Cell lines are widely used as in vitro model systems and substitute for animal experiments. The frequently used Caco-2 cell line is considered to reflect characteristics of differentiated intestinal epithelium. However, the need to culture the cells with fetal calf serum (FCS) induces a high variability, risk of contamination and is ethically disputed. We tested the culture of Caco-2 cells with human platelet lysate (PL) instead of FCS. We compared cell viability and differentiation by measuring ATP levels, gene and protein expression of specific markers in total cell extracts, brush border membrane vesicles (BBM) and lipid rafts (LR). Cell viability was slightly enhanced in cells grown with PL compared to FCS. The cells differentiated to an intestinal phenotype like the cells cultured in FCS, as indicated by the similar gene expression levels of hexose and protein transport proteins and the structural protein VILLIN. BBM showed a comparable distribution of the intestinal hydrolases, indicating a maintained cell membrane polarity. The distribution of the marker protein FLOTILLIN-2 in LR was also similar. We conclude that PL is an exquisite and suitable replacement for FCS in the culture of Caco-2 cells that can eliminate many disadvantages incurred due to the use of FCS.

Molecular dynamics of biomolecules, like proteins and nucleic acids dictate essential biological processes allowing life to function. They are involved in a vast number of cellular tasks including DNA replication, genetic recombination, transcription and translation, as well as signalling, translational motion, structure formation, biochemical synthesis, immune response, and many more. Developed over billions of years by evolution they constitute fine-tuned networks modulated by temperature and regulatory mechanisms. A better understanding of the thermodynamic fundamentals of inter- and intramolecular conformational changes can shed light on the underlying processes of diseases and enables the transfer of biological architectures, properties and compositions to nanotechnological applications. Dynamics of biomolecules occur on a wide range of timescales covering more than twelve orders of magnitude. Fluorescence spectroscopy techniques like time-correlated single photon counting (TCSPC), fluorescence correlation spectroscopy (FCS), and immobilized and freely diffusing single-molecule Förster resonance energy transfer (FRET) spectroscopy represent powerful tools monitoring the dynamics at different ranges within this large span of timescales. However, a unified approach covering all biological relevant timescales remains a goal in the field of fluorescence spectroscopy. This would comprise a methodological workflow for qualitative and quantitative analysis of biomolecular dynamics ranging from nanoseconds to hours. In this work, a custom built single-molecule fluorescence spectroscopy set-up was constructed combining confocal single-molecule FRET spectroscopy with TCSPC, FCS and fluorescence anisotropy techniques for multiparameter fluorescence detection (MFD). The set-up allows the complementary observation of single-molecules over an extensive timescale ranging from fast reconfiguration dynamics of polymers (nanoseconds) to slow membrane protein folding (hours) without the need of molecular synchronization. Freely diffusing molecules enable high throughput measurements in heterogeneous membrane-mimetic and denaturing environments. Additionally, routines for data acquisition and processing were developed followed by the elaboration of a methodological workflow for the qualitative and quantitative analysis of biomolecular dynamics. Finally, the applicability was demonstrated on a big diversity of biological systems (DNA hairpin, Holliday junction, soluble and membrane proteins) in aqueous, membrane-mimetic and denaturing environments covering conformational dynamics from nanoseconds to hours.:Chapter 1: Introduction Chapter 2: Dynamics of Biomolecules 2.1 Dynamics of Nucleic Acids 2.1.1 DNA Hairpin Dynamics 2.1.2 Dynamics of Holliday Junctions 2.2 Dynamics of Proteins 2.2.1 Model Systems of Protein Folding Chapter 3: Fundamentals of Fluorescence Spectroscopy 3.1 Basics of Fluorescence 3.2 Förster Resonance Energy Transfer (FRET) Chapter 4: Multiparameter Fluorescence Detection 4.1 Single-Molecule FRET Spectroscopy 4.1.1 Confocal Microscopy 4.1.2 Freely Diffusing Molecules 4.1.3 Fluorescence Spectroscopy 4.2 Time-Correlated Single-Photon Counting (TCSPC) 4.3 Pulsed Interleaved Excitation (PIE) 4.4 Fluorescence Anisotropy 4.5 Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS) 4.6 MFD Setup 4.7 Analysis Software Chapter 5: Analysis of Molecular Dynamics 5.1 Sub-Microseconds – Peptide Chain Dynamics 5.1.1 Identification of Peptide Chain Dynamics 5.1.2 Quantification of Peptide Chain Dynamics 5.1.3 Discussion 5.2 Microseconds – Dynamics of Barrier Crossing 5.2.1 Maximum Likelihood Estimation of the Transition-Path Time 5.2.2 Quantification of the Upper Bound of the Transition-Path Time 5.2.3 Discussion 5.3 Milliseconds – Fast Protein Folding Dynamics 5.3.1 Correlation of the Relative Donor Lifetime (τD(A) / τD(0)) with FRET Efficiency (E) 5.3.2 Burst-Variance Analysis (BVA) 5.3.3 FRET-Two-Channel Kernel-Based Density Distribution Estimator (FRET-2CDE) 5.3.4 Estimation of the Conformational Relaxation Rate using Bin-Time Analysis 5.3.5 Extracting Folding Kinetics using the Three-Gaussian (3G) Approximation 5.3.6 Dynamic Probability Distribution Analysis (dPDA) 5.3.7 Folding and Unfolding Rate Estimation using a Maximum-Likelihood Estimator 5.3.8 Discussion 5.4 Milliseconds to Seconds – Stacking Dynamics of DNA 5.4.1 Identification of Dynamics on the Recurrence Timescale 5.4.2 Quantification of Dynamics on the Recurrence Timescale 5.4.3 Discussion 5.5 Minutes to Hours – Slow Protein Folding Dynamics 5.5.1 Identification of Slow Protein Folding Dynamics 5.5.2 Quantification of Slow Protein Folding Dynamics 5.5.3 Discussion Chapter 6: Conclusion and Outlook Chapter 7: Appendices 7.1 Derivation of Equation 4.6 (inspired by Daniel Nettels) 7.2 Protein sequences 7.3 Identification of dynamics on the recurrence timescale 7.4 Dependency of psame on the sample concentration 7.5 Effect of fluorescence quenching on MFD parameters Chapter 8: References / Biomoleküle, wie Proteine und Nukleinsäuren, sind essentielle Bausteine des Lebens und permanent an biologischen Prozessen beteiligt. Innerhalb der Zelle nehmen sie eine Vielzahl von Aufgaben wahr, darunter DNA-Replikation, genetische Rekombination, Transkription und Translation, sowie Signalübertragung, Transport, Strukturbildung, biochemische Synthese und Immunreaktion. In Milliarden von Jahren evolutionärer Entwicklung wurden biomolekulare Prozesse immer feiner aufeinander Abgestimmt. Um den zugrundeliegenden Mechanismus von Krankheiten besser zu Verstehen und um die einzigartigen Eigenschaften und Kompositionen biologischer Systeme auf nanotechnologische Anwendungen übertragen zu können, ist es unbedingt notwendig ein besseres Verständnis thermodynamischer Grundlagen inter- und intramolekularer Konformationsänderungen zu erlangen. Dabei finden sich Dynamiken von Biomolekülen über eine Zeitskale von mehr als zwölf Größenordnungen verteilt. Fluoreszenzspektroskopietechniken, wie zeitkorrelierte Einzel-photonenzählung (TCSPC), Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS), und Förster-Resonanzenergietransfer (FRET)–Spektroskopie von immobilisierten und frei diffundierenden Molekülen, stellen leistungsfähige Werkzeuge dar, welche es ermöglichen Dynamiken in der den Techniken entsprechenden Zeitskala aufzulösen. Dennoch, besteht der dringende Bedarf nach einer einheitlichen Methode, der in der Fluoreszenzspektroskopie alle biologisch relevanten Zeitskalen abdeckt. Dies würde einen methodischen Workflow für die qualitative und quantitative Analyse der biomolekularen Dynamik von Nanosekunden bis Stunden bedeuten. In dieser Arbeit wurde ein speziell angefertigter Multiparamter-Fluoreszenzspektroskopie-Aufbau konstruiert, welcher die konfokale Einzelmolekül-FRET-Spektroskopie mit den TCSPC-, FCS- und Fluoreszenz-Anisotropie-Techniken kombiniert. Der Aufbau ermöglicht die Beobachtung komplementärer Eigenschaften von Einzelmolekülen über eine umfangreiche Zeitskala hinweg. Dynamiken von schnell rekonfigurierenden Polymeren (Nanosekunden) bis hin zu langsam faltenden Membranproteinen (Stunden) sind ohne molekulare Synchronisation möglich. Darüber hinaus, ermöglicht der Einsatz frei diffundierender Moleküle einen hohen Messdurchsatz und die Anwendung heterogener membranmimetischer und denaturierender Lösungen. Zusätzlich wurden Routinen zur Datenerfassung und -verarbeitung entwickelt, gefolgt von der Ausarbeitung eines methodischen Workflows zur qualitativen und quantitativen Analyse von biomolekularen Dynamiken. Abschließend wurde die Anwendbarkeit an fünf biologischen Modelsystemen (DNA-Haarnadel, Holliday-Junction, lösliche und Membranproteine) in wässrigen, membranmimetischen und denaturierenden Umgebungen demonstriert und alle biologisch relevanten Zeitskalen von Nanosekunden bis Stunden abgedeckt.:Chapter 1: Introduction Chapter 2: Dynamics of Biomolecules 2.1 Dynamics of Nucleic Acids 2.1.1 DNA Hairpin Dynamics 2.1.2 Dynamics of Holliday Junctions 2.2 Dynamics of Proteins 2.2.1 Model Systems of Protein Folding Chapter 3: Fundamentals of Fluorescence Spectroscopy 3.1 Basics of Fluorescence 3.2 Förster Resonance Energy Transfer (FRET) Chapter 4: Multiparameter Fluorescence Detection 4.1 Single-Molecule FRET Spectroscopy 4.1.1 Confocal Microscopy 4.1.2 Freely Diffusing Molecules 4.1.3 Fluorescence Spectroscopy 4.2 Time-Correlated Single-Photon Counting (TCSPC) 4.3 Pulsed Interleaved Excitation (PIE) 4.4 Fluorescence Anisotropy 4.5 Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS) 4.6 MFD Setup 4.7 Analysis Software Chapter 5: Analysis of Molecular Dynamics 5.1 Sub-Microseconds – Peptide Chain Dynamics 5.1.1 Identification of Peptide Chain Dynamics 5.1.2 Quantification of Peptide Chain Dynamics 5.1.3 Discussion 5.2 Microseconds – Dynamics of Barrier Crossing 5.2.1 Maximum Likelihood Estimation of the Transition-Path Time 5.2.2 Quantification of the Upper Bound of the Transition-Path Time 5.2.3 Discussion 5.3 Milliseconds – Fast Protein Folding Dynamics 5.3.1 Correlation of the Relative Donor Lifetime (τD(A) / τD(0)) with FRET Efficiency (E) 5.3.2 Burst-Variance Analysis (BVA) 5.3.3 FRET-Two-Channel Kernel-Based Density Distribution Estimator (FRET-2CDE) 5.3.4 Estimation of the Conformational Relaxation Rate using Bin-Time Analysis 5.3.5 Extracting Folding Kinetics using the Three-Gaussian (3G) Approximation 5.3.6 Dynamic Probability Distribution Analysis (dPDA) 5.3.7 Folding and Unfolding Rate Estimation using a Maximum-Likelihood Estimator 5.3.8 Discussion 5.4 Milliseconds to Seconds – Stacking Dynamics of DNA 5.4.1 Identification of Dynamics on the Recurrence Timescale 5.4.2 Quantification of Dynamics on the Recurrence Timescale 5.4.3 Discussion 5.5 Minutes to Hours – Slow Protein Folding Dynamics 5.5.1 Identification of Slow Protein Folding Dynamics 5.5.2 Quantification of Slow Protein Folding Dynamics 5.5.3 Discussion Chapter 6: Conclusion and Outlook Chapter 7: Appendices 7.1 Derivation of Equation 4.6 (inspired by Daniel Nettels) 7.2 Protein sequences 7.3 Identification of dynamics on the recurrence timescale 7.4 Dependency of psame on the sample concentration 7.5 Effect of fluorescence quenching on MFD parameters Chapter 8: References

Les biofilms sont des communautés de microorganismes emprisonnés dans une matrice de polymères organiques extracellulaires (EPS) permettant de stabiliser ces édifices tridimensionnels. La cohésion des EPS polyanioniques dans un environnement hydraté est assurée par des microdomaines hydrophobes. La localisation de ces sites hydrophobes est très importante pour comprendre la variabilité ainsi que la réactivité des EPS. Notre travail vise la synthèse de nouvelles sondes fluorescentes hydrophiles ou amphiphiles capables de marquer les EPS. Dans ce but, nous avons synthétisé une série de nanocristaux fluorescents à coeur CdSe, appelés Quantum Dots (QDs), modifiés à leur périphérie par des ligands hydrophiles (acide 3-mercaptopropionic) ou amphiphiles (acide dihydrolipoique couplé à des acides aminés hydrophobes tels que la Leucine ou la Phénylalanine). Par microscopie confocale de fluorescence et spectroscopie de corrélation de fluorescence (FCS), nous avons montré que les QDs fonctionnalisés s'associaient fortement aux EPS des biofilms de la bactérie S. oneidensis. La distribution de ces nanoparticules dans les EPS est dépendante de la structure du ligand et de sa densité à la périphérie des QDs. Une dispersion homogène des QDs hydrophiles dans l'ensemble du biofilm et une clusterisation des QDs amphiphiles dans des microdomaines hydrophobes ont notamment été observés. Les nouvelles sondes fluorescentes développées dans ce travail permettront de suivre le développement ainsi que la réorganisation de matrices biologiques complexes telles que les biofilms. / Microorganisms predominantly live in communities, such as biofilms, in which extracellular polymeric substances (EPS) form the matrix and stabilize the three-dimensional structure. Hydrophobic microdomains allow the cohesiveness of these hydrophilic, polyanionic systems. The localization of these hydrophobic sites is very important to understand the variability and the reactivity of the EPS. The objective of our work was to engineer new fluorescent probes with amphiphilic or hydrophilic properties able to label the EPS. For that purpose, we have synthesized a series of fluorescent CdSe-core nanocrystals, also called Quantum Dots (QDs), modified at their periphery with hydrophilic (3-mercaptopropionic acid) or amphiphilic ligands (dihydrolipoic acid coupled to hydrophobic aminoacids like Leucine or Phenylalanine). Using confocal fluorescence microscopy and fluorescence correlation spectroscopy (FCS), we demonstrated that the functionalized QDs strongly associated with the EPS of S. oneidensis biofilms and allow imaging of these microbial communities. The location of these probes within the EPS was dependent on the surface ligand structure and on its density at the periphery of QDs. A homogeneous dispersion of hydrophilic QDs in the whole biofilm was observed, while amphiphilic QDs clusterized in the small hydrophobic domains. These new fluorescent probes will be of great use to understand the development and the reorganization of complex biological matrix like biofilms.

Les bactéries forment des communautés spatiales adhérentes à des surfaces, appelées biofilms. Ces organisations bactériennes sont omniprésentes dans les milieux naturel, industriel et médical et peuvent porter atteinte à notre santé lorsqu’elles hébergent des agents pathogènes, parmi lesquels le médiatique Staphylococcus aureus sur lequel a porté l’ensemble de ce travail de thèse. Cette bactérie est l’une des principales causes d’infections chroniques, mais également d’infections nosocomiales, impliquant le plus souvent des biofilms. Il est aujourd’hui reconnu qu’une telle biostructure est un véritable bouclier à l’action des antimicrobiens et à celle du système immunitaire. Outre les résistances génétiques des bactéries pathogènes aux antibiotiques, l’hétérogénéité chimique et biologique de la structure tridimensionnelle des biofilms pourrait être à l’origine de ces phénomènes de tolérance et de chronicité d’infections. C’est à cette problématique que se rattache ce travail de thèse concernant l’action de la vancomycine sur des biofilms de S. aureus. Alors que les connaissances sur la réactivité de cet antibiotique clef avec S. aureus proviennent essentiellement d’études réalisées sur des cellules planctoniques, l’originalité de notre approche a été d’étudier la diffusion-réaction de la vancomycine in situ dans l’épaisseur des biofilms en utilisant en particulier des outils avancés de microscopie de fluorescence (Time-Lapse, FLIM, FRAP, et FCS). Nous avons ainsi évalué sa biodisponibilité dans la matrice d’exopolymères, ainsi que l’impact de la physiologie spécifique des bactéries incluses en biofilms sur l’activité de cet antibiotique, utilisé seul ou en association avec la rifampicine. Cette approche multidisciplinaire a permis une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans la singulière tolérance de ces biostructures à l’action des antibiotiques, et de souligner l’urgence de développer des approches préventives telles que le diagnostic précoce des infections impliquant des biofilms. / Bacteria form architecturally complex communities adherent to surfaces, known as biofilms. These structured living cells are ubiquitous and found in natural, industrial and medical environments. They can affect our health when they host pathogens as the well known Staphylococcus aureus species which constitute the main purpose of this thesis. This bacteria is one of the major causes of chronic and nosocomial infections, most often involving biofilms. It is now recognized that such biostructure is a true shield against the action of antimicrobial agents and the host immune system. In addition to the genetic resistance of pathogenic bacteria to antibiotics, the chemical and biological heterogeneity of biofilms could be the cause of these phenomena of tolerance and apparition of chronic infections. This work aimed at studying of the action of vancomycin on S. aureus biofilms. While the knowledge on the reactivity of this key antibiotic with S. aureus bacteria comes mainly from studies of planktonic cells, the originality of our approach was to study the diffusion-reaction processes of vancomycin in situ in the thickness of biofilms using particularly advanced fluorescence imaging tools (Time-Lapse, FLIM, FRAP and FCS). We thus assess its bioavailability in the exopolymeric matrix, and the impact of the cell physiology of bacteria included in biofilms on the activity of this antibiotic when used alone or in combination with rifampicin. This multidisciplinary approach has allowed a better understanding of the mechanisms involved in the particular tolerance of these biostructures to the action of antibiotics, and underlines the emergency to develop preventive approaches such as early diagnosis of infections involving biofilms.

This thesis perpetuates research aimed at deploying a diagnostic expert system for the MK 92 Mod 2 Fire Control System to 28 Oliver Hazard Perry class fast frigates. Referred to as the Maintenance Advisor Expert System (MAES) , this expert system is being jointly developed by the Naval Postgraduate School and Port Hueneme Division, Naval Surface Warfare Center (NSWC PHD). This thesis focuses on the long-term implementation issues related to deploying MAES to the fleet, integrating MAES into the formal training pipeline, and transitioning life cycle Support for MAES to NSWC PHD. MAES long-term implementation issues, which include hardware, software, documentation, and training requirements, are examined within the context of implementation factors and risks historically associated with deploying expert systems. Plans for deploying MAES to the fleet and integrating MAES into the formal training pipeline are provided. As part of the documentation necessary to transition life cycle support of MAES to NSWC, a System Level Description document is also provided

This thesis describes an all-in-one flight control system (FCS) that was designed for unmanned aerial vehicles (UAVs). The project focuses on the embedded hardware aspect of a stand-alone system with low-cost and reliability in mind.

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Les bactéries forment des communautés spatiales adhérentes à des surfaces, appelées biofilms. Ces organisations bactériennes sont omniprésentes dans les milieux naturel, industriel et médical et peuvent porter atteinte à notre santé lorsqu'elles hébergent des agents pathogènes, parmi lesquels le médiatique Staphylococcus aureus sur lequel a porté l'ensemble de ce travail de thèse. Cette bactérie est l'une des principales causes d'infections chroniques, mais également d'infections nosocomiales, impliquant le plus souvent des biofilms. Il est aujourd'hui reconnu qu'une telle biostructure est un véritable bouclier à l'action des antimicrobiens et à celle du système immunitaire. Outre les résistances génétiques des bactéries pathogènes aux antibiotiques, l'hétérogénéité chimique et biologique de la structure tridimensionnelle des biofilms pourrait être à l'origine de ces phénomènes de tolérance et de chronicité d'infections. C'est à cette problématique que se rattache ce travail de thèse concernant l'action de la vancomycine sur des biofilms de S. aureus. Alors que les connaissances sur la réactivité de cet antibiotique clef avec S. aureus proviennent essentiellement d'études réalisées sur des cellules planctoniques, l'originalité de notre approche a été d'étudier la diffusion-réaction de la vancomycine in situ dans l'épaisseur des biofilms en utilisant en particulier des outils avancés de microscopie de fluorescence (Time-Lapse, FLIM, FRAP, et FCS). Nous avons ainsi évalué sa biodisponibilité dans la matrice d'exopolymères, ainsi que l'impact de la physiologie spécifique des bactéries incluses en biofilms sur l'activité de cet antibiotique, utilisé seul ou en association avec la rifampicine. Cette approche multidisciplinaire a permis une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans la singulière tolérance de ces biostructures à l'action des antibiotiques, et de souligner l'urgence de développer des approches préventives telles que le diagnostic précoce des infections impliquant des biofilms.

La majorité des études sur la dynamique des facteurs de transcription en cellules vivantes s'accordent sur une dynamique rapide. Il existe cependant quelques exceptions, comme la dynamique du facteur de transcription HSF " Heat Shock Factor ", sur les chromosomes polyténiques de drosophile. Notre projet a consisté à étudier la dynamique d'HSF1 dans des cellules humaines. L'exposition des cellules à un stress tel qu'un choc thermique induit une réponse ubiquitaire et transitoire, dont la fonction est de protéger les cellules contre les effets délétères du stress. Au cours d'un choc thermique, plusieurs phénomènes se produisent : i) un arrêt global de la transcription excepté pour certains gènes tels que ceux codant pour les protéines de choc thermique (HSPs), dont l'expression est sous le contrôle du facteur de transcription HSF1. ii) une activation d'HSF1 qui se relocalise de façon rapide et transitoire sur les corps nucléaires de stress (nSBs), où il induit la transcription des séquences satellite III. Les nSBs forment un site d'activité naturellement amplifié et visible en microscopie. Nous avons utilisé deux techniques complémentaires pour étudier la dynamique d'HSF1 en cellules vivantes : le recouvrement de fluorescence après photoblanchiment (FRAP) et la spectroscopie à corrélation de fluorescence multi-confocale (mFCS), qui permet l'analyse FCS en plusieurs points simultanément. En cellules HeLa, la protéine HSF1-eGFP présente une dynamique rapide qui est significativement ralentie suite à un choc thermique. En mFCS, nous avons obtenu des constantes de diffusion de 14 µm²/s avant choc thermique et de 10 µm²/s après choc thermique. En FRAP, le temps de demi-recouvrement est de 0,2 s avant choc thermique, 2,6 s après choc thermique dans le nucléoplasme et 65 s sur les corps nucléaires de stress. Le ralentissement de la dynamique d'HSF1 s'explique par deux phénomènes : i) la formation de complexes de haut poids moléculaire, ii) une augmentation des interactions avec la chromatine. Pour mieux caractériser le changement de dynamique d'HSF1 après choc thermique, plusieurs mutants ont été analysés. Le domaine de trimérisation est indispensable pour le changement de dynamique après choc thermique, alors que le domaine de liaison à l'ADN et le domaine de transactivation n'ont que peu d'effet sur le changement de dynamique. Il ne peut donc pas être expliqué uniquement par les interactions directes à la chromatine du domaine de liaison à l'ADN, ni même par les liaisons indirectes du domaine de transactivation via d'autres protéines. La protéine HSF1 pourrait interagir de façon aspécifique avec la chromatine lors de la recherche de site de liaison, ou d'autres protéines via d'autres domaines pourraient entrainer des interactions indirectes avec la chromatine.

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