Made available in DSpace on 2015-12-06T23:47:12Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Howard Hughes Medical Institute (HHMI) / World Health Organization (WHO) / O tema deste trabalho é estudar alguns fatores importantes de patogenicidade de fungos do Filo Ascomycota e sua correlação com padrões da dinâmica da expressão gênica na perspectiva da Evolução Molecular. Decidimos concentrar nossos esforços iniciais nas questões de sistemática deste grupo, uma vez que a sistemática do Filo Ascomycota, tal como inferida por métodos atuais, apresenta politomias basais, indicando portanto, controvérsias na reconstrução dos eventos de radiação evolutiva de seus principais taxa. A análise molecular descrita neste trabalho sugere a existência de dois grupos na posição basal entre os ascomicetos filamentosos: os Discomycetes e os Pyrenomycetes. Foram propostos dois cenários para os principais eventos de radiação daquele filo, o primeiro localizando os principais eventos na era Proterozóica e o segundo, na era Paleozóica. Para tanto, geramos um alinhamento de 166 seqüências da subunidade menor do gene ribossômico 18S (SSU rDNA 18S), representativas de todos os filos de Fungi e utilizamos como base para uma análise filogenética Bayesiana. A filogenia sugeriu que os Discomycetes são o grupo basal dentre os ascomicetos filamentosos e provavelmente mantém caracteres ancestrais visto que seus representantes estão espalhados entre outros grupos de fungos filamentosos. Verificamos que a taxa evolutiva de heterogeneidade do filo Ascomycota rejeita a hipótese nula de um relógio molecular global. Para datar os principais eventos da radiação deste filo, foi utilizado o método “penalized likelihood”, e para calibração, foram incluídos um fóssil de Pyrenomycete datado em 400 Ma e considerados dois diferentes cenários encontrados na literatura, um com uma data estimada de 1.576 Ma para a separação entre planta-animal-fungo e outro, com data estimada de 965 Ma para a separação entre animal-fungo. Estimativas baseadas no primeiro cenário são mais antigas do que datas propostas em estudos anteriores baseados em seqüências do rDNA 18S, mas corroboram estimativas baseadas em análises de multiproteínas, sugerindo que a radiação dos principais grupos de Ascomycota ocorreu na era Proterozóica. Durante o processo evolutivo, fatores de patogenicidade surgiram dentro do filo Ascomycota e são encontrados em fungos dos grupos Pezizomycetes, Archiascomycetes e na Ordem Saccharomycetales. Candida albicans, o patógeno humano oportunista mais frequentemente isolado, é um representante desta ordem. Sua capacidade de formar biofilmes confere propriedades importantes para processos infectivos e colonização de diversos substratos, sendo ainda muito efetiva na resistência às drogas antifúngicas. A descrição e dinâmica dos componentes moleculares da matriz do biofilme, associados com as mudanças no metabolismo celular, poderiam explicar, pelo menos em parte, as propriedades em macro escala desta importante estrutura. Utilizando espectrometria de massa identificamos a enolase como um dos principais componentes da matriz do biofilme de Candida. Ainda, a presença de enolase na superfície celular foi confirmada por imunofluorescência. Caracteristicamente, por ser uma enzima citosólica que participa da via glicolítica, a enolase não possui sinal de secreção, no entanto, verificamos que a proteína é possivelmente glicosilada e fosforilada. Análises de degradação e recaptação mostraram que a proteína é degradada a 37o C e não é recaptada pela parede celular, sugerindo que exista uma via de secreção não-clássica por onde a enolase possa ser secretada para o biofilme e para a superfície celular sem ser degradada no meio externo. A expressão da enolase (ENO1) e das enzimas da via glicolítica como a hexoquinase, piruvatoquinase e aldolase (HXK1, HXK2, PYK1 e FBA1) de 14 diferentes linhagens de C. albicans que foram cultivadas em condições de crescimento como biofilme, microaerofilia, hifas e leveduras, não mostraram variação significativa, sugerindo que a condição de crescimento não afeta a expressão desses genes nas diferentes linhagens analisadas. Os genes ALS3 e HWP1 codificadores de adesinas tiveram a expressão diminuída em pelo menos 4 vezes em resposta a diminuição da expressão dos genes TEC1 e BCR1 que controlam a formação biofilme. Este tipo de regulação sugere que mecanismos de “feedforward” possam estar presentes nesta rede regulatória. A principal adesina da parede celular das hifas é Hwp1p, necessária para a formação apropriada de hifas e virulência em candidíase sistêmica. Nós descrevemos um novo alelo de HWP1 (HWP1-2), que não possui três importantes regiões, em comparação com o alelo descrito anteriormente (HWP1-1). As regiões 1 e 2 consistem de 10 aminoácidos repetidos em seqüência, importantes para a conformação funcional de cadeias peptídicas e a adesão das células de C. albicans ao epitélio de mamíferos. A região 3 é composta de 34 aminoácidos que promovem a ligação cruzada com outras proteínas na superfície de C. albicans. As linhagens homozigota para HWP1-2 (L757) e heterozigota (L296) têm níveis significativamente mais baixos na expressão de HWP1 durante a formação de hifas e biofilme, em comparação com a linhagem SC5314 (homozigota para HWP1-1). L757 teve crescimento na forma de hifa reduzido (40,4%) e diminuída a formação de biofilme (90,8%), sugerindo que a Hwp1-2p é menos eficiente para manter a adesão célula-célula e célula-superfície durante a formação do biofilme. Em conjunto nossos resultados mostram que as propriedades patogênicas de fungos não podem ser seriamente estudadas sem uma sólida base em sistemática molecular apoiada, por sua vez, nos métodos explicitamente quantitativos das áreas de Estatística, Teoria de Sistemas Dinâmicos e algoritmos computacionais. / The aim of this work is the study of factors that are important for the pathogenicity of the main fungi within phylum Ascomycota and its correlation with expression patterns on the perspective of Molecular Evolution. We decided to elucidate questions concerning the systematics of this group, since the actual systematics of the Ascomycota phylum is depicted as basal polytomies. The molecular analysis described in this work indicates two groups in the basal position among filamentous ascomycetes: Discomycetes and Pyrenoycetes. Also, two scenarios are proposed for the major radiation events within that phylum, one places the major events in the Proterozoic era and the other, in the Paleozoic era. Accordingly, we generated a dataset of 166 small subunit (18S) rDNA sequences, representative of all groups of Fungi and used as input in a Bayesian phylogenetic analysis. This phylogeny suggests that Discomycetes are a basal group of filamentous ascomycetes and probably maintain ancestor characters since their representatives are intermingled among other filamentous fungi. Also, we show that the evolutionary rate heterogeneity within Ascomycota rejects the null hypothesis of a global molecular clock. To estimates the dates of major radiation events, we used the penalized likelihood method and for calibration we included a 400 My Pyrenomycete fossil. Two distinct scenarios were considered, being, one with an estimated date of 1.576 Myr for the plant–animal–fungus split and the other with an estimated date of 965 Myr for the animal–fungus split. Estimates under the first scenario are older than dates proposed in previous studies based on small subunit rDNA sequences but support estimates based on multiprotein analysis, suggesting that the radiation of the major Ascomycota groups occurred into the Proterozoic era. Pathogenic factors have evolved within Ascomycota and can be found in fungi of Orders Pezizomycetes, Archiascomycetes and Saccharomycetales. Candida albicans, the most frequently isolated human opportunistic pathogen, is representative of this Order. Its ability to form biofilms is a very important factor during the infection process, colonization of several solid substrates and confers significant resistance to antifungal drugs. Components of the biofilm matrix associated with changes in the cellular metabolism could, at least in part, explain its macro-scale properties. We identified that enolase is a major component of the Candida biofilm matrix by using mass espectrometry and confirmed its presence in the cell surface by immunefluorescence. Characteristically of cytosolic enzymes that participate of the glycolytic pathway, enolase does not possess signal for secretion, however, we verified that this protein can be putatively glycosylated and phosphorylated. Degradation and reuptake analyses of enolase demonstrated that it is degraded at 37o C and it is not reuptaked by the cell wall, which suggests that there is a non-classical secretory pathway by where enolase can be sent to the biofilm matrix and the cell surface protected against the external medium degradation. No significant variation in the expression of enolase (ENO1) and glycolytic pathway enzymes hexokinase, pyruvate kinase and aldolase (HXK1, HXK2, PYK1 and FBA1) were observed among 14 different lineages of C. albicans grown in biofilm, microaerophilia, hyphal induced and yeast induced conditions. Adhesin encoding genes ALS3 and HWP1 showed diminished expression levels (at least 4-fold) in response to the down regulation of biofilm control genes TEC1 and BCR1. This suggests that expression levels of ALS3 and HWP1 can be regulated by feedforward mechanisms. The major C. albicans hyphae cell wall adhesin, Hwp1p, is necessary for hyphae formation and virulence in systemic candidiasis. We described a novel HWP1 allele (HWP1-2) lacking three important regions as compared to the previously described allele, HWP1-1. Regions 1 and 2 consist of 10 amino acid repeats important for functional conformation of peptide chains and attachment of C. albicans cells to the mammalian epithelia. Region 3 consists of 34 amino acid that promote the cross-linking with other proteins on C. albicans surface. The HWP1-2 homozygous (L757) and heterozygous (L296) strains have significantly lower levels of HWP1 expression during hyphal growth and biofilm formation compared to the strain SC5314 (HWP1-1). L757 has reduced hyphal growth (40.4%) and impaired biofilm formation (90.8%), suggesting that the HWP1-2p is less efficient to maintain cell-to-cell and cell-to-surface adhesion during biofilm formation. Our results clearly show that any study of fungal pathogenicity factors have to be solidly based on molecular systematics, which in turn, has to be grounded on the explicitly quantitative methods of Statistics, Dynamic Systems Theory and computational algorithms. / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Made available in DSpace on 2014-08-26T17:15:00Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) 60.pdf: 1087420 bytes, checksum: d43c3b6da28a66b2ee5f2ae5c11fc7ae (MD5) Previous issue date: 2010 / Cronobacter spp. (Enterobacter sakazakii) são patógenos emergentes associados a surtos de meningite, enterocolite necrosante e septicemia em neonatos em diversos países. A taxa de mortalidade relatada varia de 40 a 80% e os sobreviventes apresentam seqüelas neurológicas severas. O desenvolvimento da infecção está associado ao consumo de fórmulas infantis desidratadas. As metodologias atualmente disponíveis para o isolamento de Cronobacter spp. apresentam discrepâncias e a identificação bioquímica não é esclarecedora. Assim, torna-se necessário que metodologias confiáveis para o isolamento e identificação desses micro-organismos estejam disponíveis. Outro ponto ainda não esclarecido são os mecanismos de virulência utilizados por esses patógenos para o desenvolvimento de infecções em humanos. Os objetivos desse estudo foram o desenvolvimento de um método rápido e eficiente para a identificação de Cronobacter spp., a avaliação do perfil de resistência a antimicrobianos e a avaliação da presença de alguns fatores de virulência. Foram utilizadas inicialmente cepas de referência de Cronobacter spp e 37 isolados previamente identificados como pertencentes ao gênero. O novo protocolo foi considerado 100% sensível e específico quando comparado aos demais métodos utilizados, indicando sua utlidade. O estudo de fatores de virulência revelou que Cronobacter spp. tem desenvolvido resistência aos β-lactâmicos e cefalosporinas, é capaz de formar cápsula, biofilme, e apresentar atividade de protease e atividade hemolítica. Nesse estudo relata-se pela primeira vez a presença de hemaglutininas associadas a pili tipo 3, enquanto algumas cepas apresentaram hemaglutininas associadas a pili tipo 1. Também foi demonstrada a atividade citotóxica em células Vero e a capacidade de invasão dessas células por Cronobacter spp. Os resultados desse estudo sugerem que todas as espécies do gênero Cronobacter apresentam potencial patogênico e que autoridades de saúde pública, produtores de alimentos e pessoas responsáveis pelo cuidado de indivíduos que fazem parte dos grupos de risco devem dedicar especial atenção ao controle de ambientes e à qualidade microbiológica de produtos destinados a esses grupos de modo a minimizar o risco de infecção por esses micro-organismos. / Cronobacter spp. (Enterobacter sakazakii) is an emerging foodborne pathogen associated with outbreaks of meningitis, necrotizing enterocolitis and sepsis in neonates in different countries. The reported mortality rate ranges from 40 to 80% and the survivors present severe neurological sequela. Development of the infection is associated with the consumption of powdered infant formula. The available methodologies employed for the isolation of Cronobacter spp. lack the necessary specificity and the biochemical identification remains non-conclusive. For these reasons, it is necessary to develop reliable methodologies for the isolation and identification of these microorganisms. Another issue still to be clarified refers to the virulence mechanisms associated with human infections. The objectives of this study were to develop a rapid and efficient method to identify Cronobacter, to evaluate the antimicrobial resistance of the strains, and to evaluate the presence of some virulence factors. Initially, reference strains of Cronobacter, and 37 isolates that had been previously identified as members of the genus were used. The proposed protocol showed 100% sensitivity and specificity when compared to the other methods used, indicating its usefulness. Studies on virulence factors revealed that Cronobacter spp. has developed resistance to β-lactams and cephalosporins, is able to form capsule, biofilm, and presents protease and hemolytic activities. This study reports, for the first time in literature, the presence of hemagglutinins associated with type 3 pili and it was also shown that some strains presented previously described hemagglutinins associated with type 1 pili. Cytotoxic activity in Vero cells and the invasiveness of these cells by Cronobacter spp were also demonstrated. The results of this study suggest that all species of the genus Cronobacter have pathogenic potential and public health authorities, food producers and caregivers should pay careful attention to issues associated with environment control and with the microbial quality of the products associated with the risk groups in order to minimize the risk of infection with these microorganisms.

Made available in DSpace on 2016-04-20T12:49:38Z (GMT). No. of bitstreams: 2 amanda_tucci_ioc_mest_2015.pdf: 5122366 bytes, checksum: 8fea49a02fa58dc27c0339860fdb91fd (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2015 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A diversidade genética do Trypanosoma cruzi influencia diferentes parâmetros biológicos e tem sido apontada como fator importante para o desfecho clínico da doença de Chagas. A expressão diferencial de genes e proteínas entre as diferentes DTUs do T. cruzi parece determinar a virulência do parasito e sua capacidade de subverter a resposta imune e persistir no hospedeiro mamífero. Dentre o repertório de moléculas de superfície dos parasitos envolvido no reconhecimento celular, destacamos as proteínas de ligação à heparina (PLHs) que atuam no ciclo de vida de diferentes patógenos intracelulares, incluindo o T. cruzi. PLHs desempenham importante papel na citoaderência e entrada do T. cruzi através do reconhecimento de proteoglicanos de heparam sulfato (PGHS) na superfície de células de mamíferos. O mecanismo de invasão disparado pela interação PLHs-PGHS, assim como a presença de PLHs em T. cruzi de diferentes genótipos (TCI e TCII) ainda não foi elucidado. O presente estudo teve como objetivo avaliar a expressão de PLHs e glicoproteínas (GPs), gp35/50, gp82 e gp90, envolvidas na invasão de tripomastigotas derivados de cultivo celular (TCT), tripomastigotas sanguíneos (BT) e metacíclicos (MT) de T. cruzi da cepa Y (TcII) e isolado silvestre SMM36 (isolado de espécimes de Triatoma vitticeps da região de Santa Maria Madalena, RJ; Zimodema 3), bem como sua atuação nos eventos de internalização destes parasitos. A expressão e localização subcelular de PLHs e GPs em T. cruzi foi determinada pela incubação por 1h no gelo de tripomastigotas com 20\03BCg/mL de heparina ou heparam sulfato (HS) conjugados à biotina seguido de processamento para citometria de fluxo e microscopia de fluorescência As análises de citometria de fluxo revelaram que tripomastigotas (TCT, BT e MT) de diferentes genótipos (cepa Y e isolado SMM36) possuem uma expressão diferencial de PLHs e GPs em sua superfície. TCTs e BT (cepa Y) possuem elevada expressão de PLHs comparado aos MTs. Cerca de 90% da população de TCTs apresentam marcação positiva para PLHs enquanto apenas 10-25% dos MTs possuem esta proteína expressa na superfície. Em contraste, MTs apresentam níveis mais elevados de gp35/50, gp82 e gp90 comparados aos TCTs. A localização subcelular de PLHs em domínios de sinalização do T. cruzi é bastante peculiar. Em TCTs e BT (cepa Y), PLHs estão localizadas na membrana flagelar enquanto as GPs estão distribuídas ao longo do corpo do parasito (TCT e MT), exceto gp90 que é negativa nos TCTs. Ainda, a capacidade invasiva dos parasitos e o papel de proteoglicanos sulfatados foi analisada utilizando células de ovário de hamster chinês competentes (CHO-K1) e mutantes deficientes em glicosaminoglicanos (CHO-745) como modelo experimental de invasão. Os dados quantitativos da infecção revelaram que TCTs (cepa Y e isolado SMM36) são mais infectivos que MTs. TCTs alcançaram um perfil de infecção entre 52-85% após 2h de interação com CHO-K1, de acordo com a razão parasito-célula alvo, enquanto MTs atingiram o máximo de 6% de infecção neste tempo de interação Embora o percentual de infecção tenha sido similar entre TCTs dos diferentes genótipos, a análise do índice endocítico revelou maior eficiência do isolado SMM36 na invasão, apresentando valores cerca de 40% maior de parasitos interiorizados. Ainda, CHO-745 infectadas com TCT (Y e SMM36) apresentaram redução de aproximadamente 30% nos níveis de infecção quando comparadas a CHO-K1. Este fenômeno não foi observado em MTs mesmo após 24h de interação, cujo percentual de infecção alcançou 37% na maior relação parasito-célula alvo (60:1). Este conjunto de dados sugere que a interação PLHs-PGHS possa disparar vias de sinalização importantes para entrada de parasitos que expressam elevados níveis de PLHs em sua superfície. O mecanismo de invasão mediado pela interação PLHs-PGHS será alvo de futura investigação / The genetic diversity of Trypanosoma cruzi influences different biological parameters and has been identified as an important factor for the clinical outcome of Chagas’ disease. The differential gene and protein expression between different DTUs of T. cruzi seems to determine the virulence of the parasite and its capacity to subvert the immune response and persist in the mammalian host. Among the surface molecules repertoire of parasites involved in cell recognition, we highlight the heparin binding proteins (PLHs) acting in the life cycle of different intracellular pathogens, including T. cruzi. PLHs play an important role in cytoadherence and entrance of T. cruzi by recognizing heparan sulfate proteoglycan (PGHS) in the mammalian cell surface. The mechanism of invasion triggered by PLHs-PGHS interaction, as well as the presence of PLHs in different genotypes (TCI and TCII) of T. cruzi has not yet been elucidated. This study aimed to evaluate the expression of PLHs and glycoproteins (GPs), GP35/50, gp82 and gp90, involved in the invasion of cell culture derived trypomastigotes (TCT), bloodstream trypomastigotes (BT) and metacyclics (MT) of T. cruzi of Y strain (TCII) and the sylvatic isolate SMM36 (isolated from specimens of Triatoma vitticeps from Santa Maria Madalena region, RJ; Zymodeme 3), as well as their role in the events of internalization of these parasites. Expression and subcellular localization of PLHs and GPs in T. cruzi was determined by incubation for 1 h on ice of trypomastigotes with 20μg/mL of biotin-conjugated heparin or heparan sulfate (HS) followed by processing for flow cytometry and fluorescence microscopy. The flow cytometry analysis showed that trypomastigotes (TCT, BT and MT) of different genotypes (Y strain and SMM36 isolate) have differential expression of PLHs and GPs on their surface. TCTs and BT (Y strain) have high expression of PLHs compared to MTs. About 90% of TCT population has positive labeling to PLHs while only 10-25% of MTs have expressed this protein on the surface. In contrast, MTs have higher levels of GP35/50, gp82 and gp90 when compared to TCTs. The subcellular localization of PLHs in signaling domains of T. cruzi is quite peculiar. In TCTs and BT (Y strain), PLHs are located in the flagellar membrane while GPs are distributed throughout the parasite's body (TCT and MT), except that gp90 is negative in TCTs. Also, the invasive capacity of the parasites, and the role of sulfated proteoglycans were analyzed using wild-type chinese hamster ovary cells (CHO-K1), and its mutant cell line deficient in glycosaminoglycan (CHO-745) as experimental model of invasion. The quantitative data of infection revealed that TCTs (Y strain and SMM36 isolate) are more infective than MTs. TCTs reached a range of infection between 52-85% after 2h of interaction with CHO-K1, according to the parasite- host cell ratio, while MTs reached a maximum of 6% infection at this time of interaction. Although the percentage of infection was similar between TCTs of different genotypes, the analysis of the endocytic index showed higher efficiency of invasion in the SMM36 isolate, showing values about 40% more of internalized parasites. Also, CHO-745 infected with TCT (Y strain and SMM36 isolate) exhibit approximately 30% decrease in infection levels compared to CHO-K1. This phenomenon was not observed in MTs even after 24 hours of interaction, whose percentage of infection reached 37% at the highest parasite-target cell ratio (60: 1). These data suggest that PGHS-PLHs interaction may trigger signaling pathways important for entry of parasites that express high levels of PLHs on its surface. These invasion mechanisms mediated by PLHs PGHS-interaction will be the focus of future research. / 2016-10-29

Submitted by Angelo Silva (asilva@icict.fiocruz.br) on 2016-07-20T13:39:16Z No. of bitstreams: 2 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) 71856.pdf: 4125758 bytes, checksum: e4a473daf62a159c4c49a6416a47c48b (MD5) / Approved for entry into archive by Anderson Silva (avargas@icict.fiocruz.br) on 2016-07-28T19:26:07Z (GMT) No. of bitstreams: 2 71856.pdf: 4125758 bytes, checksum: e4a473daf62a159c4c49a6416a47c48b (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-28T19:26:07Z (GMT). No. of bitstreams: 2 71856.pdf: 4125758 bytes, checksum: e4a473daf62a159c4c49a6416a47c48b (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2016 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Desde a década de 1990, a comunidade científica tem relatado um número crescente de proteínas e trechos que não apresentam uma conformação tridimensional estável e única, mas que são biologicamente ativas, o que contrasta o paradigma estrutura-função de uma proteína. Essas proteínas podem ser denominadas como Proteínas Intrinsecamente Desordenadas (IDPs), já os trechos como Regiões Intrinsecamente Desordenadas (IDRs). As IDPs e IDRs apresentam características de composição de aminoácidos que as identificam. Além disso, como foi relatado para o protozoário Plasmodium falciparum, as IDPs e IDRs podem favorecer a relação parasito-hospedeiro. Causada por espécies do fungo Cryptococcus spp., a criptococose é uma doença que afeta principalmente pacientes com imunidade comprometida e é a principal causa de mortalidade entre os pacientes portadores do vírus HIV. Dentro deste contexto, avaliamos computacionalmente o papel biológico das IDPs e IDRs em 12 proteomas preditos de Cryptococcus spp. Para tanto, avaliamos as diferentes ferramentas computacionais disponíveis para a predição ab initio dessa interessante classe de proteínas. Parte do processo analítico envolveu a reanotação desses 12 genomas, tendo este trabalho contribuído para a anotação estrutural e funcional de oito genomas (57.680 novos genes anotados) para os quais não havia informação em banco de dados de domínio público Dentre os 11 preditores avaliados em nossas análises, cinco foram selecionados com base em seu emprego em larga escala (DisEMBL, empregando as abordagens REM465 e HOTLOOPS, GlobPlot, IUPred e ANCHOR). A análise comparativa entre os grupos virulentos e não virulentos não revelou diferença estatisticamente significativa. Além disso, considerando as sequências consenso das predições, encontramos um conteúdo de aproximadamente 60-70% de proteínas em cada proteoma analisado, com pelo menos uma IDR de no mínimo 40 resíduos de aminoácidos consecutivos. Já os resultados referentes à análise de agrupamento revelaram que das 18.900 proteínas presentes no core genome dos 12 organismos, 11.409 apresentam pelo menos uma IDR. Outro ponto observado foi que muitas IDPs ou IDRs estão participando de diversos processos biológicos, estão relacionadas aos fatores de virulência do fungo e/ou atuando como enzimas em vias metabólicas distintas. Neste estudo hipotetizamos e descrevemos o papel funcional vital dessas proteínas em vários processos biológicos nos genomas de Cryptococcus spp / Since the 1990s, the scientific community has reported an increasing number of proteins and protein regions that don´t have a stable and unique three-dimensional conformation, but which are biologically active, which contrasts the structure-function paradigm of a protein. These proteins are called Intrinsically Disordered Proteins (IDPs) and the regions, Intrinsically Disordered Regions (IDRs). IDPs and IDRs have compositional biases that characterize them. Moreover, as has been reported for the parasite Plasmodium falciparum, IDPs and IDRs can favor the host-parasite relationship. Caused by species of the fungus Cryptococcus spp., Cryptococcosis is a disease that primarily affects patients with compromised immunity and is the leading cause of mortality among patients with HIV. Within this context, we evaluated computationally the biological role of IDPs and IDRs on 12 predicted Cryptococcus spp. proteomes. Therefore, we evaluated the various computer tools available for ab initio prediction of this interesting class of proteins. Part of the analytical process involved annotation of these 12 genomes, and this work contributed to the structural and functional annotation of eight genomes (57,680 new genes annotated) for which there was no information on the public domain databases Among the 11 predictors evaluated in our analysis, five were selected based on their large-scale use (DisEMBL, employing REM465 and HOTLOOPS approaches, GlobPlot, IUPred and ANCHOR). The comparative analysis between virulent and non-virulent groups showed no statistically significant difference. Furthermore, considering the consensus sequences of the predictions, we found a content of approximately 60-70% of proteins on each proteome with at least one IDR with at least 40 consecutive amino acid residues. Regarding the results of the cluster analysis, we observed that, from the 18,900 proteins present in the core genome of the analyzed organisms, 11,409 have at least one IDR. Another point observed was that IDPs or IDRs are participating in many biological processes, are related to virulence factors of the fungus and/or acting as enzymes in different metabolic pathways. In this study we hypothesize and describe the vital functional role of these proteins in various biological processes in the genomes of Cryptococcus spp

Os Enterococcus spp. apresentam natureza ubiquitária e são encontrados no trato gastrointestinal de diversos animais. Entretanto, estudos desses microorganismos associados a tartarugas marinhas são escassos. Os objetivos deste estudo foram: isolar enterococos a partir de amostras fecais de tartarugas marinhas encontradas no Litoral Norte do Rio Grande do Sul; determinar a prevalência das espécies; avaliar seu perfil de suscetibilidade antimicrobiana; verificar a presença de genes relacionados à resistência e à virulência e; analisar sua diversidade genética. Um total de 158 enterococos foram identificados como E. faecalis (55,7%), E. faecium (23,4%), E. hirae (15,2%) e E. casseliflavus (5,7%). A maioria dos isolados foi suscetível aos antimicrobianos testados, no entanto, fenótipos de resistência foram encontrados para eritromicina (34,2%), rifampicina (32,9%) e tetraciclina (0,63%). O gene de resistência à eritromicina msrC foi encontrado em todos os E. faecium resistentes, já o gene erm(B), não foi detectado. Somente um isolado foi resistente à tetraciclina, e este não apresentou nenhum dos genes testados. Os genes de virulência, gelE e ace (98,86%), asa (68.18%) e cylA (40,90%) foram detectados somente em E. faecalis. A atividade de gelatinase e citolisina foi verificada em 87 e 19 isolados, respectivamente. A maioria dos enterococos não foi capaz de formar biofilme. A análise dos perfis gerados por PFGE revelou um grande número de clones. Em conclusão, diferentes espécies de enterococos compõem a microbiota do trato gastrointestinal das tartarugas marinhas e a presença de determinantes de resistência e virulência nestes animais pode estar relacionada a fatores antropogênicos ou, ainda, ter origem no resistoma ambiental. / Enterococcus spp. shows an ubiquitous nature and are found in the gastrointestinal tract of several animals. However, studies of enterococus in sea turtles are scarce The aims of this study were: to isolate Enterococcus spp. from fecal samples of sea turtle found on the North coast of Rio Grande do Sul; to determine the prevalence of species; to evaluate their antimicrobial susceptibility profile; to check the presence of resistance and virulence related genes and; to analyse their genetic diversity. A total of 158 enterococci were identified as E. faecalis (55.7%) E. faecium (23.4%), E. hirae (15.2 %) and E. casseliflavus (5.7%). Most of the isolates were susceptible to the tested antimicrobials, however, resistance phenotypes were found for erythromycin (34.2%), rifampicin (32.9%) and tetracycline (0.63%). The erythromycin resistance gene msrC was detected in all E. faecium erythromycin resistant; moreover, the gene erm (B) was not detected. Only one sample was resistant to tetracycline, although it did not show any of the tetracycline resistant genes tested. Virulence genes gelE and ace (98.86%), asa (68.18%) and cylA (40.90%) were detected only in E. faecalis. The cytolysin and gelatinase activity was observed in 19 and 87 strains, respectively. Most enterococci were not able to form biofilm. The profile analysis generated by PFGE revealed a large number of clones. In conclusion, different species of enterococci were found in the microflora of sea turtle gastrointestinal tract and the presence of resistance and virulence determinants in these animals might be related to anthropogenic factors or even to an environmental resistome origin.

Apesar da importância ambiental dos morcegos em ambientes urbanos, poucos estudos relatam a presença de enterococos nestes animais. Este estudo teve como objetivos: a) isolar, identificar as espécies e detectar a presença de genes de resistência e fatores de virulência em enterococos isolados de fezes de morcegos Tadarida brasiliensis; e b) avaliar a distribuição das espécies de enterococos por qPCR e dos genes de resistência por PCR nas amostras de fezes de morcegos T. brasiliensis. Quatro pools de fezes de morcegos foram coletados em três municípios do Estado do Rio Grande do Sul e foram analisados por metodologias utilizando técnicas de microbiologia e moleculares. A partir das análises dos enterococos isolados das fezes, foram identificadas 4 espécies, sendo Enterococcus faecalis a mais frequente (83,6%), seguida de E. casseliflavus (13,7%), E. gallinarum (1,35%) e E. mundtii (1,35%). As cepas apresentaram perfil de resistência para rifampicina, eritromicina, norfloxacina, ciprofloxacina e tetraciclina. Dentre as 32 cepas resistentes à eritromicina, 28 apresentaram o gene ermC. Das 13 cepas resistentes à ciprofloxacina e norfloxacina nenhuma foi positiva para o gene gyrA. A única cepa resistente à tetraciclina apresentou o gene tetM. Os genes vanC1 e vanC2-3 foram observados em cepas de E. faecalis Quanto à presença dos genes de virulência, maior incidência foi observada para os genes gelE (97,3%) e ace (91,8%), seguido por agg (49,3%), cylA (5,5%) e esp (2,7%). A análise por qPCR permitiu identificar as espécies E. casseliflavus, E. faecalis, E. faecium, E. gallinarum e E. hirae nas fezes dos morcegos. Os genes de resistência ermC, gyrA, vanA, vanB, vanC1 e vanC2-3 foram detectados por PCR. Em conclusão, diferentes espécies de enterococos fazem parte da microbiota do trato gastrointestinal de morcegos T.brasiliensis e a presença de elementos de resistência e virulência podem estar relacionadas a fatores antropogênicos ou ter origem no resistoma ambiental. / Despite the environmental importance of bats in urban environments, few studies have reported the presence of enterococci in these animals. This study aimed: a) isolate, to identify the species and to detect the presence of resistance genes and virulence factors in enterococci isolated from feces of Tadarida brasiliensis bats; b) to evaluate the distribution of the enterococci species by qPCR and the resistance genes by PCR in the faecal samples of T. brasiliensis bats. Four pools of bats feces were collected in three places of the Rio Grande do Sul State and analyzed using microbiology and molecular methodologies. From the analysis of enterococci isolated from feces, 4 species were identified, being Enterococcus faecalis the most frequent (83.6%), followed by E. casseliflavus (13.7%), E. gallinarum (1.35%) and E. mundtii (1.35%). The strains showed a resistance profile to rifampicin, erythromycin, norfloxacin, ciprofloxacin and tetracycline. Of the 32 strains resistant to erythromycin, 28 presented the ermC gene. Of the 13 strains resistant to ciprofloxacin and norfloxacin, none were positive for the gyrA gene. The single tetracycline resistant strain showed the tetM gene. The vanC1 and vanC2-3 genes were observed in E. faecalis strains. As regards the presence of virulence genes, higher incidence was observed for to gelE (97.3%) and ace (91.8%) genes, followed by agg (49.3%), cylA (5.5%) and esp (2.7%). The qPCR analysis allowed to identify the E. casseliflavus, E. faecalis, E. faecium, E. gallinarum and E. hirae species in the bats feces. The ermC, gyrA, vanA, vanB, vanC1 and vanC2-3 resistance genes were detected by PCR. In conclusion, different species of enterococci are part of the gastrointestinal tract microbiota of T. brasiliensis bats and the presence of resistance and virulence elements may be related to anthropogenic factors or originate from the environmental resistome.

A resistência antimicrobiana e fatores de virulência são importantes mecanismos de sobrevivência das bactérias, através deles elas se tornaram capazes de escapar da ação das adversidades do ambiente. O presente trabalho teve como objetivo principal analisar os fatores de virulência e genes de resistência de isolados de Klebsiella sp. e sua participação na manutenção de populações bacterianas resistentes em pontos na Laguna de Tramandaí. As amostragens foram realizadas em agosto de 2014 e janeiro de 2015 em quatro pontos distintos com diferentes graus de impacto ambiental. Foram analisados 272 isolados bacterianos das amostras de água da laguna de Tramandaí. Estes isolados foram submetidos a testes bioquímicos e microbiológicos para identificação e foram encontrados 37 isolados de Klebsiella sp. Estes isolados foram submetidos a testes de susceptibilidade antimicrobiana por disco-difusão, análise fenotípica de fatores de virulência e genes de resistência e pesquisa de genes de resistência (blaCTX-M, blaSHV, blaTEM) através de PCR e similaridade através do ERIC-PCR. Através da análise por MALDI-TOF, os 37 isolados foram identificados como quatro K. oxytoca, seis K. pneumoniae e 27 K. variicola. Todos os isolados foram suscetíveis a imipenem, ertapenem, piperacilina/tazobactam e polimixina B Ampicilina e amoxacilina foram os antimicrobianos com maior índice de resistência, o gene blashv foi o mais encontrado dentre os genes pesquisados. Todos os isolados apresentaram cápsula polissacarídica, 56,7% dos isolados apresentaram fímbrias do tipo 1, 56,7% demonstraram serem capazes de produzir biofilmes, 78,4% foram capazes de inativar os fatores bactericidas do soro e 81,1% sintetizaram sideróforos. A análise por ERIC-PCR e MALDI-TOF geraram dendrogramas de alta heterogeneidade e baixos índices de similaridade, indicando que diferentes populações de Klebsiella estão se mantendo naquele ambiente. Ficou evidenciado neste estudo, através dos isolados encontrados e suas características genéticas e fenotípicas de resistência bacteriana, que eles podem estar contribuindo para a manutenção e disseminação da resistência aos antimicrobianos no ambiente. / Antimicrobial resistance and virulence factors are important mechanisms for the survival of bacteria, through which they have become capable of escaping from the adversities of the environment. The present work had as main objective to analyze the virulence factors and resistance genes of Klebsiella sp. And its participation in the maintenance of resistant bacterial populations in points in Tramandaí Lagoon. Samplings were carried out in August 2014 and January 2015 at four different points with different degrees of environmental impact. A total of 272 bacterial isolates from the Tramandaí lagoon water samples were analyzed. These isolates were submitted to biochemical and microbiological tests for identification and 37 isolates of Klebsiella sp. These isolates were submitted to antimicrobial susceptibility tests by disc-diffusion, phenotypic analysis of virulence factors and and resistance gene (blaCTX-M, blaSHV, blaTEM) search by PCR and similarity through ERIC-PCR. Through the use of MALDI-TOF, the 37 isolates were identified as four of K. oxytoca, six of K. pneumoniae and 27 of K. variicola. All the isolates were suscetible to imipenem, ertapenem, piperacilin/tazobactam e polimixin B Ampicillin and amoxicillin were the most resistant antimicrobials, the blaSHV gene was the most found among the genes studied. All isolates presented a polysaccharide capsule, 56.7% of the isolates had type 1 fimbriae, 56.7% were able to produce biofilms, 78.4% were able to inactivate serum bactericidal factors and 81.1% synthesized siderophores. Analysis by ERIC-PCR and MALDI-TOF generated dendrograms with high diversity and low similarity indexes, indicating that different populations of Klebsiella are remaining in that environment. It was evidenced in this study, through the isolates found and their genetic and phenotypic characteristics of bacterial resistance that they may be contributing to the maintenance and dissemination of antimicrobial resistance.

Enterococcus estão presentes no trato gastrointestinal (TGI) de animais vertebrados e invertebrados, os quais podem adquirir estas bactérias através de mecanismos de transferência horizontal e vertical de micro-organismos. Pesquisas recentes descreveram a presença de Enterococcus em lepidópteros, porém estudos com borboletas do gênero Heliconius são escassos. Este trabalho teve como objetivo, a partir de uma bacterioteca de 178 Enterococcus sp. previamente isolados de fezes de imaturos de Heliconius erato phyllis detectar a presença de genes de resistência e virulência por PCR; avaliar fenotipicamente os fatores de virulência e a produção de compostos com atividade antimicrobiana; e avaliar o perfil clonal das cepas pela técnica de PFGE. Dos 178 enterococos, 55 apresentavam resistência a eritromicina e 11 a norfloxacina e/ou ciprofloxacina, porém não foi detectado nenhum gene relacionado a estes fenótipos de resistência. Quanto aos fatores de virulência testados nos 178 enterococos, 63 isolados amplificaram para o gene esp, 12 para ace e 2 para gelE. Os genes agg e cylA não foram detectados. Na análise fenotípica dos fatores de virulência, os dois E. faecalis positivos para gelE também foram positivos para a degradação da gelatinase e 130 enterococos apresentaram capacidade de hidrolisar hemácias. Para investigar a produção de substância antagonista, foram selecionados 26 enterococos; destes, 15 apresentaram atividade contra a bactéria indicadora Listeria monocytogenes. Oitenta e seis isolados foram selecionados para avaliar a relação clonal por PFGE, e foi possível observar a partir do dendrograma que os enterococos no TGI dos imaturos têm origem alimentar e materna. Conclui-se que os enterococos provenientes de amostras fecais de imaturos de H. erato phyllis possuem poucos genes relacionados a mecanismos de virulência comuns na área clínica. É possível que os Enterococcus produtores de substância antagonista desempenhem um papel importante no equilíbrio das comunidades microbianas do TGI deste inseto, e que ocorra a transferência vertical de micro-organismos das fêmeas para a prole para a espécie H. erato phyllis. / Enterococcus is present in the gastrointestinal (GI) tract of vertebrates and invertebrates, which can acquire these bacteria through mechanisms of horizontal and vertical transfer of microrganisms. Recent research has described the presence of Enterococcus in Lepidoptera, but studies with butterflies of the genus Heliconius are scarce. This study had as objective, from a bacterioteca of 178 Enterococcus sp. previously isolated from fecal samples of immature Heliconius erato phyllis detect the presence of resistance and virulence genes by PCR; phenotypically assess the virulence factors and the production of compounds with antimicrobial activity; and to evaluate the clonal profile of the strains by PFGE. Of the 178 enterococci, 55 were resistant to erythromycin and 11 resistant to norfloxacin and/or ciprofloxacin, however was not detected any gene related to these resistance phenotypes. The virulence factors were tested in 178 enterococci, and 63 isolated amplified for the esp gene, 12 for ace and 2 for gelE. The agg and cylA genes were not detected. In the phenotypic analyzes, both E. faecalis positive to gelE gene were also positive for the degradation of gelatinase, and 130 enterococci showed ability to hydrolyze red blood cells. To investigate the production of antagonistic substance, 26 enterococci were selected and of these, 15 showed activity against the indicator bacteria Listeria monocytogenes. Eighty-six isolates were selected to evaluate the clonal profile by PFGE, and it was possible to observe in the dendrogram that the origin of the enterococci in GIT of immatures was the herbivory and maternal origin. It is concluded that the enterococci from fecal samples of immature H. erato phyllis possess few mechanisms of virulence-related genes, common in the clinical area. It is possible that the antagonistic substance-producing enterococci could play an important role in the equilibrium of the microbial communities of the GIT of this insect, and there is vertical transmission of enterococci from females to their offspring to the specie H. erato phyllis.

A distribuição das espécies de enterococos, bactérias comensais do trato gastrointestinal (TGI), é bastante estudada nos diferentes mamíferos; entretanto, em lobos-marinhos (Arctocephalus spp.) ainda não existem dados. Os objetivos do estudo foram: a) isolar Enterococcus spp. a partir de amostras fecais de lobos-marinhos encontrados no litoral norte do Rio Grande do Sul; b) determinar a prevalência das espécies; c) avaliar o perfil de suscetibilidade antimicrobiana; d) verificar a presença de genes relacionados à resistência e à virulência e; e) analisar o perfil genotípico por RAPD-PCR. No total, 160 enterococos foram isolados e identificados como E. faecalis (50,62%), E. hirae (34,37%), E. casseliflavus (11,87%), E. gallinarum (1,87%), E. mundtii (0,62%) e E. faecium (0,62%). Noventa e três isolados foram sensíveis aos dez antimicrobianos testados. As propriedades de resistência foram encontradas para eritromicina (21,25%), nitrofurantoína (15,62%), tetraciclina (6,25%), norfloxacina (3,12%) e ciprofloxacina (3,12%). Dentre os 10 isolados resistentes à tetracilina, 3 apresentaram o gene tet(M) e nenhum o tet(L). Dos 34 resistentes à eritromicina, 2 apresentaram o gene erm(B). Quanto à presença dos genes de virulência, maior incidência foi observada para os genes ace (66,87%) e gelE (50,62%), seguidos por asa (11,87%) e cylA (2,5%). A atividade de gelatinase e citolisina indicou a presença de genes silenciosos. A análise do RAPD-PCR permitiu reunir os isolados em cinco grupos. Em conclusão, diferentes espécies de enterococos compõem a microbiota do TGI de lobos-marinhos e a presença de elementos de resistência e virulência podem estar relacionados a fatores antropogênicos ou ter origem no resistoma ambiental. / The species distribution of enterococci, commensal bacteria of the gastrointestinal tract (GIT), is well studied in different mammals, however in fur seals (Arctocephalus spp.) data do not exist yet. The objectives of this study were: a) to isolate Enterococcus spp. from fecal samples of fur seals found on the North coast of Rio Grande do Sul; b) to determine the prevalence of species; c) to assess the antimicrobial susceptibility profile; d) to check the presence of resistance and virulence related genes and; e) to evaluate the genotypic profile by RAPD-PCR. A total of 160 enterococci were isolated and identified as E. faecalis (50.62%), E. hirae (34.37%), E. casseliflavus (11.87%), E. gallinarum (1.87%), E. mundtii (0.62%), and E. faecium (0.62%). Ninety-three isolates were susceptible to 10 antimicrobials tested. Resistance properties were found for erythromycin (21.25%), nitrofurantoin (15.62%), tetracycline (6.25%), norfloxacin (3.12%), and ciprofloxacin (3.12%). Among the 10 isolates resistant to tetracycline, 3 harbored the tet(M) gene and none were positive to tet(L) gene. Among the 34 erythromycin-resistant isolates, 2 harbored the erm(B) gene. Regarding the virulence genes, a higher incidence was observed for the ace (66.87%) and gelE (50.62%), followed by asa (11.87%) and cylA (2.5%). Gelatinase and cytolysin activity indicated the presence of silent genes. Analysis of RAPD-PCR allowed to assemble the isolates into five groups. In conclusion, different species of enterococci are part of the fur seals GIT microbiota and the presence of resistance and virulence elements may be related to anthropogenic factors or origin in the environmental resistome.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:20Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-08-15Bitstream added on 2014-06-13T20:16:31Z : No. of bitstreams: 1 camargo_ms_me_arafcf.pdf: 358942 bytes, checksum: 8f89d0a7367c210ee69a22ae462e0342 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Universidade Estadual Paulista (UNESP) / Esse estudo foi realizado com o objetivo de avaliar o efeito da concentração subinibitória de quercetina sobre alguns fatores relacionados à virulência de Staphylococcus aureus (ATCC 25923). A atividade antibacteriana foi determinada através do método de microdiluição em caldo e a concentração de 40μg/mL de quercetina foi utilizada como sub-inibitória. O sobrenadante de culturas de S. aureus em BHI contendo quercetina diminuiu a atividade hemolítica para hemácias de carneiro mas não alterou a atividade de citolisinas extracelulares para células de linhagem contínua (células McCoy B ATCC 1696) quando comparado com o sobrenadante da cultura na ausência do flavonol. O efeito da quercetina na fagocitose do S. aureus por polimorfonucleares neutrófilos (PMN) foi determinado através de técnica quimiluminescente. O burst oxidativo de PMN foi estatisticamente significativo para bactérias tratadas em relação às não tratadas, demonstrando que S. aureus crescidos na presença de quercetina tornam-se menos susceptíveis à fagocitose. A inibição da expressão de fatores relacionados à adesão bacteriana foi evidenciada através dos experimentos de fagocitose/adesão em microscopia óptica (1.000x). Mesmo que a quercetina, abaixo da concentração inibitória, tenha pouco efeito sobre a viabilidade de S. aureus, o conhecimento de que esse flavonol é capaz de alterar a adesão de estafilicocos à superfície celular parece ser atrativo para a sua utilização como profilático em processos infecciosos, visto que a adesão é o primeiro passo na patogênese da infecção bacteriana. Entretanto, deve-se considerar sua interferência com a atividade de células fagocíticas, uma importante função do sistema imune do hospedeiro. / The aim of this study was to evaluate the effects of quercetin at sub-inhibitory concentration on some Staphylococcus aureus (ATCC 25923) factors related to the virulence. The antibacterial activity of quercetin was evaluated by broth microdilution method and the concentration of 40 μg/mL was used as sub- inhibitory. S. aureus BHI culture supernatant containing quercetin reduced the hemolytic activity for sheep erythrocytes but did not exhibit a detectable change in cytolysin extracellular activity on continuous cell lines (McCoy B cells ATCC 1696) when compared with quercetin-free medium. The effect of quercetin-grown staphylococci phagocytosis by polymorphonuclear neutrophils (PMN) was compared with the effect on non-treated bacteria by chemiluminescence assay. The level of oxidative burst of PMN was statistically different in untreated versus quercetin-treated bacteria showing that druggrown cells became less susceptible to phagocytic uptake. The inhibition of expression of factors related bacterial adhesion was established though adesion/phagocytosis experiments by optical microscopy (1.000x). Even if quercetin at low level has little effect on S. aureus viability, the knowledge that this flavonol is able to affect the properties of staphylococci adherence to cell surfaces may be an attractive advance for its applications as prophylactic in infectious process, considering that bacterial adherence is the initial event in the pathogenesis of bacterial infection. Conversely, it also interferes with the activities of phagocytic cells, an important function of host immune system.