A escolha e caracterização do ecossistema de referencia são fundamentais para orientar as ações de restauração. Além disso, novas técnicas devem ser testadas para aumentar a riqueza e o potencial da restauração ecológica, sendo duas delas a semeadura direta e a estaquia. A área de estudo corresponde a um trecho de pastagem e três fragmentos de Floresta Estacional Semidecidual, no município de Piracaia, São Paulo (23º00\'58\'\' a 23º00\'31\'\' S e 46º17\'04\'\' a 46º16\'26\'\' W). Esta dissertação teve como objetivo, no primeiro capitulo, elaborar um levantamento florístico dos fragmentos florestais e da regeneração natural na área de pasto do Projeto Cachoeira. No segundo capitulo avaliou-se o potencial de utilização da semeadura direta, objetivando-se: i) Estudar espécies nativas potenciais para uso da técnica; ii) Avaliar se a densidade de plântulas após seis meses foi suficiente para se obter uma ocupação de 1667 mudas por hectare; iii) Avaliar diferentes condições (tratamentos) da semeadura de espécies nativas para potencializar a emergência e estabelecimento das plântulas. O terceiro capitulo teve como objetivos: i) avaliar a capacidade de estabelecimento de estacas de grande porte diretamente no campo em 5 tratamentos (duas concentrações de hormônio AIB 4000 e 6000 ppm; com e sem a aplicação de hidrogel; e testemunha); ii) avaliar o enraizamento de estacas de pequeno porte em câmara de nebulização em 3 tratamentos (em duas concentrações de hormônio AIB 4000 e 6000 ppm e testemunha). O resultado do estudo floristico realizado no fragmento florestal 1 resultou na amostragem de 38 famílias, 72 gêneros, 87 espécies. No fragmento 2 foram amostradas 40 famílias, 73 gêneros, 86 espécies. No fragmento 3 foram amostradas 37 famílias, 79 gêneros, 104 espécies. Na área de pastagem obteve-se 20 famílias, 27 gêneros, 39 espécies. Na analise floristica geral foram amostradas 156 espécies, 112 gêneros, pertencentes a 51 famílias. O resultado da semeadura mostrou que está técnica é viável. Avaliando-se após 180 dias o melhor tratamento (sem hidratação recoberto com terra) apresentou 3817 indivíduos ha -1, obtendo o maior índice de estabelecimento. Devemos salientar que através da utilização de diversos tratamentos, pode-se criar distinto microssitios, permitindo o aumento da riqueza e diversidade de espécies estabelecidas tanto pela semeadura direta, quanto pela regeneração natural. A incorporação ou recobrimento das sementes se mostrou de extrema importância para a germinação e estabelecimento destas. Os resultados demonstrados para a técnica de estaquia sugerem que são necessários novos estudos e aprimoramentos para que esta técnica se torne viável nas condições avaliadas. Para estacas de grande porte, observou-se após 45 dias uma mortalidade de 100%. Isto provavelmente ocorreu devido à baixa resistência das estacas à dessecação, o que pode ser verificado com as estacas de pequeno porte na Câmera de Nebulização, onde por problemas mecânicos as estacas ficaram sem aspersão de água por dois dias e novamente a mortalidade foi total. Entretanto observações empíricas sugerem que espécies de subbosque apresentam potencial para a técnica de estaquia nas condições de Câmera de Nebulização, assim como alguns estudos apontam que está técnica pode ser eficaz para algumas espécies de Cerrado. / The selection and characterization of the ecosystem of reference are essential to guide restoration actions. In addition, new techniques must be tested to increase the wealth and potential of ecological restoration, two of these new techniques are direct seeding and cuttings. The study area corresponds to a stretch of pasture and three fragments of semideciduous forest in the municipality of Piracaia, Sao Paulo (23 ° 00\'58\'\'23 ° 00\'31\'\'Sand 46 º 17\'04\'\'to 46 16\'26\'\'W). This work aims, in the first chapter, prepare a floristic survey of forest fragments and natural regeneration in the area of pasture Project Waterfall. In the second chapter evaluates the potential use of direct seeding, aiming to: i) to study native species for potential use of the technique, ii) Evaluated the density of seedlings after six months was sufficient to obtain an occupancy rate of 1666 seedling per hectare iii) evaluated different conditions (treatments) of native species sowing to potentiate the emergence and seedling establishment. The third chapter aimed to: i) evaluated the ability for large cuttings directly in the field in five treatments (two hormone concentration 4000 and 6000 ppm IBA, with and without the application of hydrogel, and control), ii) evaluate the rooting of small cuttings in a fogging chamber in three treatments (two hormone concentration 4000 and 6000 ppm and control). The result of floristic study conducted in the forest fragment 1 resulted in a sample of 38 families, 72 genera, 87 species. In fragment 3 were sampled 37 families, 79 genera, 104 species. In the pasture area was obtained 20 families, 27 genera, 39 species. In general floristic analyses werw sampled 156 species, 122 genera, belonging to 51 families. The result showed that the seeding technique is feasible. Evaluating after 180 days the best treatment (not covered with soil moisture) showed 3817 individuals ha -1, obtaining the highest rate of establishment. We note that through the use of several treatments, you can create separate micros sites, allowing the increase of wealth and diversity of species established both by direct sowing as by natural regeneration. The incorporation or coating of the seeds proved to be extremely important for germination. The incorporation or coating of the seeds proved to be extremely important for germination and establishment of these. The results shown for the technique of cutting suggest that further studies and improvements for this technique to be viable under the conditions evaluated. For cuttings of large size, was observed after 45 days a 100% of mortality. This was probably due to low resistance of the cutting to desiccation o, which can be verified with the small cuttings in Fogging Camera. Because mechanical problems these small cuttings were without water for two days and again total mortality was showed again. However empirical observations suggest that understory species have potential for the technique of cutting in Fogging Camera conditions, as well as some studies suggest that this technique can be effective for some species of the Cerrado.

O câncer (neoplasia) é uma das principais causas de mortalidade no mundo. Apesar dos grandes avanços no diagnóstico e nas formas de tratamento, ele ainda representa um enorme desafio para os pesquisadores de muitas áreas. Recentemente houve uma importante descoberta que poderá fornecer um paradigma completamente diferente no entendimento de como o câncer se inicia e cresce, com eventualmente profundas consequências nas formas de tratamento. Essa descoberta diz respeito a presença de células tronco adultas em tumores e seu possível papel no surgimento e crescimento destes. Propomos nesse trabalho um modelo matemático que considera a presença de células com propriedades de (a) auto renovação , (b) diferenciação e (c) mobilidade , características das células tronco. O modelo proposto é um autômato celular probabilístico com atualização assíncrona em uma rede. Cada elemento da rede pode estar vazio ou conter uma célula tumoral. Há dois tipos de células: as células rotuladas como do tipo 2 que são aquelas associadas com as células tronco tumorais e aquelas rotuladas como do tipo 1 que são as células diferenciadas, somente com capacidade de reprodução. A taxa de reprodução de cada célula é definida como uma função de sua vizinhança e tipo. Diferentes taxas de reprodução foram usadas nas simulações e as células do tipo 2 podem diferenciar-se ou mover-se. Os resultados das simulações mostram como a motilidade das células 2 e as taxas de reprodução de ambos os tipos de células influenciam os padrões morfológicos do tumor. Também investigamos uma possível transição de fase que pode estar relacionada a metástase. Essa transição de fase representa algo de grande interesse biológico, uma vez que a metástase é o mecanismo mais importante que leva o organismo a óbito. Compararemos nossos resultados com dados experimentais dos colaboradores Nascimento TL et al [1] da UNIFESP- Escola Paulista de Medicina. / Cancer (neoplasia) is one of the most dangerous diseases and one of the main cause of mortality around the world. Despite the great advances in diagnosis and treatment, it still represents a huge challenge to researchers of many areas. Recently there was a strinking discovery that may give rise to a complete different paradigm in the understanding of how cancer starts and grows, with eventually profound consequences in the forms of treatment. It is related to the ending of adult stem cells in tumors, and its possible role in the birth and growth of them. We propose in this work a mathematical model that takes into account the presence of cells with the properties of (a) self renewal, (b) differentiation and (c) mobility, characteristics of stem cells. The model developed is a probabilistic cellular automaton with asynchronous update set in a grid. Each element of the grid may be empty or contain a tumor cell. There are two types of cells: the cells labeled as type 2 are those associated with cancer stem cells and those labeled as type 1 are differentiated cells only capable of reproducing. The reproduction rate of each cell is defined as a function of its neighborhood and its type. Different rates of reproduction have been used in the simulations, and type 2 cells may differentiate and some motility. Our simulation results show how the motility of cells 2 and the reproduction rates of both types of cells influence the morphological patterns of tumor. We have also investigated a possible phase transition that may be related to metastasis. This phase transition represents something of great biological interest because metastasis is the most important mechanism that leads to death. We will compare our results with experimental data from collaborators Nascimento TL et al [1] in UNIFESP-Escola Paulista de Medicina.

Células de Schwann (CS) cultivadas a partir de nervo ciático de ratos foram enxertadas, associadas ou não ao fator de crescimento derivado de células gliais (GDNF), em ratos adultos submetidos à transecção total da medula espinhal (T11). Análises do comportamento motor do 1º ao 3º mês pós-operatório e do crescimento de fibras nervosas imunorreativas no epicentro do enxerto ao término deste período mostraram: melhora temporal dos parâmetros motores superior nos grupos que receberam CS, que foi potencializada na presença do GDNF; aumento na quantidade de axônios nos grupos que receberam CS, efeito potencializado na presença do GDNF. Em outro experimento, as reatividades astrocitária, microglial e do fator neurotrófico bFGF astrocitário foram avaliados na medula espinhal parcialmente transectada de ratos, 1 semana e 3 meses após a cirurgia. Ativação astrocitária e microglial e maior intensidade de bFGF nas substâncias branca e cinzenta foram encontradas em toda a extensão da medula, fatos relacionados ao processo local de cicatrização e fenômenos tróficos e plásticos à distância. / Schwann cells (SC) obtained from rat sciatic nerve were grafted, in the presence or not of glial derived neurotrophic factor (GDNF), in adult rats submitted to a complete spinal cord transection at T11. Behavioral analysis from the 1st to the 3rd post operative month and of the immunoreactive fiber outgrowth in the graft epicenter at the end of this period showed: temporal improvements on motor parameters that were superior in the groups that received SC, being even higher in the presence of GDNF; increased amount of axonal fibers in the groups treated with SC, being even higher in the presence of GDNF. In another experiment, astrocytic and microglial activation and astrocytic neurotrophic factor bFGF expression were analyzed after a partial spinal cord transection, 1 week and 3 months after surgery. Astrocitic and microglial activation as well as a higher intensity of astrocitic bFGF in the white and gray matters were found in the entire spinal cord, what is related to the local scar formation and distant trophic and plastic phenomena.

A escolha e caracterização do ecossistema de referencia são fundamentais para orientar as ações de restauração. Além disso, novas técnicas devem ser testadas para aumentar a riqueza e o potencial da restauração ecológica, sendo duas delas a semeadura direta e a estaquia. A área de estudo corresponde a um trecho de pastagem e três fragmentos de Floresta Estacional Semidecidual, no município de Piracaia, São Paulo (23º00\'58\'\' a 23º00\'31\'\' S e 46º17\'04\'\' a 46º16\'26\'\' W). Esta dissertação teve como objetivo, no primeiro capitulo, elaborar um levantamento florístico dos fragmentos florestais e da regeneração natural na área de pasto do Projeto Cachoeira. No segundo capitulo avaliou-se o potencial de utilização da semeadura direta, objetivando-se: i) Estudar espécies nativas potenciais para uso da técnica; ii) Avaliar se a densidade de plântulas após seis meses foi suficiente para se obter uma ocupação de 1667 mudas por hectare; iii) Avaliar diferentes condições (tratamentos) da semeadura de espécies nativas para potencializar a emergência e estabelecimento das plântulas. O terceiro capitulo teve como objetivos: i) avaliar a capacidade de estabelecimento de estacas de grande porte diretamente no campo em 5 tratamentos (duas concentrações de hormônio AIB 4000 e 6000 ppm; com e sem a aplicação de hidrogel; e testemunha); ii) avaliar o enraizamento de estacas de pequeno porte em câmara de nebulização em 3 tratamentos (em duas concentrações de hormônio AIB 4000 e 6000 ppm e testemunha). O resultado do estudo floristico realizado no fragmento florestal 1 resultou na amostragem de 38 famílias, 72 gêneros, 87 espécies. No fragmento 2 foram amostradas 40 famílias, 73 gêneros, 86 espécies. No fragmento 3 foram amostradas 37 famílias, 79 gêneros, 104 espécies. Na área de pastagem obteve-se 20 famílias, 27 gêneros, 39 espécies. Na analise floristica geral foram amostradas 156 espécies, 112 gêneros, pertencentes a 51 famílias. O resultado da semeadura mostrou que está técnica é viável. Avaliando-se após 180 dias o melhor tratamento (sem hidratação recoberto com terra) apresentou 3817 indivíduos ha -1, obtendo o maior índice de estabelecimento. Devemos salientar que através da utilização de diversos tratamentos, pode-se criar distinto microssitios, permitindo o aumento da riqueza e diversidade de espécies estabelecidas tanto pela semeadura direta, quanto pela regeneração natural. A incorporação ou recobrimento das sementes se mostrou de extrema importância para a germinação e estabelecimento destas. Os resultados demonstrados para a técnica de estaquia sugerem que são necessários novos estudos e aprimoramentos para que esta técnica se torne viável nas condições avaliadas. Para estacas de grande porte, observou-se após 45 dias uma mortalidade de 100%. Isto provavelmente ocorreu devido à baixa resistência das estacas à dessecação, o que pode ser verificado com as estacas de pequeno porte na Câmera de Nebulização, onde por problemas mecânicos as estacas ficaram sem aspersão de água por dois dias e novamente a mortalidade foi total. Entretanto observações empíricas sugerem que espécies de subbosque apresentam potencial para a técnica de estaquia nas condições de Câmera de Nebulização, assim como alguns estudos apontam que está técnica pode ser eficaz para algumas espécies de Cerrado. / The selection and characterization of the ecosystem of reference are essential to guide restoration actions. In addition, new techniques must be tested to increase the wealth and potential of ecological restoration, two of these new techniques are direct seeding and cuttings. The study area corresponds to a stretch of pasture and three fragments of semideciduous forest in the municipality of Piracaia, Sao Paulo (23 ° 00\'58\'\'23 ° 00\'31\'\'Sand 46 º 17\'04\'\'to 46 16\'26\'\'W). This work aims, in the first chapter, prepare a floristic survey of forest fragments and natural regeneration in the area of pasture Project Waterfall. In the second chapter evaluates the potential use of direct seeding, aiming to: i) to study native species for potential use of the technique, ii) Evaluated the density of seedlings after six months was sufficient to obtain an occupancy rate of 1666 seedling per hectare iii) evaluated different conditions (treatments) of native species sowing to potentiate the emergence and seedling establishment. The third chapter aimed to: i) evaluated the ability for large cuttings directly in the field in five treatments (two hormone concentration 4000 and 6000 ppm IBA, with and without the application of hydrogel, and control), ii) evaluate the rooting of small cuttings in a fogging chamber in three treatments (two hormone concentration 4000 and 6000 ppm and control). The result of floristic study conducted in the forest fragment 1 resulted in a sample of 38 families, 72 genera, 87 species. In fragment 3 were sampled 37 families, 79 genera, 104 species. In the pasture area was obtained 20 families, 27 genera, 39 species. In general floristic analyses werw sampled 156 species, 122 genera, belonging to 51 families. The result showed that the seeding technique is feasible. Evaluating after 180 days the best treatment (not covered with soil moisture) showed 3817 individuals ha -1, obtaining the highest rate of establishment. We note that through the use of several treatments, you can create separate micros sites, allowing the increase of wealth and diversity of species established both by direct sowing as by natural regeneration. The incorporation or coating of the seeds proved to be extremely important for germination. The incorporation or coating of the seeds proved to be extremely important for germination and establishment of these. The results shown for the technique of cutting suggest that further studies and improvements for this technique to be viable under the conditions evaluated. For cuttings of large size, was observed after 45 days a 100% of mortality. This was probably due to low resistance of the cutting to desiccation o, which can be verified with the small cuttings in Fogging Camera. Because mechanical problems these small cuttings were without water for two days and again total mortality was showed again. However empirical observations suggest that understory species have potential for the technique of cutting in Fogging Camera conditions, as well as some studies suggest that this technique can be effective for some species of the Cerrado.

O câncer (neoplasia) é uma das principais causas de mortalidade no mundo. Apesar dos grandes avanços no diagnóstico e nas formas de tratamento, ele ainda representa um enorme desafio para os pesquisadores de muitas áreas. Recentemente houve uma importante descoberta que poderá fornecer um paradigma completamente diferente no entendimento de como o câncer se inicia e cresce, com eventualmente profundas consequências nas formas de tratamento. Essa descoberta diz respeito a presença de células tronco adultas em tumores e seu possível papel no surgimento e crescimento destes. Propomos nesse trabalho um modelo matemático que considera a presença de células com propriedades de (a) auto renovação , (b) diferenciação e (c) mobilidade , características das células tronco. O modelo proposto é um autômato celular probabilístico com atualização assíncrona em uma rede. Cada elemento da rede pode estar vazio ou conter uma célula tumoral. Há dois tipos de células: as células rotuladas como do tipo 2 que são aquelas associadas com as células tronco tumorais e aquelas rotuladas como do tipo 1 que são as células diferenciadas, somente com capacidade de reprodução. A taxa de reprodução de cada célula é definida como uma função de sua vizinhança e tipo. Diferentes taxas de reprodução foram usadas nas simulações e as células do tipo 2 podem diferenciar-se ou mover-se. Os resultados das simulações mostram como a motilidade das células 2 e as taxas de reprodução de ambos os tipos de células influenciam os padrões morfológicos do tumor. Também investigamos uma possível transição de fase que pode estar relacionada a metástase. Essa transição de fase representa algo de grande interesse biológico, uma vez que a metástase é o mecanismo mais importante que leva o organismo a óbito. Compararemos nossos resultados com dados experimentais dos colaboradores Nascimento TL et al [1] da UNIFESP- Escola Paulista de Medicina. / Cancer (neoplasia) is one of the most dangerous diseases and one of the main cause of mortality around the world. Despite the great advances in diagnosis and treatment, it still represents a huge challenge to researchers of many areas. Recently there was a strinking discovery that may give rise to a complete different paradigm in the understanding of how cancer starts and grows, with eventually profound consequences in the forms of treatment. It is related to the ending of adult stem cells in tumors, and its possible role in the birth and growth of them. We propose in this work a mathematical model that takes into account the presence of cells with the properties of (a) self renewal, (b) differentiation and (c) mobility, characteristics of stem cells. The model developed is a probabilistic cellular automaton with asynchronous update set in a grid. Each element of the grid may be empty or contain a tumor cell. There are two types of cells: the cells labeled as type 2 are those associated with cancer stem cells and those labeled as type 1 are differentiated cells only capable of reproducing. The reproduction rate of each cell is defined as a function of its neighborhood and its type. Different rates of reproduction have been used in the simulations, and type 2 cells may differentiate and some motility. Our simulation results show how the motility of cells 2 and the reproduction rates of both types of cells influence the morphological patterns of tumor. We have also investigated a possible phase transition that may be related to metastasis. This phase transition represents something of great biological interest because metastasis is the most important mechanism that leads to death. We will compare our results with experimental data from collaborators Nascimento TL et al [1] in UNIFESP-Escola Paulista de Medicina.

Células de Schwann (CS) cultivadas a partir de nervo ciático de ratos foram enxertadas, associadas ou não ao fator de crescimento derivado de células gliais (GDNF), em ratos adultos submetidos à transecção total da medula espinhal (T11). Análises do comportamento motor do 1º ao 3º mês pós-operatório e do crescimento de fibras nervosas imunorreativas no epicentro do enxerto ao término deste período mostraram: melhora temporal dos parâmetros motores superior nos grupos que receberam CS, que foi potencializada na presença do GDNF; aumento na quantidade de axônios nos grupos que receberam CS, efeito potencializado na presença do GDNF. Em outro experimento, as reatividades astrocitária, microglial e do fator neurotrófico bFGF astrocitário foram avaliados na medula espinhal parcialmente transectada de ratos, 1 semana e 3 meses após a cirurgia. Ativação astrocitária e microglial e maior intensidade de bFGF nas substâncias branca e cinzenta foram encontradas em toda a extensão da medula, fatos relacionados ao processo local de cicatrização e fenômenos tróficos e plásticos à distância. / Schwann cells (SC) obtained from rat sciatic nerve were grafted, in the presence or not of glial derived neurotrophic factor (GDNF), in adult rats submitted to a complete spinal cord transection at T11. Behavioral analysis from the 1st to the 3rd post operative month and of the immunoreactive fiber outgrowth in the graft epicenter at the end of this period showed: temporal improvements on motor parameters that were superior in the groups that received SC, being even higher in the presence of GDNF; increased amount of axonal fibers in the groups treated with SC, being even higher in the presence of GDNF. In another experiment, astrocytic and microglial activation and astrocytic neurotrophic factor bFGF expression were analyzed after a partial spinal cord transection, 1 week and 3 months after surgery. Astrocitic and microglial activation as well as a higher intensity of astrocitic bFGF in the white and gray matters were found in the entire spinal cord, what is related to the local scar formation and distant trophic and plastic phenomena.

A PEGlação é uma bem sucedida estratégia nano-biotecnológica que envolve a ligação covalente do polietilenoglicol (PEG) a uma droga para melhorar sua farmacocinética, farmacodinâmica e perfil imunológico, e portanto, aumentar seu efeito terapêutico. Atualmente, a PEGlação é usada para modificar proteínas, peptídeos, oligonucleotídeos e fragmentos de anticorpos. A Uricase (EC 1.7.3.3, UC) é uma enzima pertencente à classe das oxidorredutases, responsável pela oxidação do ácido úrico, produzindo alantoína. Essa enzima é encontrada em muitos organismos vivos como: bactérias, leveduras, fungos, vegetais e animais. Entretanto, durante a evolução das espécies o gene da UC tornou-se inativo, por isso, em humanos a UC é inativa. Nesse sentido, a UC adquiriu destaque como um potencial fármaco uricolítico, devido à necessidade do desenvolvimento de novos agentes terapêuticos no tratamento de hiperuricemia e gota. Neste estudo, a uricase recombinante purificada de Candida sp (UC-r) e a de rim bovino (UC-b) foram modificadas por PEGlação com mPEG-p-nitrofenil carbonato (mPEG-pNP) e 2-O-mPEG-4,6-dicloro-s-triazina (mPEG-CN), produzindo conjugados com considerável atividade enzimática residual UC-r-mPEG-pNP (87%), UC-r-mPEG-CN (75%) e UC-b-mPEG-pNP (75%), UC-b-mPEG-CN (50%).Além disso, os conjugados obtidos com a UC-r e UC-b apresentaram valores de KM menores do que as enzimas nativas, indicando que a PEGlação conferiu uma interessante propriedade aos conjugados, que permitiu um aumento da afinidade da UC-r e UC-b pelo ácido úrico. O efeito do pH e da temperatura sobre a UC-r e UC-b modificadas indicou que os conjugados obtidos foram mais ativos em pH próximo ao fisiológico e mais estáveis do que a respectiva enzima nativa. As formas PEGladas da UC-r e UC-b foram mais resistentes à ação de diferentes proteases e mantiveram-se estáveis em soro humano, indicando que a PEGlação favoreceu a resistência a degradação proteolítica. Análises espectroscópicas de dicroísmo circular (CD) e infravermelho (FTIR) não apresentaram nenhuma diferença relevante entre a estrutura protéica da UC-r nativa e PEGlada. Estudos in vivo com coelho e camundongos Balb/c mostraram que a UC-r nativa induziu uma intensa resposta imune sendo altamente imunogênica. Por outro lado, a UC-r PEGlada quando injetada cronicamente em camundongos não induziu qualquer resposta detectável de anticorpos. Esses resultados indicam uma suficiente redução da imunogenicidade dessa enzima, devido à conjugação do mPEG-pNP ou mPEG-CN, tornando-a adequada para um possível uso terapêutico. Portanto, nesse trabalho, os resultados obtidos com a UC-r de Candida sp, mostram que dois conjugados apresentaram interessantes propriedades físico-química, biológicas e imunológicas, que permitiram um significativo avanço na transformação de uma enzima de origem fúngica em uma droga, com uma possível aplicação terapêutica no tratamento de hiperuricemia e gota. / PEGylation is a successful nanobiotechnology strategy that involves the covalent attachment of polyethylene glycol (PEG) to a drug to improve its pharmacokinetic, pharmacodynamic, and immunological profiles, and thus, enhance its therapeutic effect. Currently, PEGylation is used to modify proteins, peptides, oligonucleotides, antibody fragments, and small organic molecules. Uricase (EC 1.7.3.3, UC) is an enzyme belonging to the class of oxidorreductases responsible for the oxidation of uric acid, producing allantoin. This enzyme is found in many living organisms such as bacteria, yeasts, fungi, plants and animals. However, during the evolution of the species gene became inactive UC, therefore, in humans UC is inactive. Accordingly, UC has acquired prominence as a potential drug uricolytic due to the need of developing new therapeutic agents for the treatment of hyperuricemia and gout. In this study, purified recombinant uricase from Candida sp (UC-r) and ox kidney (UC-b) were modified by PEGylation with mPEG-p-nitrophenyl-carbonate (mPEG-pNP) and 2-O-mPEG-4,6-dichloro-s-triazine (mPEG-CN), producing conjugates with considerable residual enzyme activity UC-r-mPEG-pNP (87%), UC-r-mPEG-CN (75%) and UC-b-mPEG-pNP (75%),UC-b-mPEG-CN (50%). In addition, conjugates obtained with the UC-r and UC-b had lower KM values than native enzymes, indicating that the PEGylation gave an interesting property the conjugate that increased the affinity of UC-r and UC-b by uric acid. The effect of pH and temperature on the modified UC-r and UC-b indicated that the conjugates were more active at pH close to the physiological and more stable than its native enzyme. PEGylated forms of UC-r and UC-b were more resistant to the action of different proteases and remained stable in human serum, indicating that the PEGylation favored resistance to proteolytic degradation. Spectroscopic analysis of circular dichroism (CD) and infrared (FTIR) did not show any relevant difference in protein structure between native and PEGylated UC-r. In vivo studies with rabbit and Balb/c mice showed that UC-r native elicited an intense immune response being highly immunogenic. On the other hand, the PEGlated UC-r when chronically injected into mice did not induce any detectable response to antibodies. These results indicate a sufficient reduction of immunogenicity of this enzyme, due to conjugation of mPEG-pNP or mPEG-CN, making it suitable for possible therapeutic use. Therefore, the results obtained with the UC-r of Candida sp, showed that two conjugates have interesting physical-chemical, biological and immunological, which allowed a significant advance in the transformation of an enzyme of fungal origin in a drug with a possible application therapeutic in the treatment of hyperuricemia and gout.

A PEGlação é uma bem sucedida estratégia nano-biotecnológica que envolve a ligação covalente do polietilenoglicol (PEG) a uma droga para melhorar sua farmacocinética, farmacodinâmica e perfil imunológico, e portanto, aumentar seu efeito terapêutico. Atualmente, a PEGlação é usada para modificar proteínas, peptídeos, oligonucleotídeos e fragmentos de anticorpos. A Uricase (EC 1.7.3.3, UC) é uma enzima pertencente à classe das oxidorredutases, responsável pela oxidação do ácido úrico, produzindo alantoína. Essa enzima é encontrada em muitos organismos vivos como: bactérias, leveduras, fungos, vegetais e animais. Entretanto, durante a evolução das espécies o gene da UC tornou-se inativo, por isso, em humanos a UC é inativa. Nesse sentido, a UC adquiriu destaque como um potencial fármaco uricolítico, devido à necessidade do desenvolvimento de novos agentes terapêuticos no tratamento de hiperuricemia e gota. Neste estudo, a uricase recombinante purificada de Candida sp (UC-r) e a de rim bovino (UC-b) foram modificadas por PEGlação com mPEG-p-nitrofenil carbonato (mPEG-pNP) e 2-O-mPEG-4,6-dicloro-s-triazina (mPEG-CN), produzindo conjugados com considerável atividade enzimática residual UC-r-mPEG-pNP (87%), UC-r-mPEG-CN (75%) e UC-b-mPEG-pNP (75%), UC-b-mPEG-CN (50%).Além disso, os conjugados obtidos com a UC-r e UC-b apresentaram valores de KM menores do que as enzimas nativas, indicando que a PEGlação conferiu uma interessante propriedade aos conjugados, que permitiu um aumento da afinidade da UC-r e UC-b pelo ácido úrico. O efeito do pH e da temperatura sobre a UC-r e UC-b modificadas indicou que os conjugados obtidos foram mais ativos em pH próximo ao fisiológico e mais estáveis do que a respectiva enzima nativa. As formas PEGladas da UC-r e UC-b foram mais resistentes à ação de diferentes proteases e mantiveram-se estáveis em soro humano, indicando que a PEGlação favoreceu a resistência a degradação proteolítica. Análises espectroscópicas de dicroísmo circular (CD) e infravermelho (FTIR) não apresentaram nenhuma diferença relevante entre a estrutura protéica da UC-r nativa e PEGlada. Estudos in vivo com coelho e camundongos Balb/c mostraram que a UC-r nativa induziu uma intensa resposta imune sendo altamente imunogênica. Por outro lado, a UC-r PEGlada quando injetada cronicamente em camundongos não induziu qualquer resposta detectável de anticorpos. Esses resultados indicam uma suficiente redução da imunogenicidade dessa enzima, devido à conjugação do mPEG-pNP ou mPEG-CN, tornando-a adequada para um possível uso terapêutico. Portanto, nesse trabalho, os resultados obtidos com a UC-r de Candida sp, mostram que dois conjugados apresentaram interessantes propriedades físico-química, biológicas e imunológicas, que permitiram um significativo avanço na transformação de uma enzima de origem fúngica em uma droga, com uma possível aplicação terapêutica no tratamento de hiperuricemia e gota. / PEGylation is a successful nanobiotechnology strategy that involves the covalent attachment of polyethylene glycol (PEG) to a drug to improve its pharmacokinetic, pharmacodynamic, and immunological profiles, and thus, enhance its therapeutic effect. Currently, PEGylation is used to modify proteins, peptides, oligonucleotides, antibody fragments, and small organic molecules. Uricase (EC 1.7.3.3, UC) is an enzyme belonging to the class of oxidorreductases responsible for the oxidation of uric acid, producing allantoin. This enzyme is found in many living organisms such as bacteria, yeasts, fungi, plants and animals. However, during the evolution of the species gene became inactive UC, therefore, in humans UC is inactive. Accordingly, UC has acquired prominence as a potential drug uricolytic due to the need of developing new therapeutic agents for the treatment of hyperuricemia and gout. In this study, purified recombinant uricase from Candida sp (UC-r) and ox kidney (UC-b) were modified by PEGylation with mPEG-p-nitrophenyl-carbonate (mPEG-pNP) and 2-O-mPEG-4,6-dichloro-s-triazine (mPEG-CN), producing conjugates with considerable residual enzyme activity UC-r-mPEG-pNP (87%), UC-r-mPEG-CN (75%) and UC-b-mPEG-pNP (75%),UC-b-mPEG-CN (50%). In addition, conjugates obtained with the UC-r and UC-b had lower KM values than native enzymes, indicating that the PEGylation gave an interesting property the conjugate that increased the affinity of UC-r and UC-b by uric acid. The effect of pH and temperature on the modified UC-r and UC-b indicated that the conjugates were more active at pH close to the physiological and more stable than its native enzyme. PEGylated forms of UC-r and UC-b were more resistant to the action of different proteases and remained stable in human serum, indicating that the PEGylation favored resistance to proteolytic degradation. Spectroscopic analysis of circular dichroism (CD) and infrared (FTIR) did not show any relevant difference in protein structure between native and PEGylated UC-r. In vivo studies with rabbit and Balb/c mice showed that UC-r native elicited an intense immune response being highly immunogenic. On the other hand, the PEGlated UC-r when chronically injected into mice did not induce any detectable response to antibodies. These results indicate a sufficient reduction of immunogenicity of this enzyme, due to conjugation of mPEG-pNP or mPEG-CN, making it suitable for possible therapeutic use. Therefore, the results obtained with the UC-r of Candida sp, showed that two conjugates have interesting physical-chemical, biological and immunological, which allowed a significant advance in the transformation of an enzyme of fungal origin in a drug with a possible application therapeutic in the treatment of hyperuricemia and gout.

As células glias de Müller são capazes de gerar novos neurônios retinianos em resposta a lesões, atuando como uma possível fonte para regeneração retiniana. Nesse contexto, as GTPases Rho podem ter um papel interessante, visto que regulam múltiplas vias de sinalização que controlam, por exemplo, a transcrição gênica, sobrevivência e proliferação celular. No presente estudo analisamos a participação de um dos membros dessa família (Rac1) na proliferação de células gliais de Müller da retina de galinhas após lesão excitotóxica com N-Metil-D-Aspartato (NMDA). A injeção intraocular de NMDA promoveu extensa proliferação de células gliais de Müller. A inibição de Rac1 com NSC23766 não alterou a quantidade de células que entraram no ciclo celular, mas, provocou um retardo em sua progressão. Esses resultados sugerem um importante papel para a GTPase Rac1 na regulação da proliferação de células gliais de Müller em resposta a lesões retinianas. / Müller glial cells may generate new neurons in response to retinal injury, acting as a potential source for retinal regeneration. In this context, Rho GTPases may have an interesting role, since they regulate multiple signaling pathways that control, for example, gene transcription, cell proliferation and survival. This study analyzed the involvement of a member of this family (Rac1) in the proliferation of Müller glial cells of chick retina after excitotoxic injury with N-methyl-D-aspartate (NMDA). Intraocular injection of NMDA promoted extensive Müller glia proliferation. Rac1 inhibition with NSC23766 did not affect the cell cycle entry, but a delay in cell cycle progression was observed. These results suggest an important role for Rac1 in the regulation of Müller glial cells proliferation in response to retinal injury.

As células glias de Müller são capazes de gerar novos neurônios retinianos em resposta a lesões, atuando como uma possível fonte para regeneração retiniana. Nesse contexto, as GTPases Rho podem ter um papel interessante, visto que regulam múltiplas vias de sinalização que controlam, por exemplo, a transcrição gênica, sobrevivência e proliferação celular. No presente estudo analisamos a participação de um dos membros dessa família (Rac1) na proliferação de células gliais de Müller da retina de galinhas após lesão excitotóxica com N-Metil-D-Aspartato (NMDA). A injeção intraocular de NMDA promoveu extensa proliferação de células gliais de Müller. A inibição de Rac1 com NSC23766 não alterou a quantidade de células que entraram no ciclo celular, mas, provocou um retardo em sua progressão. Esses resultados sugerem um importante papel para a GTPase Rac1 na regulação da proliferação de células gliais de Müller em resposta a lesões retinianas. / Müller glial cells may generate new neurons in response to retinal injury, acting as a potential source for retinal regeneration. In this context, Rho GTPases may have an interesting role, since they regulate multiple signaling pathways that control, for example, gene transcription, cell proliferation and survival. This study analyzed the involvement of a member of this family (Rac1) in the proliferation of Müller glial cells of chick retina after excitotoxic injury with N-methyl-D-aspartate (NMDA). Intraocular injection of NMDA promoted extensive Müller glia proliferation. Rac1 inhibition with NSC23766 did not affect the cell cycle entry, but a delay in cell cycle progression was observed. These results suggest an important role for Rac1 in the regulation of Müller glial cells proliferation in response to retinal injury.