O gênero Phytomonas compreende parasitas cosmopolitas de plantas transmitidos por hemípteros. Não há estudos recentes sobre a taxonomia de Phytomonas e apenas duas espécies foram filogeneticamente validadas: P. serpens e P. françai. Até o momento 6 - 11 grupos (A-K) constituem esse gênero, dependendo do marcador molecular. O principal objetivo deste estudo foi caracterizar uma grande amostragem de isolados de Phytomonas de plantas e hemípteros com inferências filogenéticas de sequências de SSUrDNA, gGAPDH e ITSrDNA. Foi confirmado a subdivisão em 7 clados: Grupo A - 59 isolados de látex e insetos (Coreidae) de diferentes países. Grupo B - 7 isolados de látex e insetos (Scutelleridae e Pentatomidae) do Brasil e Suriname. Grupo C - 4 isolados de látex da Espanha. Grupo D - 11 isolados de Euphorbiaceae e Coreidae de diferentes países. Grupo E - 16 isolados de Solanaceae e Pentatomidae do Brasil. Grupo F - restrito a P. françai do Brasil. Grupo H - isolados de floema da América do Sul. Os resultados permitiram identificar candidatos a novas espécies de Phytomonas. / The Phytomonas genus is comprised by cosmopolitan plant´s parasites and is transmitted by Hemiptera. There are no recent studies based on the taxonomy of Phytomonas and only two species were phylogenetically validated: P. serpens and P. françai. To date this genus is constitute by 6 - 11 groups (A-K), depending on the molecular marker. The aim of this study was to characterize large samples of Phytomonas isolated from plants and Hemiptera throught phylogenetic inferences sequences SSUrDNA, gGAPDH and ITSrDNA. 7 Subclades was confirmed: Group A - 59 isolates of latex and insects (Coreidae) from different countries. Group B - 7 isolates of latex and insects (Scutelleridae and Pentatomidae) from Brazil and Suriname. Group C - 4 isolates of Spain latex. Group D - 11 isolates of Euphorbiaceae and Coreidae from different countries. Group E - 16 isolates of Solanaceae and Pentatomidae from Brazil. Group F - restricted to Brazilian P. françai isolates. Group H - Isolates of phloem from South America. Our results shown possible candidates for new species of Phytomonas.

O gênero Phytomonas compreende parasitas cosmopolitas de plantas transmitidos por hemípteros. Não há estudos recentes sobre a taxonomia de Phytomonas e apenas duas espécies foram filogeneticamente validadas: P. serpens e P. françai. Até o momento 6 - 11 grupos (A-K) constituem esse gênero, dependendo do marcador molecular. O principal objetivo deste estudo foi caracterizar uma grande amostragem de isolados de Phytomonas de plantas e hemípteros com inferências filogenéticas de sequências de SSUrDNA, gGAPDH e ITSrDNA. Foi confirmado a subdivisão em 7 clados: Grupo A - 59 isolados de látex e insetos (Coreidae) de diferentes países. Grupo B - 7 isolados de látex e insetos (Scutelleridae e Pentatomidae) do Brasil e Suriname. Grupo C - 4 isolados de látex da Espanha. Grupo D - 11 isolados de Euphorbiaceae e Coreidae de diferentes países. Grupo E - 16 isolados de Solanaceae e Pentatomidae do Brasil. Grupo F - restrito a P. françai do Brasil. Grupo H - isolados de floema da América do Sul. Os resultados permitiram identificar candidatos a novas espécies de Phytomonas. / The Phytomonas genus is comprised by cosmopolitan plant´s parasites and is transmitted by Hemiptera. There are no recent studies based on the taxonomy of Phytomonas and only two species were phylogenetically validated: P. serpens and P. françai. To date this genus is constitute by 6 - 11 groups (A-K), depending on the molecular marker. The aim of this study was to characterize large samples of Phytomonas isolated from plants and Hemiptera throught phylogenetic inferences sequences SSUrDNA, gGAPDH and ITSrDNA. 7 Subclades was confirmed: Group A - 59 isolates of latex and insects (Coreidae) from different countries. Group B - 7 isolates of latex and insects (Scutelleridae and Pentatomidae) from Brazil and Suriname. Group C - 4 isolates of Spain latex. Group D - 11 isolates of Euphorbiaceae and Coreidae from different countries. Group E - 16 isolates of Solanaceae and Pentatomidae from Brazil. Group F - restricted to Brazilian P. françai isolates. Group H - Isolates of phloem from South America. Our results shown possible candidates for new species of Phytomonas.

O gênero Phytomonas está associado a enfermidades devastadoras em plantações de interesse econômico, enquanto que outros vegetais parasitados não apresentam nenhum dano aparente. A seqüência-consenso de um agrupamento de ESTs de P. serpens determinado anteriormente apresentou alta similaridade com indolpiruvato descarboxilases (IPDCs) de fitobactérias e putativas piruvato/indolpiruvato descarboxilases de Leishmania spp. A enzima IPDC está na via de biossíntese do ácido 3-indolil acético, um dos hormônios vegetais mais importantes. Verificamos que o gene IPDC está presente em diversos isolados de Phytomonas, em múltiplas cópias (cerca de 104 cópias em P. serpens e 200 cópias em P. françai), contíguas e concentradas em uma banda cromossômica. Análises filogenéticas e amplificações por PCR com oligonucleotídeos degenerados apontam o clado Phytomonas-Leishmania como grupo-irmão de IPDCs de fitobactérias, sugerindo um processo de transferência horizontal anterior à separação dos tripanossomatídeos do clado que também inclui Leptomonas, Herpetomonas e Crithidia. / The genus Phytomonas is associated to devastating diseases in commercially important crops, whereas in other plant species no apparent damage is observed. The consensus sequence of one group of ESTs of P. serpens previously determined showed high similarity with indolepyruvate decarboxylases (IPDCs) from phytobacteria and putative pyruvate/indolepyruvate decarboxylases of Leishmania spp. The enzyme ipdC participates in the biosynthetic pathway of the indole-3-acetic acid, one of the most important plant hormones. We found that the IPDC gene is present in several Phytomonas isolates, in multiple copies (about 104 copies in P. serpens and 200 copies in P. françai, in tandem and concentrated in one chromosomal band. The phylogenetic analyses and data of PCR amplifications with degenerated primers point the clade Phytomonas-Leishmania as a sister group of IPDCs of phytobacteria, suggesting a process of horizontal gene transfer prior to the separation of the trypanosomatid clade that also includes Leptomonas, Phytomonas, Herpetomonas, Leishmania and Crithidia.

Um gene que codifica uma piruvato/indolpiruvato descarboxilase (PDC/IPDC) está presente no tripanossomatídeo de plantas Phytomonas serpens. A PDC atua na fermentação alcoólica, enquanto que a IPDC atua na biossíntese do fitormônio ácido indol-3-acético (AIA). Análises filogenéticas indicam que a PDC/IPDC de P. serpens é monofilética com IPDCs de gama-proteobactérias, sugerindo um evento de transferência horizontal gênica. A análise de meios de cultura de P. serpens confirma a produção de etanol e AIA. A funcionalidade do fitormônio foi confirmada em ensaios de alongamento de hipocótilos de tomateiros. Tomates inoculados com P. serpens mostraram aumento no teor de AIA-amida e -éster conjugados. A atividade PDC foi mostrada em extratos de P. serpens. Concluímos que a PDC/IPDC seria uma 2-cetoácido descaboxilase com atividade catalítica variável para diferentes substratos. A atividade PDC parece ser predominante em P. serpens, representando um mecanismo para oxidar parte do NADH formado na glicólise, principal responsável pela produção de ATP neste organismo. / A gene codifying a pyruvate/indolepyruvate decarboxylase (PDC/IPDC) is present in the plant trypanosomatid Phytomonas serpens. PDC acts in the alcoholic fermentation, whyle IPDC acts in the biosynthesis of the phytohormone indole-3-acetic acid (IAA). Phylogenetic analysis indicate that P. serpens PDC/IPDC is monophyletic with gamma-proteobacteria IPDCs, suggesting a horizontal gene transfer event. Analysis of P. serpens culture media confirms production of ethanol and IAA. The functionality of the phytohormone was confirmed by tomato hypocotyl elongation tests. Tomatoes inoculated with P. serpens showed an increase in the concentration of IAA amide and ester conjugated. PDC activity was shown in P. serpens extracts. We conclude that the PDC/IPDC would be a 2-keto acid decaboxylase with variable catalytic activity for different substrates. The PDC activity appears to be prevalent in P. serpens representing a mechanism to oxidize part of NADH formed in glycolysis, responsible for ATP production in this organism.

O gênero Phytomonas está associado a enfermidades devastadoras em plantações de interesse econômico, enquanto que outros vegetais parasitados não apresentam nenhum dano aparente. A seqüência-consenso de um agrupamento de ESTs de P. serpens determinado anteriormente apresentou alta similaridade com indolpiruvato descarboxilases (IPDCs) de fitobactérias e putativas piruvato/indolpiruvato descarboxilases de Leishmania spp. A enzima IPDC está na via de biossíntese do ácido 3-indolil acético, um dos hormônios vegetais mais importantes. Verificamos que o gene IPDC está presente em diversos isolados de Phytomonas, em múltiplas cópias (cerca de 104 cópias em P. serpens e 200 cópias em P. françai), contíguas e concentradas em uma banda cromossômica. Análises filogenéticas e amplificações por PCR com oligonucleotídeos degenerados apontam o clado Phytomonas-Leishmania como grupo-irmão de IPDCs de fitobactérias, sugerindo um processo de transferência horizontal anterior à separação dos tripanossomatídeos do clado que também inclui Leptomonas, Herpetomonas e Crithidia. / The genus Phytomonas is associated to devastating diseases in commercially important crops, whereas in other plant species no apparent damage is observed. The consensus sequence of one group of ESTs of P. serpens previously determined showed high similarity with indolepyruvate decarboxylases (IPDCs) from phytobacteria and putative pyruvate/indolepyruvate decarboxylases of Leishmania spp. The enzyme ipdC participates in the biosynthetic pathway of the indole-3-acetic acid, one of the most important plant hormones. We found that the IPDC gene is present in several Phytomonas isolates, in multiple copies (about 104 copies in P. serpens and 200 copies in P. françai, in tandem and concentrated in one chromosomal band. The phylogenetic analyses and data of PCR amplifications with degenerated primers point the clade Phytomonas-Leishmania as a sister group of IPDCs of phytobacteria, suggesting a process of horizontal gene transfer prior to the separation of the trypanosomatid clade that also includes Leptomonas, Phytomonas, Herpetomonas, Leishmania and Crithidia.

Um gene que codifica uma piruvato/indolpiruvato descarboxilase (PDC/IPDC) está presente no tripanossomatídeo de plantas Phytomonas serpens. A PDC atua na fermentação alcoólica, enquanto que a IPDC atua na biossíntese do fitormônio ácido indol-3-acético (AIA). Análises filogenéticas indicam que a PDC/IPDC de P. serpens é monofilética com IPDCs de gama-proteobactérias, sugerindo um evento de transferência horizontal gênica. A análise de meios de cultura de P. serpens confirma a produção de etanol e AIA. A funcionalidade do fitormônio foi confirmada em ensaios de alongamento de hipocótilos de tomateiros. Tomates inoculados com P. serpens mostraram aumento no teor de AIA-amida e -éster conjugados. A atividade PDC foi mostrada em extratos de P. serpens. Concluímos que a PDC/IPDC seria uma 2-cetoácido descaboxilase com atividade catalítica variável para diferentes substratos. A atividade PDC parece ser predominante em P. serpens, representando um mecanismo para oxidar parte do NADH formado na glicólise, principal responsável pela produção de ATP neste organismo. / A gene codifying a pyruvate/indolepyruvate decarboxylase (PDC/IPDC) is present in the plant trypanosomatid Phytomonas serpens. PDC acts in the alcoholic fermentation, whyle IPDC acts in the biosynthesis of the phytohormone indole-3-acetic acid (IAA). Phylogenetic analysis indicate that P. serpens PDC/IPDC is monophyletic with gamma-proteobacteria IPDCs, suggesting a horizontal gene transfer event. Analysis of P. serpens culture media confirms production of ethanol and IAA. The functionality of the phytohormone was confirmed by tomato hypocotyl elongation tests. Tomatoes inoculated with P. serpens showed an increase in the concentration of IAA amide and ester conjugated. PDC activity was shown in P. serpens extracts. We conclude that the PDC/IPDC would be a 2-keto acid decaboxylase with variable catalytic activity for different substrates. The PDC activity appears to be prevalent in P. serpens representing a mechanism to oxidize part of NADH formed in glycolysis, responsible for ATP production in this organism.

The thesis summarizes data gathered on various components of respiratory chain of Trypanosoma brucei. Namely, NADH:ubiquinone oxidoreductase (complex I), alternative NADH:ubiquinone oxidoreductase (NDH2) and mitochondrial glycerol-3-phosphate dehydrogenase are discussed themselves and in broader context of energy metabolism. Also, a work done using RNA interference library is described.

Submitted by Anderson Silva (avargas@icict.fiocruz.br) on 2012-07-20T17:10:28Z No. of bitstreams: 1 prisicila_mo_costa_ioc_bp_0037_2006.pdf: 2669544 bytes, checksum: 9b2e6aaf65027a066f8ad3713540db99 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-07-20T17:10:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 prisicila_mo_costa_ioc_bp_0037_2006.pdf: 2669544 bytes, checksum: 9b2e6aaf65027a066f8ad3713540db99 (MD5) Previous issue date: 2006 / Cnpq / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil. / O estudo de tripanosomatídeos de plantas teve início em 1909, quando foram encontradas formas flageladas em látex, sendo depois encontradas em floema, frutas e flores. Desde a refutada tentativa de Donovan de criar o gênero Phytomonas, temos atualmente, várias espécies classificadas dentro do gênero Phytomonas, incluíndo Phytomonas serpens, organismo alvo de nosso estudo. O ciclo de vida de P. serpens compreende planta e inseto. A transmissão é feita do tomate para inseto, do inseto para tomate. O vetor natural é o hemíptero Phthia picta (Hemiptera: Coriidae) que quando se alimenta de tomates infectados, se torna infectado após 10 a 15 dias, apresentando parasitos nas fezes, urina, tubo digestivo e glândulas salivares. Pouco se sabe sobre P. serpens e o conhecimento é ainda mais escasso se levarmos em conta todos os organismos dentro do gênero Phytomonas. O objetivo deste projeto é explorar o genoma de P. serpens gerando e analisando seqüências de seu genoma, aumentando o conhecimento deste organismo e comparando seu genoma com outros organismos. A cepa 9T de P. serpens (CT–IOC-174) foi cultivada a 27oC em meio Schneiders ́insect medium suplementado com 10% de soro fetal bovino. O DNA genômico foi extraído por lise alcalina para a construção da biblioteca genômica. O DNA foi parcialmente digerido com a enzima de restrição Sau3A. Os fragmentos de DNA com tamanhos entre 1-3 kb foram recuperados do gel de agarose e purificados. Os fragmentos de DNA foram clonados no sítio BamHI do vetor de clonagem pUC18. A reação de sequenciamento foi realizada na plataforma de sequenciamento ABI3730 – 48 capilar PDTIS/FIOCRUZ e na plataforma MegaBase na UERJ. Todas as seqüências foram armazenadas em banco de dados “open source” nos servidores Linux no Laboratório de Biologia Molecular de Tripanosomatídeos e Flebotomíneos (DBBM/IOC/FIOCRUZ). Foram seqüenciados 829 clones da biblioteca de DNA genômico obtendo-se um total de 379 seqüências GSS (Genomic Sequence Survey) de alta qualidade. Foram utilizadas para a complementação deste estudo, as seqüências do projeto EST de P. serpens que estavam disponíveis no GenBank. Os 221 clusters GSS e os 697 clusters de EST (Expressed Sequence Tag) foram comparados com o programa de busca de similaridade Blast a diferentes bancos de dados, utilizando como parâmetro evalue 10 -5, gerando 599 clusters com entradas positivas (Hits) e 303 clusters com nenhum hit, representando possíveis genes espécie específicos. Os clusters foram anotados de acordo com sua função quando comparados ao banco de dados Gene Ontology (GO) representando uma análise inédita no genoma de P.serpens. Inferências filogenéticas e de similaridade com o banco “Taxonomy” do NCBI foram realizados, usando inclusive seqüências do genoma ambiental, para verificar se as mesmas pertencem a Kinetoplastida, o que não se comprovou. As inferências filogenéticas realizadas com genes concatenados mostraram que P. serpens é mais próximo de T. cruzi, enquanto que inferências com genes individuais apontaram para L. major. Com base na literatura, inferimos que a análise da árvore de genes concatenados é correta. Foram encontradas com o GLIMMER 20 genes hipotéticos nas seqüências de GSS. Encontramos 22 cluters em GSS que não foram encontrados anteriormente em EST, como por exemplo, Piroglutamil-peptidase I, antígeno nuclear de proliferação celular (PCNA) e Peptidase_M8. / The study of trypanosomatids of plants began in 1909, when flagellate forms were found in latex from Euphorbiaceae, being later found in phloem, fruits/seeds and flowers in a wide variety of plants species. Since the refuted attempt of Donovan to create the genus Phytomonas, a great number of species were classified in the genus Phytomonas, including Phytomonas serpens, the major organism of our study. The described life cycle of P. serpens involves plant (tomato) and insect. The natural vector is the Coreid bug, Phthia picta (Hemiptera: Coriidae), that becomes infected 10 a 15 days after feeding on infected tomatoes, presenting the parasite in excrements, urine, digestive tube and salivary glands. Very little is known about these organisms and even less is known about the genus Phytomonas. The goal of this project is to explore the P. serpens genome by generating and analyzing sequences of its genome aiming to increase the knowledge of this organism and to analyze comparatively with genomes of other organisms. P. serpens infects tomatoes but we still have doubts about its pathogenicity. A strain of P. serpens 9T (CT-IOC-174) was cultured at 27oC in Schneiders ́insect medium supplemented with 10% heat-inactivated fetal bovine serum. The DNA was extracted by alkaline lyses for the construction of a genomic library. Genomic DNA was partially digested with the restriction enzyme Sau3A. DNA fragments with an average size of 1.0-3.0 kb were recovered and purified from agarose gel. DNA inserts were cloned into the BamHI restriction site of pUC18 cloning vector. The sequencing reaction was made at the Sequencing Platform ABI3730 - PDTIS/FIOCRUZ and MegaBase platform at UERJ. All the sequences were stored in an open source database in the Linux server in the Laboratory of Molecular Biology of Trypanosomatids and Phlebotomines (DBBM/IOC/FIOCRUZ). 829 clones of the P. serpens genomic DNA library were sequenced obtaining a total of 379 high quality sequences GSS (Genome Sequence Survey). Sequences from the EST (Expressed Sequence Tag) project of P. serpens available at GenBank were used for the complementation of this study. 221 GSS clusters and 697 EST clusters were compared with different databases with the similarity search program Blast, using evalue 10 -5 as default, obtaining 599 clusters with positive hits and 303 clusters without hit, indicating possible species-specific genes. 357 clusters that were identified when compared with Gene Ontology (GO) had their function classified, representing the first analysis of P. serpens genome using GO. Phylogenetics and similarity studies with Taxonomy database from NCBI were carried out confirming the position of P. serpens in relations to the others trypanosomatids and disclosing similarity with T. cruzi genome. The phylogenetic study included sequences of the enviromental genome, in order to verify if these sequences belong to the Kinetoplastid, what was not proven to be true. Phylogenetic studies using concatenated genes showed that P. serpens is phylogenetically closer to T. cruzi, but studies with individuals genes pointed to L. major. Based on literature, we infer that the analysis of the tree of concatenated genes is correct. 20 hypothetical genes in the GSS sequences were found with the GLIMMER. We found 22 clusters in GSS sequences that were not found in EST before, among others, Pyroglutamil-peptidase I, proliferating cell nuclear antigen (PCNA) and Peptidase_M8.