have iniciated the functional characterization of the Bzo2h genes concentrating initially on AtbZIP9, a unique gene that represents an ancestral function and for which no functional informational is available. We showed that AtbZIP9 expression is restricted to phloem cells and regulated by glucose, abscisic acid and cytokinin, suggesting that this gene is an element of the signalization pathways of these metabolic and hormonal signals in the phloem. Reverse genetic approaches such as RNAi, knockout and superexpression failed to reveal the biological function of AtbZIP9 in Arabidopsis life cycle and suggested that post-transcriptional regulation and/or functional redundancy may act on AtbZIP9. In order to improve our Rnowledge on AtbZIP9 function, Arabidopsis transgenic lines expressing constitutive transcriptional activator versions of AtbZIP9 were obtained. Since such modified versions of AtbZIP9 are theoretically able to promote the superexpression of AtbZIP9 target genes, this strategy should be independent of functional redundancy. When compared to wild type plants, primary transformants for constitutive transcriptional activator versions of AtbZIP9 showed alterations of leaf morphology, as well as metabolic and physiologic modifications, such as phenolic compound accumulation in leaves, cell death and senescence symptoms. Analyses of this transformants also suggest that AtbZIP9 is possibly involved in the control of leaf and root vascular system development. We suspect that the alteration of leaf morphology and physiology observed in primary transformants possibly reflects consequences of changes in phloem transport functional properties, due to defects in vascular cylinder cell differentiation and organization / Mestrado / Genetica Vegetal e Melhoramento / Mestre em Genética e Biologia Molecular

Teak tree (Tectona grandis L.f.) has a high value in the timber trade for fabrication of woody products due to its extraordinary qualities of color, density and durability. Despite the importance of this species, genetic and molecular studies available are limited. Also, the lack of molecular information about secondary xylem and tree maturation has hindered genetic exploration of teak. Therefore, gene expression studies and transcriptomic profiling are essential to explore wood formation and lignin biosynthesis through the development and aging of vascular plants. Aiming the gene expression studies, it was essential to identify and clone reference genes for teak. Eight genes were tested, commonly used in qRT-PCR, including TgRP60S, TgCAC, TgACT, TgHIS3, TgSAND, TgTUB, TgUBQ and TgEF1a. Expression profiles of these genes were evaluated by qRT-PCR in six tissue and organ samples (leaf, flower, seedling, root, stem and branch secondary xylem). Stability validation by NormFinder, BestKeeper, geNorm and Delta Ct programs showed that TgUBQ and TgEF1a are the most stable genes to use as qRT-PCR reference genes in teak in the conditions tested. Due to the availability of 12- and 60-year-old teak trees, RNA-seq was performed in diferent organs (seedlings, leaves, flowers, root, stem and branch secondary xylem). A total of 462,260 transcripts were obtained by assembling with \"Trinity\" software. Also, 1,502 and 931 genes differentially expressed were identified for stem and branch secondary xylem, respectively, using DESeq program, and MYB transcription factors, which were characterized. TgMYB1 amino acid sequence displayed a predicted coiled-coil (CC) motif while TgMYB2, TgMYB3 and TgMYB4 showed R2R3-MYB domain. All of them were phylogenetically grouped with several gymnosperms and flowering plants. High expression of TgMYB1 and TgMYB4 in lignified tissues of 60-year-old trees was observed. In this work, the Cinnamyl Alcohol Dehydrogenase (CAD) gene family was also studied. One complete (TgCAD1) and three partial (TgCAD2 to TgCAD4) members were characterized. The four enzymes presented residues for catalytic and structural zinc action, NADPH binding and substrate specificity, consistent with the mechanism of alcohol dehydrogenases. TgCAD3 and TgCAD4 were highly expressed in young and mature sapwood and seem to be duplicated and highly related with lignin biosynthesis. Tree genetic improvement, marker-assisted selection and plant transformation seem to be promising lines of research for the data obtained from this research. This is the first study addressing gene characterization and expression, phylogeny and transcriptomic profiling in teak. / A árvore de teca (Tectona grandis L.f.) tem alto valor no comércio de madeira para a fabricação de produtos lenhosos, devido às suas qualidades extraordinárias de cor, densidade e durabilidade. Apesar da importância desta espécie, são poucos os estudos genéticos e moleculares disponíveis. Também, a falta de informação molecular sobre xilema secundário e maturação da árvore tem dificultado a exploração genética de teca. Assim, estudos de expressão gênica e perfis transcricionais são relevantes para explorar a formação da madeira e a biossíntese de lignina durante o desenvolvimento e envelhecimento das plantas vasculares. Visando os estudos de expressão gênica, foi essencial identificar e clonar genes de referencia para a teca. Foram testados oito genes comumente usados em qRT-PCR, TgRP60S, TgCAC, TgACT, TgHIS3, TgSAND, TgTUB, TgUBQ e TgEF1a. Perfis de expressão destes genes foram avaliados por qRT-PCR em seis amostras de tecidos e órgãos (folhas, flores, plântulas, raiz, xilema secundário de caule e ramo). A validação da estabilidade pelos programas NormFinder, BestKeeper, geNorm e Delta CT mostrou que TgUBQ e TgEF1a são os genes mais estáveis para usar como genes de referência em teca nas condições testadas. Em virtude da disponibilidade de árvores de teca de diferentes idades, entre 12 e 60 anos, foi realizado o RNAseq de diferentes órgãos (plântulas, folhas, flores, raiz, ramos e caules de árvores de 12 e 60 anos). Obteve-se um total de 462.260 transcritos pela montagem com o software \"Trinity\". Foram identificados 1.502 e 931 genes diferencialmente expressos para xilema secundário de caule e ramo, respectivamente, utilizando o programa DESeq e fatores de transcrição MYB, que foram posteriormente caracterizados. A sequência de aminoácidos do TgMYB1 exibiu um motivo \"coiled-coil\" (CC), enquanto TgMYB2, TgMYB3 e TgMYB4 mostraram domínio R2R3-MYB. Todos eles foram filogeneticamente agrupados com várias gimnospermas e angiospermas. Observou-se alta expressão do TgMYB1 e TgMYB4 em tecidos lignificados de árvores de 60 anos de idade. Neste trabalho também foi estudada a família gênica Cinamil álcool desidrogenase (CAD). Foi caracterizado um membro completo (TgCAD1) e três parciais (TgCAD2 a TgCAD4). As quatro enzimas apresentaram resíduos de ação catalítica e estrutural de zinco, de ligação ao NADPH e de especificidade de substrato, em conformidade com o mecanismo conservado de álcool desidrogenases. TgCAD3 e TgCAD4 foram altamente expressos no alburno jovem e maduro e parecem estar duplicados e relacionados com a biossíntese de lignina. O melhoramento genético de árvores, a seleção assistida utilizando marcadores moleculares e a transformação de plantas parecem ser linhas promissoras de pesquisa, a partir dos dados obtidos nesta pesquisa. Este é o primeiro estudo sobre caracterização e expressão gênica, filogenia e perfis transcricionais em teca.

INTRODUÇÃO: O meduloblastoma, tumor maligno do Sistema Nervoso Central mais comum em crianças, foi inicialmente descrito de forma uniforme em 1925 por Bailey e Harvey Cushing. A despeito do avanço diagnóstico e terapêutico, os índices de morbimortalidade persistem altos. Grupos epidemiologicamente semelhantes podem ter desfechos diferentes, e evoluções desfavoráveis ocorrem em pacientes com marcadores de bom prognóstico. Os avanços nas pesquisas em biologia molecular procuram explicar os diferentes comportamentos da doença, e de forma sistemática, buscam identificar genes que sirvam como alvos terapêuticos, já que o tratamento disponível atualmente ainda é bastante insatisfatório e com muitos efeitos colaterais. Simeone e colaboradores identificaram os genes OTX1 e OTX2, presentes em humanos, e cuja função é organizar, compartimentalizar e hierarquizar a formação do sistema nervoso central, especialmente o cerebelo. Os genes OTX1 e OTX2 são expressos no tecido cerebelar em humanos até a nona semana de vida extra-uterina, exclusivamente. Os mesmos autores também identificaram que os mesmos genes são alvo terapêutico do ácido transretinóico, que inibe a expressão gênica. Estudos prévios demonstraram a expressão dos genes OTX1 e OTX2 em meduloblastomas, o que torna o ácido uma potencial terapêutica para estes tumores, assim como os genes OTX1 e OTX2 potenciais alvos para desenvolvimento de novas drogas terapêuticas. OBJETIVOS: Estudar a prevalência dos genes OTX1 e OTX2 em uma amostra de 60 pacientes, e estabelecer correlações entre a expressão gênica e aspectos clínicos, patológicos e de evolução. CASUÍSTICA E MÉTODO: Realizada análise retrospectiva de 60 pacientes com diagnóstico meduloblastoma, operados no Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo, e no Hospital do Câncer de Barretos. Organizado um banco de dados de 60 pacientes contendo dados da expressão gênica dos genes OTX1 e OTX2 (obtida através da técnica de PCR em tempo real) e dados clínico-epidemiológicos. Realizados testes estatísticos para se estabelecer correlação entre dados clínico-patológicos e de expressão gênica. RESULTADOS: O gene OTX1 foi expresso em 52% da população estudada, e tal expressão variou com a idade (sendo maior em adultos), localização (preferência por hemisfério) e tipo histológico (desmoplásico). O gene OTX2 foi expresso em 62% da população estudada, e tal expressão variou com a idade (sendo maior quanto menor a faixa etária), localização (preferência por vérmis) e tipo histológico (clássico). Houve correlação estatística entre a expressão do gene OTX2 e o desenvolvimento de metástases leptomeníngeas. CONCLUSÕES: Na população estudada, a expressão dos genes OTX1 e OTX2 corrobora a impressão de seu papel importante na patogênese dos meduloblastomas, e é dependente da idade do paciente, da localização tumoral e do tipo histológico. Dada a sensibilidade do gene ao ácido transretinóico, a identificação deste perfil populacional pode significar no futuro novas perspectivas de tratamento. / INTRODUCTION: Medulloblastoma, the most common malignant tumor of the central nervous system in children, was first uniformly described in 1925 by Bailey and Harvey Cushing. Despite the diagnostic and therapeutic advances, the morbidity and mortality rates remain high. Epidemiologically similar groups may have different outcomes, and adverse developments occur in patients with markers of good prognosis. Advances in molecular biology research seeks to explain the different behaviors of the disease, and consistently seek to identify genes that serve as drug targets, since the treatment currently available is still unsatisfactory and with many side effects. Simeone and colleagues identified genes OTX1 and OTX2 in humans, and whose function is to organize, prioritize and compartmentalize the formation of the central nervous system, especially the cerebellum. OTX1 and OTX2 genes are expressed in cerebellar tissue in humans until the ninth week of extra uterine life, exclusively. The same authors also found that the same genes are therapeutic target of trans-retinoic acid, which inhibits gene expression. Previous studies have demonstrated the expression of OTX1 and OTX2 genes in medulloblastomas, which makes the acid a potential therapy for these tumors, as well as the genes OTX2 and OTX1 potential targets for developing new therapeutic drugs. OBJECTIVES: To study the prevalence of OTX1 and OTX2 genes in a sample of 60 patients, and to establish correlations between gene expression and clinical, pathological and follow up aspects. CASUISTICS AND METHODS: A retrospective analysis of 60 patients diagnosed with medulloblastoma, assisted at Hospital of the Faculty of Medicine, University of São Paulo, and the Cancer Hospital of Barretos. Organized a database of 60 patients which contains the gene expression of OTX1 and OTX2 genes (obtained through the technique of real-time PCR) and clinical and epidemiological data. Performed statistical tests to establish a correlation between clinical-pathological and gene expression. RESULTS: The OTX1 gene was expressed in 52% of the population studied, and such expression varied with age (being higher in adults), location (preferably by hemisphere) and histology (desmoplastic). The OTX2 gene was expressed in 62% of the studied population, and such expression varied with age (being higher the younger the age group), location (preferably vermis) and histological type (classical). A statistical correlation between the expression of OTX2 gene and development of leptomeningeal metastases was observed. CONCLUSIONS: In the studied population, the expression of OTX1 and OTX2 genes corroborates the impression of his role in the pathogenesis of medulloblastomas, and is dependent on patient age, tumor location and histological type. Given the sensitivity of the gene-trans retinoic acid, the identification of the population profile in the future will represent new opportunities for treatment.

A resistência aos antibióticos é um problema de saúde pública global com sérias consequências para o tratamento de várias infecções bacterianas. Os fatores de transcrição da família MarR têm sido descritos controlando resistência a antibióticos e vários outros processos em bactérias. Neste trabalho, estudamos mecanismos de resistência a antibióticos em Chromobacterium violaceum, uma bactéria Gram-negativa ambiental que pode atuar como um patógeno oportunista em humanos. A estratégia envolveu a varredura de um painel de treze linhagens mutantes de fatores de transcrição da família MarR de C. violaceum disponíveis, por testes de susceptibilidade a 24 antibióticos. Estes ensaios revelaram que apenas o mutante ?emrR apresentou resistência aumentada ao antibiótico ácido nalidíxico em relação à linhagem selvagem. Esta resistência aumentada do mutante ?emrR ao ácido nalidíxico foi revertida em uma linhagem complementada deste mutante, conforme verificado por ensaios de viabilidade, ensaios de difusão em disco e concentração inibitória mínima (MIC). O fenótipo de diminuída produção de violaceína deste mutante, observado em meio líquido, também foi complementado. Além disso, foi realizado o isolamento de mutantes espontâneos de C. violaceum resistentes a ácido nalidíxico com mutação pontual em emrR. Os ensaios de microarranjo de DNA mostraram que EmrR reprime algumas dezenas de genes, incluindo o operon emrCAB, o qual codifica a bomba de efluxo EmrCAB. Os ensaios de Northern blot confirmaram que o EmrR reprime o operon emrCAB, e que a expressão desta bomba é induzida por salicilato, mas não outros compostos, como ácido nalidíxico ou brometo de etídeo. Os ensaios de alteração de mobilidade eletroforética (EMSA) mostraram que a proteína EmrR purificada se liga diretamente às 8 regiões promotoras de emrR, emrCAB e vários outros genes do regulon EmrR, para exercer uma regulação negativa direta sobre esses genes. Um mutante nulo ?emrCAB foi obtido, mas a ausência desta bomba de efluxo não tornou C. violaceum mais susceptível ao ácido nalidíxico, sugerindo que ela é importante somente em condições nas quais é induzida. Estas condições indutoras talvez incluam estresse oxidativo, uma vez que enzimas antioxidantes são parte do regulon de EmrR e a proteína EmrR formou dímeros covalentes na presença de agentes oxidantes in vitro. Portanto, nossos dados revelam que mutações pontuais ou moléculas como salicilato abolem a atividade repressora do fator de transcrição EmrR sobre o operon emrCAB, levando a superexpressão da bomba de efluxo EmrCAB e aumentando a resistência ao ácido nalidíxico em C. violaceum. / Antibiotic resistance is a global public health problem with serious consequences for the treatment of various bacterial infections. MarR family transcription factors have been described controlling antibiotic resistance and several other processes in bacteria. In this work, we studied mechanisms of antibiotic resistance in Chromobacterium violaceum, an environmental Gramnegative bacterium that can act as a human opportunistic pathogen. The strategy involved a screening of an available collection of thirteen C. violaceum mutant strains of MarR family transcription factors, by susceptibility testing for 24 antibiotics. These assays revealed that only the ?emrR mutant showed increased resistance to the antibiotic nalidixic acid in relation to the wild-type strain. This increased resistance of the ?emrR mutant to nalidixic acid was reversed in a complemented strain of this mutant, as verified by viability, disk diffusion, and minimal inhibitory concentration (MIC) assays. The phenotype of decreased violacein production of this mutant, observed in a liquid medium, was also complemented. In addition, it was performed the isolation of spontaneous mutants of C. violaceum resistant to nalidixic acid with a point mutation in emrR. DNA microarray assays showed that EmrR represses a few dozen of genes, including the emrCAB operon, which encodes the EmrCAB efflux pump. Northern blot assays confirmed that EmrR represses the emrCAB operon and that the expression of this pump is induced by salicylate, but not other compounds, such as nalidixic acid or ethidium bromide. Electrophoretic mobility shift assays (EMSA) showed that the purified EmrR protein binds directly to the promoter regions of emrR, emrCAB and several other genes of the EmrR regulon, to exert a direct negative regulation of these genes. A ?emrCAB null mutant strain was obtained, but the absence of this efflux pump did not make C. violaceum more susceptible to nalidixic acid, suggesting that it is important only under conditions in which it is induced. These inducing conditions may include 10 oxidative stress since antioxidant enzymes are part of the EmrR regulon and the EmrR protein has formed covalent dimers in the presence of oxidizing agents in vitro. Therefore, our data reveal that point mutations or molecules such as salicylate abolish the repressive activity of the EmrR transcription factor on the emrCAB operon, causing overexpression of the EmrCAB efflux pump and increasing the resistance to nalidixic acid in C. violaceum.

Orientadores: Ricardo Aparicio, Marcelo Menossi Teixeira / Dissertação (mestrado) - Universidade Esstadual de Campinas, Instituto de Quimica / Made available in DSpace on 2018-08-12T12:36:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Kiyota_Eduardo_M.pdf: 3864663 bytes, checksum: fb929727fccb0492142f162a1eca404e (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: Os fatores de transcrição do tipo bZIP estão presentes em organismos eucariotos e estão envolvidos na regulação da expressão gênica e no controle de muitos processos intracelulares. Esses fatores se ligam a seqüências específicas no DNA e são capazes de reconhecer seqüências reguladoras no promotor de um gene. As bZIPs são caracterizadas por uma região conservada rica em resíduos de aminoácidos básicos, e um zíper de leucinas, que possui repetições de uma seqüência de aminoácidos hidrofóbicos onde há uma leucina que ocupa a mesma posição a cada 7 resíduos. Estudos estruturais com bZIPs mostraram que essas proteinas enovelam-se na forma de uma extensa hélice-a e são capazes de formar dímeros através de um arranjo do tipo coiled- coil. Neste trabalho, a parte correspondente à região básica e ao zíper de leucinas de duas bZIPs, SCF5 e SCF12 de cana-de-açúcar, pertencentes a sub-famílias diferentes, foram clonadas, expressas e purificadas para estudos estruturais. O DNA correspondente a SCF12 foi clonado em pET28a e a proteína recombinante foi produzida em E. coli BL21 (DE3) pRil. A SCF12 purificada por cromatografia de afinidade (IMAC) teve sua estrutura secundária caracterizada por dicroísmo circular. A SCF5, clonada em pET3C e expressa em E. coli BL21 (DE3) pLysS foi purificada por cromatografia de troca catiônica. Cristais de um complexo da proteína ligada a uma seqüência de DNA de 24 pares de bases foram obtidos mas não exibiram qualidade suficiente para permitir a determinação da estrutura cristalográfica. Entretanto, foi possível obter um modelo do complexo a partir de experimentos de espalhamento de Raios X a baixos ângulos (SAXS, do inglês Small Angle X-Ray Scattering) em solução, e interpreta-lo à luz de estruturas de homólogas já conhecidas. / Abstract: The bZIP transcription factors are present in eukaryotic organisms and are involved in the regulation of gene expression and many intracellular processes. These factors bind specific DNA sequences and are able to recognize regulatory sequences of a gene promoter. The bZIPs are characterized by a conserved region rich in basic amino acid residues as well as by having the leucine zipper region, which possess a sequence of hydrophobic residues where there are leucines every seventh amino acids. Structural studies have shown that bZIP-folding is alpha-helical and these proteins are capable of dimmer formation via coiled-coil arrangement. In this work, the basic region and the leucine zipper of two sugarcane bZIPs, SCF12 and SCF5, belonged to two different bZIP-families were cloned, expressed and purified for structural studies. The corresponding SCF12 DNA was cloned into pET28a expression vector and the protein was produced in E. coli BL21 (DE3) pRil cells. SCF12 protein was purified by affinity chromatography (IMAC) and had its secondary structure characterized by CD. SCF5, cloned into pET3c and expressed in E. coli BL21 (DE3) pLysS was purified by cation exchange chromatography. Crystals of a complex formed by SCF5 protein and a 24-base-pair DNA sequence were obtained but unfortunately with quality insufficient for crystallographic structure determination. However, it was possible to obtain a model of the analyzed complex applying Small Angle X-ray Scattering (SAXS) technique by protein homologous structure comparison. / Mestrado / Físico-Química / Mestre em Química

Orientador: Fabio Papes / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-24T14:16:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tolentino_FelipeThadeu_M.pdf: 9244448 bytes, checksum: deea9f7963e05d8a997d9b5a554f9708 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: O Sistema Sensorial Olfativo de mamíferos é composto por vários subsistemas na cavidade nasal. Dentre estes, destacam-se o sistema olfativo principal e o sistema olfativo acessório ou vomeronasal. O primeiro realiza a detecção geral de odores e parece participar também da detecção de algumas substâncias que levam a respostas comportamentais instintivas (feromônios), enquanto o último é especializado na detecção desta classe de semioquímicos. A detecção dos estímulos sensoriais olfativos resulta em informações importantes que dependem de vias complexas para sua interpretação e para a geração de respostas apropriadas por parte do sistema nervoso central. Existem vários pontos ainda desconhecidos sobre o funcionamento do sistema olfativo, tanto no que diz respeito aos mecanismos moleculares subjacentes à escolha dos receptores a serem expressos por um dado neurônio sensorial ¿ sendo que cada neurônio olfativo expressa apenas um receptor dentro de uma grande família multi-gênica ¿ quanto em relação ao processamento da informação sensorial em centros cerebrais superiores. Neurônios sensoriais olfativos cultivados eficientemente in vitro seriam extremamente úteis, pois poderiam ser utilizados como ferramenta para o estudo destes problemas, como a investigação da atividade das células sensoriais olfativas, possibilitando, por exemplo, uma melhor compreensão dos mecanismos genéticos e moleculares por trás da expressão dos receptores olfativos e de suas propriedades de detecção. Neste trabalho foram desenvolvidas ferramentas baseadas em vetores retrovirais com o objetivo de induzir a diferenciação celular de neurônios olfativos in vitro, utilizando uma combinação de fatores de transcrição, por meio de transdução viral em células-alvo (fibroblastos murinos). Os retrovírus produzidos foram testados e algumas combinações de fatores de transcrição foram preliminarmente testadas, sendo capazes de induzir mudanças moleculares em fibroblastos acompanhadas da expressão de marcadores de neurônios sensoriais olfativos / Abstract: The mammalian Olfactory System enables the vast majority of animal species to identify the presence and quality of food, predators, competitors, conspecifics and potential mates in the environment. Olfactory stimuli detected by sensory neurons are interpreted by brain processing pathways to generate appropriate behavioral and endocrine responses. Despite its central importance in mammalian physiology, several aspects about the biology of this sensory system remain uncharacterized. For example, it is known that each olfactory sensory neuron (OSN) in the nasal cavity expresses only one gene out of a large multi-gene family coding for receptors involved in odorant and pheromone detection. However, the molecular mechanisms behind this process of olfactory receptor gene choice are not fully understood. The study of this and many other aspects of olfaction has been made difficult by the lack of appropriate in vitro cellular models. An efficient way to obtain cultured OSNs would thus be extremely useful, enabling researchers to investigate the sensory neuron¿s activity in a controllable environment, avoiding obstacles imposed by the cellular heterogeneity found in sensory organs in vivo. In this study, we aimed at obtaining OSNs directly differentiated from mouse embryonic fibroblasts (MEF) using the forced expression of specific transcription factors via retroviral vectors. We therefore developed tools based on retroviral vectors with the objective of differentiating olfactory sensory neurons in vitro, using viral transduction in target cells (murine fibroblasts) with combinations of select transcription factors. Retroviruses were tested and some combinations of transcription factors were tested on a preliminary basis, which were capable of inducing molecular alterations on fibroblasts followed by the expression of olfactory sensory neuron markers / Mestrado / Genetica Animal e Evolução / Mestre em Genética e Biologia Molecular