Submitted by Luiz Felipe Barbosa (luiz.fbabreu2@ufpe.br) on 2015-04-17T13:17:00Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Dissertação Denise Silva.pdf: 1491313 bytes, checksum: 5002c52d4f092276a79be2382fa961f2 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-04-17T13:17:00Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Dissertação Denise Silva.pdf: 1491313 bytes, checksum: 5002c52d4f092276a79be2382fa961f2 (MD5) Previous issue date: 2013 / FACEPE / A aguardente de cana-de-açúcar, também conhecida como cachaça, é uma bebida genuinamente brasileira que vem ganhando espaço no mercado internacional de bebidas destiladas. Os compostos voláteis são responsáveis pelo sabor característico dessa bebida e são produzidos pelas leveduras durante o processo fermentativo. A relevância da levedura Dekkera bruxellensis no contexto fermentativo tem despertado o interesse em analisar a viabilidade de utilização desta levedura para a produção de cachaça. Neste trabalho, foram analisados o perfil metabólico e a produção de compostos aromáticos pela levedura D. bruxellensis durante a fermentação no caldo de cana e em diferentes meios sintéticos com diversas fontes de nitrogênio. Os ensaios foram realizados em pequena escala, simulando as condições empregadas na produção de cachaça artesanal. Os resultados mostraram que, a suplementação do meio com aminoácidos ramificados exerce uma forte influência no metabolismo e na produção de aromas da levedura D. bruxellensis. Foi também confirmado que essa levedura é capaz de assimilar fontes de nitrogênio alternativas como os aminoácidos ramificados, porém, com rendimentos fermentativos menores aos observados em meios com fontes de nitrogênio preferenciais, como o sulfato de amônio. Sendo assim, esses resultados confirmam a grande influência da fonte de nitrogênio no metabolismo de alcoóis superiores e ésteres, ratificam a relevância de estudar mais a fundo as necessidades de nitrogênio para um melhor controle dos aromas que são formados no processo fermentativo e poderá abrir perspectivas para a utilização industrial desta levedura na elaboração da cachaça.

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:04:29Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo4595_1.pdf: 1938039 bytes, checksum: c4f93fc7a8d37e558b6625c6c70bbb3f (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2006 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O processo de fermentação alcoólica industrial é caracterizado por um intenso reciclo das células de leveduras, com constante exposição a baixos valores de pH tanto no mosto quanto no pré-fermentador. Isto induz um constante estresse ácido que leva a diminuição da viabilidade celular no processo. Este trabalho tem como objetivo o estudo dos fatores celulares responsáveis pela resistência ao estresse ácido a partir da identificação dos genes de Saccharomyces cerevisiae que respondem a este estresse e do isolamento e caracterização de mutantes resistentes a ácidos inorgânicos. Inicialmente a linhagem JP1 foi isolada do mosto de fermentação pela sua capacidade de dominância no processo fermentativo de diferentes destilarias. Esta linhagem apresentou a mesma resposta fenotípica às diferentes formas de estresse industrial (ácido e etanólico) que a linhagem comercial PE-2. As células da linhagem JP-1 foram posteriormente testadas para o crescimento celular e desempenho fermentativo em meio mineral acidificado e os resultados mostraram o baixo pH do meio não influenciou estes dois parâmetros. Adicionalmente, cerca de 1% dos genes da linhagem de laboratório JT-95 de S. cerevisiae apresentou modificação no padrão de expressão, sendo 35 genes reprimidos e 28 genes induzidos pelo ácido sulfúrico. Entretanto, não se observou uma relação direta entre o conjunto de genes modificados e os mecanismos conhecidos de resposta a estresse, o que sugere uma resposta multifatorial ao choque ácido em leveduras. E finalmente um mutante resistente a ácidos inorgânicos (sulfúrico e clorídrico) foi isolado a partir de células da linhagem JP-1. Este mutante foi capaz de crescer em meio ajustado para pH 2, mas semelhante ao parental não apresentou resistência a ácidos orgânicos (sorbato). Isto mostra que a resistência a estes dois tipos de ácidos deve ser mediada por mecanismos celulares diferentes. A análise de expressão gênica neste mutante deverá gerar informações mais precisas sobre este mecanismo de resistência

A espécie Dekkera bruxellensis tem sido detectada como a principal levedura contaminante em diversos processos fermentativos, dentre eles o de produção de etanol combustível, apresentando uma surpreendente capacidade de crescimento e adaptação naqueles substratos. No entanto, pouco se conhece sobre suas características de crescimento em condições de estresse e comportamento fermentativo. Desta forma, este trabalho objetivou avaliar a tolerância ao estresse e as características fermentativas exibidas por três linhagens de D. bruxellensis isoladas da fermentação alcoólica, além do efeito da contaminação em mosto de caldo de cana sobre os parâmetros fermentativos, buscando informações que possam contribuir para o manejo da fermentação alcoólica quando contaminada com esta levedura. Foram realizados testes de caracterização em meio YEPD sólido e líquido em condições estressantes para as três linhagens de D. bruxellensis e uma linhagem de S. cerevisiae (PE-02). O efeito do tratamento ácido associado ao etanol sobre a viabilidade das quatro linhagens em situação de agitação e sem agitação foi também avaliado. Em seguida, testes fermentativos em meio sintético (sem reciclo celular) e em meio de caldo de cana (com reciclo celular e utilizando-se ou não tratamento ácido) foram conduzidos para verificar as características fermentativas das linhagens de D. bruxellensis em comparação com S. cerevisiae, simulando-se uma contaminação por 103 células/mL da linhagem CCA155 em meio de caldo de cana. As três linhagens de D. bruxellensis apresentaram crescimento invasivo em meio YEPD sólido, possivelmente um mecanismo de sobrevivência da levedura em condições estressantes. Observou-se uma variação na resposta das linhagens às situações de estresse (baixo pH e alta concentração de etanol). Em condições não estressantes, a linhagem PE-02 apresentou melhor desenvolvimento, no entanto, em situações de estresse de pH, concentrações de açúcar e etanol, as linhagens de D. bruxellensis desenvolveram-se melhor. O controle eficiente do crescimento destas leveduras poderia ser obtido com um tratamento combinado de baixo pH (1,5) e etanol (9%), porém houve também prejuízo significativo à levedura S. cerevisiae, embora em menor extensão. Em sistema de batelada sem reciclo celular em meio sintético, verificou-se que a agitação influenciou significativamente a produção de etanol e ácidos por D. bruxellensis. O teor alcoólico foi maior quando se utilizou glicose como fonte de carbono ao invés de sacarose. Em sistema de batelada com reciclo celular em meio de caldo de cana, foram obtidos melhores resultados quanto à produção de etanol, menor teor de açúcar redutor total residual e maior eficiência fermentativa quando se utilizou o tratamento ácido do fermento (pH 1,5), assim como melhor controle do crescimento da linhagem CCA155 quando em cultura mista com S. cerevisiae (PE-02). O tratamento ácido utilizado teve efeito não só sobre o crescimento da levedura contaminante, mas também beneficiou a levedura do processo, resultando assim na minimização do efeito da contaminante sobre a fermentação conduzida em meio de caldo de cana sob dez ciclos fermentativos de 12 horas. / The species Dekkera bruxellensis has been considered as the main contaminant yeast in several fermentative processes, including the fuel alcohol production, showing a surprising growth capacity and adaptation in those substrates. However, a little is known about their growth characteristics in stressing conditions and fermentative profile. In this context, this work aimed to evaluate the stress tolerance and fermentative characteristics exhibited by three strains of D. bruxellensis isolated from the alcoholic fermentation, besides the effect of the contamination in sugar cane juice over the fermentative parameters, searching for information that could contribute to the management of the alcoholic fermentation when the medium is contaminated with this yeast. Characterization tests in YEPD medium (solid and liquid) under stressing conditions for the D. bruxellensis and S. cerevisiae (PE-02) strains were carried out. The effect of the acid treatment associated with ethanol over the cell viability of the four strains in shaken and non-shaken flasks was also evaluated. Following, fermentative tests in synthetic medium (without cell recycle) and in sugar cane juice (with cell recycle and with/without acid treatment) were carried out to verify the fermentative characteristics of the strains of D. bruxellensis comparing to S. cerevisiae, simulating a contamination by 103 cells/mL of the strain CCA155 in sugar cane juice. All the strains of D. bruxellensis showed invasiveness in YEPD agar medium, probably a survival mechanism in stressful conditions. A variation in the response of the strains to the stressing conditions (low pH and high ethanol concentration) was observed. In nonstressing situations, the strain PE-02 showed better growth; however, in stressing conditions of pH, ethanol and sugar concentrations, the strains of D. bruxellensis had better growth performance. The effective control of their growth could be obtained with a combined treatment of low pH (1.5) and ethanol (9%), however, a significant harmful effect to the S. cerevisiae strain was also verified, but in a lower extension. In batch system without cell recycle in synthetic medium, it was verified the influence of agitation over the ethanol and acid production by D. bruxellensis. The alcohol content was significantly higher when glucose was utilized instead of sucrose. In batch system with cell recycle in sugar cane juice, the best results for ethanol production, lower residual total reducing sugar and higher fermentative efficiency were obtained with the acid treatment of the ferment at pH 1.5, as well as a better growth control of the strain CCA155, in mixed culture with S. cerevisiae (PE-02). The acid treatment utilized in this work had effect not only over the growth of the contaminant yeast, but also benefited the yeast S. cerevisiae, resulting in the minimization of the effect of the contaminant over the fermentation developed in sugar cane juice medium in 12-hour ten fermentative cycles.

As leveduras Dekkera/Brettanomyces estão envolvidas na deterioração de vinhos após o término das fermentações alcoólicas e maloláticas, tendo se apresentado como agente contaminante de processos contínuos de produção de etanol industrial. São caracterizadas pela morfologia celular típica (células alongadas e ogivais), alta produção de ácido e crescimento lento, porém de difícil identificação. Embora muitos trabalhos já tenham sido publicados acerca do seu papel na fermentação do vinho, pouco se conhece sobre o seu comportamento no processo de fermentação para produção de álcool combustível. Desta forma, este trabalho objetivou selecionar, identificar e caracterizar linhagens de Dekkera e Brettanomyces isoladas de processos fermentativos, através de testes de taxonomia clássica, moleculares (PCR e sequenciamento) e de biotipagem através do sistema killer, visando a avaliação de fermentações mistas de Saccharomyces cerevisiae e Dekkera bruxellensis, a última em níveis de contaminação variando de 101 a 103 células/mL, em meio de caldo de cana, em processo de fermentação em batelada com reciclo celular (14 ciclos de 12 horas) para produção de etanol. Os testes morfológicos e fisiológicos/bioquímicos de oito linhagens selecionadas pela alta produtividade de ácido a partir da glicose e morfologia celular característica, apontaram os gêneros Dekkera ou Brettanomyces, sem possibilidade de identificação em nível de espécie devido à ambigüidade dos resultados dos testes fisiológicos. O sequenciamento da região ITS (Internal transcribed spacer) do DNA ribossomal confirmou somente três linhagens como Dekkera bruxellensis, sendo as demais predominantemente pertencentes à espécie Pichia guillermondii. O tamanho da região ITS, incluindo o gene 5,8S, variou de 400 500 pb entre as três linhagens. A utilização do sistema killer como método de biotipagem para leveduras Dekkera mostrou-se inviável devido ao fenótipo predominantemente neutro apresentado pelas linhagens. Somente a levedura killer CCA510 (Kluyveromyces marxianus) apresentou atividade inibitória contra as três linhagens de D. bruxellensis. Os ensaios fermentativos realizados com a linhagem de D. bruxellensis (CCA059) em fermentações puras e mistas com S. cerevisiae (CCA193, PE-02), mostraram que a levedura contaminante foi capaz de crescer em meio de caldo de cana, independentemente do tamanho do seu inóculo inicial (101 a 103 células/mL), impactando negativamente a fermentação etanólica, causando a diminuição da viabilidade de S. cerevisiae, diminuindo o pH do meio, decréscimo na produção de etanol e eficiência fermentativa, possivelmente devido à produção de ácido acético a partir do ART do meio de fermentação. Extrapolando-se os resultados obtidos em escala de laboratório para a escala industrial de uma destilaria de médio porte, a contaminação por Dekkera bruxellensis acarretaria uma perda de 6 milhões a 15 milhões de litros de álcool na safra, que deixariam de ser produzidos, dependendo do nível de contaminação. / Dekkera/Brettanomyces yeasts are found to be either contaminants in wine after completion of alcoholic and malolactic fermentations and in continuous fermentations for fuel alcohol production. They are characterized by typical cell morphology (elongated and ogival cells), high acid production and slow growth, however not easily identified. Although their role in wine fermentations is well-defined, a little is known about their behavior during fermentation for ethanol production. This work aimed the screening, identification and characterization of Dekkera and Brettanomyces strains isolated from fermentative processes, through classical taxonomic tests, molecular analysis (PCR and DNA sequencing) and biotyping by killer system. Following fermentation essays were carried out to evaluate mixed fermentations of Saccharomyces cerevisiae and Dekkera bruxellensis, the last one in contamination levels varying from 101 to 103 cells/mL, in sugar cane medium, using batch fermentation process with cell recycle (fourteen 12-hour cycles) for fuel ethanol production. Morphological and physiological/biochemical tests involving eight strains selected for their high acid production from glucose and typical cell morphology, pointed out to the genera Dekkera or Brettanomyces, without possibility of species identification due to the variability and ambiguity of physiological tests. DNA sequencing of the ITS (Internal transcribed spacer) region belonging to ribosomal DNA confirmed only three strains as Dekkera bruxellensis, the others were predominantly Pichia guilliermondii. The ITS region, including the 5,8S gene, varied from 400 to 500 bp among the three strains. The use of killer system as a biotyping method for Dekkera strains might not be applied because the strains were predominantly neutral to killer toxins. Only the killer strain CCA510 (Kluyveromyces marxianus) showed to have inhibitory activity against the strains of D. bruxellensis. The fermentative essays using a strain of D. bruxellensis (CCA059) in mixed and pure fermentations with S. cerevisiae (CCA193, PE-02), have shown that the contaminant yeast was able to grown in sugar cane juice, regardless of the initial inoculum size ((101 to 103 cells/mL), impairing the bioethanol fermentation, causing diminished S. cerevisiae viability, pH decrease, lower ethanol production and fermentative efficiency, mainly due to the acetic acid production from reducing sugar present in fermentation medium. Extrapolation of the results obtained in laboratory scale to industrial scale in a medium-sized distillery, have revealed that contamination by Dekkera bruxellensis would result in a alcohol loss of 6 millions to 15 millions of liters, which would not be produced, depending on the contamination level.

O objetivo deste trabalho foi estudar os componentes químicos de aguardentes de cana-de-açúcar, fermentadas por diferentes cepas comerciais da levedura Saccharomyces cerevisiae e duplamente destiladas em alambique. Vinhos de mosto de caldo de cana-de-açúcar fermentados pelas leveduras CA-11, Y-904, BG-1, PE-2, SA-1 e CAT-1 foram destilados em alambique seguindo a metodologia utilizada para a produção de whisky. Os destilados, tanto da primeira como da segunda destilação, foram analisados quanto às concentrações de etanol, acidez volátil, aldeídos, ésteres, furfural, álcoois superiores e metanol. As aguardentes provenientes das fermentações com as diferentes cepas de levedura apresentaram diferentes composições químicas. As cepas CA-11 e a CAT-1 foram as que prporcionaram composição química mais adequada para aguardente duplamente destilada em alambique. / The objective of this was to study the chemical components from sugar cane spirits, fermented by different commercial yeast strains of Saccharomyces cerevisiae and double distilled in pot still. Sugar cane juices were fermented by the yeasts CA-11, Y-904, BG-1, PE-2, SA-1 and CAT-1 and distilled in simple still according to methodology used for Whisky production. Both distillates, from first and second distillation, was analyzed for concentrations of ethanol, volatile acidity, aldehydes, esters, furfural, higher alcohols and methanol. The sugar cane spirits came from the fermentations carried out by the different yeast strains presented different chemical compositions. The sugar cane spirits produced by the strains CA-11 and CAT-1 presented a more desirable chemical composition.

As características do processo industrial brasileiro para a produção do bioetanol tornam as destilarias susceptíveis a presença de microrganismos contaminantes que ocasionam na queda de rendimento de produção. Dentre as etapas do processo, tem-se a fermentação alcoólica, que consiste na metabolização de açúcares pela cepa de levedura selecionada da espécie Saccharomyces cerevisiae produzindo o etanol. Nesta etapa ocorre a contaminação por leveduras do gênero Saccharomyces, leveduras não Saccharomyces e bactérias. As bactérias mais encontradas são as pertencentes ao grupo das bactérias láticas (LAB), que por utilizarem diferentes vias para metabolizar os açúcares, são classificadas em heterofermentativa obrigatória, homofermentativa obrigatória e heterofermentativa facultativa. Entre os gêneros deste grupo, os Lactobacillus são os mais comuns devido à sua habilidade em tolerar altas concentrações de etanol e açúcares, altas temperaturas e baixo pH. As espécies L. fermentum e L. plantarum foram relatadas em diversos trabalhos como entre as espécies mais encontradas contaminando esse ambiente. Os Lactobacillus contaminantes estão em constante interação com a cepa de levedura que por consequência, tem sua eficiência fermentativa reduzida. Este trabalho teve por objetivo analisar os metabólitos produzidos durante a fermentação alcoólica industrial e que podem ser utilizados pelas bactérias contaminantes, obtendo assim, condições para serem competitivas e persistentes no processo. Para isso, foram utilizadas duas linhagens, isoladas de destilaria e identificadas como L. fermentum (I3a) com metabolismo heterofermentativo obrigatório e L. plantarum (I4a) com metabolismo heterofermentativo facultativo, apresentando nas condições estudadas um metabolismo homofermentativo. Ambas as linhagens foram submetidas ao crescimento na presença do glicerol, malato e piruvato, que são metabólitos produzidos e excretados pela levedura e o manitol produzido e excretado pela bactéria heterofermentativa obrigatória. Foi observado que o metabólito manitol é uma eficiente fonte de carbono para ambas as linhagens proporcionando crescimento mesmo sem a presença de açúcares. Além disso, a combinação entre glicose, frutose, manitol e malato foi capaz de aumentar o crescimento das linhagens. Já a presença do piruvato, apresentou estímulo de crescimento para a linhagem heterofermentativa. Em relação ao consumo, as linhagens foram capazes de metabolizar o manitol, malato e piruvato, entretanto, não apresentaram consumo do glicerol. Com isso, ambas as linhagens são beneficiadas pelo metabolismo da levedura e ainda a heterofermentativa é capaz de reabsorver o manitol quando os açúcares fermentescíveis são esgotados e de disponibilizar o metabólito para uso da homofermentativa. / The characteristics of the Brazilian industrial process to produce bioethanol make the distilleries susceptible to the presence of contaminating microorganisms that cause in the fall of production yield. Among the stages of the process, we have the alcoholic fermentation, which consists in the metabolization of sugars by the yeast strain selected from the Saccharomyces cerevisiae species producing the ethanol. At this stage contamination occurs by yeasts of the genus Saccharomyces, yeasts not Saccharomyces and bacteria. The most commonly found bacteria are those belonging to the group of lactic bacteria (LAB), which, because they use different routes to metabolize sugars, are classified as obligate heterofermentative, obligate homofermentative and facultative heterofermentative. Among the genera of this group, Lactobacillus are the most common because of their ability to tolerate high concentrations of ethanol and sugars, high temperatures and low pH. The species L. fermentum and L. plantarum have been reported in several studies as among the most frequent species contaminating this environment. Lactobacillus contaminants are in constant interaction with the yeast strain which consequently has its fermentative efficiency reduced. This work aimed to analyze the metabolites produced during industrial alcoholic fermentation and that can be used by the contaminating bacteria, thus obtaining conditions to be competitive and persistent in the process. For this, two strains were used, isolated from distillery and identified as L. fermentum (I3a) with obligate heterofermentative metabolism and L. plantarum (I4a) with facultative heterofermentative metabolism, presenting a homofermentative metabolism under the conditions studied. Both strains were submitted to growth in the presence of glycerol, malate and pyruvate, which are metabolites produced and excreted by yeast and mannitol produced and excreted by the obligate heterofermentative bacterium. It was observed that the metabolite mannitol is an efficient source of carbon for both strains providing growth even without the presence of sugars. In addition, the combination of glucose, fructose, mannitol and malate was able to increase strains growth. However, the presence of pyruvate presented growth stimulus for the heterofermentative strain. In relation to consumption, the strains were able to metabolize mannitol, malate and pyruvate, however, they did not present glycerol consumption. Thus, both strains are benefited by yeast metabolism and the heterofermentative can reabsorb mannitol when the fermentable sugars are depleted and to make the metabolite available for homofermentative use.

Dentre as leveduras selvagens mais comumente encontradas na fermentação alcoólica, destaca-se o gênero Saccharomyces apresentando colônias rugosas com células dispostas em cachos (pseudohifas). Este biótipo de levedura tem sempre sido associado com problemas na indústria, ocasionando queda no rendimento fermentativo. Sendo assim, o presente trabalho teve por objetivo realizar a caracterização genética, morfo-fisiológica e da resistência ao estresse de linhagens de Saccharomyces cerevisiae que apresentam colônias rugosas e mucosas, buscando alternativas que possam contribuir para o manejo dessas leveduras selvagens (rugosas) na fermentação alcoólica. Foram realizados testes de caracterização para crescimento invasivo, atividade killer, temperatura, pH, concentração de etanol e açúcar, presença de actidione, floculação e capacidade fermentativa, utilizando-se 22 linhagens de leveduras (11 rugosas e 11 mucosas) selecionadas previamente por seqüenciamento da região ITS do DNA ribossomal. O efeito do tratamento ácido em diferentes valores de pH sobre o crescimento de duas linhagens (52 rugosa e PE-02 mucosa) foi também avaliado, seguido do monitoramento do crescimento em meio de caldo de cana após tratamento ácido. Em seguida, testes fermentativos em meio de caldo de cana foram conduzidos em culturas puras e mista dessas linhagens. Os testes de caracterização morfofisiológica mostraram que a invasividade em meio YEPD Agar ocorreu em baixa freqüência dentre as 22 leveduras testadas; dez dentre onze leveduras rugosas apresentaram taxa de floculação expressiva, e entre as mucosas a floculação foi praticamente inexistente; nenhuma das linhagens apresentou produção de toxina killer; as linhagens com colônias rugosas apresentaram capacidade fermentativa significativamente inferior às linhagens com colônias mucosas, em sistema de batelada com ciclo único de 48 horas em meio de caldo de cana, demonstrando velocidade mais lenta de fermentação. Quanto à resistência ao estresse por temperatura, pH, etanol e concentração de açúcar, as linhagens mucosas tiveram maior resistência à acidez do meio, enquanto as linhagens rugosas foram mais resistentes às concentrações elevadas de etanol e açúcar. Nenhuma levedura foi resistente ao actidione. A análise genética, através dos loci microssatélites, revelou a presença de dois grupos principais relacionados geneticamente, sendo o primeiro ramo constituído principalmente de colônias rugosas (67%), contendo, no entanto, a linhagem PE-02, apresentando linhagens com alta taxa de floculação e tolerância às altas concentrações de açúcar e etanol; o outro grupo (com três subgrupos) compreendeu principalmente colônias mucosas, apresentando pouca resistência às situações estressantes aqui estudadas. A levedura com colônia rugosa (linhagem 52) foi bastante afetada pelo tratamento ácido em valores de pH 1,0 e 1,5, ao contrário da levedura com colônia mucosa (PE-02). A fermentação em sistema de batelada com reciclo celular e tratamento ácido conduzido em pH 1,5 teve efeito sobre o crescimento da levedura rugosa quando em cultura mista com a levedura mucosa, não resultando em prejuízo à eficiência fermentativa, quando comparada com a cultura pura da PE-02. Em cultura pura da levedura rugosa, constatou-se eficiência fermentativa por volta de 60%, confirmando o baixo desempenho destas leveduras. O conhecimento das respostas das leveduras rugosas 12 às situações estressantes pode ajudar a manejar a fermentação alcoólica para minimizar o efeito da levedura contaminante. / Among the wild yeasts more commonly found in the alcoholic fermentation, wrinkled colonies with pseudohyphal morphology belonging to Saccharomyces genus are highlighted. This yeast biotype has been associated with industrial problems, resulting in the decrease of the fermentative yield. In this context, this work aimed to perform the genetic, morphological/physiological characterization and stress tolerance of Saccharomyces cerevisiae strains which exhibited wrinkled and mucous colonies, searching for alternatives that could contribute to the management of these wild yeasts (wrinkled colonies) in the alcoholic fermentation. Characterization tests for invasiveness in Agar medium, killer activity, temperature, pH, ethanol and sugar concentration, actidione, flocculation and fermentative capacity were carried out with 22 strains (11 wrinkled and 11 mucous colonies), which were screened previously by the sequencing of the ITS region of the ribosomal DNA. The effect of the acid treatment using different pH values over the growth of two strains (52 wrinked and PE-02 mucous) was also evaluated, following the growth monitoring in sugar cane juice after acid treatment. Fermentative tests in sugar cane juice were carried out with pure and mixed cultures of these strains. The morphological/physiological tests showed that the invasiveness in YEPD Agar medium occurred in low frequency among the 22 strains tested; ten out of eleven wrinked yeasts exhibited expressive flocculation, and among the mucous, the flocculation was near zero; none of the strains showed killer activity; the wrinkled colonies presented lower fermentative capacity comparing to mucous colonies, in a 48- hour cycle in batch system using sugar cane juice, with slower fermentation rate. Concerning the resistance to temperature, pH, ethanol and sugar concentration, the mucous colonies were more resistant to low pH, while the wrinkled colonies were more resistant to the elevated ethanol and sugar concentrations. None of the yeasts were resistant to actidione. The genetic analysis by microsatellite loci revealed the presence of two main genetic related groups, the first branch comprised mainly of wrinkled colonies (67%), containing however the PE-02 strain, showing strains with high flocculation rate and tolerance to high concentration of sugar and ethanol; the other group (with three subgroups) comprised mainly mucous colonies, showing lower resistance to the stressing conditions here studied. The yeast with wrinkled colony (strain 52) was severely affected by the acid treatment in pH values of 1.0 and 1.5, but the same did not occur with the mucous colony (PE-02). The batch fermentation with cell recycle and acid treatment in pH 1.5 had effect over the wrinkled yeast growth when in mixed culture with the mucous yeast, and did not impair the fermentative efficiency comparing to the pure culture of PE-02. In pure culture with the wrinkled colony, a fermentative efficiency as low as 60% was observed, confirming the low performance of these yeasts. The knowledge of the response to stressful conditions exhibited by the yeasts with wrinkled colonies can help to manage the alcoholic fermentation in order to minimize the effect of the contaminant yeast.

A contaminação de dornas por leveduras selvagens pode prejudicar o rendimento e a produtividade da produção industrial de etanol, inexistindo métodos eficientes para o controle deste tipo de contaminação. Facilidade, rapidez e o baixo custo seriam características desejáveis para o controle de leveduras que eventualmente contaminam o processo de fermentação. Com este objetivo, TAVARES (1989) desenvolveu um processo de produção de etanol com o controle de leveduras contaminantes, que utiliza um híbrido M606 de Saccharomyces cerevisiae de alta produtividade e resistente a nistatina, um antifúngico de amplo espectro que pode ser usado para garantir a pureza genética do inóculo industrial. Para facilitar a identificação de leveduras GOMES et al. (2000), utilizaram a propriedade de fluorescência expressada pelo gene GFP \"Green Fluorescent Protein\" sob o controle do promotor da da ADH2 em baixas concentrações de glicose. Associar estas duas propriedades em uma levedura industrial permitiria manter a pureza do inóculo e facilitaria a sua identificação. Com este objetivo, foram efetuados experimentos de transformação genética do híbrido M606 com o plasmídio pYGFP3 construído por Gomes et al (2000), sem obter o sucesso desejado. Por isto, como passo inicial para obtenção de ambas propriedades em híbrido altamente produtivo, optou-se pela metodologia de cruzamentos entre uma linhagem segregante haplóide resistente a nistatina M606-2c(n) e a linhagem X2904- GFP3 portadora do plasmídio pYGFP3. Alguns híbridos deste cruzamento natural foram selecionados, para posterior avaliação do nível de resistência à nistatina, da estabilidade do plasmídio pYGFP3 e da capacidade fermentativa. Verificou-se que os híbridos selecionados (P16, P34 e P42) foram capazes de crescer numa concentração de 10mg.L-1 de nistatina. Contudo, detectou-se instabilidade do plasmídio pYGFP3 em todos os híbridos selecionados. Os híbridos P34 e P42 demonstraram uma capacidade fermentativa inferior às linhagens controle, o que pode ser explicado pela fragilidade do sistema de membranas decorrente da natureza da resistência à nistatina. O híbrido P16 não apresentou diferenças na capacidade de fermentação em relação as linhagens controle. Apesar de obter híbridos resistentes a nistatina expressando o gene GFP3, verifica-se que há necessidade de modificar o plasmídio pYGFP3 tornando-o integrativo no genoma da levedura, para permitir a estabilidade do gene GFP3. / Vats contamination by wild yeasts can harm the efficiency and the productivity of ethanol industrial production and there are not efficient methods to control this type of contamination. Easiness, speed and the low cost would be desirable characteristics for the control of yeasts that eventually contaminate the fermentation process. With this aim, TAVARES (1989) developed an ethanol production process with the control of spoilage yeasts contaminants, that uses a Saccharomyces cerevisiae hybrid M606, of high productivity and resistant to the nystatin. It´s a wide spectrum antifungal that can be used to guarantee the genetic purity of the industrial inoculum. To facilitate the yeasts identification, GOMES et al. (2000) used the fluorescence property expressed by the GFP gene \"Green Fluorescent Protein\", that is controlled by the promoter of ADH2 in a low glucose concentrations. The association of these two properties in an industrial yeast strain would allow to maintain the purity of the inoculum and it would facilitate its identification. With this aim, an assay of genetic transformation of hybrid M606 with pYGFP3 plasmid built by Gomes et al (2000) was made, but it had not success. Therefore, as initial step for obtaining of both properties in hybrid highly productive, It was opted for the methodology of crossings between a nystatin resistant haploid segregant strain M606-2c(n) and the strain X2904-GFP3(n) harboring of the plasmid pYGFP3. Some hybrids were selected of this natural crossing, with subsequent evaluation of nystatin resistance level, stability of the pYGFP3 plasmid and fermentative capacity. The selected hybrids (P16, P34 and P42) were capable to grow in a concentration of 10mg.nystatin L-1. However, plasmidial instability of the pYGFP3 was detected in all the selected hybrids. The hybrids P34 and P42 showed a smaller fermentative capacity than control strain, which can be explained by the fragility of the membranes system due to the nature of the resistance to the nystatin. The hybrid P16 did not showed difference in the fermentative capacity to the strain control. In spite of obtaining resistant hybrid to the nystatin expressing the GFP3 gene, there is a need to modify the pYGFP3 plasmid, turning it integrative in the yeast genome to allow the gene stability GFP3.

A monitoração do processo de fermentação alcoólica para a obtenção de etanol é um tema de grande interesse pelo fato deste ser utilizado como fonte sustentavel de energia na indústria. Os processo de monitoração convencionalmente utilizados na indústria são dispendiosos, baseados em medições supervisionadas de densidade e estimativas de parâmetros químicos mediante procedimentos offline. O uso de técnicas de monitoração não invasivas baseadas em ultra-som vem sendo desenvolvidas para esse fim, fazendo uso de estimativas de parâmetros clássicos como a velocidade de propagação acústica e a atenuação. No entanto, a evolução do processo fermentativo não é bem descrita por esses parâmetros. Devido a isso, o presente trabalho propõe um sistema híbrido de processamento de sinais de ultra-som que utiliza um conglomerado de parâmetros para uma caracterização mais eficiente do processo fermentativo. O sistema incorpora procedimentos computacionais para a detecção, caracterização e classificação das fases do mosto em fermentação, visto como uma suspensão sólido-líquido (fase dispersa e contínua). Esses procedimentos foram baseadas em estimativas de estacionariedade dos sinais de retroespalhamento de ultra-som ( teste de hipotese não paramétrico - Teste de Run), ajuste de curvas sobre a largura de banda espectral (técnica de curve fitting), assim como a extração de atributos espectrais tais como : frequência central, largura de banda e valores de amplitude da componente fundamental, entre outros, além de parâmetros ultra-sônicos como o coeficiente de atenuação (slope) e o coeficiente integrado de retro-espalhamento (IBC). Para a classificação foi utilizado o algoritmo K-means. Os resultados obtidos mostraram a viabilidade na caracterização multiparamétrica não invasiva do fluido em fermentação, permitindo a identificação das principais fases do processo fermentativo. O trabalho contribui com uma metodología alternativa para a avaliação da cinética do crescimento microbiano como indicador da evolução da fermentação alcoólica. / Monitoring of alcoholic fermentation process for the ethanol production is a topic of great interest because it can be used as a sustainable energy source in the industry. The monitoring process conventionally used in industry are expensive, based on supervised measurements of density and parameter estimates by chemical offline procedures. The use of noninvasive monitoring techniques based on ultrasound are being developed for this purpose, using estimates of classical parameters as the acoustic propagation velocity and attenuation. However, the time evolution of the fermentation process is not well described by these parameters. For this reason, this study proposes a hybrid system of ultrasound signal processing that uses a conglomerate of parameters aiming a more efficient characterization about the fermentation process. The system incorporates computational procedures for the detection, characterization and classification of the fermentation must phases, seen as a solid-liquid suspension (dispersed and continuous phases). These procedures were based on estimates of stationarity for ultrasound backscattered signals (non-parametric statistical test - Run Test), curve fitting on the spectral bandwidth, as well as spectral attributes extraction such as center frequency, bandwidth and energy values of the fundamental frequency and so on, plus ultrasonic parameters as the attenuation coefficient (slope) and the integrated back-scattering coefficient (IBC). For classification we used the k-means algorithm. The results showed the feasibility for the multiparametric noninvasive characterization of fluid in fermentation, identifying the main stages of the fermentation process. This work contributes with an alternative methodology to evaluate the kinetics of microbial growth as an indicator of the alcoholic fermentation evolution.

Durante o crescimento da levedura Saccharomyces cerevisiae em meios contendo sacarose, a enzima invertase hidrolisa a sacarose no ambiente extracelular em glicose e frutose, as quais são posteriormente captadas pelas células por difusão facilitada. Num trabalho prévio, a localização da enzima invertase foi modificada nesta levedura, eliminando-se a forma extracelular e superexpressando-se a forma intracelular da enzima (Stambuk et al., 2009). Como resultado, a captação de sacarose por esta linhagem modificada (iSUC2) é realizada pelo co-transporte ativo com íons H+, implicando no gasto de 1 mol de ATP para cada mol de H+ extrudado pelas células para manutenção do pH intracelular. Como forma de compensar este gasto energético, espera-se que a linhagem iSUC2 desvie uma maior parte do fluxo de carbono para a geração de energia e, consequentemente, para a formação de etanol, em relação a uma linhagem selvagem. No presente trabalho, uma avaliação fisiológica quantitativa de uma linhagem com esta modificação genética foi realizada tanto em quimiostatos limitados por sacarose, como em cultivos descontínuos com sacarose como única fonte de carbono. Os dados obtidos em quimiostatos anaeróbios demonstram que na linhagem iSUC2 a enzima invertase ficou retida no ambiente intracelular e apresentou atividade absoluta total cerca de duas vezes maior que na linhagem-referência (SUC2). Além disto, verificou-se um aumento de 4% no fator de conversão de sacarose a etanol (Y ETH/S), em relação à linhagem SUC2. No entanto, como foi observado que cerca de 8 % da sacarose não foi consumida pelas células da linhagem iSUC2 durante o estado-estacionário dos quimiostatos anaeróbios, decidiu-se melhorar a capacidade do transporte ativo deste dissacarídeo nesta linhagem através de uma estratégia de engenharia evolutiva caracterizada pelo cultivo destas células em quimiostatos longos limitados por sacarose, em anaerobiose. Obteve-se assim, após cerca de 60 gerações, uma linhagem mutante (iSUC2 evoluída) com atividade de transporte de sacarose 20 vezes superior à linhagem iSUC2, sendo capaz de consumir toda a sacarose do meio de cultivo. Esta linhagem apresentou um aumento de 11% no YETH/S e uma diminuição de 27% no fator de conversão de sacarose a células (YX/S), quando comparada à linhagem-referência. A análise do transcriptoma revelou o aumento da expressão de vários genes codificadores de transportadores de hexoses, bem como genes relacionados ao metabolismo de maltose, incluindo o gene do transportador de alta-afinidade para alfa-glicosídeos AGT1, quando a linhagem iSUC2 evoluída foi comparada à linhagem iSUC2. Detectou-se que a evolução em quimiostato resultou na duplicação do gene AGT1, sem que houvesse mutação neste gene. Através da superexpressão do gene AGT1 na linhagem iSUC2, conseguiu-se gerar uma linhagem que apresentou YETH/S muito próximo ao da linhagem iSUC2 evoluída. No entanto, outros parâmetros fisiológicos, foram diferentes nestas duas linhagens, indicando que a duplicação do gene AGT1 não foi a única mutação que ocorreu durante o processo de evolução em quimiostato. Este trabalho ilustra o potencial da combinação entre engenharia metabólica e engenharia evolutiva para a obtenção de linhagens de levedura melhoradas, para aplicação na produção industrial de etanol combustível a partir de meios contendo sacarose. / When growing on sucrose-containing substrates, Saccharomyces cerevisiae secretes invertase that hydrolyses sucrose into glucose and fructose, which are subsequently assimilated by facilitated diffusion. In a previous work, the cellular location of invertase in yeast was modified, by eliminating the extracellular form of the enzyme and over-expressing the intracellular one (Stambuk et al., 2009). As a result, sucrose uptake by this modified strain (iSUC2) occurs by an active H+-sucrose symport system, in which 1 ATP needs to be used by the cells to extrude the proton co-transported. In order to compensate for this, it is expected that these cells will deviate a higher proportion of the carbon flow towards energy generation, and consequently to ethanol formation, in comparison with the wild-type phenotype (SUC2). In the present work, a quantitative physiological evaluation of the iSUC2 strain was performed in both batch and chemostat cultures. Cells from the iSUC2 strain harvested from steady-state anaerobic sucrose-limited chemostats retained all invertase intracellularly and showed a 2-fold higher total invertase activity, when compared to the SUC2 strain grown under identical conditions. Besides this, the ethanol yield on sucrose in the former cells was 4% higher than in the latter case. However, due to the high levels of residual sucrose during these cultivations with the iSUC2 strain, we attempted to improve the transport capacity in the iSUC2 strain by evolutionary engineering. After 60 generations of cultivation in an anaerobic sucrose-limited chemostat, an evolved strain was selected, which presented a 20-fold increase in the sucrose transport capacity, when compared with the parental strain (iSUC2), leading to almost no residual sucrose. During growth of this evolved strain in anaerobic sucrose-limited chemostats, the ethanol yield on sucrose was 11% higher and the biomass yield on sucrose was 27% lower, when compared with the SUC2 strain. Transcriptome analysis revealed an increase in the expression level of several hexose transporters, as well as many MAL-related genes, including the gene for the high-affinity permease AGT1. Indeed, it was verified that this gene was duplicated during the evolution experiment, but no point mutation was detected. By over-expressing the AGT1 gene in the iSUC2 strain, it was possible to attain a similar ethanol yield on sucrose, when compared to the evolved iSUC2 strain. However, several other physiological parameters were different in both strains, indicating that the AGT1 gene duplication was not the only mutation that occurred during evolution in the chemostat. To conclude, this work illustrates that the combination of metabolic and evolutionary engineering is a powerful strategy to obtain improved sucrose-fermenting yeast strains.