Cryptococcus neoformans e C. gattii são as principais espécies do gênero que causam infecção no homem, C. albidus e C. laurentii são espécies menos envolvidas. O presente trabalho teve por objetivos avaliar a patogenicidade in vivo, os fatores e os genes relacionados à virulência, e verificar o perfil de suscetibilidade ao fluconazol de 10 isolados ambientais de cada uma das espécies: C. neoformans, C. albidus e C. laurentii, antes e após a inoculação em camundongos BALB/c imunocompetentes; pesquisar os sorotipos, mating types e realizar a tipagem molecular. Proteinase, fosfolipase, urease, produção de melanina e crescimento à 37ºC foram pesquisados utilizando metodologias clássicas, e a pesquisa dos genes e determinação dos sorotipos e mating types foram feitas por PCR. A tipagem molecular foi realizada por PCR-fingerprinting, com os iniciadores (GACA)4 e M13. A determinação da CIM do fluconazol foi realizada pelo método da microdiluição em caldo. Todos os isolados de C. neoformans foram sorotipos A e MAT-alfa. A inoculação em animais mostrou que 9 isolados de C. neoformans mataram 100% deles em até 33 dias, e 1 levou os animais à morte num período entre 40 e 82 dias; 9 isolados foram recuperados dos pulmões e cérebro dos animais em 7 e 14 dias, e um deles levou todos os animais à morte em 12 dias, sendo possível recuperá-lo somente no 7º dia. Os animais inoculados com C. albidus e C. laurentii permaneceram vivos até negativação das culturas dos órgãos avaliados. C. albidus foi isolado principalmente do fígado e dos pulmões até 10 dias após a inoculação, C. laurentii dos pulmões e do cérebro até 120 dias. Todos os isolados das 3 espécies produziram cápsula antes e após a inoculação. Todos C. neoformans, 6 C. albidus e 6 C. laurentii cresceram à 37ºC antes e depois da inoculação. Melanina foi produzida por todos os isolados de C. neoformans e nenhum C. albidus nas duas ocasiões; e por 6 e 9 isolados de C. laurentii, antes e depois da inoculação, respectivamente. Seis isolados de C. neoformans e 1 de C. laurentii produziram proteinase nas duas ocasiões. Sete isolados de C. albidus produziram proteinase antes e todos depois da inoculação. Fosfolipase foi produzida por todos C. neoformans e C. albidus, e por 6 C. laurentii nas duas ocasiões. A avaliação da atividade da urease realizada em meio líquido foi positiva em 24 a 48 horas pelos isolados de C. neoformans e C. laurentii, e em 24 a 96 horas por C. albidus. A CIM de fluconazol variou de 2 a 8 ug/mL para C. neoformans, de 8 a >= 64 ug/mL para C. albidus, e de 1 a 64 ug/mL para C. laurentii, nas duas ocasiões. Todos os isolados de C. neoformans apresentaram os genes lacase (Lac1), fosfolipase (PLB1), proteinase (cnap1), calcineurina (CNA1), urease (URE1), e ERG11, com os oligonucleotídeos utilizados. A PCR com ERG11 mostrou uma banda no gel de agarose para todos C. albidus, porém nenhum dos outros genes pesquisados foram amplificados em C. albidus e C. laurentii. A tipagem molecular por PCR-fingerprinting dos isolados de C. neoformans revelou 2 tipos moleculares: VNI (7 isolados) e VNII (3 isolados). A maioria dos isolados de C. albidus apresentou homogeneidade nos padrões de bandas gerados, e C. laurentii foi a espécie que demonstrou maior diversidade genética por esta metodologia. Concluímos que a passagem dos isolados pelos animais não alterou os fenótipos estudados e nenhuma alteração foi detectada pela análise molecular. No entanto, verificamos a grande heterogeneidade molecular dos isolados de C. laurentii estudados. / Species of Cryptococcus neoformans and C. gattii are the main ones in the genus causing infection in man while C. albidus and C. laurentii are less involved. This study evaluated the in vivo pathogenicity, factors and genes related to virulence and the susceptibility to fluconazole before and after inoculation in immunocompetent BALB/c mice of ten environmental isolates of C. neoformans, C. albidus and C. laurentii. Serotypes, mating types and molecular typing were also determined to complete the evaluation. Enzymes like proteinases, phospholipase, urease, production of melanin and growth at 37oC were investigated by classical methods, but gene characterization and determination of serotypes and mating types were investigated by PCR. Molecular typing was done by PCR-fingerprinting with primers (GACA)4 and M13. The microdilution method was used to determine the minimum inhibitory concentration (MIC) of flucozanole. All C. neoformans isolates were serotype A and MAT-alfa and 9 of them when inoculated in animals killed 100% in up to 33 days. One isolate inoculated killed the animals in 40 to 82 days. Nine isolates were recovered from the animal lungs and brain in 7 and 14 days and the one which killed all animals in 12 days was only recovered on the 7th day. Animals inoculated with C. albidus and C. laurentii were alive until the tissue cultures of evaluated organs were negative. C. albidus was isolated mainly from the liver and lungs in up to 10 days after inoculation and strains of C. laurentii from the lungs and brain in up to 120 days. All isolates in the 3 species were capsule producers before and after inoculation. All strains of C. neoformans, 6 C. albidus and 6 C. laurentii grew at 37oC both before and after inoculation. All C. neoformans produced melanin and 6 C. laurentii produced it before inoculation and nine after. None was produced by C. albidus. Six isolates of C. neoformans and one of C. laurentii produced proteinases in both situations, before and after inoculation. Seven C. albidus isolates produced the protein hydrolyzing enzyme before inoculation and all after. Phospholipase enzyme was produced by all C. neoformans, and C. albidus and by 6 C. laurentii in both conditions, before and after inoculation. Urease activity was detected between 24 and 48 hours after incubation in a liquid medium for C. neoformans and C. laurentii cultures and after 24 to 96 hours for C. albidus. Fluconazole MICs ranged from 2 to 8 ug/ mL for C. neoformans isolates, from 8 to >= 64 ug/mL for C. albidus and from 1 to 64 ug/mL for C. laurentii in both conditions. Genes laccase (Lac1), phopholipase (PLB1) proteinase (cnap1), calcineurine (CNA1), urease (URE1) and ERG11, detected with the primers used were present in all C. neoformans. With exception of ERG11, which showed a band in agarose electrophoresis by all C. albidus, the other genes were not amplified in C. albidus and C. laurentii. Molecular typing by PCR-fingerprinting showed two molecular types in C. neoformans: VNI in 7 isolates and VNII in 3 isolates. Most C. albidus showed homogenous patterns in the bands generated and C. laurentii was the species with the higher genetic diversity by this methodology. It is concluded that isolate inoculations in animals does not alter phenotypes and no alteration is detected by molecular analysis. However, the high molecular heterogeneity of C. laurentii was detected.

Neste estudo, 26 amostras de ostras (Crassostrea gigas) comercializadas na cidade de São Paulo e em alguns pontos do litoral de São Paulo, e 36 amostras de mexilhões (Perna perna) colhidas mensalmente em 3 pontos do litoral de Ubatuba - SP, foram submetidas à pesquisa de vibrios potencialmente patogênicos. As amostras desses moluscos eram submetidas a enriquecimento em água peptonada alcalina sem cloreto de sódio e com 1 por cento de cloreto de sódio, e GSTB. O isolamento foi realizado em ágar TCBS. Colônias sacarose positivas e negativas, sugestivas de espécies de Vibrio foram identificadas presuntivamente em meio de ágar ferro de Kligler, sendo confirmadas através de provas bioqufmicas complementares. Uma parte das amostras de vibrios potencialmente patogênicos isoladas foi submetida ao teste de Dean e teste de alça ligada em íleo de coelhos. Os vibrios potencialmente patogênicos encontrados em amostras de ostras foram V. alginolyticus (81 por cento ), V.parahaemolyticus (77 por cento ), V. cholerae não 0:1 (31 por cento ), V. fluvialis (27 por cento ), V. furnissii (19 por cento ), V. mimicus (12 por cento ) e V. vulnificus (12 por cento ) e em amostras de mexilhões foram V. alginolyticus(97 por cento ), V. parahaemolyticus(75 por cento ), V. fluvialis (47 por cento ), V. vulnificus (11 por cento ), V. cholerae não 0:1 (6 por cento ), V. furnissii (6 por cento ) e V. mimicus (6 por cento ). Observou-se acúmulo de fluido em alça ligada de íleo de coelho entre 0,25 e 0,49 ml/cm em 6,9 por cento das amostras, entre 0,5 e 0,99 ml/cm em 15,6 por cento e maior ou igual a 1 ml/cm em 15,1 por cento , e/ou intestino de camundongos lactentes (Teste de Dean) em 26,6 por cento das amostras testadas, confirmando o elevado potencial desses microrganismos em causar gastrenterite. Verificou-se ausência de variação sazonal e também, de correlação entre os vibrios potencialmente patogênicos isolados e os indicadores de contaminação fecal, confirmando que a presença desses microrganismos ocorre de forma autóctone e que, as condições climáticas foram favoráveis à sobrevivência dessas espécies em todas as épocas do ano. Considerando-se os resultados obtidos no presente estudo e o fato de que ostras e mexilhões são habitualmente ingeridos crus ou insuficientemente cozidos, pode-se concluir que sua ingestão constitui-se em um determinado grau de risco para a saúde do consumidor. / In this work, 26 oysters samples (Crassostrea gigas), found in the market of São Paulo city and some coastal areas of São Paulo State, and 36 mussels samples (Perna perna), that were collected monthly in 3 coastal areas of Ubatuba city - SP., were analyzed for the potential patogenic vibrios occurrence. Samples were enriched in alcalin peptone water with (1 per cent ) and without sodium cloride and GSTB. Isolation was performed on TCBS agar. suspect sacharosis positive and negative colonies, resembling vibrio species, were presumptively identified on Kligler iron agar, and confirmed by complementary biochemical tests. Some of this potential patogenic vibrios were submitted to suckling mouse assay and rabbit ileal loop assay. Potential patogenic vibrios isolated from oyster samples were: V. alginolyticus (81 per cent ), V. parahaemolyticus (77 per cent ), V. cholerae non 0:1 (31 per cent ), V. fluvialis (27 per cent ) I V. furnissii (19 per cent ), V. mimicus (12 per cent ) and V. vulnificus (12 per cent ) and from mussels samples were: V. a.1ginolyticus (97 per cent ), V. parabaemolyticus (75 per cent ), V. fluvialis (47 per cent ), V. vulnificus (11 per cent ), V. cholerae non 0:1 (6 per cent ), V. furnissii (6 per cent ) and V. mimicus (6 per cent ). It was found 6,9 per cent of samples between 0,25 and 0,49 ml/cm of fluid accumulation in ileal loop assay, 15,6 per cent between 0,5 and 0,99 ml/cm and 15,1 per cent was equal or higher than 1 ml/cm. Among the samples assayed for suckling mouse 26,6 per cent were positive. These results confirm the high potential of these microrganisms to induce gastroenteritis. Seasonal variation as well as correlation between the potential patogenic vibrios isolated and the fecal contamination indicators were not found, confirming that the presence of such microrganisms occurs autochthonously and that the climate conditions were favourable to these species survival during the whole year. with the results of this work and considering that oyster and mussels are usually ingested raw or insufficiently cooked, the conclusion is that the ingestion of such mollusks presents a certain degree of risk for the consumer\'s health.

Os objetivos desta pesquisa foram observar a incidência de E. coli enterotoxigênica (ETEC), E. coli enteropatogênica clásssica (EPEC) e E. coli invasora (EIEC) em alimentos e estudar algumas de suas propriedades. Foram estudadas 360 amostras de alimentos, de origem animal e vegetal, das quais foram isoladas 1351 cepas diferentes de E.coli. Todas foram sorotipadas para investigação daquelas pertencentes aos sorogrupos enteropatogênicos clássicos, e as cepas imóveis e lisinadescarboxilase negativas sorotipadas para identificação daquelas pertencentes aos sorogrupos invasores. A capacidade de produção das enterotoxinas LT e ST de todas as cepas de E. coli foi também investigada. As amostras patogênicas isoladas corresponderam a 1,6 do total de cepas de E.coli estudado. Os alimentos de onde foram isolados representaram 4,2% do total de amostras de alimentos estudados e 5,2% das amostras de alimentos contendo E. coli. Não foram isoladas amostras de EIEC nas amostras de alimentos estudadas. As amostras de EPEC isoladas pertenceram aos sorogrupos 026 e 0125. Entre as amostras de ETEC isoladas predominaram aquelas produtoras somente da toxina LT, não tendo sido isoladas amostras capazes de produzir as toxinas LT e ST simultaneamente. Nenhuma das amostras de ETEC pertenceu aos sorogrupos enterotoxigênicos mais frequentes, nem possuiu os fatôres de colonização CFA/I e CFA/II. No teste de resistência a drogas, a maioria das amostras enteropatogênicas mostrou-se sensível às drogas utilizadas. O modelo de fermentação de açúcares foi relativamente uniforme entre estas amostras, e bastante semelhante ao apresentado pelo gênero Escherichia. / The objectives of this research work were to study the incidence of enterotoxigenic E. coli (ETEC), enteropathogenic. E.coli (EPEC) and invasive E. coli (EIEC) in foods, and to study some of their properties. 360 food samples, both of animal and plant origin, were studied and 1351 different E. coli strains were isolated. All of them were serotyped in order to identify those belonging to the serogroups enteropathogenic for children (EPEC). The strains which were non-motile and lysine descarboxylase negative were serotyped for the identification of those belonging to invasive serogroups. The capacity of all strains in producing enterotoxins ST and LT was also investigated. The isolated pathogenic strains corresponded to 1,6% of the E. coli strains tested. The foods from which they were isolated represented 4,2% of the total of food samples tested, and 5,2% of the food samples showing contamination with E. coli. No invasive strain was observed in the food samples tested. The isolated EPEC strains belonged to serogroups 026 and 0125. There was a prevalence of enterotoxin LT only producing strains among the ETEC ones, and no strain able to produce both enterotoxins LT and ST simultaneously was observed. None of them belonged to the usual enterotoxigenic serogroups, nor had colonization factors CFA/I and CFA/II. The antibiotic resistence test showed that the majority of pathogenic strains were sensitive to the drugs employed. The sugar fermentation model was relatively uniform among these strains, and very smilar to the one showed by the genus Escherichia.

Enterococcus são associados à microbiota intestinal de mamíferos e aves. Além dos primatas apresentarem estreita relação evolutiva com seres humanos, é pouco conhecido o impacto da resistência antimicrobiana associada às bactérias comensais, como os enterococos. O trabalho teve como objetivo identificar e caracterizar enterococos isolados de amostras fecais de macacos-prego (Sapajus nigritus) em relação a determinantes de resistência e virulência. As amostras foram coletadas de animais vivendo em cativeiro no Zoológico de Sapucaia do Sul (ZOO) e selvagens, nas cidades de São Sebastião do Caí (SSC) e Santa Cruz do Sul (SCS). As espécies isoladas foram identificadas utilizando a técnica de MALDI-TOF. Estas foram testadas frente a 12 antimicrobianos através do método disco difusão. Genes que conferem resistência à tetraciclina (tetM, tetL e tetS), fluoroquinolonas (gyrA), eritromicina (msrC e ermB) e virulência (agg, esp, cylA, ace e gelE) foram detectados por PCR. Foram identificados 296 isolados de Enterococcus sp. oriundos de 24 amostras fecais de macacos-prego. Destes, 137 eram oriundos de amostras de SSC, 86 de SCS e 73 do ZOO. A espécie mais encontrada foi E. faecalis (42,6 %), seguida de E. hirae (29,4 %) e E. faecium (15,5 %). Cento e noventa e nove amostras (67,2 %) apresentaram suscetibilidade reduzida a antimicrobianos. As amostras apresentaram menos suscetíveis para rifampicina (46,3 %), tetraciclina (26,0 %) e eritromicina (22,3 %). Entre os isolados, E. faecalis (69,0 %) apresentou as maiores frequências de suscetibilidade reduzida. Em relação ao local de coleta, 69,3 % dos isolados das amostras SSC apresentaram suscetibilidade reduzida a antimicrobianos, 69,7 % dos isolados das amostras SCS e 60,2 % dos isolados das amostras do ZOO, sendo atribuído perfil de múltipla resistência a 29 isolados de SSC, 6 isolados SCS e 8 de ZOO. As amostras ZOO apresentaram maiores índices para os genes de resistência msrC (81,8 %), gyrA (60,7 %) e tetL (44,4 %). Para o gene tetM os isolados de SCS apresentaram maior frequência (100 %). As amostras SSC e SCS apresentaram as maiores porcentagens para o gene gelE (100 %). Para esp (3,5 %), ace (93,0 %) e agg (10,5 %), as amostras SCS apresentaram as maiores porcentagens. As presenças de determinantes de resistência e virulência nas amostras foram atribuídas tanto à ação antropogênica encontrada no habitat dos macacos como através do próprio resistoma ambiental. Ainda, a proximidade dos animais com o ser humano demonstrou ser uma das principais fontes de disseminação de resistência bacteriana. / Enterococcus is associated with the intestinal microbiota of mammals and birds. In addition to primates having a close evolutionary relationship with humans, the impact of antimicrobial resistance associated with commensal bacteria, such as enterococci, is little known. The objective of this work was to identify and characterize isolates of enterococci from faecal samples of black capuchin monkey (Sapajus nigritus) in relation to determinants of resistance and virulence. The samples were collected from animals living in the Sapucaia do Sul Zoo (ZOO) and wild, in the cities São Sebastião do Caí (SSC) and Santa Cruz do Sul (SCS). The isolated species were identified using the MALDI-TOF technique. These were tested against 12 antimicrobials using the disc diffusion method. Genes that confer resistance to tetracycline (tetM, tetL and tetS), fluoroquinolones (gyrA), erythromycin (mrsC and ermB) and virulence (agg, esp, cylA, ace and gelE) were detected by PCR. It were identified 296 isolates of Enterococcus sp. from 24 faecal samples of S. nigritus. Of these, 137 were from SSC samples, 86 from SCS and 73 from ZOO. The most common species was E. faecalis (42.6 %), followed by E. hirae (29.4 %) and E. faecium (15.5 %). One hundred and ninety-nine samples (67.2%) presented reduced antimicrobial susceptibility. The samples were less susceptible to rifampicin (46.3%), tetracycline (26.0%) and erythromycin (22.0%). Among the isolates, E. faecalis (69.0%) had the highest frequencies of reduced susceptibility. Regarding the collection site, 69.3% of the SSC isolates presented reduced susceptibility to antimicrobials, 69.7% of the isolates from the SCS samples and 60.2% from the isolates from the ZOO samples, with a multiple resistance profile 29 SSC isolates, 6 SCS isolates and 8 ZOO isolates. The ZOO samples presented higher indices for the resistance genes msrC (81.8%), gyrA (60.7%) and tetL (44.4%). For the tetM gene the SCS isolates showed a higher frequency (100%). The SSC and SCS samples showed the highest percentages for the gelE gene (100%). For esp (3.5%), ace (93.0%) and agg (10.5%), the SCS samples presented the highest percentages. The presences of resistance and virulence determinants in the samples were attributed both to the anthropogenic action found in the monkey habitat and through the environmental resistance itself. Furthermore, the proximity of animals to humans has been shown to be one of the main sources of dissemination of bacterial resistance.

Candida spp. se tornaram, nas últimas décadas, importantes agentes causadores de infecções invasivas, responsáveis por altos índices de morbidade e mortalidade. Acredita-se que a aspartato protease secretada (Sap) seja um fator diretamente associado aos processos infecciosos exercendo papel determinante na patogenicidade de Candida spp. e que a exposição a concentrações subinibitórias de antifúngicos, pode aumentar a produção de Sap e selecionar isolados resistentes. Analisaram-se isolados de Candida albicans e Candida não-albicans oriundos de casos de infecção hospitalar. Avaliou-se o perfil proteico destes isolados por eletroforese SDS-PAGE. Avaliou-se, também, o perfil de sensibilidade dos isolados frente a antifúngicos de uso convencional em esquemas terapêuticos (fluconazol e anfotericina B) e a antifúngicos mais novos que ainda não fazem parte das rotinas hospitalares (voriconazol e caspofungina). Determinou-se a atividade proteolítica qualitativa e quantitativa de Sap e atividade metabólica de C. albicans e Candida não-albicans cultivados na presença e ausência de concentrações subinibitórias de fluconazol e anfotericina B. Estabeleceu-se a correlação entre os testes e por fim, avaliou-se a expressão do gene SAP2 em C. albicans ATCC 64548 e C. krusei ATCC 6258. 100% dos isolados foram sensíveis a anfotericina B, voriconazol e caspofungina e 89,9% a fluconazol. Dois isolados (7,4%) apresentaram sensibilidade dependente da dose e um (3,7%) apresentou resistência ao fluconazol. Na análise qualitativa da atividade proteolítica, 77,7% dos isolados apresentaram atividade. A maioria dos isolados de C. albicans (50%) e Candida não-albicans (32%) apresentou atividade proteolítica moderada. A adição de fluconazol ao cultivo não promoveu alterações significativas na atividade proteolítica dos isolados padrões, enquanto anfotericina B inibiu o crescimento de C. glabrata ATCC 90030 e C. krusei ATCC 6258. Na análise quantitativa, todos os isolados se apresentaram ativos, sendo que a maior atividade foi observada em Candida complexo “psilosis” 210 (100%) e a menor em C. albicans 257 (2,44%). A maioria dos isolados de C. albicans (50%) foi classificada como fracamente proteolítica, enquanto Candida não-albicans (53%) como moderadamente proteolítica. A presença de antifúngicos no cultivo alterou significativamente o percentual de degradação da maioria dos isolados. A maior diferença de percentual foi observada em C. lusitaniae 286, que na presença de ¼ da IC90 de anfotericina B aumentou 13,7x em relação à ausência do fármaco. O método quantitativo de determinação da atividade proteolítica apresentou maior sensibilidade. 63% dos isolados de C. albicans apresentaram alta atividade metabólica e 68% de Candida não-albicans, atividade moderada. A maior atividade metabólica foi observada em C. albicans 120 (61,72%) e a menor em C krusei ATCC 6258 (2,35%). A atividade metabólica da maioria dos isolados foi significativamente alterada. A maior diferença de percentual foi observada em Candida complexo “psilosis” 210, que na presença de ½ da IC50 de fluconazol apresentou redução de 8x na atividade metabólica em relação à ausência do fármaco. Houve expressão de SAP2 apenas em C. albicans ATCC 64548, que foi reduzida significativamente na presença de ¼ da IC90 de anfotericina B. A atividade de Sap pode ser considerada um fator potencial associado à virulência, uma vez que o isolado que apresentou a maior atividade apresentou sensibilidade antifúngica reduzida. / Candida spp. has become in recent decades, major causative agents of invasive infections, responsible for high rates of mortality and morbidity. It is believed that the secreted aspartate protease (Sap) is a factor directly associated with infection exerting decisive role in the pathogenicity of Candida spp. and that the exposure to subinibitory concentrations of antifungals may increase the production of Sap and to select resistant isolates. We analyzed isolates of Candida albicans and Candida non-albicans from cases of hospital infection. We evaluated the protein profile of the isolates of Candida spp. by SDS-PAGE. We evaluated also the susceptibility profile of the isolates against antifungals of use conventional in regimens therapeutics (fluconazole and amphotericin B) and newer antifungals that are not yet part of the hospital routine (voriconazole and caspofungin). It was determined the proteolytic activity qualitative and quantitative of Sap and metabolic activity of isolates of C. albicans and Candida non-albicans grown in the presence and absence of subinhibitory concentrations of fluconazole and amphotericin B. Was established the correlation between the tests and, finally, the expression of the SAP2 gene in C. albicans ATCC 64548 and C. krusei ATCC 6258 was evaluated. 100% of the isolates were susceptible to amphotericin B, voriconazole and caspofungin and 89.9% to fluconazole. Two isolates (7.4%) showed susceptibility dose dependent and one (3.7%) showed resistance to fluconazole. In the qualitative analysis of proteolytic activity, 77.7% of the isolates showed activity. The most isolates of C. albicans (50%) and Candida non-albicans (32%) had moderate proteolytic activity. The addition of fluconazole to culture did not promote significant changes in the proteolytic activity of the isolates patterns, while amphotericin B inhibited the growth of C. glabrata ATCC 90030 and C. krusei ATCC 6258. In quantitative analysis, all isolates were active, being that the highest activity was observed in Candida complex “psilosis” 210 (100%) and the lowest in C. albicans 257 (2.44%). The most of the C. albicans isolates (50%) were classified as weakly proteolytic, while Candida non-albicans (53%) as moderately proteolytic. The presence of antifungals in the culture significantly changed the percentage of substrate degradation of the most of isolates. The greatest difference of percentage was observed in C. lusitaniae 286, which in the presence of ¼ IC90 of amphotericin B increased 13.7x regarding to absence of the drug. The quantitative method of determining the proteolytic activity presented greater sensitivity. 63% of the isolates of Candida albicans showed high metabolic activity and 68% of Candida non-albicans had moderate activity. The higher metabolic activity was observed in C. albicans 120 (61.72%) and lowest in C krusei ATCC 6258 (2.35%). The metabolic activity of the most of the isolates was significantly altered. The major difference of percentages was observed in Candida complex “psilosis” 210, which in the presence of ½ IC50 of fluconazole showed reduction of 8x in the metabolic activity regarding to absence of the drug. There was expression of SAP2 only in C. albicans ATCC 64548, which was significantly reduced in the presence of ¼ IC90 of amphotericin B. The Sap activity may be considered a potential factor associated to virulence, once that the isolate that showed the greatest activity showed susceptibility reduced. / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES

Enterococcus spp. pertencem ao grupo das bactérias láticas e estão presentes em solos, águas, plantas, microbiota autóctone de vários alimentos e como membros da microbiota intestinal de humanos e animais. Esses microrganismos foram considerados por muito tempo como comensais, mas o aumento da severidade das infecções nosocomiais causadas por enterococos mutirresistentes a antimicrobianos e, a falta de conhecimento sobre seus fatores de virulência geram insegurança na utilização de cepas deste gênero na produção de alimentos como culturas fermentadoras e/ou probióticas. A diferença entre uma cepa de enterococos com potencial patogênico e outra aparentemente segura para uso em processamento de alimentos não é clara, e a probabilidade de que esta última adquira fatores de virulência merece investigação. O objetivo do presente projeto foi determinar características fenotípicas e genotípicas de Enterococcus spp. isolados de amostras de alimentos e águas correlacionando sua presença com indicadores clássicos de higiene e contaminação fecal. De 812 colônias indicativas do gênero enterococos obtidas a partir de 120 amostras de alimentos, 299 isolados (37%) foram presuntivamente caracterizados como Enterococcus spp. Após identificação por PCR, 139 (46,5%) E. faecium, 80 (26,8%) E. faecalis, 36 (12%) E. casseliflavus e 8 (2,7%) E. gallinarum. Produção de gelatinase foi detectada apenas em isolados de E. faecalis (60%). Um isolado de E. faecium (0,7%) e 31 isolados de E. faecalis (38,7%) apresentaram perfil β-hemolítico. Produção de bacteriocina contra Lactobacillus sakei e/ou Listeria monocytogenes foi observada para 10% dos isolados de E. faecalis e 23% dos isolados de E. faecium. Hidrólise de sais biliares foi observada para 100% dos isolados de E. gallinarum, 86% E. casseliflavus, 65% E. faecalis e 62,6% de E. faecium. Alguns isolados de E. faecium apresentaram resistência à vancomicina, eritromicina e tetraciclina. Entre os isolados de E. faecalis não houve resistência à vancomicina, mas foi observada resistência à tetraciclina, eritromicina e alta concentração de gentamicina. Houve uma maior prevalência dos genes de virulência (esp, gel, ace, as, efaA e cylA) entre os isolados de E. faecalis quando comparado a E. faecium. Além disso, os isolados de E. faecalis, resistentes a antibióticos, mostraram forte adesão a células Caco-2 e capacidade de formação de biofilme em superfície abiótica. RAPD-PCR individualizou 14 cepas de E. faecium e 17 cepas de E. faecalis dentre os 52 isolados Enterococcus spp. resistentes a antibióticos. A variabilidade dos resultados impediu o estabelecimento de uma correlação entre a presença ou contagem de coliformes, E. coli e enterococos nas amostras analisadas. Os dados deste trabalho sobre marcadores fenotípicos e genotípicos de virulência, e a presença de cepas resistentes a antibióticos evidenciam a necessidade da avaliação cuidadosa de linhagens de enterococos para aplicações em alimentos. / Enterococcus spp. belong to the group of lactic acid bacteria widely distributed in soil, plants, foods, animals and humans. In the past, these microorganisms were considered commensals but the increase of antibiotic-resistant enterococci and the lack of knowledge about their virulence markers, had raised concerns regarding the safety of using strains of this genus in the food production as fermentative or probiotic cultures. Besides this, literature data suggests the use of enterococci as sanitary indicator for foods. Differences between enterococci strains with pathogenic potential and an apparently safe ones is unclear and there is a concern about virulence markers transfer. The aim of this work was to determine phenotypic and genotypic characteristics of Enterococcus spp. isolated from foods and water and also to correlate their presence with classical indicators of sanitary quality. Out of 812 presumptive enterococci colonies obtained from 120 food samples, 299 isolates (37%) were presuntively characterized as Enterococcus spp. Isolates were identified by PCR: 139 (46.5%) E. faecium, 80 (26.8%) E. faecalis, 36 (12.0%) E. casseliflavus and 8 (2.7%) E. gallinarum. Only E. faecalis isolates (60%) produced gelatinase. One E. faecium (0.7%) and 31 E. faecalis (38.7%) were β-haemolytic. Bacteriocin activity against Lactobacillus sakei and/or Listeria monocytogenes was observed for 10% of the E. faecalis and for 23% of the E. faecium isolates. All E. gallinarum isolates, 86% of the E. casseliflavus, 65% of the E. faecalis and 62.6% of the E. faecium isolates showed bile salt hydrolysis activity. Some E. faecium isolates were resistant to vancomycin, erythromycin and tetracycline. Vancomycin resistance was absent among the E. faecalis but, resistance to tetracycline, erythromycin and highlevel gentamicin was observed. There was a higher prevalence of virulence genes (esp, gel, ace, as, efaA e cylA) among the E. faecalis isolates when compared to the E. faecium. Antibiotic resistant E. faecalis isolates strongly adhered to Caco-2 cells and formed biofilm on abiotic surface. Using RAPDPCR 14 E. faecium and 17 E. faecalis strains could be individualized from the 52 antibiotic resistant enterococci. It was not possible to correlate the presence of total coliforms, E. coli and Enterococcus spp. in the samples of food and water analysed due to results variability. Data obtained regarding phenotypic and genotypic virulence markers and the presence of antibiotic resistant enterococci raise the needs of a carefully evaluation of the Enterococcus spp. strains before future applications in foods.

A piometra canina, também denominada como complexo hiperplasia-cística-endometrial, é uma enfermidade da cadela adulta caracterizada pela inflamação do útero com acumulação de exsudatos, que ocorre na fase lútea do ciclo estral e que pode acometer vários sistemas do organismo. Ocorre em decorrência de alterações hormonais e geralmente está associada a infecções bacterianas. A incidência de piometra na cadela é alta, sendo a doença reconhecida como uma das causas mais comuns de enfermidade e morte desta espécie animal. A piometra é uma das condições patológicas mais comuns que acomete o trato genital dos cães. A bactéria mais freqüentemente isolada do conteúdo uterino de cadelas com piometra é Escherichia coli. Algumas cepas de E.coli são comprovadamente patogênicas para o homem e/ou animais. No homem, o microrganismo tem sido associado a severos distúrbios gastrintestinais, além de infecções extra-intestinais, com referência especial às infecções urinárias, meningites do recém-nascido e septicemias. Para a realização deste trabalho foi realizado o isolamento microbiológico das bactérias presentes no conteúdo intra-uterino de 100 cadelas com piometra, a contagem de unidades formadoras de colônias por ml, antibiograma das bactérias isoladas, exame histopatológico do útero, e pesquisa de fatores de virulência nos isolados de E.coli. O trabalho foi realizado na Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo, e as amostras coletadas de animais submetidos à cirurgia de ovário-salpingo-histerectomia no Setor de Obstetrícia do Hospital Veterinário. O presente estudo confirmou a ocorrência da Escherichia coli como sendo o principal agente envolvido na piometra em cadelas, bem como permitiu verificar a presença de fatores de virulência nas cepas isoladas. Estatisticamente quanto maior o número de unidades formadoras de colônias/ml, maior a intensidade do processo inflamatório. Observou-se uma maior sensibilidade de E.coli aos antimicrobianos norfloxacina, polimixina B, sulfazotrin, cloranfenicol, enrofloxacina, e gentamicina e uma maior resistência aos antimicrobianos cefalotina e ampicilina. Nas cepas isoladas de bactérias Gram negativas houve maior sensibilidade aos antimicrobianos norfloxacina e polimixina B e maior resistência aos antimicrobianos ampicilina, cefalotina, cefoxitina, cefalexina, e tetraciclina. Nas cepas isoladas de bactérias Gram positivas houve maior sensibilidade aos antimicrobianos vancomicina, cefalexina, norfloxacina, sulfazotrin, gentamicina, e polimixina B e maior resistência aos antimicrobianos penicilina, oxacilina e ampicilina. Foram identificados fatores de virulência em 98,0% das cepas de Escherichia coli avaliadas, demonstrando uma alta freqüência de E.coli potencialmente patogênica. / Canine pyometra, also known as cystic endometrial hyperplasia complex, is a disease of the adult dog characterized by the inflammation of the uterus with accumulation of purulent discharge, that occurs in the luteus phase of the estrus cycle and that can affect various systems of the organism. It occurs in result of hormone alterations and generally is associated with bacterial infections. The incidence of pyometra in the bitch is high, being the disease recognized as one of the most common illness occuring in this animal species and one of the most common cause of death. Pyometra is one of the main pathological condition that affects the genital tract in dogs. The bacterial species most frequently isolated from the uterine contents of dogs with pyometra is Escherichia coli. Some strains of E.coli are proven to be pathogenic for the man and/or animals. In man, the microrganism has been associated with severe gastrintestinal diseases, as well as extra-intestinal diseases, with special reference to the bladder infections, septicemias and neonatal meningitis. This study consisted of microbiological isolation of the bacteria from the intrauterine contents of 100 dogs with pyometra, the counting of number of units forming colonies in 1ml, antibiogram of the isolated bacteria, histologic examination of the uterus, and research of virulence factors in the E.coli strains. The study was carried out in the Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia of the Universidade de São Paulo, and the samples obtained from the animals submitted to surgery of ovariohysterectomy in the Sector of Obstetrics of the Veterinarian Hospital. The present study confirmed the occurrence of Escherichia coli as being the main agent involved in pyometra in bitches, as well as verified the presence of virulence factors in the strains isolated. Statistically the bigger the number of unit forming colonies/ml the greater the intensity of the inflammatory process. One observed more sensitivity of E.coli to the antimicrobial substances norfloxacin, polimixin B, sulfazotrin, chloranfenicol, enrofloxacin, and gentamicin and more resistance to the antimicrobial substances cefalotin and ampicilin. In the strains of Gram negative bacteria there was more sensitivity to the antimicrobial substances norfloxacin and polimixin B and a greater resistance to the antimicrobial substances ampicilin, cefalotin, cefoxitin, cefalexin, and tetraciclin. In the strains isolated of Gram positive bacteria there was a greater sensitivity to the antimicrobial substances vancomicin, cefalexin, norfloxacin, sulfazotrin, gentamicin, and polimixin B and a greater resistance to the antimicrobial substances penicillin, oxacilin and ampicilin. Virulence factors were identified in 98,0% of the strains of Escherichia coli evaluated, demonstrating a high frequency of potentially pathogenic E.coli

A capacidade do Staphylococcus aureus escapar do sistema imune do hospedeiro é atribuída à existência de algumas exotoxinas, as quais são codificadas por genes acessórios. A expressão de genes codificadores de exotoxinas é controlada por reguladores, tais como o agr (acessory gene regulator), sendo identificados 4 tipos polimórficos deste regulador. Neste estudo, foram utilizadas 37 isolados de Staphylococcus aureus, sensíveis à oxacilina, originados de laboratórios e hospitais públicos e privados brasileiros. Utilizou-se a técnica de PCR para a amplificação dos genes codificadores dos fatores de virulência estudados e do tipo de agr presente em cada cepa. A técnica da eletroforese em campo pulsado (PFGE) foi utilizada para se verificar a existência clonal entre os isolados. Observou-se que o gene codificador de enterotoxina mais freqüentemente isolado foi o gene sea, todos relacionados com o tipo III de agr. Observou-se, também, alguns pontos divergentes com publicações anteriores como a presença dos genes seb e tst na mesma cepa (33%), cuja relação julgava-se não ser muito freqüente, o mesmo acontecendo com os genes tst e lukElukD. Não se encontrou isolado portador dos genes codificadores das toxinas esfoliatinas. Segundo a técnica de PFGE, não houve relação clonal entre os isolados. Conclui-se, portanto, que as bases moleculares da patogenicidade do S. aureus são multi-fatoriais, dependendo não somente da presença como também da expressão de alguns genes acessórios como também do tipo de agr presente. / The capacity of the Staphylococcus aureus to escape from the immune system of the host is conferred to the existence of some exotoxins, which are codified by accessory genes. The expression of the genes of exotoxins is controlled by regulators, such as agr (acessory gene regulator), being identified four different types of this regulator. In this study, it had been used 37 strains of Staphylococcus aureus, sensible to the oxacillin, proceeding from public and private Brazilians laboratories. It had been used the PCR technique for detention of the genes of the virulence factors and the agr type present in each strain. The PFGE had been used for detectation of clonal relationship between the strains. Thus, it was observed that the most frequently determined gene coder of enterotoxin was sea (100% were related as type of agr III). it was observed divergent points to the studies carried through in other countries, like strains with coders genes of seb and tst (33%).This correlation, the literature judged not to be frequent, the same happening for the simultaneous presence of tst and lukE-lukD. It was not found in this study strains carrying of exfoliatin toxins. According to PFGE, there wasn\' t evidence of clonal relationship between the strains. It is concluded, therefore, that the molecular bases of the pathogenicity of the S. aureus are multifactorial, depending not only on the presence, as also of the expression of some accessory genes and the agr type present.

A emergência de resistência à vancomicina no mundo iniciou-se no final dos anos 80, sendo primeiro documentada na parte ocidental da Europa e posteriormente nos EUA. Depois disso, o isolamento de enterococos resistentes à vancomicina (VRE - do inglês, vancomycin-resistant enterococci) tem sido continuamente reportado em diversas localizações geográficas, inclusive no Brasil. As infecções nosocomiais causadas por enterococos são grandes desafios para os médicos devido à ocorrência de isolados resistentes a múltiplos antibióticos. Diversos métodos de tipagem molecular têm sido utilizados para estudar a epidemiologia de VRE. Neste trabalho, foi realizada a caracterização genética da resistência à vancomicina e epidemiologia molecular de VREs isolados de pacientes de dois hospitais de Ribeirão Preto, o Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo (HCFMRP-USP) e a Santa Casa de Misericórdia de Ribeirão Preto (SCMRP), no período de setembro de 2008 a setembro de 2010. Foram estudados também os primeiros VREs isolados no HCFMRP-USP, em meados de 2005/2006. Foram determinadas as espécies e os genótipos de 53 VREs, pela reação da polimerase em cadeia (PCR), e todos eram E. faecium e apresentavam o gene vanA. Todos E. faecium isolados dos 2 hospitais em estudo apresentaram CIM para vancomicina >256?g/mL pelo Etest®, já daptomicina mostrou valores de CIM dentro do limite de sensibilidade para todos os enterococos analisados. Com relação aos fatores de virulência, foi evidente a predominância dos genes acm e esp nos E. faecium estudados. Os primeiros VREfm (do inglês, vancomycin-resistant E. faecium) isolados em meados de 2005/2006 de pacientes do HCFMRP-USP apresentaram o transposon Tn1546 intacto, já todos os E. faecium isolados do HCFMRP-USP e da SCMRP, no período de setembro de 2008 a setembro de 2010, apresentaram produto de amplificação maior do que os 4,4kb esperados para grupamento gênico vanRSHAX. Resultados de overlapping PCR e sequenciamento da região do transposon que amplificou fragmento de DNA com tamanho maior que o esperado utilizando primers P11-P12, mostraram que 81% (43 VREfm) isolados nos dois hospitais em estudo, no período de setembro de 2008 a setembro de 2010, apresentaram deleção da extremidade esquerda do Tn1546 e insersão (IS1251), entre genes vanS e vanH. A análise da PFGE dos VREfm em estudo mostrou que havia ocorrido disseminações clonais com determinados perfis de PFGE em períodos específicos. O fato dos primeiros VREfm terem apresentado perfil de PFGE diferente da maioria dos isolados, não permitiu que se determinasse o ancestral comum por PFGE, mas resultados de MLST mostraram que VREfm isolados, no período de 2008-2010, podem ser descendentes diretos destes cinco primeiros VREfm ou podem ter evoluído de um mesmo ancestral comum. A análise da tipagem por MLST de 31 linhagens de VREfm selecionadas a partir dos resultados de PFGE, mostrou que havia 9 STs diferentes, dentre estes, sendo 5 STs novos (656, 657, 658, 659 e 660). Os STs predominantes foram STs 412 e 478. Todos STs identificados pertenciam ao complexo clonal 17 (CC17), com exceção do ST658 que era um singleton. O ST78 que vem se disseminando mundialmente, foi identificado pela primeira vez no Brasil em linhagens do presente estudo. E, por fim, a tipagem por MLST comprovou o que já havia sido determinado pelos resultados de PFGE, que existe relação clonal entre linhagens isoladas nos dois hospitais estudados de Ribeirão Preto. / World reports on vancomycin resistance emerged in the late 1980s and first documented in Western Europe and later in the United States. Since then, isolation of vancomycin-resistant enterococci (VRE) has been continuously reported in several geographic locations, including Brazil. The widespread occurrence of strains resistant to multiple antibiotics present a challenge to clinicians when treating enterococci caused nosocomial infections. Several molecular typing methods have been used to study the epidemiology of VRE. In this study, genetic characterization of vancomycin resistance and molecular epidemiology were performed in VREs isolated from patients in two hospitals in Ribeirão Preto, Sao Paulo/Brazil, the University Hospital of the Faculty of Medicine of Ribeirao Preto, University of Sao Paulo (HCFMRP-USP) and the Santa Casa de Misericórdia de Ribeirão Preto (SCMRP), from September 2008 to September 2010. The first five VREs isolated in the HCFMRP-USP, in mid 2005/2006 were also included in this study. Species and genotypes of 53 VREs determined by the polymerase chain reaction (PCR) were all E. faecium and had the vanA gene. MICs for vancomycin determined by Etest® were >256?g/mL for all E. faecium isolated in the two hospitals, whereas daptomycin showed MIC values within the limit of susceptibility for all the enterococci analyzed. acm and esp genes predominated as virulence factors. The first five vancomycin resistant E. faecium (VREfm) isolated in mid 2005/2006 showed an intact Tn1546 transposon, whereas all E. faecium isolated later, September 2008 to September 2010, gave a larger amplified DNA fragment than the expected 4,4kb gene cluster vanRSHAX. Results of overlapping PCR and sequencing (primers P11-P12) of the transposon region that amplified the larger than expected DNA fragment showed that 81% (n=43) of the these VREfm had a deletion of the left end of Tn1546 and also a IS1251, between the vanS and vanH genes. The analysis of VREfm PFGEs indicated the occurrence of clonal disseminations with some PFGE profiles at specific times. The different PFGE profiles of the first VREfm (2005-2006) in relation to the latter isolates showed that the common ancestor could not be determined by PFGE. However, MLST results indicated that VREfm isolated, in the period from 2008 to 2010, could be direct descendants of the first five VREfm or could have evolved from a common ancestor. MLST analysis of 31 VREfm isolates selected according to the PFGE results, showed that there were nine different STs, among these five new STs (656, 657, 658, 659, 660). The predominant STs were ST412 and 478. All STs identified belonged to clonal complex 17 (CC17), except for ST658, a singleton. The ST78 that has spread worldwide is being identified in Brazil for first time in this study. MLST confirmed PFGE results showing that there is a clonal link between strains isolated in the two hospitals of Ribeirao Preto, Sao Paulo, Brazil.

Orientador: José Moacir Marin / Banca: Everlon Cid Rigobelo / Banca: Maria de Fátima Martins / Banca: Cleber Jacob Silva de Paula / Banca: Mônica Hitomi Okura / Resumo: A indústria avícola brasileira gera grandes quantidades de resíduos orgânicos, como a cama de frango, utilizada frequentemente na agricultura. Entre as bactérias presentes neste fertilizante orgânico estão os membros da família Enterobacteriaceae. O objetivo deste estudo foi analisar o perfil de fatores de virulência e resistência antimicrobiana de isolados de Escherichia coli da cama de frango na produção comercial de aves de corte. Foi montado um sistema de fermentação similar ao utilizado nas granjas comerciais de frango de corte, sendo coletadas amostras desta cama 5, 10, 15, 30 e 60 dias após o início do tratamento. Um total de 47 cepas de Escherichia coli foi isolado e testado por meio da reação em cadeia da polimerase para detectar genes de virulência característicos de APEC (hlyF, iss, ompT, iroN e iutA). Além disso, foram realizados testes de susceptibilidade a 14 antimicrobianos. Os resultados indicaram que as cepas apresentaram genes característicos de E. coli patogênica aviária (APEC), sendo os genes hlyF, iss e ompT os mais prevalentes. Os isolados apresentaram alta resistência (˃50%) à tetraciclina, gentamicina, cefotaxima, nitrofurantoína e ampicilina. Estes resultados sugerem que as estirpes possuem genes de virulência e resistência que podem ser disseminados no ambiente, representando um potencial risco zoonótico para os seres humanos. / Abstract: The Brazilian poultry industry generates large amounts of organic waste, such as chicken litter, which is often used in agriculture. Among the bacteria present in organic fertilizer are members of the Enterobacteriaceae family. The objective of this study was to analyze the profile of virulence factors and antimicrobial resistance of Escherichia coli isolates from poultry litter in commercial plants production. A fermentation system similar to that used in commercial chicken farms was set up, and samples of this litter were collected 5, 10, 15, 30 and 60 days after the start of treatment. A total of 47 Escherichia coli strains were isolated and tested through Polymerase chain reaction to detect virulence genes característicos de APEC (hlyF, iss, ompT, iroN e iutA). Antimicrobial susceptibility testing was performed using 14 antimicrobials. The results indicated that our strains harbored genes characteristic of Avian Pathogenic E. coli (APEC), with the hlyF, iss and ompT genes being the most prevalent. The isolates showed high resistance (˃50%) to tetracycline, gentamicin, cefotaxime, nitrofurantoin and ampicillin. These findings suggest that our strains harbored virulence and resistance genes which can be spread in the environment and are a potential zoonotic risk for humans. / Doutor