A ineficiência dos protocolos de criopreservação limita o uso em larga escala da produção in vitro de embriões bovinos. O objetivo deste trabalho foi identificar os danos causados pela criopreservação e pelo cultivo embrionário de embriões bovinos produzidos in vitro após a descongelação, avaliando a morfologia, a expressão gênica e o desenvolvimento in vitro antes e após a criopreservação. Complexos cummulusoócitos foram maturados, fecundados e cultivados in vitro. Blastocistos expandidos (n=600) obtidos entre os dias 7 e 9 de cultivo (fecundação D0) foram submetidos a congelação controlada (grupo controlado: 10% de etileno glicol (EG) por 10 minutos, 1,2oC por minuto), congelação rápida (grupo rápido: 10% de EG por 10 minutos , 20% de EG + 20% de Glicerol (Gli) por 30 segundos) ou vitrificação (grupo vitrificação: 10% de EG por 10 minutos, 25% EG + 25% Gli por 30 segundos). Os embriões do grupo controle não foram expostos a crioprotetores e nem a protocolos de criopreservação, sendo avaliado o índice de eclosão 12 dias após a fecundação (46,09%). As palhetas para os protocolos de congelação rápida e vitrificação foram mantidas em vapor de nitrogênio líquido (0,8cm sobre o líquido) por 2 minutos e imersas no nitrogênio líquido. Os embriões foram descongelados por 10 segundos em ar e 20 segundos em banhomaria a 25oC. Os embriões foram reidratados em solução de PBS + 0,2% de BSA + 0,3M de sacarose e em solução de PBS + 0,2% de BSA ambos por 3 minutos. Para avaliar o desenvolvimento, os embriões, após a descongelação, foram co-cultivados com células da granulosa em meio TCM199 ou SOFaa por 4 dias. Os dados foram analisados com o aplicativo PROC MIXED do programa SAS Sistems for Windows®. O grupo controlado apresentou índices de eclosão de 44,65% ± 5,94 e 11,65 ± 3,37 para o meio TCM199 e para o meio SOFaa, respectivamente. Embriões do grupo rápido não apresentaram eclosão, independente do meio de cultivo. O grupo vitrificação apresentou índices de eclosão de 9,43% ± 6,77 e 8,67% ± 4,47, respectivamente, em meio TCM199 e SOFaa. Os valores foram significativos quando p<0,05. O grupo controlado apresentou diferença em relação aos outros grupos em ambos os meios de cultivo. No meio TCM199 os índices de re-expansão e eclosão foram mais altos. Para a análise da expressão gênica, 2 pools de 10 blastocistos expandidos de embriões frescos e criopreservados (congelação controlada) foram utilizados para a extração de RNA. Foi feita reação de Transcrição Reversa (RT-PCR) e de PCR em Tempo Real. Os resultados da reação de PCR em Tempo Real demonstraram que a quantidade de material não foi suficiente para a amplificação de produtos em todas as reações. Concluindo, o meio de cultivo TCM199 exerce influência sobre o desenvolvimento embrionário após a criopreservação, sendo mais apropriado do que o meio SOFaa. E, para proceder a análise da expressão gênica pela reação de PCR em Tempo Real é necessário número maior de blastocistos expandidos. / The inefficiency of embryo cryopreservation protocols limits the broad use of in vitro production (IVP) of bovine embryos. The aim of this work was to identify the damage caused by cryopreservation and embryo culture of in vitro produced bovine embryos after thawing by morphological analysis, gene expression and in vitro development before and after cryopreservation. Cummulus-oocyte complexes were in vitro matured, fertilized and cultured. Expanded blastocysts (n= 600) harvested on days 7-9 were submitted controlled freezing [controlled group: 10% ethylene glycol (EG) for 10 minutes and 1.2oC per minute cryopreservation], quick-freezing [quick group: 10% EG for 10 minutes, 20% EG + 20% Glycerol (Gly) for 30 seconds] or vitrification [vitrification group: 10% EG for 10 minutes, 25% EG + 25% Gly for 30 seconds] protocols. The embryos of the control group were not exposed to cryoprotectant or crypreservation method and the hatching rate was evaluated on day12 post-insemination. The straws (quick and vitrification groups) were first placed on nitrogen vapor (0.8 cm over the liquid nitrogen) for 2 minutes and than immersed in liquid nitrogen. Embryos were thawed in air for 10 seconds followed by 25oC water bath for 20 seconds. Embryos were rehydrated in PBS + 0.2% BSA + 0.3M sucrose for 3 minutes and PBS + 0.2% BSA for the same time. In order to evaluate development of frozen-thawed embryos they were cocultured on granulosa cells in TCM 199 or SOFaa for 4 days. Hatching rate of control group was 46.09%. Data was analyzed by PROC MIXED model of SAS Sistems for Windows®. Controlled group hatching rate was 44.65% ± 5.94 and 11.65% ± 3.37 for TCM 199 and in SOFaa, respectively. Embryos submitted to quick group did not hatch regardless of culture condition. Vitrification group showed hatching rates of 9.43% ± 6.77 and 8.67% ± 4.47, respectively, in TCM 199 and SOFaa., and values were significant at p<0.05. The controlled group showed difference between the other groups of cryopreservation in both medium (TCM 199 and SOFaa). However, TCM 199 showed high rates of re-expansion and hatching. To gene expression analysis, 2 pools of 10 expanded blastocysts of fresh and cryopreserved embryos (controlled freezing) was used to RNA extraction, Reverse Transcription PCR (RT-PCR) was done and submitted to a Real Time PCR. The results of the Real Time PCR showed that the amount of material was not enough to the amplification of products in all reactions. In conclusion, the culture medium influences the embryo development after the cryopreservation being TCM199 more appropriate than SOFaa. And more number of expanded blastocysts is necessary to analysis the gene expression in a Real Time PCR reaction.

O sucesso da fecundação e da sustentação do desenvolvimento embrionário subseqüente é dependente de atributos espermáticos relacionados à qualidade seminal. A produção in vitro de embriões em bovinos é uma ferramenta fundamental para a aceleração do ganho genético do rebanho, porém o uso comercial depende diretamente da melhoria do sistema de produções in vitrode embriões a um baixo custo. Técnicas que proporcionem melhoria da qualidade seminal possibilitando um incremento na produção in vitro de embriões e ainda a um baixo custo possuem apelo econômico. O laser de baixa potência emite ondas eletromagnéticas com efeitos biológicos. Este efeito é dependente dos parâmetros de irradiação e do tipo celular alvo. Trabalhos avaliando o laser de baixa potência em amostras seminais sugerem que seja utilizado para melhorar os atributos espermáticos e, conseqüentemente, a produção in vitro de embriões. Este estudo teve como objetivo avaliar o efeito do laser de baixa potência sobre a viabilidade espermática e averiguar o efeito desta estimulação na produção in vitro de embriões bovinos. Para isso, amostras comerciais de sêmen criopreservado foram descongeladas e submetidas à irradiação com laser He-NE. No experimento 1 foram testadas as potências de 0; 5; 7,5 e 10mW, por 5 ou 10 minutos de tratamento. As amostras de sêmen foram avaliadas imediatamente após a irradiação e após 30 minutos de incubação. Foram verificadas possíveis interações duplas (Potência*Duração do Tratamento, Potência*Tempo e Duração do Tratamento*Tempo) e tripla (Potência*Duração do Tratamento*Tempo). No experimento 2 foi avaliado o efeito da melhor combinação potência X duração dos tratamentos utilizados no Experimento 1, para irradiar o sêmen utilizado para a produção in vitro de embriões. O laser de baixa potência apresentou efeito sobre diversos atributos relacionados à viabilidade espermática. Este efeito foi dependente da potência e da duração do tratamento. Nas condições experimentais, a potência de 5mW com duração de 10 minutos de aplicação sugere efeitos positivos no aumento na viabilidade espermática. No entanto, o tratamento de espermatozóides nesta potência e duração do tratamento, não apresenta incremento nas taxas de produção nem na qualidade embrionária. / Success of fertilization and the maintenance of subsequent embryo development rely on sperm attributes related to seminal quality. The in vitro production of bovine embryos is an essential tool for genetic gain in the herd. However, its commercial use directly depends on improvement of the production system at a low cost. Inexpensive techniques which provide an increase of seminal quality, allowing the increment of in vitro production of embryos are of great interest to cattle breeding. Low-power laser emits electromagnetic waves with biological effects. These effects are dependent of irradiation parameters and target cell type. Studies with seminal samples irradiated by low potency laser suggest its use to improve several sperm features and, therefore, in vitro production of embryos. This study aimed to evaluate the effect of low potency laser on sperm viability and fertilization ability of irradiated sperm. Briefly, in Experiment 1, samples of frozen/thawed commercial semen were subjected to He-NE laser irradiation. Laser potencies of 0, 5, 7.5 or 10mW were tested for 5 or 10 min of treatment. Samples were evaluated immediately and 30 min after irradiation. Double (Potency*Treatment length, Potency*Time and Treatment length*Time) and triple interactions (Potency*Treatment length*Time) were assessed. Afterwards, in Experiment 2, the effect of the best combination of potency and exposure length on in vitro production of embryos was verified. Low potency laser affected several semen attributes related to sperm viability. This effect was dependent on laser potency and the length of treatment. In the experimental conditions tested in this study, 5mW potency combined to 10 min of exposure had appeared to have positive effect of increasing sperm viability. However, 5mW potency laser for 10 min sperm irradiation did not improve in vitro embryo production rates and bovine embryo quality.

A ineficiência dos protocolos de criopreservação limita o uso em larga escala da produção in vitro de embriões bovinos. O objetivo deste trabalho foi identificar os danos causados pela criopreservação e pelo cultivo embrionário de embriões bovinos produzidos in vitro após a descongelação, avaliando a morfologia, a expressão gênica e o desenvolvimento in vitro antes e após a criopreservação. Complexos cummulusoócitos foram maturados, fecundados e cultivados in vitro. Blastocistos expandidos (n=600) obtidos entre os dias 7 e 9 de cultivo (fecundação D0) foram submetidos a congelação controlada (grupo controlado: 10% de etileno glicol (EG) por 10 minutos, 1,2oC por minuto), congelação rápida (grupo rápido: 10% de EG por 10 minutos , 20% de EG + 20% de Glicerol (Gli) por 30 segundos) ou vitrificação (grupo vitrificação: 10% de EG por 10 minutos, 25% EG + 25% Gli por 30 segundos). Os embriões do grupo controle não foram expostos a crioprotetores e nem a protocolos de criopreservação, sendo avaliado o índice de eclosão 12 dias após a fecundação (46,09%). As palhetas para os protocolos de congelação rápida e vitrificação foram mantidas em vapor de nitrogênio líquido (0,8cm sobre o líquido) por 2 minutos e imersas no nitrogênio líquido. Os embriões foram descongelados por 10 segundos em ar e 20 segundos em banhomaria a 25oC. Os embriões foram reidratados em solução de PBS + 0,2% de BSA + 0,3M de sacarose e em solução de PBS + 0,2% de BSA ambos por 3 minutos. Para avaliar o desenvolvimento, os embriões, após a descongelação, foram co-cultivados com células da granulosa em meio TCM199 ou SOFaa por 4 dias. Os dados foram analisados com o aplicativo PROC MIXED do programa SAS Sistems for Windows®. O grupo controlado apresentou índices de eclosão de 44,65% ± 5,94 e 11,65 ± 3,37 para o meio TCM199 e para o meio SOFaa, respectivamente. Embriões do grupo rápido não apresentaram eclosão, independente do meio de cultivo. O grupo vitrificação apresentou índices de eclosão de 9,43% ± 6,77 e 8,67% ± 4,47, respectivamente, em meio TCM199 e SOFaa. Os valores foram significativos quando p<0,05. O grupo controlado apresentou diferença em relação aos outros grupos em ambos os meios de cultivo. No meio TCM199 os índices de re-expansão e eclosão foram mais altos. Para a análise da expressão gênica, 2 pools de 10 blastocistos expandidos de embriões frescos e criopreservados (congelação controlada) foram utilizados para a extração de RNA. Foi feita reação de Transcrição Reversa (RT-PCR) e de PCR em Tempo Real. Os resultados da reação de PCR em Tempo Real demonstraram que a quantidade de material não foi suficiente para a amplificação de produtos em todas as reações. Concluindo, o meio de cultivo TCM199 exerce influência sobre o desenvolvimento embrionário após a criopreservação, sendo mais apropriado do que o meio SOFaa. E, para proceder a análise da expressão gênica pela reação de PCR em Tempo Real é necessário número maior de blastocistos expandidos. / The inefficiency of embryo cryopreservation protocols limits the broad use of in vitro production (IVP) of bovine embryos. The aim of this work was to identify the damage caused by cryopreservation and embryo culture of in vitro produced bovine embryos after thawing by morphological analysis, gene expression and in vitro development before and after cryopreservation. Cummulus-oocyte complexes were in vitro matured, fertilized and cultured. Expanded blastocysts (n= 600) harvested on days 7-9 were submitted controlled freezing [controlled group: 10% ethylene glycol (EG) for 10 minutes and 1.2oC per minute cryopreservation], quick-freezing [quick group: 10% EG for 10 minutes, 20% EG + 20% Glycerol (Gly) for 30 seconds] or vitrification [vitrification group: 10% EG for 10 minutes, 25% EG + 25% Gly for 30 seconds] protocols. The embryos of the control group were not exposed to cryoprotectant or crypreservation method and the hatching rate was evaluated on day12 post-insemination. The straws (quick and vitrification groups) were first placed on nitrogen vapor (0.8 cm over the liquid nitrogen) for 2 minutes and than immersed in liquid nitrogen. Embryos were thawed in air for 10 seconds followed by 25oC water bath for 20 seconds. Embryos were rehydrated in PBS + 0.2% BSA + 0.3M sucrose for 3 minutes and PBS + 0.2% BSA for the same time. In order to evaluate development of frozen-thawed embryos they were cocultured on granulosa cells in TCM 199 or SOFaa for 4 days. Hatching rate of control group was 46.09%. Data was analyzed by PROC MIXED model of SAS Sistems for Windows®. Controlled group hatching rate was 44.65% ± 5.94 and 11.65% ± 3.37 for TCM 199 and in SOFaa, respectively. Embryos submitted to quick group did not hatch regardless of culture condition. Vitrification group showed hatching rates of 9.43% ± 6.77 and 8.67% ± 4.47, respectively, in TCM 199 and SOFaa., and values were significant at p<0.05. The controlled group showed difference between the other groups of cryopreservation in both medium (TCM 199 and SOFaa). However, TCM 199 showed high rates of re-expansion and hatching. To gene expression analysis, 2 pools of 10 expanded blastocysts of fresh and cryopreserved embryos (controlled freezing) was used to RNA extraction, Reverse Transcription PCR (RT-PCR) was done and submitted to a Real Time PCR. The results of the Real Time PCR showed that the amount of material was not enough to the amplification of products in all reactions. In conclusion, the culture medium influences the embryo development after the cryopreservation being TCM199 more appropriate than SOFaa. And more number of expanded blastocysts is necessary to analysis the gene expression in a Real Time PCR reaction.

Altas taxas de mortalidade embrionária ocorrem no período de implantação em embriões provenientes de IATF e FIV. Acredita-se que a falha no desenvolvimento do saco vitelino possa estar relacionada com estas perdas embrionárias. O objetivo deste trabalho foi descrever as características macroscópicas, microscópicas e expressão gênica do processo de involução do saco vitelino, visto que os dados da literatura são contraditórios ao descrever os processos de formação e involução do saco vitelino em embriões provenientes de IATF e FIV. Foram utilizados 19 embriões de IATF e 16 de FIV, provenientes da Sociedade Agropecuária Imaculada Conceição-Redenção/PA, Brasil. Observou-se que não houve diferença significativa no tamanho dos embriões nas idades de 25 (p=0,1), 35 (p=0,1), 40 (p=0,4) e 45 (p=0,36) dias, quando comparados os grupos de IATF e FIV. Entretanto entre os embriões de IATF e FIV com 30 dias de gestação, apresentaram diferença estatística (p= 0,03). A curva de crescimento (Crow-Rump) aumentou gradativamente e linearmente em função da idade gestacional. Macroscopicamente, observou-se que aos 25 dias de gestação, o saco vitelino apresentava formato de T e coloração translúcida. Uma porção central se encontrava próxima a região ventral do embrião emitindo duas extremidades que eram finas membranas, estas acompanhavam o alantóide juntamente com os vasos umbilicais. Aos 30 a 35 dias, apresentava coloração amarelada, sua parte central e extremidades bem diminuídas mostrando sinais de um início de regressão. Aos 40 a 45 dias, o seu processo de involução estava caracterizado, com extremidades enoveladas e região central assemelhando-se a um pequeno grão achatado que se encontrava em contato com o âmnio. Microscopicamente, o saco vitelino era formado por três camadas: o endoderma, camada única que reveste a cavidade vitelínica, uma camada intermediária mesenquimal vascular e o mesotélio, camada simples voltada ao exoceloma. O epitélio do saco vitelino formava dobras ou criptas que se projetavam para a luz. Imunohistoquímica notou-se marcação para os anticorpos VEGF, Flt-1 e KDR. Observou-se que não houve diferença significativa na expressão do mRNA do VEGF, KDR e Flt-1 entre os grupos e nas idades gestacionais analisadas, aos 30 dias notou-se uma tendência entre os grupos em relação a expressão do Flt-1. Os fatores de crescimento b FGF, FGFR-1 e FGFR-2, não apresentaram diferenças em suas expressões, somente aos 35 dias de gestação para o mRNA FGFR-1. Conclui-se que o saco vitelino está intensamente relacionado com o desenvolvimento embrionário, na qual sua involução e desaparecimento relacionam-se com o crescimento e \"maturação\" embrionária. / High mortality rates occur during embryonic implantation embryos from IVF and FTAI. It is believed that the failure in the development of the yolk sac may be related to these embryonic losses. The objective of this study was to describe the macroscopic, microscopic and mRNA expression features of the yolk sac involution process, since the literature relates contradictory information regarding the processes of formation and involution of the yolk sac in IVF and TAI embryos. Nineteen embryos were used for FTAI and 16 IVF; the specimes were obtained from the Sociedade Agropecuária Imaculada Conceição-Redenção/PA, Brazil. No significant differences were observed in the size of embryos aged 25 (p = 0.1), 35 (p = 0.1), 40 (p = 0.4) and 45 (p = 0.36) days in the groups of IVF and FTAI. However between FTAI and IVF embryos with 30 days of gestation, a difference (p = 0.03) was detectable. The growth curve (Crow-Rump) increased gradually and linearly with gestational age. Macroscopically, it was observed that after 25 days of gestation, the yolk sac was \"T-shaped\" and transparent colored. A central portion was observed in the vicinity of the ventral ends of the embryo exhibiting two thin membranes, which accompanied the allantois with the umbilical vessels. At 30 to 35 days this portion becomes yellowish and its central part together with the extremities was reduced displaying clearly signs of regression. At 40 to 45 days, the process of involution was presented in a curled fashion and ends with the central region resembling a flat small grain in contact with the amnion. Microscopically, the yolk sac was formed by three layers: the endoderm, single layer lining the vitelline cavity, an intermediate layer and vascular mesenchymal mesothelium, exoceloma focused on single layer. The epithelium of the yolk sac formed folds or crypts, which projected to the light. Immunohistochemistry marking was noted for antibodies VEGF, Flt-1 and KDR. No significant difference were observed in mRNA expression of VEGF, KDR and Flt-1 between groups and the gestational ages analyzed at 30 days there has been a trend among the groups regarding the expression of Flt-1. The growth factors bFGF, FGFR-1 and FGFR-2 showed no differences in their expressions, with the exception of 35 days of gestation for the m-RNA FGFR 1. It was concluded that the yolk sac is strongly related to embryonic development, in which the involution and disappearance are related to growth and \"maturity\" stage.

Submitted by Sandro Camargo (sandro.camargo@unipampa.edu.br) on 2015-03-08T18:55:13Z No. of bitstreams: 1 117110032.pdf: 700015 bytes, checksum: 794f9c0fa96f18e2200227f043531c61 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-08T18:55:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 117110032.pdf: 700015 bytes, checksum: 794f9c0fa96f18e2200227f043531c61 (MD5) Previous issue date: 2013-08-02 / A maturação in vitro (MIV) é um dos pontos críticos da produção in vitro de embriões bovinos, sendo que vários fatores podem interferir na MIV, como a tensão de oxigênio e a densidade de oócitos por volume de meio. O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito da tensão de oxigênio associada a diferentes densidades de oócitos durante a MIV. Para tanto, três experimentos foram conduzidos com oócitos bovinos obtidos de ovários de abatedouro. O experimento I consistiu na avaliação da maturação citoplasmática e nuclear, o experimento II na avaliação da produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) e atividade antioxidante, e o experimento III na avaliação das taxas de fecundação in vitro. Após a seleção, os oócitos foram submetidos a MIV distribuídos aleatoriamente em 4 tratamentos: Tratamento 1:10/5%: 1 oócito em 10μl de meio de MIV em 5% de O 2 ; Tratamento 1:10/20%: 1 oócito em 10μl de meio em 20% de O 2 ; Tratamento 1:20/5%: 1 oócito em 20μl em 5% de O 2 e Tratamento 1:20/20%: 1 oócito em 20μl de meio em 20% de O 2 . A MIV foi conduzida em grupos de 15 oócitos em meio TCM 199 modificado, acrescido de FSH, LH, EGF, soro de égua em estro (SEE) e piruvato por 24h. Decorrido o período de MIV foi conduzida a fecundação in vitro em gotas de 300μl de meio Fert-TALP, sendo realizada pelo co-cultivo de oócitos e espermatozóides (2x10 6 sptz/mL) selecionados por gradientes de mini-Percoll por 18h. No experimento I, as taxas de maturação nuclear (69,66%) e maturação citoplasmática (71,55%) foram similares entre os tratamentos (P>0,05). No experimento II, a produção de ROS foi avaliada nos oócitos e no meio de MIV, assim como a atividade antioxidante foi avaliada após 24 h de MIV. A produção de ROS pelos oócitos foi superior nos tratamentos com baixa tensão de oxigênio (5%; 13,3UF) em relação a alta tensão de oxigênio (20%; 7,0UF) independentemente da densidade de oócitos (P<0,05). Os níveis de ROS detectados no meio de MIV foram superiores nos tratamentos com alta densidade de oócitos (1:10) independentemente da tensão de oxigênio (P<0,05). A atividade da SOD (21,3UI) e os níveis de GSH (6,95 nmol GSH/ml) mensurados nos oócitos foram similares entre os tratamentos (P>0,05). As taxas de fecundação e penetração foram superiores nos tratamentos com 20% de O 2 e com alta densidade de oócitos (1:10; 48,8%) em relação aos tratamentos 1:10/5% (29,5%) e 1:20/20% (29,1%; P<0,05). Adicionalmente a taxa de polispermia foi maior no tratamento com alta tensão de oxigênio e baixa densidade de oócitos. (1:20/20%; 27.8%) em relação ao tratamento 1:10/20% (13,41%; P<0,05). Os resultados deste estudo mostram interação entre a tensão de oxigênio e a densidade de oócitos aumentando a produção de ROS em determinadas associações e influenciando posteriormente as taxas de fecundação in vitro de oócitos bovinos. / The in vitro maturation is one of the critical points on in vitro production of bovine embryos so many factors can do an interference on IVM, like oxygen tension and oocyte density by volume of medium. The aim of this study was evaluate the effects of association of oxygen tension with different oocyte density during IVM Three experiments were performed with bovine oocytes obtained from abattoir ovaries, on experiment I was performed the nuclear and cytoplasmic evaluation, on the experiment III the biochemical assay of ROS production and antioxidant activity and on experiment III was realized the evaluation of in vitro fertilization. After selection, the oocytes were randomly distributed in 4 treatments: Treatment 1:10/5%: 1:10µl in 5% of O2; Treatment 1:10/20%: 1:10µl in 20% of O2; Treatment 1:20/5%: 1:20µl in 5% of O2; Treatment 1:20/20%: 1:20µl in 20% of O2. The IVM was performed in droplets (150µl or 300µl) of TCM 199 plus FSH, LH, EGF, EMS and pyruvate. The IVF were performed in droplets (300µl) of Fert-TALP. Was realized IVF with oocytes and spermatozoa (2x106 sptz/mL) selected by Percoll density gradients for 18h. On experiment I, the nuclear maturation rates (69.66%) and reorganization mitochondrial (71.55%) rates were similar among treatments (P>0.05). In Experiment II, the ROS production in oocytes, IVM medium and antioxidant activity were evaluated after 24 h of IVM. ROS production in oocytes was higher on treatments with low tension (5%; 13.3 UF) than 20% oxygen tension (7.0 UF) independently of oocyte density (P<0.05). ROS levels on IVM medium was higher on treatments with high oocyte density (1:10) independently of oxygen tension (P<0.05). The GSH levels (6.95 nmol GSH/ml) and SOD activity (21.3UI) were similar among treatments (P>0.05). The rates of normal fertilization and normal penetration were higher in treatments with 20% of O2 with high oocyte density (1:10;48.8%) than treatments 1:10/5% (29.5%) and 1:20/20% (29.1%; P<0.05). In addiction the polysperm rates were higher on treatment with high oxygen tension and low oocyte density (1:20/20%; 27.8%) than treatment 1:10/20% (13.4%; P<0.05). The results of this study show an interaction between oxygen tension and oocyte density, that increase ROS production on certain associations and subsequently affects the IVF rates. / The viruses are significant important pathogenic agents of several animal species, including cattle. In Brazil, several viral agents causing infections have been described in cattle and they produce significant economic losses. The identification of animals infected by a virus can be performed in different ways; however, definitive confirmation requires demonstration of the agent or immune response. For this purpose, various methods with the capacity to detect the viral particle, biological activity, genome, viral antigens, or specific immune response have been developed. Immunoassays are widely used in laboratory routine for detection of viral antigens in clinical or research. These assays exhibit good sensitivity, specificity and easy for implantation. The immunoassay methodologies are based on the employment of monoclonal or polyclonal antibodies specific to the viral antigens. Therefore, the aim of this study was to produce polyclonal antibodies for some bovine virus, and evaluate their reactivity in immunofluorescence, immunoperoxidase and slot blot tests. For this purpose, strains and/or isolates of bovine herpesvirus type 1 (BoHV-1), bovine herpesvirus type 2 (BoHV-2), bovine herpesvirus type 5 (BoHV-5), bovine herpesvirus type 5 gE deleted (BoHV-5 gEΔ), bovine viral diarrhea virus (BVDV), bovine respiratory syncytial virus (BRSV), bluetongue virus (BTV), and vaccinia virus (VACV) were amplified in cell culture and the supernatant were used to immunize rabbits. The animals were immunized five times by the subcutaneous route, and five days after the last boost the blood was collected. The serum was obtained by centrifugation. The serum was diluted (1:100 a 1:204.800) and used as primary antibodies in the immunofluorescence, immunoperoxidase and slot blot assays. The working dilution was selected among those produced specific reaction with infected cells and absent or weak background in control cells. The antiserum showed higher reactivity in immunoperoxidase technique than the immunofluorescence and slot blot. The antiserum of the BoHV-1, BoHV-5, BVDV and BRSV presented the reactivity when tested with heterologous isolates in immunofluorescence, immunoperoxidase assays. In summary, that the polyclonal antibodies raised in rabbits have high concentrations of specific antibodies, which were demonstrated by the reactivity in immunofluorescence, immunoperoxidase and slot blot assays. Additionally, these reagents can be considered an important tool for the detection and characterization of various bovine viruses in diagnostic and research routine.

Altas taxas de mortalidade embrionária ocorrem no período de implantação em embriões provenientes de IATF e FIV. Acredita-se que a falha no desenvolvimento do saco vitelino possa estar relacionada com estas perdas embrionárias. O objetivo deste trabalho foi descrever as características macroscópicas, microscópicas e expressão gênica do processo de involução do saco vitelino, visto que os dados da literatura são contraditórios ao descrever os processos de formação e involução do saco vitelino em embriões provenientes de IATF e FIV. Foram utilizados 19 embriões de IATF e 16 de FIV, provenientes da Sociedade Agropecuária Imaculada Conceição-Redenção/PA, Brasil. Observou-se que não houve diferença significativa no tamanho dos embriões nas idades de 25 (p=0,1), 35 (p=0,1), 40 (p=0,4) e 45 (p=0,36) dias, quando comparados os grupos de IATF e FIV. Entretanto entre os embriões de IATF e FIV com 30 dias de gestação, apresentaram diferença estatística (p= 0,03). A curva de crescimento (Crow-Rump) aumentou gradativamente e linearmente em função da idade gestacional. Macroscopicamente, observou-se que aos 25 dias de gestação, o saco vitelino apresentava formato de T e coloração translúcida. Uma porção central se encontrava próxima a região ventral do embrião emitindo duas extremidades que eram finas membranas, estas acompanhavam o alantóide juntamente com os vasos umbilicais. Aos 30 a 35 dias, apresentava coloração amarelada, sua parte central e extremidades bem diminuídas mostrando sinais de um início de regressão. Aos 40 a 45 dias, o seu processo de involução estava caracterizado, com extremidades enoveladas e região central assemelhando-se a um pequeno grão achatado que se encontrava em contato com o âmnio. Microscopicamente, o saco vitelino era formado por três camadas: o endoderma, camada única que reveste a cavidade vitelínica, uma camada intermediária mesenquimal vascular e o mesotélio, camada simples voltada ao exoceloma. O epitélio do saco vitelino formava dobras ou criptas que se projetavam para a luz. Imunohistoquímica notou-se marcação para os anticorpos VEGF, Flt-1 e KDR. Observou-se que não houve diferença significativa na expressão do mRNA do VEGF, KDR e Flt-1 entre os grupos e nas idades gestacionais analisadas, aos 30 dias notou-se uma tendência entre os grupos em relação a expressão do Flt-1. Os fatores de crescimento b FGF, FGFR-1 e FGFR-2, não apresentaram diferenças em suas expressões, somente aos 35 dias de gestação para o mRNA FGFR-1. Conclui-se que o saco vitelino está intensamente relacionado com o desenvolvimento embrionário, na qual sua involução e desaparecimento relacionam-se com o crescimento e \"maturação\" embrionária. / High mortality rates occur during embryonic implantation embryos from IVF and FTAI. It is believed that the failure in the development of the yolk sac may be related to these embryonic losses. The objective of this study was to describe the macroscopic, microscopic and mRNA expression features of the yolk sac involution process, since the literature relates contradictory information regarding the processes of formation and involution of the yolk sac in IVF and TAI embryos. Nineteen embryos were used for FTAI and 16 IVF; the specimes were obtained from the Sociedade Agropecuária Imaculada Conceição-Redenção/PA, Brazil. No significant differences were observed in the size of embryos aged 25 (p = 0.1), 35 (p = 0.1), 40 (p = 0.4) and 45 (p = 0.36) days in the groups of IVF and FTAI. However between FTAI and IVF embryos with 30 days of gestation, a difference (p = 0.03) was detectable. The growth curve (Crow-Rump) increased gradually and linearly with gestational age. Macroscopically, it was observed that after 25 days of gestation, the yolk sac was \"T-shaped\" and transparent colored. A central portion was observed in the vicinity of the ventral ends of the embryo exhibiting two thin membranes, which accompanied the allantois with the umbilical vessels. At 30 to 35 days this portion becomes yellowish and its central part together with the extremities was reduced displaying clearly signs of regression. At 40 to 45 days, the process of involution was presented in a curled fashion and ends with the central region resembling a flat small grain in contact with the amnion. Microscopically, the yolk sac was formed by three layers: the endoderm, single layer lining the vitelline cavity, an intermediate layer and vascular mesenchymal mesothelium, exoceloma focused on single layer. The epithelium of the yolk sac formed folds or crypts, which projected to the light. Immunohistochemistry marking was noted for antibodies VEGF, Flt-1 and KDR. No significant difference were observed in mRNA expression of VEGF, KDR and Flt-1 between groups and the gestational ages analyzed at 30 days there has been a trend among the groups regarding the expression of Flt-1. The growth factors bFGF, FGFR-1 and FGFR-2 showed no differences in their expressions, with the exception of 35 days of gestation for the m-RNA FGFR 1. It was concluded that the yolk sac is strongly related to embryonic development, in which the involution and disappearance are related to growth and \"maturity\" stage.

Made available in DSpace on 2016-12-08T16:24:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PGCA12MA106.pdf: 7444114 bytes, checksum: 2547058845886ef40cf92c5b6a4e6867 (MD5) Previous issue date: 2012-03-27 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Newborn calves derived from in vitro fertilization (IVF) procedures often have difficulties to adapt to life ex utero, with high birth weights usually associated with high plasma fructose levels in some in vitro-produced calves. We hypothesize that the fructose metabolic pathway is active at birth, with the fructosemia levels being either detrimental or beneficial to animal survival depending on the respiratory function in the neonate. To investigate this hypothesis, four and five newborn calves derived from in vitro- and in vivo-produced embryos were evaluated for morpho-physiological and clinical normality at birth, and for subsequent signs adaptation to life ex utero in the first 24 h of life. At birth, animals were subjected to gene expression analyses for key enzymes in the fructose metabolic pathway and to the collection of fetal fluids and urine for fructose analysis. In addition, during the period between birth and 24 h of life, animals were evaluated for clinical signs, plasma concentrations of metabolic substrates, blood chemistry, hemogasometry, and hematologic parameters. Neonatal physical, clinical, and behavioral traits were compared with physiological, biochemical, metabolic, and molecular findings observed at birth and in the first 24 h of life for the determination of physiological alterations and relationships of biological significance between the experimental groups. In vitro-derived newborn calves were heavier and larger at birth, having lower respiratory rate and thermoregulatory response than in vivo-derived controls, with no significant differences in fructose, glucose and lactate levels between groups. Nevertheless, physiological and metabolic findings at birth, in general, were widely similar and normal between groups. However, during the first 24 h of life, IVF-derived calves showed physiological, metabolic, biochemical, hemogasometric, and hematologic features indicative of a lower adaptation to life ex utero, particularly in the first 4 to 6 h of life. The main differences indicated that larger animals, mainly the IVF-derived calves, had more difficulties to maintain plasma oxygen levels, likely due to a less efficient hematosis, with evidence of a metabolic shift and elevation of metabolic substrates (mostly lactate), and a trend for acidosis followed by a compensatory normalization of the acid-base balance, predominantly in the first 6 h of life. The physiological and metabolic role of fructose was apparent, but not conclusive / Neonatos bovinos derivados de fecundação in vitro (FIV) frequentemente apresentam dificuldades de adaptação à vida ex utero, estando o excesso de peso ao nascer associado a elevadas concentrações plasmáticas de frutose em alguns bezerros de FIV. A hipótese deste trabalho é que a via metabólica da frutose é ativa ao nascimento, podendo ser benéfica ou prejudicial à sobrevivência neonatal, dependendo da função respiratória do neonato. Para investigar esta hipótese, quatro neonatos bovinos derivados de embriões produzidos in vitro e cinco de embriões in vivo foram avaliados quanto à normalidade morfo-fisiológica e clínica ao nascimento, e quanto a sinais de adaptação ao ambiente extrauterino nas primeiras 24 h de vida. Ao nascimento, os animais foram submetidos à análise de expressão gênica de enzimas da via metabólica da frutose e à coleta de fluídos fetais e de urina para mensuração da frutose. Durante o período do parto até as 24 h de vida, foram avaliados os sinais clínicos, as concentrações plasmáticas de substratos metabólicos, a bioquímica sanguínea, a hemogasometria e o hemograma. As características físicas, clínicas e comportamentais dos neonatos foram comparadas aos parâmetros fisiológicos, bioquímicos, metabólicos e moleculares avaliados ao parto e nas primeiras 24 h de vida para a determinação de alterações fisiológicas e inter-relações de significância biológica entre os grupos experimentais. Os neonatos bovinos derivados de FIV foram mais pesados e maiores ao nascimento, apresentando uma menor frequência respiratória e uma menor resposta termoregulatória que animais SOV, não havendo diferenças nos níveis de frutose, glicose e lactato entre os grupos. Não obstante, os parâmetros fisiológicos e metabólicos ao nascimento foram, em geral, amplamente similares e normais entre os grupos experimentais. Porém, ao longo das primeiras 24 h, os neonatos de FIV apresentaram características fisiológicas, metabólicas, bioquímicas, hemogasométricas, e hematológicas indicativas de uma maior dificuldade de adaptação à vida ex utero, em especial nas primeiras 4 a 6 h após de vida. As principais diferenças indicaram que animais maiores, em especial os de FIV, apresentaram maior dificuldade para a manutenção da normóxia, por uma hematose menos eficiente, mudanças metabólicas e uma elevação de substratos metabólicos (principalmente o lactato), e uma tendência à acidose com normalização compensatória do balanço ácido-base, principalmente nas primeiras 6 h de vida. O papel fisiológico e metabólico da frutose foi aparente, mas não conclusivo

O avanço da ciência, em especial na área da reprodução humana, permitiu a ocorrência de concepção humana de forma extracorpórea através do processo de fecundação in vitro a ser feita em laboratório especializado em reprodução humana assistida. Os embriões não implantados em útero materno são criopreservados. Este trabalho busca trazer os questionamentos da bioética, do biodireito, a cerca deste tema e das questões nele envolvidas. Também examina o enquadramento destes embriões sob a ótica da proteção Constitucional do patrimônio genético, da inviolabilidade da vida e da dignidade da pessoa humana. Trata também do Meio Ambiente quando aborda a Constituição Federal Brasileira de 1988, que em seu artigo 225 § 1º, inciso I, legisla sobre a preservação e restauração dos processos ecológicos e, no inciso II, determina que incumbe ao poder público preservar a diversidade e a integridade do patrimônio genético do País ficando demonstrado que tratar de embriões é tratar de patrimônio genético e de Meio Ambiente.Trata ainda da Nova Lei de Biossegurança/2005, a qual veio permitir pesquisas com célulastronco de embriões criopreservados, bem como a regulamentação desta Lei, tratando ainda sobre a Ação Direta de Inconstitucionalidade (ADIN) 3.510-0 que fora proposta junto ao Supremo Tribunal Federal (STF), questionando a constitucionalidade da permissão legal destas pesquisas. Dessa forma, é feita uma análise sobre a legislação existente com vistas a obter uma visão sobre eventuais direitos e proteção dos embriões criopreservados. / Submitted by Marcelo Teixeira (mvteixeira@ucs.br) on 2014-06-04T19:54:25Z No. of bitstreams: 1 Dissertacao Denise Kempf.pdf: 1443498 bytes, checksum: 1586cffbe1630fc158628d51f0cd295a (MD5) / Made available in DSpace on 2014-06-04T19:54:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao Denise Kempf.pdf: 1443498 bytes, checksum: 1586cffbe1630fc158628d51f0cd295a (MD5) / The advancement of science, particularly in the area of human reproduction, allowed the occurrence of human conception in a bypass through the process of in vitro fertilization to be made in a laboratory specializing in assisted human reproduction. The embryos not implanted in the uterus are cryopreserved. This work seeks to bring the questions of bioethics, the biolaw, about this issue and the issues involved. It also examines the framework of these embryos from the perspective of Constitutional protection of genetic heritage, the sanctity of life and human dignity. It also deals with the Environment when addresses the Brazilian Constitution of 1988, which in article 225 § 1, section I, legislation on the preservation and restoration of ecological processes and, in section II, provides that "it is for the government to preserve the diversity and integrity of the genetic heritage being shown that treating embryos is to address genetic heritage and also the Middle Ambiente.Trata Biossegurança/2005 New Law, which has allowed research on stem cells from cryopreserved embryos, as well as regulation this Act, still dealing with on the direct action of unconstitutionality (ADIN) 3510-0 which was proposed to the Supreme Court (STF), questioning the constitutionality of the legal permission of this research. Thus, an analysis is made on the existing legislation in order to get an insight into possible rights and protection of cryopreserved embryos.

O avanço da ciência, em especial na área da reprodução humana, permitiu a ocorrência de concepção humana de forma extracorpórea através do processo de fecundação in vitro a ser feita em laboratório especializado em reprodução humana assistida. Os embriões não implantados em útero materno são criopreservados. Este trabalho busca trazer os questionamentos da bioética, do biodireito, a cerca deste tema e das questões nele envolvidas. Também examina o enquadramento destes embriões sob a ótica da proteção Constitucional do patrimônio genético, da inviolabilidade da vida e da dignidade da pessoa humana. Trata também do Meio Ambiente quando aborda a Constituição Federal Brasileira de 1988, que em seu artigo 225 § 1º, inciso I, legisla sobre a preservação e restauração dos processos ecológicos e, no inciso II, determina que incumbe ao poder público preservar a diversidade e a integridade do patrimônio genético do País ficando demonstrado que tratar de embriões é tratar de patrimônio genético e de Meio Ambiente.Trata ainda da Nova Lei de Biossegurança/2005, a qual veio permitir pesquisas com célulastronco de embriões criopreservados, bem como a regulamentação desta Lei, tratando ainda sobre a Ação Direta de Inconstitucionalidade (ADIN) 3.510-0 que fora proposta junto ao Supremo Tribunal Federal (STF), questionando a constitucionalidade da permissão legal destas pesquisas. Dessa forma, é feita uma análise sobre a legislação existente com vistas a obter uma visão sobre eventuais direitos e proteção dos embriões criopreservados. / The advancement of science, particularly in the area of human reproduction, allowed the occurrence of human conception in a bypass through the process of in vitro fertilization to be made in a laboratory specializing in assisted human reproduction. The embryos not implanted in the uterus are cryopreserved. This work seeks to bring the questions of bioethics, the biolaw, about this issue and the issues involved. It also examines the framework of these embryos from the perspective of Constitutional protection of genetic heritage, the sanctity of life and human dignity. It also deals with the Environment when addresses the Brazilian Constitution of 1988, which in article 225 § 1, section I, legislation on the preservation and restoration of ecological processes and, in section II, provides that "it is for the government to preserve the diversity and integrity of the genetic heritage being shown that treating embryos is to address genetic heritage and also the Middle Ambiente.Trata Biossegurança/2005 New Law, which has allowed research on stem cells from cryopreserved embryos, as well as regulation this Act, still dealing with on the direct action of unconstitutionality (ADIN) 3510-0 which was proposed to the Supreme Court (STF), questioning the constitutionality of the legal permission of this research. Thus, an analysis is made on the existing legislation in order to get an insight into possible rights and protection of cryopreserved embryos.