Sugarcane (Saccharum spp) is an important commercial crop cultivated widely in tropical and subtropical countries. Primarily sugarcane is used to produce sugar and recently it is proven to be a valuable resource for bioethanol, biodiesel, bioplastic and bioelectricity. Smut is one of the most serious sugarcane disease and occurs in sugarcane fields all over the world. The disease is caused by the biotrophic fungus Sporisorium scitamineum. The fungus induces metabolic changes in the plant leading to the production of a whip-like structure where fungal sporogenesis take place. The objective of this study was to analyse the reactive oxygen species (ROS) production, antioxidant enzymes activity and expression of genes associated with the ROS metabolism in smut susceptible (IAC66-6) and resistant sugarcane genotypes (SP80-3280). In addition, this work assessed the relationship between antioxidant enzymes and sensitivity of S. scitamineum to exogenous hydrogen peroxide (H2O2). This thesis is presented in the format of two chapters (chapters 2 and 3). In the second chapter, the results revealed that there were variations in the antioxidant system as well as in the ROS production in resistant sugarcane genotype, whereas few changes occurred in the susceptible genotype inoculated with S. scitamineum. Microscopic analysis revealed that S. scitamineum teliospore germination and appressorium formation were delayed during early infection in the smut resistant genotype, which coincided with H2O2 accumulation. In chapter 3, the results demonstrated that S. scitamineum is highly resistant to exogenous H2O2. At 2 mM exogenous H2O2 concentration the fungus presented an effective antioxidant system in response to the secondary products of oxidative stress. Furthermore, S. scitamineum when exposed for a long time at 2 mM exogenous H2O2 concentration it can acquire an adaptive response to H2O2. The results obtained in this study contributed to increase the understanding of this very complex interaction between sugarcane and S. scitamineum and it will be helpful toward understanding which aspects are involved in the resistance to S. scitamineum. These informations are important to create strategies for improving smut resistance in sugarcane. / Cana-de-açúcar (Saccharum spp) é uma importante cultura comercial amplamente cultivada em países tropicais e subtropicais. A cana-de-açúcar é principalmente utilizada para produzir açúcar e recentemente é considerada uma valiosa fonte para produção de bioetanol, biodiesel, bioplásticos e bioeletricidade. O carvão é uma das doenças mais graves da cana-de-açúcar e ocorrem em canaviais do mundo inteiro. A doença é causada pelo fungo biotrófico Sporisorium scitamineum. Este fungo induz mudanças metabólicas na planta, levando a formação de uma estrutura chamada chicote, onde ocorre a esporogênese. O objetivo desse estudo foi analisar a produção de espécies reativas de oxigênio (EROs), atividade de enzimas antioxidantes e a expressão de genes associados ao metabolismo de EROs em genótipos de cana-açúcar susceptível (IAC66-6) e resistente (SP80-3280). Além disso, este trabalho avaliou a relação entre as enzimas antioxidantes e sensibilidade de S. scitamineum a peróxido de hidrogênio (H2O2) exógeno. Esta tese está apresentada no formato de 2 capítulos (capítulos 2 e 3). No segundo capítulo, os resultados revelaram que ocorreram alterações no sistema antioxidante, bem como na produção de EROs no genótipo resistente, enquanto que poucas mudanças ocorreram no genótipo susceptível inoculado com S. scitamineum. Análises de microscopia revelaram que a germinação de teliósporos e a formação de apressórios de S. scitamineum atrasou durante o início da infeção no genótipo resistente ao carvão, coincidindo com o acúmulo de H2O2. No capítulo 3, os resultados demonstraram que S. scitamineum é altamente resistente a H2O2 exógeno. O fungo crescendo na concentração de 2 mM de H2O2 apresentou um eficiente sistema antioxidante em resposta a produtos secundários do estresse oxidativo. Além disso, quando S. scitamineum foi exposto a 2 mM de H2O2 exógeno, ele pode adquirir uma resposta adaptativa ao H2O2. Os resultados obtidos neste estudo contribuíram para aumentar o entendimento dessa complexa interação entre cana e S. scitamineum e será útil para a compreensão de quais aspectos estão envolvidos na resistência a este fungo. Estas informações são importantes para criar estratégias para o melhoramento de cana a essa doença.

Em concentrações subletais, agentes antimicrobianos modulam a expressão gênica bacteriana, sendo que o conjunto de genes que é modulado depende tanto da cepa bacteriana, como da natureza do agente antimicrobiano. Neste trabalho, avaliamos o perfil de expressão gênica de Xylella fastidiosa cepa 9a5c em resposta ao tratamento por até 60 minutos com dose subletal do antibiótico estreptomicina. Esta é uma cepa virulenta, originalmente isolada de laranjeiras com sintomas de clorose variegada dos citros. A hibridização de microarranjos de DNA representando 2608 das 2848 sequências codificadoras (CDS) previamente anotadas no genoma desta cepa, revelou que 136 CDS apresentaram expressão gênica diferencial em resposta à exposição à estreptomicina, sendo que destas 109 foram negativamente moduladas e 27 positivamente moduladas. Realizamos, também, ensaios de PCR quantitativo precedido de transcrição reversa (RTqPCR) de 21 CDS para confirmar a modulação observada na análise global da expressão gênica. O perfil de expressão gênica de X. fastidiosa em resposta à estreptomicina foi analisado de forma integrada com outros perfis de expressão gênica desta bactéria. Entre as CDS positivamente moduladas, destacamos aquelas codificadoras das chaperoninas GroEL e GroES, que estão associadas a resposta de choque térmico, e CDS associadas à tradução, tais como proteínas ribossomais e fatores de tradução. Interessantemente, a exposição à estreptomicina induz a expressão da CDS que codifica poligalacturonase, que é um fator de virulência em algumas cepas de X. fastidiosa. Por outro lado, o tratamento com estreptomicina promoveu a modulação negativa de CDS relacionadas à formação e manutenção de biofilme ao contrário do observado quando estas bactérias foram submetidas ao tratamento com gomesina, um peptídeo antimicrobiano. O conjunto destas observações sugere que a exposição à dose subletal de estreptomicina possa promover um fenótipo de maior virulência, contrariamente ao efeito previamente observado com a gomesina. Neste trabalho, também descrevemos o pirosequenciamento do genoma da cepa J1a12 de Xylella fastidiosa, que exibe fenótipo menos virulento em citros e tabaco em relação à cepa 9a5c. A comparação da sequência genômica destas duas cepas confirma diferenças anteriormente observadas utilizando-se microarranjos de DNA e destaca genes potencialmente importantes para virulência de Xylella fastidiosa. / At sublethal concentrations, antimicrobials compounds modulate bacterial gene expression and the gene set that is modulated depends not only on the bacterial strain but also on the nature of antimicrobial agent. In this study, we evaluated changes in gene expression profile of Xylella fastidiosa strain 9a5c exposed up to 60 min to sublethal concentration of streptomycin. This a virulent strain originally isolated from orange trees with symptoms of citrus variegated chlorosis. Hybridization of DNA microarrays representing 2,608 out of 2848 coding sequences (CDS) previously annotated in strain 9a5c genome revealed 136 CDS differentially expressed upon streptomycin treatment. Of which 109 were down-regulated and 27 up-regulated. Differential expression for a subset of 21 CDS was further evaluated by reverse transcriptionquantitative PCR (RT-qPCR). In addition, we performed an integrated analysis of the gene expression profile of X. fastidiosa in response to streptomycin along with other gene expression profiles available for this bacterium. Among the up-regulated CDS, we highlight those encoding chaperonins GroEL and GroES, which are associated with heat shock response, and those CDS related to translation, such as ribosomal proteins and translation factors. Interestingly, exposure to streptomycin induces the expression of a CDS encoding polygalacturonase, which is a virulence factor for some X. fastidiosa strains. Furthermore, treatment with streptomycin down-regulates some CDS related to biofilm formation oppositely to treatment with gomesin, an antimicrobial peptide. Together, these observations suggest that exposure to sublethal dose of streptomycin might promote a higher virulent phenotype, in contrast to the effect previously observed with gomesin. In the present work, we also describe the pyrosequencing of J1a12 genome, a X. fastidiosa strain that exhibits a less virulent phenotype in citrus and tobacco if compared to strain 9a5c. A comparison of genome sequences of these two strains confirms differences previously observed using DNA microarrays and highlights important genes for virulence of X. fastidiosa.

Xylella fastidiosa é uma bactéria Gram-negativa, do subgrupo das Gama-Proteobactérias, não-flagelada, que coloniza o xilema de diversas plantas cultivadas e silvestres, podendo ser causadora de doenças. Sua disseminação é feita por insetos conhecidos como cigarrinhas. Genomas de cepas de X. fastidiosa isoladas de distintos hospedeiros já foram sequenciados completa ou parcialmente: 9a5c de citros; Temecula-1 e GB514 de videira; Dixon, M12 e M23 de amendoeira; Ann-1 de espirradeira e EB92-1, isolada de sabugueiro e utilizada como bio-controle para Doença de Pierce de videiras. Estudos de genômica comparativa associados a abordagens de genômica funcional e de genética molecular têm possibilitado o estudo detalhado de mecanismos potencialmente relevantes tanto para a colonização de plantas e insetos por este fitopatógeno como para o desenvolvimento de sintomas associados a doenças específicas em seus respectivos hospedeiros vegetais. Exceto o genoma de 9a5c, todos os demais genomas conhecidos são de cepas isoladas na América do Norte. Neste trabalho descrevemos o pirossequenciamento dos genomas da cepa J1a12, que exibe fenótipo não-virulento em citros, e das cepas Pr8x e Hib4, isoladas, respectivamente, de ameixeira e hibisco. A cepa J1a12 possui além de seu cromossomo principal de 2.788.789 pb dois plasmídeos, pXF51 e pXF27, respectivamente de 51.180 pb e 27.268 pb. pXF51 já foi descrito também na cepa de citros 9a5c e pXF27 tem similaridade com outros plasmídeos de cepas de X. fastidiosa norte-americanas isoladas de amoreira e videira. A cepa Pr8x possui além de seu cromossomo principal de 2.666.242 pb um plasmídeo, pXF39, de 39.580 pb, o qual contém a maioria das CDS presentes no pXF51. A cepa Hib4, isolada de hibisco, tem o maior cromossomo (2.813.297 pb) e também o maior plasmídeo (pXF64 com 64.251 pb) já descritos para X. fastidiosa. pXF64 apresenta extensa similaridade com o plasmídeo pBVIE04 de Burkholderia vietnamensis cepa G4, sendo descrito pela primeira vez em cepas de X. fastidiosa. Análises comparativas destes genomas possibilitaram a identificação de alterações que podem ser correlacionadas com os fenótipos exibidos por estas cepas, além da variedade e diversidade de regiões relacionadas a bacteriófagos e de plasmídeos que co-existem nas diferentes cepas deste fitopatógeno. / Xylella fastidiosa is a Gram-negative bacteria, of the Gamma-proteobacterium subgroup, non-flagellated that colonizes the xylem of several cultivated and wild plants, where may cause disease. The bacterium is spread by insects known as sharpshooters. Genomes of X. fastidiosa strains isolated from different hosts have been completely or partially sequenced: 9a5c from citrus; Temecula-1 and GB514 from grapevine; Dixon, M12 and M23 from almond tree; Ann-1 from oleander and EB92-1, isolated from elderberry and used as bio-control for Pierce\'s disease of grapevines. Comparative genomics studies associated with approaches from functional genomics and molecular genetics have allowed a detailed study of mechanisms potentially relevant to the colonization of plants and insects by this pathogen as well as to the development of symptoms associated with specific diseases in their respective host plants. Except for 9a5c, all other known genomes are from strains isolated in North America. Here we describe the pyrosequencing of the genomes of strain J1a12, which displays non-virulent phenotype in citrus and of Pr8x and Hib4 strains isolated, respectively, from plum and hibiscus. J1a12 has a main chromosome of 2,788,789 bp and two plasmids, pXF51 and pXF27, respectively of 51,180 bp and 27,268 bp. pXF51 has been described also in the citrus strain 9a5c and pXF27 has similarity with other plasmids found in North American strains isolated from mulberry tree and grapevine. The strain Pr8x has a main chromosome of 2,666,242 bp and one plasmid, pXF39, of 39,580 bp which present similarities with pXF51. Hib4, the strain isolated from hibiscus, has the largest chromosome (2,813,297 bp) and the largest plasmid (pXF64 with 64,251 bp) described for X. fastidiosa. pXF64 shows extensive similarity with the plasmid pBVIE04 of Burkholderia vietnamensis G4 strain and is described for the first time in X. fastidiosa. Comparative analyzes of these genomes have identified several differences that may be correlated with the phenotypes displayed by these strains, in addition to the variety and diversity of regions related to bacteriophages and plasmids that co-exist in different strains of this pathogen.

O gênero Phytomonas está associado a enfermidades devastadoras em plantações de interesse econômico, enquanto que outros vegetais parasitados não apresentam nenhum dano aparente. A seqüência-consenso de um agrupamento de ESTs de P. serpens determinado anteriormente apresentou alta similaridade com indolpiruvato descarboxilases (IPDCs) de fitobactérias e putativas piruvato/indolpiruvato descarboxilases de Leishmania spp. A enzima IPDC está na via de biossíntese do ácido 3-indolil acético, um dos hormônios vegetais mais importantes. Verificamos que o gene IPDC está presente em diversos isolados de Phytomonas, em múltiplas cópias (cerca de 104 cópias em P. serpens e 200 cópias em P. françai), contíguas e concentradas em uma banda cromossômica. Análises filogenéticas e amplificações por PCR com oligonucleotídeos degenerados apontam o clado Phytomonas-Leishmania como grupo-irmão de IPDCs de fitobactérias, sugerindo um processo de transferência horizontal anterior à separação dos tripanossomatídeos do clado que também inclui Leptomonas, Herpetomonas e Crithidia. / The genus Phytomonas is associated to devastating diseases in commercially important crops, whereas in other plant species no apparent damage is observed. The consensus sequence of one group of ESTs of P. serpens previously determined showed high similarity with indolepyruvate decarboxylases (IPDCs) from phytobacteria and putative pyruvate/indolepyruvate decarboxylases of Leishmania spp. The enzyme ipdC participates in the biosynthetic pathway of the indole-3-acetic acid, one of the most important plant hormones. We found that the IPDC gene is present in several Phytomonas isolates, in multiple copies (about 104 copies in P. serpens and 200 copies in P. françai, in tandem and concentrated in one chromosomal band. The phylogenetic analyses and data of PCR amplifications with degenerated primers point the clade Phytomonas-Leishmania as a sister group of IPDCs of phytobacteria, suggesting a process of horizontal gene transfer prior to the separation of the trypanosomatid clade that also includes Leptomonas, Phytomonas, Herpetomonas, Leishmania and Crithidia.

Xylella fastidiosa é uma bactéria gram-negativa, não flagelada, agente causal de doenças de importância econômica como a doença de Pierce nas videiras e a clorose variegada dos citros (CVC) nas laranjeiras. O objetivo do presente trabalho foi realizar análises in silico das sequências promotoras dos genes deste fitopatógeno em uma tentativa de arrecadar novas evidências para o melhor entendimento da dinâmica de regulação transcricional de seus genes, incluindo aqueles envolvidos em mecanismos de patogenicidade e virulência. Para tanto, duas estratégias foram utilizadas para predição de elementos cis-regulatórios em regiões promotoras do genoma da cepa referência 9a5c, comprovadamente associada à CVC. A primeira, conhecida como phylogenetic footprinting, foi empregada para identificação de elementos regulatórios conservados em promotores de unidades transcricionais ortólogas, levando em consideração o conjunto de genes de X. fastidiosa e 7 espécies comparativas. O critério para identificação de unidades transcricionais ortólogas, isto é, unidades trancricionais oriundas de espécies distintas e cujos promotores compartilham elementos cis-regulatórios, foi paralelamente estudado utilizando-se informações regulatórias das bactérias modelos: Pseudomonas aeruginosa, Bacillus subtilis e Escherichia coli. Os resultados obtidos com análise de phylogenetic footprinting nos permitiu acessar a rede regulatória transcricional da espécie de forma compreensiva (global). Foram estabelecidas 2990 interações regulatórias, compreendendo 80 motivos distribuídos nos promotores de 56.8% das unidades transcricionais do genoma de X. fastidiosa. Na segunda estratégia recuperamos informações regulatórias experimentalmente validadas em E. coli e complementamos o conhecimento de dez regulons de X. fastidiosa, através de uma metodologia de scanning (varredura), dos quais algumas interações regulatórias já haviam sido previamente descritas por outros trabalhos. Destacamos os regulons de Fur e CRP, reguladores transcricionais globais, que se mostraram responsáveis pela modulação de genes relacionados a mecanismos de invasão e colonização do hospedeiro vegetal entre outros. Por fim, análises comparativas em regiões regulatórias correspondentes entre cepas foram realizadas e diferenças possivelmente associadas a particularidades fenotípicas foram identificadas entre 9a5c e J1a12, um isolado de citros não virulento, e 9a5c e Temecula1, um isolado de videira causador da doença de Pierce. / Xylella fastidiosa is a gram-negative, non-flagellated bacterium responsible for causing economically important diseases such as Pierce\'s disease in grapevines and Citrus Variegated Clorosis (CVC) in sweet orange trees. In the present work we performed in silico analysis on promoter sequences of protein-coding genes from this phytopathogen, including those involved in virulence and pathogenic mechanisms, in an attempt to better understand the underlying transcriptional regulatory dynamics. Two strategies for cis-regulatory elements prediction were applied on promoter sequences from 9a5c strain genome, a proven causal agent of CVC. The first one, known as phylogenetic footprinting, involved the prediction of regulatory motifs conserved on promoter sequences of orthologous transcription units from X. fastidiosa and a set of 7 comparatives species. The criteria to identify orthologous transcription units, i. e., those from different species and whose promoter sequences share at least one common regulatory motif, was studied based on regulatory information available for model organisms: Pseudomonas aeruginosa, Bacillus subtilis and Escherichia coli. The results obtained with the phylogenetic footprinting analysis permitted us to access the underlying transcriptional regulatory network from the species in a comprehensive manner (genome-wide), with a total of 2990 regulatory interactions corresponding to 80 predicted motifs distributed on promoter sequences of 56.8% of all transcription units. In the second strategy regulatory information from E. coli was recovered and used to expand the knowledge of ten regulons in X. fastidiosa, through a scanning process, of which some regulatory interactions were previously described by independent studies. We emphasize some genes related to host invasion and colonization present in the Fur and CRP regulons, two global transcription regulators. Lastly, comparative analysis on corresponding regulatory regions among strains were performed and differences possibly associated to phenotypic variation were identified between 9a5c and J1a12, a non-virulent strain isolated from orange trees, and between 9a5c and Temecula1, a strain associated to Pierce\'s disease on grapevines.

Xylella fastidiosa é uma bactéria gram-negativa, não flagelada, agente causal de doenças de importância econômica como a doença de Pierce nas videiras e a clorose variegada dos citros (CVC) nas laranjeiras. O objetivo do presente trabalho foi realizar análises in silico das sequências promotoras dos genes deste fitopatógeno em uma tentativa de arrecadar novas evidências para o melhor entendimento da dinâmica de regulação transcricional de seus genes, incluindo aqueles envolvidos em mecanismos de patogenicidade e virulência. Para tanto, duas estratégias foram utilizadas para predição de elementos cis-regulatórios em regiões promotoras do genoma da cepa referência 9a5c, comprovadamente associada à CVC. A primeira, conhecida como phylogenetic footprinting, foi empregada para identificação de elementos regulatórios conservados em promotores de unidades transcricionais ortólogas, levando em consideração o conjunto de genes de X. fastidiosa e 7 espécies comparativas. O critério para identificação de unidades transcricionais ortólogas, isto é, unidades trancricionais oriundas de espécies distintas e cujos promotores compartilham elementos cis-regulatórios, foi paralelamente estudado utilizando-se informações regulatórias das bactérias modelos: Pseudomonas aeruginosa, Bacillus subtilis e Escherichia coli. Os resultados obtidos com análise de phylogenetic footprinting nos permitiu acessar a rede regulatória transcricional da espécie de forma compreensiva (global). Foram estabelecidas 2990 interações regulatórias, compreendendo 80 motivos distribuídos nos promotores de 56.8% das unidades transcricionais do genoma de X. fastidiosa. Na segunda estratégia recuperamos informações regulatórias experimentalmente validadas em E. coli e complementamos o conhecimento de dez regulons de X. fastidiosa, através de uma metodologia de scanning (varredura), dos quais algumas interações regulatórias já haviam sido previamente descritas por outros trabalhos. Destacamos os regulons de Fur e CRP, reguladores transcricionais globais, que se mostraram responsáveis pela modulação de genes relacionados a mecanismos de invasão e colonização do hospedeiro vegetal entre outros. Por fim, análises comparativas em regiões regulatórias correspondentes entre cepas foram realizadas e diferenças possivelmente associadas a particularidades fenotípicas foram identificadas entre 9a5c e J1a12, um isolado de citros não virulento, e 9a5c e Temecula1, um isolado de videira causador da doença de Pierce. / Xylella fastidiosa is a gram-negative, non-flagellated bacterium responsible for causing economically important diseases such as Pierce\'s disease in grapevines and Citrus Variegated Clorosis (CVC) in sweet orange trees. In the present work we performed in silico analysis on promoter sequences of protein-coding genes from this phytopathogen, including those involved in virulence and pathogenic mechanisms, in an attempt to better understand the underlying transcriptional regulatory dynamics. Two strategies for cis-regulatory elements prediction were applied on promoter sequences from 9a5c strain genome, a proven causal agent of CVC. The first one, known as phylogenetic footprinting, involved the prediction of regulatory motifs conserved on promoter sequences of orthologous transcription units from X. fastidiosa and a set of 7 comparatives species. The criteria to identify orthologous transcription units, i. e., those from different species and whose promoter sequences share at least one common regulatory motif, was studied based on regulatory information available for model organisms: Pseudomonas aeruginosa, Bacillus subtilis and Escherichia coli. The results obtained with the phylogenetic footprinting analysis permitted us to access the underlying transcriptional regulatory network from the species in a comprehensive manner (genome-wide), with a total of 2990 regulatory interactions corresponding to 80 predicted motifs distributed on promoter sequences of 56.8% of all transcription units. In the second strategy regulatory information from E. coli was recovered and used to expand the knowledge of ten regulons in X. fastidiosa, through a scanning process, of which some regulatory interactions were previously described by independent studies. We emphasize some genes related to host invasion and colonization present in the Fur and CRP regulons, two global transcription regulators. Lastly, comparative analysis on corresponding regulatory regions among strains were performed and differences possibly associated to phenotypic variation were identified between 9a5c and J1a12, a non-virulent strain isolated from orange trees, and between 9a5c and Temecula1, a strain associated to Pierce\'s disease on grapevines.