Propriedades estruturais de membranas modelo, tais como as vesículas lipídicas, podem ser investigadas através da adição de sondas fluorescentes. Após sua incorporação aos sistemas biomoleculares, as moléculas fluorescentes são excitadas por luz linearmente polarizada e a emissão de fluorescência é despolarizada, devido à difusão translacional e também à difusão rotacional do fluoróforo, durante o tempo de vida do estado excitado. O monitoramento da luz emitida é feito através da técnica de fluorescência resolvida no tempo, em que são acompanhadas, por um lado, a intensidade da luz emitida, que fornece o tempo de decaimento da fluorescência, dependente do meio, e, por outro, o decaimento da anisotropia nas componentes da luz emitida, cujos tempos de correlação rotacional informam sobre a fluidez do meio. Uma molécula muito usada como sonda fluorescente é o DPH. Este fluoróforo, bastante hidrofóbico, possui simetria molecular uniaxial, e seus momentos de transição de absorção e emissão são colineares. Um dos usos desta sonda é no acompanhamentos da fluidez da bicamada lipídica ao longo da transição de fase das cadeias. A interpretação de dados experimentais requer modelos para a localização das moléculas fluorescentes, bem como para as possíveis restrições a seu movimento. Neste estudo, apresentamos três modelos para a difusão de moléculas fluorescentes uniaxiais, como o DPH, sugeridos em diversos artigos da literatura. O primeiro modelo consiste de um dipolo com rotação livre aleatória em solução homogênea, e serve como base para os modelos de difusão em meios anisotrópicos. No segundo modelo, consideramos rotações aleatórias dos dipolos reemissores no interior de cones distribuídos com seus eixos perpendiculares à vesícula esférica, geometria que pode refletir o movimento da sonda com eixo em media paralelo às cadeias lipídicas, restrito por elas. No terceiro modelo, o dipolo rotacional no plano da bicamada de geometria esférica, movimento que poderia ocorrer entre as monocamadas que constituem a bicamada. Para cada um dos modelos propostos analisamos a difusão rotacional da sonda através de dois métodos: (i) resolvemos a equação de difusão, para uma única molécula, levando em conta as condições de contorno impostas pelos modelos e determinamos a probabilidade da molécula ser encontrada com uma dada configuração em um tempo t. considerando a distribuição de moléculas na geometria proposta, obtemos a expressão analítica para a anisotropia de fluorescência. No caso da geometria do cone, a solução é obtida numericamente; (ii) realizamos simulações numéricas do passeio aleatório rotacional restrito, nas geometrias correspondentes, método muito útil no caso de geometrias de baixa simetria ou de composição de geometrias. Realizamos um estudo exploratório dos dados experimentais para DPH em membrana modelo, à luz dos resultados para os dois modelos propostos para este meio anisotrópico. / Structural properties of model membranes, such as lipid vesicles, may be investigated through the addition of fluorescent probes. After incorporation into the biomolecular system, the fluorescent molecules are excited with linearly polarized light and the fluorescence emission is depolarized due to translational as well as rotational diffusion during the life-time of the excited state. The monitoring of emitted light emitted informs on fluorescence decay times, and the decay of the components of the emitted light yield rotational correlation times which inform on the fluidity of the medium. The fluorescent molecule DPH, of uniaxial symmetry, is rather hydrophobic and has collinear transition and emission moments. It has been used frequently as a probe for the monitoring of the fluidity of the lipid bilayer along the phase transition of the chains. The interpretation of experimental data requires models for localization of fluorescent molecules as well as for possible restrictions on their movement. In this study, we develop calculations for three models for uniaxial diffusion of fluorescent molecules, such as DPH, suggested in several articles in the literature. The first model consists of a free randomly rotating dipole in a homogeneous solution, and serves as the basis for the study of the diffusion of models in anisotropic media. In the second model, we consider random rotations of emitting dipoles distributed within cones with their axes perpendicular to the vesicle spherical geometry: this could mimic the movement of the probe axis parallel to an average lipid chain. In the third model, the dipole rotates in the plane of the bilayer spherical geometry, within a movement that might occur between the monolayers forming the bilayer. For each of the models proposed, two methods are used by us in order to analyse the rotational diffusion: (1) solution of the corresponding rotational diffusion equation for a single molecule, taking into account the boundary conditions imposed by the models, for the probability of the fluorescent molecule to be found with a given configuration at time t. considering the distribution of molecules in the geometry proposed, we obtain the analytical expression for the fluorescence anisotropy, except for the cone geometry, for which the solution is obtained numerically; (11) numerical simulations of a rotational random walk restricted in geometries corresponding method very useful in case of low-symmetry geometries or geometries of composition. In this study, we have reproduced existing calculations, in some cases, extended calculations developed previously by other authors, in others, or, still, developed new calculations. As an application of our methodology for analysis of diffusional rotations, we have conducted an exploratory study of the experimental data for DPH in lipid bilayers, in the light of the results for the two models proposed for anisotropic media.

Foi estudado o comportamento fotofísico da 9-aminoacridina (9AA) e derivados, safranina O, auramina e 9-vinilantraceno, em partículas de sílica. Inicialmente, partículas de sílica obtidas comercialmente foram modificadas e marcadas com corantes acridínicos, porém sua morfologia tornou inviável o estudo fotofísico, devido à sua irregularidade. Foram preparadas nanoesferas de sílica, pelo método de Stöber, com diâmetro médio de 50 nm, que apresentaram altos sinais de fluorescência. Além disso, para evitar a dessorção dos marcadores nas nanopartículas em suspensão, foram preparadas nanopartículas do tipo cascacaroço, contendo um núcleo rico em marcador, protegido por uma casca de sílica. Estas nanopartículas, com diâmetro médio de 125 nm, mostraram-se excelentes matrizes para o estudo dos corantes, retardando sua difusão para o solvente. Foram ainda preparadas nanopartículas contendo poli(metacrilato de metila) marcado com derivado acridínico. A interação entre grupos silanol na superfície e o grupo N-H do marcador bloqueou o processo de transferência de carga intramolecular, característico do corante. Por fim, foram preparadas nanopartículas marcadas com 9-aminoacridina e safranina O. Na presença de safranina O, o tempo de vida de fluorescência referente à desativação do cromóforo acridina passou de 12,2 ns para 9,71 ns, indicando processos de transferência de energia e supressão de fluorescência, no interior das partículas. / Photophysical behavior of 9-aminoacridine (9AA) and derivatives, safranine O, auramine and 9-vinylanthracene was investigated, in silica particles. Firstly, commercial silica was modified and grafted with acridinic dyes; however, photophysical studies became unviable, due to its morphology. Silica nanospheres were prepared by Stöber method, with mean diameter of 50 nm, presenting high fluorescence emission. Moreover, in order to avoid de desorption of dyes from particles in suspension, systems containing a dye reach nucleus protected by silica shells were prepared (core-shell nanoparticles). The core-shell nanospheres, with mean diameter of 125 nm, are excellent matrixes for fluorescence studies, since it retards dye diffusion to the solvent. It was also prepared nanoparticles containing poly(methylmethacrylate) grafted with 9AA derivative. Interaction between silica silanol groups and dye N-H groups broke the intramolecular charge transfer, a characteristic process occurring in this dye. Finally, nanoparticles grafted with 9AA and safranine O were prepared. In the presence of safranine, fluorescence lifetime related to the deactivation of the chromophore acridine reduced from 12.2 ns to 9.71 ns, suggesting energy transfer and fluorescence quenching processes within the particles.

Neste trabalho foi investigado o controle do processo de fluorescência excitada por absorção de dois fótons no polímero conjugado MEH-PPV, utilizando um sistema de formatação espectral da fase dos pulsos ultracurtos. Para tal estudo, foi utilizado um oscilador laser de Ti:Safira (15 fs, ~ 800 nm e largura de banda de 60 nm). Através de dois distintos métodos de formatação, observa-se a influência destes no processo de fotodegradação do MEHPPV, inferido pela diminuição da intensidade do sinal de fluorescência. No primeiro método de formatação, é estudada a influência de diferentes chirps impostos aos pulsos no processo de fluorescência do MEH-PPV. Observa-se uma menor taxa de fotodegradação para pulsos com maiores chirps, independente do sinal, em comparação a pulsos no limite de transformada. Esse efeito foi relacionado ao acréscimo na duração temporal dos pulsos com chirp, com consequente diminuição da intensidade. Numa segunda etapa, através do uso de um espelho deformável, a fase espectral do pulso é formatada usando uma máscara de fase senoidal. Neste caso, a intensidade de fluorescência foi modulada em aproximadamente 25%, num claro processo de controle coerente, sem nenhuma diferença apreciável no processo de fotodegradação. Desta forma, técnicas de controle coerente com formatação espectral da fase poderiam ser utilizadas para modular a intensidade do sinal de fluorescência no MEH-PPV, sem detrimento ao processo fotodegradativo. / In this work we studied the control of two-photon excited fluorescence in the conjugated polymer MEH-PPV, using pulse-shaping techniques to manipulate the pulse spectral phase. The experiments were carried out with a Ti:sapphire laser oscillator (15 fs, ~ 800 nm and 60 nm of bandwidth). We investigated the influence of two distinct pulse-shaping methods in the MEH-PPV photodegradation, inferred by the decrease in the fluorescence intensity. In the first method, we studied the effect of different pulse chirps on the MEH-PPV fluorescence. A smaller photodegradation rate was observed for pulses with higher chirps, independently of its sing, in comparison with pulses close to the Fourier Transform limit. This effect was attributed to the increase in the pulse duration for chirped pulses, and consequent decrease in the pulse intensity. In a second stage, we modulate the pulse spectral phase by employing a senoidal phase mask though a deformable mirror. In this case, a 25% modulation in the fluorescence intensity was determined, whereas no considerable effect was observed in the photodegradation. In this way, coherent control techniques employing spectral phase pulse-shaping could be used to modulate MEH-PPV fluorescence, without any negative effect to its photodegradation.

Nos dias atuais, os pacientes tem uma grande preocupação com a estética dos dentes. Alterações de posicionamento é um exemplo de problema que o paciente tem interesse em resolver com o tratamento ortodôntico. No entanto, o próprio tratamento ortodôntico tem como característica o uso de acessórios que podem facilitar o acúmulo de resíduos alimentares e dificultar a higienização. Facilitando o desenvolvimento de lesões cariosas. Este estudo in vitro se propôs a avaliar o efeito do mascaramento de tecido dental desmineralizado quando restaurado com a resina infiltrante. Vinte superfícies vestibulares obtidas através de incisivos bovinos tiveram suas superfícies planificadas. Cada espécime foi individualizado de modo que toda leitura para recolhimento de dados fosse feita na mesma superfície. Os espécimes foram submetidos a análise por espectrofotômetro, para obtenção de coordenadas de cor, e a análise da perda mineral, através de quantificação de fluorescência induzida por luz (QLF), sendo que essas análises foram feitas nos tempos: inicial, pós ciclagem de pH, após restauração com a resina infiltrante e após hidratação da resina infiltrante. A análise inicial foi feita de modo a ser obtido o valores iniciais de cor e de conteúdo mineral dos espécimes. Após a leitura inicial, os espécimes foram submetidos a ciclagem de pH durante 16 dias, permanecendo diariamente em soluções desmineralizadora e remineralizadora por 6horas e 18 horas respectivamente. Após o desafio ácido, os espécimes foram avaliados, sendo este o tempo denominado Inicial. Em seguida os espécimes foram restaurados utilizando a resina infiltrante seguidos de nova avaliação, sendo este tempo denominado Icon. Os espécimes permaneceram em água destilada para hidratação da resina e submetidos a nova avaliação, sendo este tempo denominado Hidratado. Pode-se concluir que a variação total de cor (E), é perceptível ao observador comum, quando comparado à cor inicial com a cor após a restauração. Enquanto que a análise feita pelo QLF, a perda mineral não foi detectada após a hidratação da resina infiltrante. / In the present days, patients have a major concern with the aesthetics of teeth. Changes positioning is an example of a problem that the patient is interested in resolve with orthodontic treatment. However, the actual orthodontic treatment is characterized by the use of accessories that can facilitate the accumulation of food residues and hinders hygiene. This facilitates the development of caries lesions. This in vitro study aimed to evaluate the effect of masking demineralized dental tissue when restored with the infiltrant resin. Twenty buccal surfaces obtained from bovine incisors had planned their surfaces. Each specimen was individualized so that the entire data for analysis was done on the same surface. The specimens were analyzed by spectrophotometer for obtaining color coordinates, and the analysis of mineral loss through quantification of light-induced fluorescence (QLF), and these analyzes were made at times: initial pH cycling post, after restoration with resin infiltrating and. The specimens were analyzed by spectrophotometer for obtaining color coordinates, and the analysis of mineral loss through quantification of light-induced fluorescence (QLF), and these analyzes were made at times: initial pH cycling post, after restoration with resin infiltrating and infiltrating resin after hydration. The initial analysis was made in order to obtain the initial values of color and mineral content of the specimens.. After the initial reading, the specimens were subjected to pH cycling for 16 days, daily remaining in demineralizing and remineralizing solution for 6 hours and 18 hours respectively. After the acid challenge, the specimens were evaluated, this time called Inicial. Then the specimens were restored using resin infiltration followed new analysis, this time being named Icon. The specimens remained in distilled water for hydratation of the resin and subjected to new analysis, this time being called Hidratado. It can be concluded, that the total variation of color (E) is perceptible to the casual observer, when compared to the initial color with the color after restoration. While the analysis by QLF, the mineral loss was not detected after hydratation of resin infiltration.

Este trabalho teve por objetivo estudar as interações do corante auramina O em suspensões aquosas de argilas naturais e sintéticas, correlacionando as diferenças de comportamento do corante com as propriedades das argilas estudadas. Estes sistemas podem ser futuramente empregados no desenvolvimento de materiais híbridos corante-argila fotoativos. A Auramina O foi estudada nas argilas, utilizando-se espectroscopia de absorção molecular na região do UV - visível e técnicas de fluorescência estática e dinâmica. A fluorescência da Auramina O aumenta após a adição do corante na argila, devido à adsorção das moléculas de corante na superfície externa das argilas, que restringe o movimento de torção da Auramina. Em períodos mais longos, as moléculas do corante migram para a região interlamelar das partículas de argila. A agregação das moléculas de corante pode ocorrer na região interlamelar, conduzindo à diminuição da emissão de fluorescência. Os rendimentos quânticos de fluorescência (ΦF) da auramina O nas argilas montmorilonitas naturais SAz-1, SWy-1, e nas argilas sintéticas Syn-1 e Laponita RDS são 0,015; 0,007; 0,016 e 0,017, respectivamente. Estes valores são maiores do que o rendimento quântico de fluorescência (ΦF) da auramina em solução aquosa e são da mesma ordem de grandeza do ΦF encontrado para solventes viscosos investigados como n-hexanol e n-heptanol (0,014 e 0,015). Estudos de espectroscopia de fluorescência resolvidos no tempo da Auramina adsorvida em argilas revelaram decaimentos multiexponenciais com componentes nas faixas de 25-36 ps, 219-362 ps e 1300-1858 ps. Os componentes de vida curtos podem ser atribuídos às espécies ligadas à superfície externa e os componentes de maior tempo de vida são atribuídos a moléculas do corante nos espaços interlamelares, que interagem fortemente com a argila. Parece claro que, a adsorção da Auramina nas argilas provoca uma redução significativa da taxa de conversão interna que envolve a difusão de rotação, de modo que o corante é bloqueado em uma geometria desfavorável para a conversão conformacional interna. / This thesis aims to study the auramine dye interactions in the aqueous suspensions of natural and synthetic clays, correlating dye behavioral differences with the properties of the studied clays. The spectroscopic behavior of Auramine O in aqueous suspensions of montmorillonite clays was studied using absorption and static and dynamic fluorescence techniques. The fluorescence of Auramine O increases immediately after mixing the dye solution with the suspension of clay due to its adsorption on the external surface of the clays, which restricts the torsional molecular motion of Auramine. At longer times, the dye molecules migrate into the interlamellar region of the clay particles. Aggregation of the dye molecules can occur in the interlayer region, leading to the decrease of the fluorescence emission. The fluorescence quantum yields (ΦF) of auramine O on the natural montmorillonites SAz-1, SWy-1, Syn-1 and Laponite clays were 0.015, 0.007, 0.016 and 0.017, respectively. These values are higher than the ΦF of auramine O in aqueous solution and are of the same order of magnitude of the ΦF found for viscous solvents such as n-hexanol and n-heptanol (0.014 and 0.015). Time-resolved fluorescence spectroscopy studies of adsorbed Auramine on clays revealed multi-exponential decays with components in the 25-36 ps, 219-362 ps and 1300-1858 ps ranges. The short-lived components can be attributed to species bound to external surface and the longer lifetime is assigned to dye molecules in interlayer spaces interacting strongly with the clay. It seems clear that the binding of Auramine to clays causes a significant reduction of the rate of internal conversion that does involve rotational diffusion, so that the clay will be locked in a conformational geometry unfavorable for internal conversion.

Sensores ópticos possibilitam a determinação da temperatura de maneira rápida e à distância, em ambientes onde os sensores de contato padrão se mostram ineficientes, como centrais elétricas (fortes campos eletromagnéticos), circuitos eletrônicos e células biológicas (escala micrométrica). Estes dispositivos são baseados em variações de uma propriedade óptica de um dado material devido à variação de temperatura. A técnica da razão da intensidade de fluorescência (FIR) faz uso da variação das intensidades relativas das emissões de dois níveis termicamente acoplados de um centro emissor, muitas vezes um íon terra-rara trivalente. O neodímio (Nd3+) é comumente empregado por apresentar emissões na janela biológica óptica do infravermelho próximo. Neste trabalho, vidros fluorofosfatos dopados com Nd3+ são utilizados como materiais para determinação da temperatura através da FIR. As emissões são coletadas por uma fibra óptica conectada a um espectrômetro portátil, cujos espectros medidos são analisados por um software. Este sistema permite a determinação em tempo real das razões das intensidades de fluorescência e, consequentemente, da temperatura. Sensibilidades de até 1,96%/K são obtidas para a razão entre as emissões do Nd3+ em 800 e 870 nm. Já o uso da razão entre as intensidades das emissões em 750 e 870 nm resulta em sensibilidades que chegam a 2,46%/K. A adição de itérbio (Yb3+) aos vidros faz com que a sensibilidade chegue a 2,77%/K quando emissões de ambos os íons são comparadas. O papel dos fônons na transferência de energia entre os íons é analisado. Os valores de razão de fluorescência obtidos a partir da análise pela teoria de Judd-Ofelt são aproximadamente 25% inferiores aos obtidos experimentalmente, não permitindo, neste sistema, o cálculo a priori da curva de calibração do sensor. / Optical sensors enable fast and long-distance temperature measurements in environments where standard contact sensors are ineffective, such as power stations (strong electromagnetic fields), electronic circuits and biological cells (sub-micron scale). These devices are based on temperature induced changes in optical properties of a given material. The fluorescence intensity ratio technique (FIR) makes use of the relative emission intensities variation of two thermally coupled levels of an emission center, usually a trivalent rare-earth ion. Neodymium (Nd3+) is commonly employed as its emissions lie in the near-infrared biological optical window. Here, Nd3+-doped fluorophosphate glasses are employed as a temperature sensing material through the use of FIR. The emissions are collected by an optical fiber connected to a portable spectrometer, whose measured spectra are analyzed by a software. This system enables real-time determination of the fluorescence intensity ratios and, therefore, the temperature. Sensibilities as high as 1.96%/K are obtained through the ratio between 800 and 870 nm Nd3+ emissions. The use of the emission ratio between 750 and 870 nm results in 2,46%/K sensibilities. The addition of ytterbium (Yb3+) dopant to the glasses makes the sensibilities increase to 2,77%/K when the emissions from both ions are compared. The phonons role in the energy tranfer between the ions is analyzed. The fluorescence ratio values obtained via Judd-Ofelt analysis are approximately 25% lower than the experimentally obtained, thus preventing, in this system, a priori calculation of the sensors calibration curve.

A validade da técnica de espectroscopia de fluorescência como método de diagnóstico de lesões induzidas em borda lateral da língua de hamsters sírios dourados foi avaliada no presente estudo. O modelo animal com indução química empregando o DMBA (dimetilbenzantraceno) foi escolhido por apresentar fases de carcinogênese comparáveis as encontradas no desenvolvimento do carcinoma oral em humanos. Os grupos experimentais foram avaliados a cada duas semanas após a 4a semana de indução por um período de até 26 semanas. O sistema de espectroscopia de fluorescência utilizado é composto por: laser de excitação, sonda de investigação do tipo Y, espectrômetro e computador. Dois comprimentos de onda foram empregados para excitação dos tecidos biológicos: 442 e 532nm. A sonda de investigação possui uma fibra central para entrega do laser de excitação e seis fibras concêntricas que coletam a luz re-emitida pelo tecido. A fluorescência é analisada no espectrômetro no intervalo entre 378 e 842 nm. A investigação é pontual, e o resultado é um espectro por ponto. Após a leitura óptica, os animais foram sacrificados e a língua removida para análise histopatológica. A coleta dos espectros de autofluorescência foi realizada durante todo o desenvolvimento neoplásico e o estudo em função das características clínicas e principalmente do resultado histopatológico das lesões. Os espectros foram analisados de duas formas distintas: análise da correlação intra-espectral e análise inter-espectral através da análise de dados multivariados. A excitação em 442 nm produziu a melhor discriminação normal versus carcinoma. O melhor resultado foi o obtido com o * KNN, com índices de 95,7% de sensibilidade, 91,6% de especificidade e 94% de acurácia. No entanto, os resultados obtidos com a determinação dos coeficientes são considerados bons, quando da avaliação da validade do método, com 90,9% de sensibilidade, 813% de especificidade e 87,1% de acurácia. Com a determinação adequada do limite de discriminação resultados semelhantes aos da quimiometria puderam ser obtidos. / The diagnostic validity of the fluorescence spectroscopy in the discrimination of induced lesions at lateral border of the tongue of hamsters was investigated in this study. The animal model using chemical induction with DMBA (dimethylbenzanthracene) was chosen for the carcinogenesis phases comparable to the ones observed at oral cancer development in humans. The experimental groups were evaluated at each two weeks after the first four induction weeks until a total of 26 weeks. The fluorescence spectroscopy system employed is composed by: excitation laser, Y-type investigation probe, spectrometer and a computer. Two excitation wavelengths were used: 442 and 532 nm. The investigation probe has a central fiber for laser delivering and six concentric ones for reemitted light collection. The fluorescence is analyzed in the spectrometer in the 378-842 nm range. The optical investigation is punctual and the result is one spectrum per point. Then the animals were killed and the tongue removed for histopathological analysis. The spectra study was performed during the entire carcinogenesis process and the final analysis comparing to clinical and histopathological results. The spectra were evaluated in two ways: intra-spectral correlation analysis and inter-spectral analysis. The 442 nm excitation induced the best normal/carcinoma discrimination. The best result was achieved with the KNN analysis with 95.7% of sensitivity, 91.6% of specificity and 94% of accuracy. The discrimination using the intra-spectral analysis obtained 90.9%, 81.5% and 87.1% of sensitivity, respectively. However, using a discerning determination of the discrimination limit for classification it was possible to achieve similar results between the two employed analyses.

Níveis não aceitáveis de resíduos de ivermectina (IVM), uma droga anti-parasitária amplamente utilizada no Brasil para controle de endectoparasitas, pode estar presente no leite para consumo humano se administrada incorretamente. O nível máximo de resíduos no leite para este composto é de 10 ng mL-1 e sua presença tem sido comprovada em pesquisas realizadas por orgãos reguladores. Com o conhecimento deste problema, um método para a detecção de ivermectina em amostras de leite foi desenvolvido utilizando a extração líquido-líquido com base em acetonitrila e hexano, seguida por derivatização com 1-metilimidazol (MI), trietilamina (TEA), ácido anidro trifluoroacético (TFAA) e ácido trifluoroacético (TFA) e cromatografia líquida com detecção fluorescente (LC-FL) para a análise. Além disso, o método proposto foi testado de acordo com parâmetros de validação estabelecidos pela ANVISA. Parâmetros, tais como seletividade, linearidade (R² 0,98), precisão (coeficiente de variação entre 0,6-19%), recuperação (90-95%) e robustez foram avaliados durante o processo de validação. Subsequentemente, foi testado em amostras de leite de vacas tratadas com uma formulação comercial de ivermectina a 1%. O método aplicado em amostras de campo, provou possuir um perfil de quantificação e de confirmação para o método concebido no presente estudo. / Non-acceptable residue levels of ivermectin (IVM), an anti-parasitic drug widely employed in Brazil for control of endectoparasites, could be present in milk for human consumption if improperly administered. The maximum residue level in milk for this compound is 10 ng mL-1 and its presence has been proved from previous government surveys. With this rising subject, a method for the detection of ivermectin in milk samples was developed using liquid-liquid extraction based in acetonitrile and hexane, followed by derivatization with 1-methylimidazole (MI), triethylamine (TEA), anhydrous trifluoacetic acid (TFAA) and trifluoracetic acid (TFA) and liquid chromatography coupled to fluorescent detection (LC-FL) for the analysis. Moreover, the proposed method was tested according to validation parameters estabilished by ANVISA. Parameters, such as selectivity, linearity (R² 0.98), precision (RSD values between 0.6 19%), recovery (90-95%) and robustness were evaluated during the validation process. Subsequently it was tested in milk samples from cows treated with a commercial ivermectin formulation at 1%. The method applied to field samples, proved a quantifiable and confirmatory profile for the method designed in this study.

Atualmente o diagnóstico da morte súbita dos citros (MSC) é realizado através de inspeção visual e coleta do material do porta-enxerto o que confere ao método elevado grau de subjetividade e imprecisão, além de demandar muito tempo para o levantamento de dados de infestação. Este trabalho pretende estudar as mudanças nas propriedades físicas e químicas acarretadas pela MSC em folhas e porta-enxertos de laranjeira doces (Citrus (L.) Osbeck), e desenvolver uma nova metodologia de diagnóstico da doença. Para tanto, folhas, porta-enxertos e seus extratos foram analisados através das seguintes técnicas espectroscópicas: absorção de luz uv-visível, absorção de infravermelho com transformada de Fourier, fluorescência e fluorescência induzida por laser. Além do estudo utilizando técnicas espectroscópicas foram realizados estudos utilizando técnicas de imagem de fluorescência de folhas saudáveis e doentes. Foram coletadas amostras de folhas saudáveis, doentes com a MSC e doentes com o declínio dos citros (DC). A comparação entre estas doenças é primordial visto que no campo os sintomas são muito parecidos, confundindo muito o sistema de avaliação de contaminação. Foram observadas mudanças significativas nos espectros de emissão de fluorescência para os três tipos de amostras e baseados nestas diferenças foi definido um índice capaz de diagnosticar a MSC e o DC. A técnica de imagens de fluorescência também trouxe informações importantes permitindo diferenciar plantas saudáveis e doentes de uma forma muito rápida. A junção da técnica de imagens com as espectroscópicas deu origem a uma nova metodologia de diagnóstico da MSC com potencial de ser muito mais rápida, precisa e não invasiva permitindo análises da folha in natura. / Currently, the diagnosis of citrus sudden death (CSD) is carried out by visual inspection and collection of the rootstock, which causes the method to be inaccurate and allows for much subjectivity, besides demanding much time to examine the infestation data. The present work intends to study changes in the physical and chemical properties resulting in CSD of leaves and rootstock material of sweet orange trees (Citrus (L.) Osbeck), as well as developing a new diagnosis methodology of the disease. Thus, leaves, rootstock and their extracts were analyzed by means of the following spectroscopic techniques: absorption of uv-visible light, absorption of infrared with Fourier transform, fluorescence and laser-induced fluorescence. Besides employing spectroscopic techniques, studies using fluorescence images of healthy and sick leaves were carried out. Samples of healthy leaves, sick leaves with CSD and sick leaves with citrus decline (CD) were collected. Comparison of these diseases is primordial since in the field the symptoms are similar, causing much confusion in the evaluation system of contamination. Significant changes were observed in the spectra of fluorescence emissions for the three types of samples and based on such differences an index capable of diagnosing CSD and CD was defined. The fluorescence image techniques also brought important information, thus allowing to quickly differentiate between healthy and sick leaves. Joining the technique of images with spectroscopy originated a new methodology of CSD, which is potentially much faster, precise and non-invasive, thus allowing in natura analysis of leaves.

Os citros são as plantas economicamente mais importantes da fruticultura mundial. O Brasil responde por cerca de 30% da produção do planeta, e o Estado de São Paulo produz cerca de 80% dos citros do país. A pior ameaça atual a esse mercado é a doença bacteriana conhecida como greening ou huanglongbing (HLB), pela severidade dos sintomas, por afetar todas as variedades de citros e pela rapidez com que se espalha pelos pomares, transmitida pelo inseto psilídeo Diaphorina citri. O greening torna os frutos inúteis para consumo e leva à morte da planta. Não existe cura para a doença, de modo que o principal método de controle de infestação é a combinação das pulverizações, para reduzir a população do inseto vetor, com a erradicação das plantas doentes. Este último procedimento é efetuado porque a planta doente funciona como foco de propagação para o restante do pomar. Por isso, é importante identificar e erradicar a planta doente o mais cedo possível. Hoje, a identificação das plantas doentes é feita por inspeção visual. Esse método é muito pouco eficaz, pois, na ausência de frutos, os sintomas nas folhas não se manifestam de maneira uniforme em toda a planta e podem ser bastante sutis, sendo até confundidos com outras doenças. Além disso, as plantas inoculadas permanecem cerca de um ano sem manifestar sintoma algum. Por isso, a inspeção visual tipicamente identifica apenas cerca de 27% das plantas infectadas. O método de diagnóstico mais preciso disponível atualmente é a reação em cadeia de polimerase em tempo real (RT- PCR). Entretanto, essa técnica é trabalhosa e dispendiosa, o que torna impossível seu uso para o diagnóstico de grandes quantidades de plantas. Este trabalho propõe uma metodologia de diagnóstico baseada na obtenção de espectros de fluorescência induzida por laser (LIFS) das folhas e na aplicação de redes neurais artificiais para distinguir plantas sadias e doentes. Um experimento realizado no campo com pés de laranjeira Pêra-rio enxertada em limoeiro Cravo demonstrou que plantas sintomáticas podem ser diagnosticadas com eficiência de 87%. Um experimento controlado usando mudas de laranjeira Valência em citrumeleiro Swingle atestou que a técnica proposta também é capaz de diagnosticar plantas assintomáticas, obtendo taxas de acerto de até 63%. Da comparação dos resultados com os obtidos por RT-PCR constatou-se que a técnica aqui proposta apresenta taxa de acerto até duas vezes maior nos estágios iniciais do desenvolvimento da doença, até dois meses antes do aparecimento dos sintomas. Foram feitos também estudos preliminares da viabilidade do uso das técnicas de imagens de fluorescência induzida por laser (LIFI) e espectroscopia de emissão óptica com plasma induzido por laser (LIBS) para o diagnóstico precoce do greening. Os resultados foram bons em ambos os casos: na fase assintomática da doença, LIFI obteve sempre mais de 68% de acerto, e LIBS obteve mais de 62% em todos os casos. Todas as técnicas forneceram, portanto, resultados muito melhores que os da inspeção visual, e todas são mais viáveis que o RT-PCR, tanto pela rapidez quanto pelo custo envolvido. / Citrus plants are the most economically important fruit worldwide. Brazil accounts for about 30% of the planet\'s production, and the State of São Paulo produces 80% of citrus in the country. Nowadays, the worst threat to this market is the bacterial disease known as greening or huanglongbing (HLB), because it causes severe symptoms, affects all citrus varieties, and spreads very quickly through the orchards, being transmitted by the insect Diaphorina citri. The greening-affected fruits are useless and the plant dies. There is no healing for this disease, so the main method for infestation control is pulverization, to reduce the population of the vector insect, combined with eradication of diseased plants. The last procedure is done because the diseased plant acts as a focus, spreading HLB to the healthy trees around. Therefore, it is important to identify and eradicate the diseased plant as soon as possible. The identification of diseased plants is done currently by visual inspection. This method is very inefficient, because, in the absence of fruits, the leaf\'s symptoms do not appear uniformly throughout the plant and when appear they can be quite subtle, and even they can be mistaken for other diseases. Moreover, inoculated plants do not show any symptoms for about a year. This is why visual inspection typically identifies only about 27% of infected plants. At present, the most accurate method of diagnosis available is real-time polymerase chain reaction (RT-PCR). However, this technique is laborious and costly, making impossible to use it for large scale diagnosis. This study proposes a new diagnostic methodology carried out in the leaves, without any preparation, based on laser-induced fluorescence spectroscopy (LIFS) and artificial neural networks to distinguish diseased plants from healthy ones. A field experiment using Pêra-rio orange grafted on Cravo lemon plants has shown that symptomatic trees can be diagnosed with an efficiency of 87%. A controlled experiment using Valência orange on Swingle citrumelo trees testified that the proposed technique is also able to diagnose asymptomatic plants, achieving accuracy rates up to 63%. Comparison with results obtained by RT-PCR revealed that the technique proposed here achieves accuracy rates up to twice as high in the early stages of disease development, until two months before the onset of symptoms. Preliminary studies about the feasibility of laser-induced fluorescence imaging (LIFI) and laser-induced breakdown spectroscopy (LIBS) for greening early diagnosis were also performed. Results were good in both cases: in the symptomatic stage of the disease, LIFI always got more than 68% accuracy, and LIBS obtained more than 62% in all cases. All the techniques have provided thus far better results than those from visual inspection, and they all are more applicable than RT-PCR, because of quickness and low cost of analysis.