O objetivo deste estudo foi caracterizar bactérias multirresistentes (MDR) isoladas de cavalos saudáveis (fezes) e doentes no Brasil e na França. De março de 2012 a dezembro de 2014, amostras clínicas coletadas de cavalos saudáveis e doentes no Brasil foram selecionadas para pesquisa da presença de bactérias MDR. A investigação sobre as amostras franceses foi restria a isolados de Escherichia coli (EC) recuperados a partir de amostras clínicas coletadas entre 2014 e 2015. Nos cavalos brasileiros, a análise de amostras de fezes de animais saudáveis revelou a presença de clones de EC não relacionados pertencentes aos filogrupos A, D ou B2 que carreavam genes como: blaCTX-M-1, blaCMY-2, qnr- e genes add-tipo (amino-transferases); enquanto que nos cavalos doentes foram encontradas EC, Proteus mirabilis, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa e Serratia marcescens carreando genes blaCTX-M-15, blaCTX-M-1, rmtD 16S rRNA metilase, qnr-tipo, aac(6´)-Ib-cr e aad-tipo. Nos cavalos doentes franceses de EC MDR foram positivas para CTX-M-1, seguido de M-2- e M-9. Estes resultados destacam a importância de cavalos como um novo reservatório de bactérias MDR. / The aim of this study was to characterize multidrug-resistant (MDR) bacteria isolated from healthy and infected horses in Brazil and France. From March 2012 to December 2014, clinical samples collected from healthy and infected horses, in Brazil, were screened for the presence of MDR bacteria. Investigation on French isolates was restricted to E. coli strains recovered from clinical samples collected between 2014 and 2015. In Brazilian horses, the analysis of fecal samples from healthy animals revealed the presence of clonally unrelated A, D or B2 phylogroups of E. coli strains carrying blaCTX-M-1, blaCMY-2, qnr- and aminoglycoside adenyl transferase (aad)-type genes, whereas in infected horses, E. coli, Proteus mirabilis, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa and Serratia marcescens isolates carrying blaCTX-M-15, blaCTX-M-1, rmtD 16S rRNA methylase, qnr-type, aac(6´)-Ib-cr and aad-type genes. In French infected horses, most MDR E. coli isolates were positive for CTX-M-1-, followed by CTX-M-2- and CTX-M-9-type extended-spectrum beta-lactamases. These results highlight the importance of horses as a new reservoir of MDR bacteria.

Nesta dissertação são apresentadas a síntese e caracterização de duas novas substâncias, consideradas aqui como metalo-fármacos em potencial: o composto iônico (C17H19FN3O3)3[RuCl6].3H2O e o complexo [Ru(C17H17FN3O3)3].4H2O, obtidos através da reação entre RuIII e a fluoroquinona ciprofloxacina em diferentes condições de síntese (meio ácido ou neutro e refluxo, respectivamente). O espectro ESI MS em modo positivo de (C17H19FN3O3)3[RuCl6].3H2O exibiu um pico principal em m/z = 994,6 que foi atribuído ao aduto (ciprofloxacina)3.H+ em fase gasosa, enquanto [Ru(C17H17FN3O3)3].4H2O apresentou picos m/z em 1093,3 e 547,1, atribuídos aos íons [Ru(C17H17FN3O3)3].H+ e [Ru(C17H17FN3O3)3].2H+, respectivamente. Os resultados de análise térmica estão em concordância com os conteúdos de água propostos para as duas substâncias. Os espectros de absorção em meio aquoso são dominados pelas transições da ciprofloxacina na região UV. Não obstante, duas bandas foram observadas em 421 e 496 nm no caso de (C17H19FN3O3)3[RuCl6].3H2O, e atribuídas à transição de transferência de carga e à transição d-d, respectivamente; no caso de [Ru(C17H17FN3O3)3].4H2O, apenas um ombro largo em torno de 450 nm foi observado na região do Visível, tendo sido atribuído à uma transição d-d. O voltamograma cíclico deste complexo exibiu um processo quase-reversível em 0,25 V (versus EPH) enquanto o composto iônico apresentou o mesmo processo em 0,11 V, sugerindo que, neste caso, o íon central de rutênio é estabilizado no estado de oxidação III através da coordenação dos átomos de oxigênio das três unidades de ciprofloxacina. O complexo de coordenação é estável por mais de 48 horas em pH fisiológico, estomacal e intestinal. Ambos foram incubados nas condições estomacais (pH = 1,5 e temperatura = 370C) e não causaram diminuições significativas nos valores de pH. / This work presents the synthesis and characterization of two potential new metallodrugs, the ionic (C17H19FN3O3)3[RuCl6].3H2O and the coordination [Ru(C17H17FN3O3)3].4H2O compounds, by combining ruthenium (III) and the fluoroquinolone ciprofloxacin in different synthetic conditions (acid media or neutral and reflux conditions, respectively). The ESI MS (positive mode) spectrum of the ionic compound displayed a main peak at m/z = 994.6, which was assigned to the gaseous phase adduct (ciprofloxacin)3.H+, while the coordination compound featured peaks at m/z 1093.3 and 547.1 ascribed to the singly and doubly charged ions [Ru(C17H17FN3O3)3].H+ and [Ru(C17H17FN3O3)3].2H+, respectively. Thermal analysis corroborated the proposed water content for both complexes. The absorption spectra of the compounds in aqueous medium are dominated by the ciprofloxacin transitions in the UV region but two bands were observed at 421nm and 496nm for the ionic compound, assigned to a charge transfer and d-d transitions. In the case of the coordination compound only a broad shoulder around 450 nm was observed in the visible region, also assigned to a ligand field transition The cyclic voltammograms of the [Ru(C17H17FN3O3)3] complex exhibited a quasi-reversible process ascribed to the Ru(II) / (III) redox pair at -0.25 V (vs SHE) while compound (C17H19FN3O3)3[RuCl6] displayed this process at -0.11V, showing that the central ruthenium ion is stabilized in the (III) oxidation state by the coordination to the hard oxygen atoms of the ciprofloxacin ligand. The coordination compound is stable under physiological, stomachal and intestinal pH over 48 hours. Both compounds are stable incubated under stomachal conditions (pH=1.5 and 37oC) without significant pH lowering.

O objetivo deste estudo foi caracterizar bactérias multirresistentes (MDR) isoladas de cavalos saudáveis (fezes) e doentes no Brasil e na França. De março de 2012 a dezembro de 2014, amostras clínicas coletadas de cavalos saudáveis e doentes no Brasil foram selecionadas para pesquisa da presença de bactérias MDR. A investigação sobre as amostras franceses foi restria a isolados de Escherichia coli (EC) recuperados a partir de amostras clínicas coletadas entre 2014 e 2015. Nos cavalos brasileiros, a análise de amostras de fezes de animais saudáveis revelou a presença de clones de EC não relacionados pertencentes aos filogrupos A, D ou B2 que carreavam genes como: blaCTX-M-1, blaCMY-2, qnr- e genes add-tipo (amino-transferases); enquanto que nos cavalos doentes foram encontradas EC, Proteus mirabilis, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa e Serratia marcescens carreando genes blaCTX-M-15, blaCTX-M-1, rmtD 16S rRNA metilase, qnr-tipo, aac(6´)-Ib-cr e aad-tipo. Nos cavalos doentes franceses de EC MDR foram positivas para CTX-M-1, seguido de M-2- e M-9. Estes resultados destacam a importância de cavalos como um novo reservatório de bactérias MDR. / The aim of this study was to characterize multidrug-resistant (MDR) bacteria isolated from healthy and infected horses in Brazil and France. From March 2012 to December 2014, clinical samples collected from healthy and infected horses, in Brazil, were screened for the presence of MDR bacteria. Investigation on French isolates was restricted to E. coli strains recovered from clinical samples collected between 2014 and 2015. In Brazilian horses, the analysis of fecal samples from healthy animals revealed the presence of clonally unrelated A, D or B2 phylogroups of E. coli strains carrying blaCTX-M-1, blaCMY-2, qnr- and aminoglycoside adenyl transferase (aad)-type genes, whereas in infected horses, E. coli, Proteus mirabilis, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa and Serratia marcescens isolates carrying blaCTX-M-15, blaCTX-M-1, rmtD 16S rRNA methylase, qnr-type, aac(6´)-Ib-cr and aad-type genes. In French infected horses, most MDR E. coli isolates were positive for CTX-M-1-, followed by CTX-M-2- and CTX-M-9-type extended-spectrum beta-lactamases. These results highlight the importance of horses as a new reservoir of MDR bacteria.

O presente estudo visou determinar a prevalência de bactérias Gram-negativas produtoras de produzem b-lactamases de amplo espectro (ESBL) e resistência adquirida a quinolonas mediada por plasmídeos (PMQR) em animais de estimação, investigando o potencial papel destes hospedeiros como portadores assintomáticos. Em 2012, foram coletadas 216 amostras (fezes e saliva) de 108 animais de companhia (29 gatos e 79 cães) abrigados em casas de família, um centro de acolhimento de animais abandonados, e no Centro de Controle de Zoonoses da Cidade de São Paulo. Do total de cepas estudadas, 85% apresentaram fenótipo sugestivo de PMQR; enquanto que 62% dos isolados exibiram um fenótipo característico e sugestivo para produção de ESBL, sendo na sua maioria identificadas como E. coli. Dentre os isolados, 14 carregaram variantes do gene blaCTX-M, 9 foram positivos para o gene blaTEM, e 6 foram positivos para blaSHV. Em relação às cepas resistentes às Q/FQ, 56% (n= 43) foram positivas para a presença do gene qnr, o qual foi identificado em 11 espécies diferentes. Os resultados apresentados demostram que animais de companhia podem ser portadores assintomáticos de cepas produtoras de ESBL e PMQR. / The present study aimed to determine the prevalence of Gram-negative bacteria producing b-lactamases producing broad-spectrum (ESBL) and acquired resistance to quinolones mediated by plasmids (PMQR) in pets, investigating the potential role of these hosts as asymptomatic carriers. In 2012, 216 samples (feces and saliva) of 108 companion animals (29 cats and 79 dogs) housed in shelters or a Zoonosis Control Center were collected from São Paulo city. Of the total strains studied, 85% had a phenotype suggestive for PMQR; while 62 % of the isolates exhibited a characteristic phenotype and suggestive for ESBL-producing genes, with the most identified as E. coli. Among the isolates, 14 carried variants blaCTX -M gene 9 were positive for blaTEM gene, and 6 were positive for blaSHV. Regarding resistant Q/FQ isolates, 56% (n = 43) were positive for the presence of qnr gene, which was identified on 11 different species. The results presented demonstrate that pets can be asymptomatic carriers of ESBL producing strains and PMQR.

Introdução. Quinolonas são antimicrobianos sintéticos que inibem as enzimas DNA-girase e topoisomerase IV resultando na morte bacteriana. São altamente eficazes no tratamento de infecções bacterianas, especialmente causadas por bactérias Gram negativas, e portanto amplamente utilizados na medicina humana e veterinária, na qual também são empregados como profiláticos. Porém, o uso indiscriminado e inadequado levou ao aumento de bactérias resistentes a estes compostos. Esta resistência pode ocorrer devido a mutações nas enzimas DNA-girase e topoisomerase IV, e também por genes contidos em plasmídeos. Estes últimos são os principais responsáveis pela disseminação e circulação da resistência entre o meio ambiente e o ambiente hospitalar. Objetivos. Pesquisar genes de resistência a antimicrobianos do grupo das quinolonas em bactérias Gram negativas de origem clínica e ambiental que apresentam resistência fenotípica a este grupo. Material e Métodos. 73 cepas de Enterobacteriaceae e Aeromonas sp. de origem clínica e ambiental foram selecionadas para o estudo, e avaliadas quanto à sensibilidade aos antimicrobianos do grupo das quinolonas e à pesquisa de genes de resistência a este mesmo grupo e mutações no gene que codifica a enzima DNA-girase por meio de PCR e sequenciamento. Resultados. Das 73 cepas previamente selecionadas para compor o estudo, 65 foram utilizadas, devido à exclusão de perfis clonais similares. Nestas, foram observados os genes, qnrS1 (1,5 por cento ), qnrS2 (26,2 por cento ), qnrB1 (3,1 por cento ), qnrB19 (12,3 por cento ), qnrD1 (1,5 por cento ), aac(6)-Ib-cr (10,8 por cento ), oqxA (43,1 por cento ) e oqxB (41,5 por cento ), e duas variantes determinadas qnrB-like (3,1 por cento ) e qnrB69-like (1,5 por cento ). Os genes qnrA, qnrC e qepA não foram identificados. Mutações na enzima DNA-girase foram observadas em 97,9 por cento das cepas positivas para algum dos genes pesquisados. Em 4 cepas foi possível estabelecer a associação do gene aac(6)-Ib-cr com integron de classe 1. Foi realizado sequenciamento e caracterização do plasmídeo completo onde estava inserido o gene qnrD1. Conclusões. Este estudo relata pela primeira vez no Brasil a ocorrência dos genes qnrS2, oqxA e oqxB, a associação entre o elemento genético integron de classe 1 e o gene aac(6)-Ib-cr, e o gene qnrD1 e a caracterização do plasmídeo completo onde este estava inserido. Os genes qnrB1, qnrB19, e aac(6)-Ib-cr, anteriormente apenas relatados em cepas clínicas, foram observados em cepas ambientais. Os resultados deste estudo mostram alta frequência de genes de resistência a quinolonas tanto em isolados clínicos quanto em isolados ambientais, alertando quanto à disseminação da resistência entre fontes diferentes, e possível manutenção destes genes por cepas ambientais. / Introduction. Quinolones are synthetic antimicrobial agents that inhibit DNA gyrase and topoisomerase IV enzymes resulting in bacterial death. They are highly effective in the treatment of bacterial infections, especially the ones caused by Gram negative bacteria, as well as for prophylaxy. Therefore they are widely used in human and veterinary medicine. However, indiscriminate and improper use led to an increase of bacteria resistance to these compounds. This resistance can be due to mutations in DNA gyrase and topoisomerase IV enzymes and also by genes contained in plasmids, which are mainly responsible for the spread and transmission of resistance between the environment and the hospital set. Objectives. To search for genes of resistance to quinolone antimicrobial agents in Gram-negative bacteria from clinical and environmental strains that present phenotypic resistance to this group. Material and Methods. 73 strains of Enterobacteriaceae and Aeromonas spp., from clinical and environmental origin, were selected for this study, and evaluated for antimicrobial susceptibility of quinolone and search of resistance genes in this same group and also for mutations in the gene encoding the enzyme DNA gyrase by PCR and sequencing. Results. Of the 73 strains previously selected to compose this study, 65 were used, due to the exclusion of similar clonal profiles. In these, genes qnrS1 (1.5 per cent ), qnrS2 (26.2 per cent ) qnrB1 (3.1 per cent ), qnrB19 (12.3 per cent ) qnrD1 (1.5 per cent ) aac(6\')-Ib-cr (10.8 per cent ) oqxA (43.1 per cent ) and oqxB (41.5 per cent ) were observed, and two variants were named as qnrB-like (3.1 per cent ) and qnrB69-like (1.5 per cent ). The qnrA, qnrC and qepA genes were not identified. Mutations in DNA gyrase enzyme were observed in 97.9 per cent of the positive strains for at least one of the genes studied. It was possible to establish the association of aac(6\')-Ib-cr with class 1 integron gene in four strains. Complete sequencing and characterization of plasmid qnrD1, where the gene was inserted, was performed. Conclusions. This study reports, for the first time in Brazil, the occurrence of qnrS2, oqxA and oqxB genes, the association between genetic element integron class 1 gene and the aac (6 \')-Ib-cr, and qnrD1 gene and the characterization of the complete plasmid where this was inserted. qnrB1, qnrB19, and aac(6\')-Ib-cr genes, previously only reported in clinical strains, were observed in environmental strains. The results of this study show a high frequency of quinolone-resistance genes for both clinical and environmental isolates, warning about the spread of resistance through different sources, and the possible maintenance of these genes by environmental strains.

Atividades antropogênicas relacionadas ao uso massivo de antibacterianos tem favorecido para que ambientes aquáticos sejam importantes locais para seleção e/ou disseminação de bactérias multirresistentes (MR). O objetivo do estudo foi monitorar a ocorrência de bactérias MRs em ambientes aquáticos públicos no estado de SP, caracterizando genótipos de resistência adquirida. Foram analisados 50 isolados de bactérias gram-negativas, recuperadas de amostras de água, sendo que 70% dos isolados apresentaram perfil de MR, identificando-se os genes blaCTX-M-2 (n= 5), blaCTX-M-9 (n= 1), blaCTX-M-15 (n= 2), blaKPC-2 (n= 3), qnrB (n= 1), oqxA (n= 3), oqxB (n= 3) e, aac(6)1b-cr (n= 7). Destaca-se a primeira detecção de A. calcoaceticus produtora de KPC-2. Ambientes aquáticos de acesso público podem ser importantes fontes para a disseminação e/ou transmissão de uma ampla variedade de espécies bacterianas MRs tanto para seres humanos como para ecossistemas associados, sendo que a presença de genótipos endêmicos sugere contaminação por esgoto doméstico e/ou hospitalar. / Anthropogenic activities related to the massive use of antibacterial has contributed to the selection and spread of multidrug-resistant (MDR) into the aquatic environment. This study aimed to monitor the occurrence of MDR bacteria in public aquatic environments, in the state of São Paulo, characterizing genotypes of acquired resistance. Of the 50 gram-negative isolates, recovered of water samples, 70% exhibited a MDR profile. Indeed, blaCTX-M-2 (n= 5), blaCTX-M-9 (n= 1), blaCTX-M-15 (n= 2)-, blaKPC-2 (n= 3)-, qnrB (n= 1)-, oqxA (n= 3)-, oqxB (n= 3)- and aac(6)-1b-cr (n = 7) genes were identified. Noteworthy is the first the detection of KPC-2-producing Acinetobacter calcoaceticus. Aquatic environments, with public access, may be important sources for the dissemination and/or transmission of a wide variety of MDR bacterial species to both humans and associated ecosystems. Moreover, the presence of endemic genotypes suggests contamination by domestic and/or hospital sewage.

As micobactérias de crescimento rápido causam infecções pulmonares, infecções relacionadas a traumas cutâneos e aos cuidados com a saúde. Ha um número reduzido de opções terapêuticas para o tratamento dessas infecções e os dados nacionais sobre os determinantes genéticos dessa resistência são escassos. Duas classes de antimicrobianos importantes no tratamento são as fluorquinolonas e os macrolídeos. Enquanto a maioria dos isolados do Grupo M. chelonae-abscessus apresenta resistência intrínseca às fluorquinolonas, e são sensíveis aos macrolídeos, a maioria dos isolados do Grupo M. fortuitum é sensível às fluorquinolonas e expressa RNA-metilases que impedem a ação dos macrolídeos. Os determinantes da resistência às fluorquinolonas conhecidos em micobactérias são mutações no gene gyrA e para os macrolídeos é a expressão de genes erm, que codificam RNA-metilases. Nos dois casos os determinantes tem localização cromossômica. Outros determinantes de resistência podem ter localização plasmidial, a exemplo do gene aacA4\'-8, presente em plasmídio do grupo de incompatibilidade IncP, detectado em M. abscessus, que codifica resistência à kanamicina e tobramicina. Neste estudo foram avaliados: a correlação entre à susceptibilidade ao ciprofloxacino e moxifloxacino e presença de mutações nos genes gyrA e gyrB; a susceptibilidade à claritromicina e presença de genes que codificam RNA-metilases; a presença de plasmídios do grupo de incompatibilidade IncP em diferentes espécies de micobactérias; a estabilidade e a transferência por conjugação do plasmídio pBRA-100; a relação clonal entre isolados que albergam plasmídios IncP e o perfil de susceptibilidade antimicrobiana de uma coleção de isolados da espécie M. abscessus. Cento e vinte e dois isolados dos Grupos M. abscessus e M. fortuitum foram analisados quanto às concentrações inibitórias mínimas, por microdiluição, utilizando-se o painel RAPMYCO®. As sequências parciais dos genes gyrA e gyrB e a presença de genes que codificam RNA-metilases foram determinadas em 69 e 59 desses isolados, respectivamente. A presença de plasmídios do grupo IncP foi determinada por PCR e os produtos de amplificação tiveram suas sequencias caracterizadas. A estabilidade do plasmídio pBRA-100 em Escherichia coli TOP10® foi avaliada realizando-se repiques sucessivos por 57 dias e semeadura em agar LB contendo kanamicina. A transferência horizontal foi avaliada por ensaio de conjugação com E. coli J53 resistente à azida sódica. Em M. abscessus não houve diferença entre as sequencias da região QRDR de GyrA e GyrB entre isolados sensíveis e resistentes ao ciprofloxacino. Em M. abscessus subsp. abscessus e M. abscessus subsp. bolletii todos os isolados testados apresentaram genes erm; entretanto não foi observada correlação entre a presença dos genes e resistência indutiva a claritromicina. O gene erm(45), descrito neste trabalho, foi detectado apenas em M. abscessus subsp. bolletii. Os ensaios de microdiluição evidenciaram que os antimicrobianos mais ativos contra M. abscessus subsp. abscessus foram amicacina (89%), tigeciclina (96%) e claritromicina (86%). Apenas nos dois isolados da espécie M. fortuitum resistentes ao ciprofloxacino foi detectada a substituição S83W na proteína GyrA. Trata-se de substituição ainda não descrita em micobactérias. Nao foi observada correlação entre substituições em GyrB e resistência ao ciprofloxacino ou moxifloxacino. O gene erm(46), descrito neste estudo, foi detectado em 65% dos isolados. Nos demais isolados foram detectados três outros genes: erm(47), erm(48) e erm(49), ainda nao descritos. Os plasmídios IncP foram detectados apenas em \"M. massiliense\" pertencentes a três grupos clonais distintos com índice de similaridade maior que 92%, quando analisados por ERIC-PCR. Houve sucesso na conjugação entre E. coli TOP-Myco e E. coli J53. Os ensaios de estabilidade evidenciaram que o plasmídio pBRA-100 é estável em E. coli com aproximadamente 100% da população bacteriana albergando o plasmídio após 57 subcultivos. / The rapidly growing mycobacteria cause lung infections, skin infections related to trauma and health care associated infections. There are a limited number of therapeutic options for treating these infections and national data on the genetic determinants of this resistance are scarce. Two major classes of antimicrobials used in treatment of these infections are macrolides and fluoroquinolones. While the majority of the isolates from M. chelonae-abscessus Group have intrinsic resistance to fluoroquinolones, and are sensitive to macrolides, most isolates from M. fortuitum Group are sensitive to fluoroquinolones and express RNA methylases that prevent the action of macrolides. The known fluoroquinolones resistance determinants in to mycobacteria are mutations in thegyrA gene and for macrolides the main determinant is the expression of erm genes which encode RNA methylases. In both cases the determinants are located at the chromosome. Other resistance determinants may have a plasmidial location, such as aacA4\'-8 gene, present in the pBRA100 plasmid detected in M. abscessus, which encodes resistance to kanamycin and tobramycin. This study evaluated the correlation between the susceptibility to ciprofloxacin and moxifloxacin and mutations in genes gyrA and gyrB; susceptibility to clarithromycin and the presence of RNA-methylases encodinggenes , the presence of plasmids of the incompatibility group IncP in different species mycobacteria; stability and conjugal transfer of plasmid pBRA-100; the clonal relationship between isolates harboring plasmids IncP and antimicrobial susceptibility profile of a collection of isolates of M. abscessus. One hundred and twenty-two isolates of M. chenolae-abscessus and M. fortuitum Groups were analyzed for their minimal inhibitory concentrations by microdilution, using the RAPMYCO® Panel. The partial sequences of the genes gyrA and gyrB and the presence of genes encoding RNA methylases were determined in 69 and 59 isolates, respectively. The presence of IncP group plasmids was determined by PCR and the sequence of PCR products were characterized. The stability of the pBRA-100 plasmid in Escherichia coli TOP10® was evaluated by performing successive subcultures for 57 days, and plating on LB agar containing kanamycin. The horizontal transfer was evaluated by conjugation with E. coli J53 a sodium azide resistant strain. In M. abscessus no differences between the sequences of the QRDR region of gyrA or gyrB among isolates susceptible and resistant to ciprofloxacin were observed. In M. abscessus subsp. abscessus and M. abscessus subsp. bolletii all isolates tested had erm genes; however there was no correlation between the presence of these genes and inducible resistance to clarithromycin. The erm(45), gene described in this paper, was only detected in M. abscessus subsp. bolletii. Microdilution tests showed that the most active antibiotics against M. abscessus subsp. abscessus were amikacin (89%), tigecycline (96%) and clarithromycin (86%). In only in two M. fortuitum isolates resistant to ciprofloxacin the amino acid substitution S83W was detected in GyrA. This substitution had not been described mycobacteria. No correlation was observed between substitutions in GyrB and resistance to ciprofloxacin or moxifloxacin. The erm(46) gene described in this study, was detected in 65% of the isolates. In the remaining isolates other three not yet described genes were detected: erm(47), erm(48) and erm(49). IncP plasmids were detected only in \"M. massiliense\" belonging to three clonal groups with at similarity index greater than 92% when analyzed by ERIC-PCR.We succeeded in conjugating E. coli TOP-Myco and E. coli J53. The stability tests showed that the plasmid pBRA-100 is stable in E. coli since approximately 100% of the bacterial population harbored the plasmid after 57 subcultures.

Atividades antropogênicas relacionadas ao uso massivo de antibacterianos tem favorecido para que ambientes aquáticos sejam importantes locais para seleção e/ou disseminação de bactérias multirresistentes (MR). O objetivo do estudo foi monitorar a ocorrência de bactérias MRs em ambientes aquáticos públicos no estado de SP, caracterizando genótipos de resistência adquirida. Foram analisados 50 isolados de bactérias gram-negativas, recuperadas de amostras de água, sendo que 70% dos isolados apresentaram perfil de MR, identificando-se os genes blaCTX-M-2 (n= 5), blaCTX-M-9 (n= 1), blaCTX-M-15 (n= 2), blaKPC-2 (n= 3), qnrB (n= 1), oqxA (n= 3), oqxB (n= 3) e, aac(6)1b-cr (n= 7). Destaca-se a primeira detecção de A. calcoaceticus produtora de KPC-2. Ambientes aquáticos de acesso público podem ser importantes fontes para a disseminação e/ou transmissão de uma ampla variedade de espécies bacterianas MRs tanto para seres humanos como para ecossistemas associados, sendo que a presença de genótipos endêmicos sugere contaminação por esgoto doméstico e/ou hospitalar. / Anthropogenic activities related to the massive use of antibacterial has contributed to the selection and spread of multidrug-resistant (MDR) into the aquatic environment. This study aimed to monitor the occurrence of MDR bacteria in public aquatic environments, in the state of São Paulo, characterizing genotypes of acquired resistance. Of the 50 gram-negative isolates, recovered of water samples, 70% exhibited a MDR profile. Indeed, blaCTX-M-2 (n= 5), blaCTX-M-9 (n= 1), blaCTX-M-15 (n= 2)-, blaKPC-2 (n= 3)-, qnrB (n= 1)-, oqxA (n= 3)-, oqxB (n= 3)- and aac(6)-1b-cr (n = 7) genes were identified. Noteworthy is the first the detection of KPC-2-producing Acinetobacter calcoaceticus. Aquatic environments, with public access, may be important sources for the dissemination and/or transmission of a wide variety of MDR bacterial species to both humans and associated ecosystems. Moreover, the presence of endemic genotypes suggests contamination by domestic and/or hospital sewage.

Introdução. Quinolonas são antimicrobianos sintéticos que inibem as enzimas DNA-girase e topoisomerase IV resultando na morte bacteriana. São altamente eficazes no tratamento de infecções bacterianas, especialmente causadas por bactérias Gram negativas, e portanto amplamente utilizados na medicina humana e veterinária, na qual também são empregados como profiláticos. Porém, o uso indiscriminado e inadequado levou ao aumento de bactérias resistentes a estes compostos. Esta resistência pode ocorrer devido a mutações nas enzimas DNA-girase e topoisomerase IV, e também por genes contidos em plasmídeos. Estes últimos são os principais responsáveis pela disseminação e circulação da resistência entre o meio ambiente e o ambiente hospitalar. Objetivos. Pesquisar genes de resistência a antimicrobianos do grupo das quinolonas em bactérias Gram negativas de origem clínica e ambiental que apresentam resistência fenotípica a este grupo. Material e Métodos. 73 cepas de Enterobacteriaceae e Aeromonas sp. de origem clínica e ambiental foram selecionadas para o estudo, e avaliadas quanto à sensibilidade aos antimicrobianos do grupo das quinolonas e à pesquisa de genes de resistência a este mesmo grupo e mutações no gene que codifica a enzima DNA-girase por meio de PCR e sequenciamento. Resultados. Das 73 cepas previamente selecionadas para compor o estudo, 65 foram utilizadas, devido à exclusão de perfis clonais similares. Nestas, foram observados os genes, qnrS1 (1,5 por cento ), qnrS2 (26,2 por cento ), qnrB1 (3,1 por cento ), qnrB19 (12,3 por cento ), qnrD1 (1,5 por cento ), aac(6)-Ib-cr (10,8 por cento ), oqxA (43,1 por cento ) e oqxB (41,5 por cento ), e duas variantes determinadas qnrB-like (3,1 por cento ) e qnrB69-like (1,5 por cento ). Os genes qnrA, qnrC e qepA não foram identificados. Mutações na enzima DNA-girase foram observadas em 97,9 por cento das cepas positivas para algum dos genes pesquisados. Em 4 cepas foi possível estabelecer a associação do gene aac(6)-Ib-cr com integron de classe 1. Foi realizado sequenciamento e caracterização do plasmídeo completo onde estava inserido o gene qnrD1. Conclusões. Este estudo relata pela primeira vez no Brasil a ocorrência dos genes qnrS2, oqxA e oqxB, a associação entre o elemento genético integron de classe 1 e o gene aac(6)-Ib-cr, e o gene qnrD1 e a caracterização do plasmídeo completo onde este estava inserido. Os genes qnrB1, qnrB19, e aac(6)-Ib-cr, anteriormente apenas relatados em cepas clínicas, foram observados em cepas ambientais. Os resultados deste estudo mostram alta frequência de genes de resistência a quinolonas tanto em isolados clínicos quanto em isolados ambientais, alertando quanto à disseminação da resistência entre fontes diferentes, e possível manutenção destes genes por cepas ambientais. / Introduction. Quinolones are synthetic antimicrobial agents that inhibit DNA gyrase and topoisomerase IV enzymes resulting in bacterial death. They are highly effective in the treatment of bacterial infections, especially the ones caused by Gram negative bacteria, as well as for prophylaxy. Therefore they are widely used in human and veterinary medicine. However, indiscriminate and improper use led to an increase of bacteria resistance to these compounds. This resistance can be due to mutations in DNA gyrase and topoisomerase IV enzymes and also by genes contained in plasmids, which are mainly responsible for the spread and transmission of resistance between the environment and the hospital set. Objectives. To search for genes of resistance to quinolone antimicrobial agents in Gram-negative bacteria from clinical and environmental strains that present phenotypic resistance to this group. Material and Methods. 73 strains of Enterobacteriaceae and Aeromonas spp., from clinical and environmental origin, were selected for this study, and evaluated for antimicrobial susceptibility of quinolone and search of resistance genes in this same group and also for mutations in the gene encoding the enzyme DNA gyrase by PCR and sequencing. Results. Of the 73 strains previously selected to compose this study, 65 were used, due to the exclusion of similar clonal profiles. In these, genes qnrS1 (1.5 per cent ), qnrS2 (26.2 per cent ) qnrB1 (3.1 per cent ), qnrB19 (12.3 per cent ) qnrD1 (1.5 per cent ) aac(6\')-Ib-cr (10.8 per cent ) oqxA (43.1 per cent ) and oqxB (41.5 per cent ) were observed, and two variants were named as qnrB-like (3.1 per cent ) and qnrB69-like (1.5 per cent ). The qnrA, qnrC and qepA genes were not identified. Mutations in DNA gyrase enzyme were observed in 97.9 per cent of the positive strains for at least one of the genes studied. It was possible to establish the association of aac(6\')-Ib-cr with class 1 integron gene in four strains. Complete sequencing and characterization of plasmid qnrD1, where the gene was inserted, was performed. Conclusions. This study reports, for the first time in Brazil, the occurrence of qnrS2, oqxA and oqxB genes, the association between genetic element integron class 1 gene and the aac (6 \')-Ib-cr, and qnrD1 gene and the characterization of the complete plasmid where this was inserted. qnrB1, qnrB19, and aac(6\')-Ib-cr genes, previously only reported in clinical strains, were observed in environmental strains. The results of this study show a high frequency of quinolone-resistance genes for both clinical and environmental isolates, warning about the spread of resistance through different sources, and the possible maintenance of these genes by environmental strains.

<i>Staphylococcus aureus</i> is a ubiquitous organism causing world-wide morbidity and mortality. This species readily develops resistance to antimicrobial agents. Current dosing strategies are based, in part, on minimum inhibitory concentrations (MICs). This susceptibility test fails to detect the presence of first-step resistant mutants often present in large heterogeneous populations of infecting bacteria. Dosing strategies based on MIC results may, in fact, allow for the selective proliferation of resistant subpopulations. The mutant-prevention concentration (MPC) is the drug concentration at which all first-step resistant mutants will be eradicated along with the susceptible cells. Determination of the mutant-selection window (MSW) is possible using MIC and MPC data. When considered together with achievable drug concentrations in human bodily sites, the MSW helps determine which antimicrobials are likely to select for resistance. MIC and MPC testing on clinical isolates of methicillin-susceptible (MSSA) and -resistant (MRSA) S. aureus was performed. Characterization via the polymerase chain reaction, sequencing, and electron microscopy (EM) was done on selected organisms recovered from MPC studies (MPC-recovered). MIC and MPC testing was performed on organisms isolated sequentially from patients with recurring S. aureus infections. Pulsed field gel electrophoresis was performed on these sequential isolates. Based on the MIC and the MPC values, the most potent agents for systemic MSSA and MRSA infections are gemifloxacin and vancomycin, respectively. Re-testing MPC-recovered populations by the MIC showed increased MIC results compared to the parent populations. Macrolide-resistance genes were discovered in S. aureus MPC-recovered populations; in contrast, parental isolates lacked these resistance determinants. EM revealed an increase in cell wall thickness of a vancomycin MPC-recovered population compared to its parental population. Moxifloxacin and vancomycin had the lowest and narrowest MSWs for systemic MSSA and MRSA infections, respectively, compared to the other agents tested. Sequential isolates showed no change in MIC and MPC values. The data presented provides evidence for the application of the MPC test to S. aureus organisms. The MPC data is significant when determining appropriate dosing strategies aimed at preventing resistance.