Les composés phénoliques de la baie, et plus particulièrement les flavonoïdes (flavonols, tanins condensés, anthocyanes), constituent un des paramètres clés contrôlant la qualité organoleptique du raisin et du vin. Ils représentent également une source de molécules antioxydantes d’intérêt grandissant pour les industries pharmacologiques, agro-alimentaires et cosmétiques. De nombreux travaux réalisés sur les plantes modèles ont démontré que la régulation de la voie de biosynthèse des flavonoïdes est essentiellement gouvernée par des facteurs de transcription de type MYB, bHLH et des protéines de type WD40. Chez la Vigne (Vitis vinifera L.), plusieurs facteurs de transcription de type MYB régulant la voie des anthocyanes et/ou des tanins condensés ont déjà été identifiés. Cependant, aucun facteur de transcription de type bHLH ou WD40 n’a encore été caractérisé. Différentes approches ont été mises en œuvre pour identifier de nouveaux régulateurs de la voie des flavonoïdes chez la Vigne. Dans un premier temps, le facteur de transcription VvMYB5b a été utilisé comme appât dans une approche de double hybride non ciblé chez la Levure (Saccharomyces cerevisiae). Dans un deuxième temps, le promoteur d’un gène codant une enzyme centrale de la voie de biosynthèse des flavonoïdes, VvDFR, a été choisi afin de développer une approche de simple hybride non ciblé chez la Levure. Enfin, une approche ciblée vers des « gènes candidats » a permis l’identification des facteurs de transcription de type bHLH VvMYC1 et VvMYCA1. Le profil d’expression de VvMYCA1 correspond à celui de l’accumulation des tanins condensés dans la pellicule, et celui de VvMYC1 corrèle avec le profil de synthèse des flavonols, des anthocyanes et des tanins condensés dans la baie de raisin, ainsi que dans les inflorescences. De plus, VvMYC1 peut interagir avec différents partenaires MYB de Vigne régulant la synthèse des anthocyanes et/ou des tanins condensés, à la fois dans la Levure mais également in planta, où l’interaction VvMYC1/VvMYBs affecte l’expression de gènes structuraux tels que l’UFGT et l’ANR. Cette interaction induit une synthèse d’anthocyanes, aussi bien en système homologue qu’en système hétérologue (Tabac et Arabidopsis). Enfin, des essais complémentaires impliquant le promoteur de VvMYC1 ont permis de démontrer que VvMYC1, en interagissant avec VvMYBPA1, peut moduler sa propre expression in vivo. / Phenolic compounds, and more specifically flavonoids (flavonols, condensed tannins and anthocyanins), are key components of the grapevine and wine quality. Because of their antioxidant activities, these compounds are of interest in pharmacological and cosmetic industries, as well as being beneficial to the human diet. Previous work on model plants showed that the flavonoid pathway was mainly regulated by the MYB and bHLH transcription factors, and WD40 proteins. In the grapevine (Vitis vinifera L.), only MYB regulators have been identified until now, and no bHLH or WD40 have been characterised. In this work, several approaches were used to identify new transcription factors involved in grapevine flavonoid biosynthesis. Firstly, the VvMYB5b protein was used as a bait in a large scale two hybrid experiment in yeast (Saccharomyces cerevisiae). Secondly, the promoter of the VvDFR gene, coding a central enzyme of the flavonoid pathway, was chosen to conduct a large scale one hybrid experiment, also in yeast. Finally, a “gene candidate” approach allowed identification of the bHLH transcription factors VvMYC1 and VvMYCA1. VvMYCA1 expression profile in berry skin and seeds correlates with condensed tannins synthesis, whereas VvMYC1 transcript accumulation in these tissues and the grapevine inflorescence correlates with condensed tannins, anthocyanins and flavonols accumulation. In yeast, VvMYC1 could physically interact with different MYB partners regulating the anthocyanin or the condensed tannins biosynthesis. This interaction was confirmed by transient promoter assays in grape cell suspensions, where co-expression of VvMYC1 with specific MYB partners activated the UFGT and ANR promoters. Likewise, this interaction induced anthocyanin accumulation in grape cells, as well as in tobacco leaves and Arabidopsis. Eventually, additional transient promoter assays revealed that VvMYC1 is involved, with VvMYBPA1, in feedback regulation of its own expression.

La résistance aux agents chimiothérapeutiques (Multidrug Resistance ou MDR) est caractérisée par la surexpression de différentes protéines membranaires de type ABC, parmi lesquelles, MRP1 et ABCG2 sont largement impliquées. Ces transporteurs diminuent les concentrations intracellulaires des agents chimiothérapeutiques en augmentant leur efflux de la cellule cancéreuse. Dans le but de contrecarrer cette chimiorésistance, nous avons conçu, synthétisé et étudié des activateurs de MRP1 et des inhibiteurs d'ABCG2. Les activateurs de MRP1 sont des dérivés de flavonoïdes et de vérapamil. Ces activateurs sont capables d'induire un efflux rapide et massif de glutathion cellulaire via MRP1 qui entraîne l'apoptose des cellules cancéreuses. Nous avons également conçu et synthétisé de nouveaux composés, dérivés de chromone, inhibiteurs sélectifs d'ABCG2, afin de restaurer la sensibilité des cellules cancéreuses aux agents chimiothérapeutiques. Mots clés : MRP1, ABCG2, flavonoïdes, analogues de vérapamil, chromones, inhibiteurs, activateurs

Ces dernières années, des progrès remarquables ont été accomplis afin d’élucider la biosynthèse des flavonoïdes. Cependant les dernières étapes menant à la formation des proanthocyanidines ou tannins condensés issus de la vigne, restent à ce jour inconnues. Dans le but de déterminer si une ou plusieurs enzyme(s) spécifique(s) sont impliquées dans cette voie de biosynthèse, nous avons développé une approche de protéomique chimique, impliquant des matrices d’affinité constituées de substrats de type flavanols greffés sur un support solide. La validation de ces outils à l’aide de LDOX, une enzyme issue de Vitis vinifera a pu être menée à bien dans le cadre de ces travaux de thèse. / Remarkable progress toward the complete elucidation of the biosynthesis of flavonoids has been accomplished during the last decade, but the final step leading to proanthocyanidins still remain to be elucidated, in particular, the exact nature of starter and extension units as well as the enzymatic or non enzymatic condensation process. In order to answer whether some specific enzymes are involved in the biosynthesis of grapevine proanthocyanidins, we have developped a chemical proteomics approach, with an affinity chromatography-based tool in which a flavanol type substrate is loaded on an appropriate solid support. The validation of these tools with the LDOX enzyme from Vitis vinifera was developped and performed in this Ph.D work.

L'objectif de la thèse est de contribuer à l'explicitation du lien au terroir, dans le cas de vins d'Appellation d'Origine Contrôlée. À ce lien au terroir correspond une typicité, qui correspond à des propriétés remarquables et partagées pour un groupe humain de référence. Le lien causal entre typicité et terroir a été étudié en prenant comme élément d'étude le chantier de vendange et les vinifications associées. La composition phénolique des vendanges, et leur aptitude à être extraits lors de la vinification ont permis de mieux interpréter le lien causal étudié. La représentation conceptuelle de la typicité, qui engendre des choix techniques, a été mise en évidence, du point de vue des critères sensoriels d'appartenance et des critères sensoriels de distinction. Cette représentation conceptuelle est en générale consensuelle, et les principaux facteurs du terroir, explicatifs du lien, correspondent au milieu physique. La représentation perceptuelle a été étudiée, permettant de mettre en évidence des descripteurs d'appartenance et de distinction, et de les hiérarchiser vis à vis de la perception globale de la typicité. Cette représentation est moins consensuelle. Les principaux facteurs du terroir, explicatifs du lien, correspondent aux actes techniques, en particulier la date de vendanges et la durée de cuvaison.Une évolution de la composition de la vendange en fonction du niveau de maturité a été mise en évidence d'un point de vue histologique, mais son interprétation est incomplète. L'aptitude des proanthocyanidines à être extraits, en fonction du niveau de maturité des baies est fortement corrélé à la perception globale de la typicité. Dans le cas de vins revendiquant un lien au terroir, certaines représentations de la typicité sont partagées, et engendrent des choix techniques (date de vendange, durée de cuvaison). L'importance de ces choix peut être démontré par l'étude de la composition de la vendange en composés phénoliques. Cependant, il existe un écart entre la typicité en tant que concept et la typicité telle qu'elle est sensoriellement perçue. / The aim of this work is to contribute to highlight the terroir effect, in the case of wines from delimited origin. The typicality is the result of the terroir effect and corresponds, to remarkable and shared properties for a human group of reference. The causal link between typicality and terroir was studied by taking into account the harvest date and the associated wine makings. The phenolic composition of the grape at harvest, and their extractability during the wine making made it possible to better interpret the studied causal link. The conceptual representation of the typicality, which generates technical choices, was highlighted, from the point of view of the sensory criteria of similarity and of distinction. This conceptual representation is in general consensual, and the main factors of the terroir, which explain the causal link, correspond to the soil and climate. The perceptual representation was studied, descriptors of similarity and distinction were highlighted, and theses descriptors were organized with respect to the global perception of the typicality. This representation is less consensual than conceptual one. The main factors of the terroir, which explain the causal link, correspond to the technical acts, particularly the harvest date and the vatting duration.Composition of the harvest, according to the level of maturity was highlighted from a histological point of view, but its interpretation was unfinished. The aptitude of the proanthocyanidins for being extracted, according to the level of maturity is strongly correlated for the global perception of the typicality. For wines related to terroir, some typicality representations are shared, and lead to technical choices (harvest date, duration of vatting). These choices are explained by the harvest composition. However, there is a difference between the typicality as a concept and the typicality as sensory perception.

Le transporteur de drogues membranaire MRP1 participe à la résistance des cellules cancéreuses à la chimiothérapie lorsqu’il est surexprimé. Cette surexpression peut être exploitée afin de provoquer l’apoptose sélective de ces cellules, MRP1 devenant leur talon d’Achille : c’est l’effet de sensibilité collatérale (SC). Ainsi, le vérapamil stimule l’efflux médié par MRP1 d’un tripeptide antioxydant indispensable aux cellules, le GSH ou glutathion réduit, et provoque la mort sélective des cellules surexprimant ce transporteur. La recherche d’autres agents de SC comme le vérapamil nous a menés à l’étude de composés flavonoïdiques pouvant induire un efflux rapide et massif de GSH. Parmi ces composés, nous avons identifié un puissant agent de SC des cellules résistantes surexprimant MRP1, le dimère de flavonoïde 4e, candidat très prometteur pour de futures études in vivo. Nous avons déterminé que la surexpression de MRP1 est effectivement responsable de la SC dans les cellules cancéreuses résistantes H69AR, et que l’efflux de GSH se doit d’être massif et prolongé pour induire l’apoptose des cellules. Nous avons montré que cet efflux perturbe l’homéostasie du glutathion et l’état redox des cellules, entraînant un stress oxydatif qui participe au déclenchement de la mort cellulaire. Enfin, nous nous sommes attachés à identifier d’éventuelles cibles secondaires des agents de SC dans les cellules surexprimant MRP1, via l’initiation de l’étude de leur transcriptome et métabolome. La compréhension du mécanisme d’action de ces agents de sensibilité collatérale vise, à terme, à l’éradication des cancers résistants surexprimant MRP1 / The membrane drug transporter MRP1 is involved in the resistance of cancer cells to chemotherapy, when overexpressed. This overexpression can be exploited in order to induce the selective apoptosis of these cells, so that MRP1 becomes their Achilles’ heel: this is called Collateral Sensitivity (CS). Thus verapamil stimulates the MRP1-mediated efflux of GSH (reduced form of glutathione) that is an antioxidant tripeptide essential for cells, and induces the selective death of MRP1- overexpressing cells. Seeking for other CS agents than verapamil led to the study of flavonoid compounds able to induce a massive and rapid efflux of GSH and to the identification of a powerful CS agent of resistant cells overexpressing MRP1, i.e. flavonoid dimer 4e, which is a very promising candidate for in vivo studies. We determined that overexpression of MRP1 is indeed responsible for CS in H69AR resistant cancer cells, and that GSH efflux must be massive and protracted in order to induce cell apoptosis. We showed that this efflux disturbs glutathione homeostasis and cell redox state, which leads to an oxidative stress that is involved in triggering cell death. At last, we sought to identify possible secondary targets of CS agents in MRP1-overexpressing cells, via the initiation of transcriptomic and metabolomic studies. Understanding the mechanism of action of these Collateral Sensitivity agents aims to the eradication of resistant cancers that overexpress MRP1

La symbiose Methylobacterium nodulans / Crotalaria podocarpa est une symbiose originale. En effet, la méthylotrophie, propriété remarquable de la bactérie, s'exprime à l'apex du nodule et modifie localement le métabolisme : une dégradation apicale marquée des tissus est observée suite à une digestion des parois végétales, libérant du méthanol directement utilisable par la bactérie. Grâce à ce métabolisme, le bactéroïde -de taille et de forme inhabituellement grandes- fournirait l'énergie nécessaire à l'activité de la nitrogénase, et permettrait à la plante d'accumuler des réserves carbonées sous forme d'amyloplastes dans les cellules infectées. Cette propriété méthylotrophique bactérienne apporte également à la plante-hôte un gain de biomasse (>40 % par rapport aux mutants non méthylotrophes). En revanche, à l'échelle de l'espèce, la crotalaire n'est pas avantagée, en termes de fixation d'azote, à s'associer avec M. nodulans ou avec Bradyrhizobium sp., autre genre bactérien décrit en symbiose avec ces plantes. L'originalité de cette association symbiotique se situe également au niveau du dialogue moléculaire : les gènes nod de M. nodulans sont insensibles aux isoflavones, flavonoïdes inducteurs des Bradyrhizobium, mais sont induits par les flavanones et les flavones. L'analyse phylogénétique des gènes nod révèle que M. nodulans forme une branche particulière avec Methylobacterium sp. 4-46 et Burkholderia tuberum STM678, isolées de nodules de Légumineuses appartenant à la tribu des Crotalariae. Au niveau du signal bactérien, une structure unique de facteur Nod a été caractérisée chez M. nodulans ORS2060T : MnV(C18:1, S). Enfin, si la symbiose fonctionnelle M. nodulans/ Crotalaria a été identifiée seulement chez trois espèces de ce genre, la capacité du partenaire bactérien à former des pseudonodules avec d'autres Crotalaria laisse entrevoir un rôle clé de plusieurs composés pendant le processus d'infection suggérant différents mécanismes moléculaires impliqués dans la spécificité d'hôte.

Le feu bactérien des Maloïdées ( Pommier, Poirier, ... ) est causé par la gamma-protéobactérie nécrogène, Erwinia amylovora (Ea), dont le pouvoir pathogène réside essentiellement dans sa capacité d'injection d'effecteurs protéiques dans la cellule hôte par un système de sécrétion de type III. L'objectif de la présente étude était de caractériser le pathosystème Ea-Pommier afin d'identifier les mécanismes régissant le devenir de l'interaction. Les résultats ont permis de montrer que la bactérie attaque principalement, chez un Pommier sensible (génotype MM106), le parenchyme lacuneux des feuilles et le parenchyme cortical des pétioles et tiges, et que cette progression s'accompagne d'une forte répression de la voie de l'acide jasmonique, et d'une forte activation de la voie de l'acide salicylique. A l'inverse, au niveau des feuilles d'un génotype de Pommier résistant (Evereste) plusieurs éléments sont en faveur d'un blocage rapide de la bactérie : (i) lignification importante du sclérenchyme sous-vasculaire dans les nervures, (ii) occlusion du xylème et (iii) modulations transitoires de l'expression de gènes de défense. Ce blocage rapide suggère par ailleurs l'implication de défenses constitutives. L'étude biochimique des dihydrochalcones (DHC), des flavonoïdes présents en très forte quantités dans les feuilles de Pommier, suggère qu'elles ne sont pas impliquées directement dans la résistance constitutive à Ea, malgré leurs propriétés antioxydante et antibactérienne. En revanche, il semble que leur transformation enzymatique, déglucosylation et oxydation, aboutissent, en fonction de leur prépondérance, à des produits qui pourraient jouer un rôle dans l'interaction.

La valorisation paysagère et horticole des espèces du genre Hydrangea est basée sur l'exploitation de leur diversité phénotypique s'exprimant notamment dans les formes architecturales et les coloris. La collection de ressources génétiques, située à Angers, comprend treize espèces introduites en Europe à partir du 18ème siècle. L'analyse de la composition chimique des inflorescences, réalisée pour la première fois sur l'ensemble du genre, permettra de compléter la caractérisation génétique des espèces et des clones. L'objectif de cette étude était ainsi d'analyser les profils phénoliques d'un ensemble de clones ainsi que la diversité intra et interspécifique existant dans la collection. La caractérisation structurale et la quantification de 80 composés phénoliques présents dans les inflorescences de 99 génotypes répartis dans 11 espèces du genre Hydrangea ont été réalisées. Ces composés se répartissent parmi 4 grandes classes chimiques : les flavonoïdes, les anthocyanes, les acides cinnamiques et les amines polyacylées. Une diversité importante existe entre les profils aussi bien des espèces que des sous-espèces. La structuration de cette diversité inter et intrapécifique est analysée. Ces connaissances nouvelles devraient permettre d'orienter les stratégies de conservation et de sélection.

La résistance aux agents chimiothérapeutiques (Multidrug Resistance ou MDR) est caractérisée par la surexpression de différentes protéines membranaires de type ABC, parmi lesquelles, MRP1 et ABCG2 sont largement impliquées. Ces transporteurs diminuent les concentrations intracellulaires des agents chimiothérapeutiques en augmentant leur efflux de la cellule cancéreuse. Dans le but de contrecarrer cette chimiorésistance, nous avons conçu, synthétisé et étudié des activateurs de MRP1 et des inhibiteurs d'ABCG2. Les activateurs de MRP1 sont des dérivés de flavonoïdes et de vérapamil. Ces activateurs sont capables d'induire un efflux rapide et massif de glutathion cellulaire via MRP1 qui entraîne l'apoptose des cellules cancéreuses. Nous avons également conçu et synthétisé de nouveaux composés, dérivés de chromone, inhibiteurs sélectifs d'ABCG2, afin de restaurer la sensibilité des cellules cancéreuses aux agents chimiothérapeutiques. Mots clés : MRP1, ABCG2, flavonoïdes, analogues de vérapamil, chromones, inhibiteurs, activateurs / Resistance to chemotherapeutic agents (Multidrug Resistance or MDR) is characterized by the overexpression of membrane ABC proteins, such as MRP1 and ABCG2. These transporters decrease intracellular concentrations of chemotherapeutic agents by increasing their efflux from the cancer cell. In order to find effective modulators of drug resistance, we have designed, synthesized and investigated MRP1 activators and ABCG2 inhibitors. We designed and synthesized new derivatives of flavonoids and verapamil as activators of MRP1. These activators are capable of inducing a rapid and massive efflux of intracellular glutathione via MRP1 and causing cells death by apoptosis. We have also designed and synthesized new compounds, derivatives of chromone, as selective inhibitors of ABCG2, to restore sensitivity of cancer cells to chemotherapeutic agents. The biological evaluation of investigated compounds enabled us to identify new activators of MRP1 as well as potent and selective inhibitors of ABCG2. Keywords: MRP1, ABCG2, flavonoids, verapamil analogs, chromone, inhibitors, activators

Les flavonoïdes sont des substances naturelles connues pour leurs propriétés anti-inflammatoires, anti-cancéreuses ou anti-virales chez l'homme. Chez les végétaux, ils participent notamment à leur protection vis-à-vis d'organismes pathogènes. La voie de biosynthèse des flavonoïdes est l'une des plus étudiées chez les plantes et notamment chez la vigne : Vitis vinifera. Cependant, la ou les enzymes impliquées dans les dernières étapes de biosynthèse conduisant aux anthocyanes et aux proanthocyanidines restent, à ce jour, peu ou pas connues. L’étude que nous proposons a pour but de concevoir des sondes moléculaires d’affinité susceptibles d’interagir avec une ou plusieurs enzymes impliquées dans ces dernières étapes de biosynthèse. Ces sondes, basées sur la technologie émergeante de protéomique chimique : « Activity- and affininity Based Protein Profiling » (ABPP), ont été validées à l’aide d’une enzyme modèle : la leucoanthocyanidine dioxygénase (LDOX). Elles ont ensuite été appliquées à des extraits complexes de protéines issus de Vitis vinifera. / Flavonoids are natural substances known for their anti-inflammatory, anti-cancerous and anti-virals properties in humans. In plants, they are one of the molecules responsible for fighting pathogens. The flavonoid biosynthesis pathway as been greatly studied in plants, especially in that of the grapevine: Vitis vinifera. However, detailed studies of the exact function of the enzymes involved in the last steps of the biosynthesis of anthocyanins and proanthocyanidins remains largely lacking.The study that we propose is to synthesize molecular probes designed to specifically interact with enzymes involved in the last stages of flavonoids biosynthesis. Our probes, based on the emerging chemical proteomic technology, activity- and affinity based protein profiling (ABPP), were validated with a model enzyme: leucoanthocyanidin dioxygenase (LDOX). After which, they were used with complex protein mixtures from Vitis vinifera.