Made available in DSpace on 2014-10-09T12:53:00Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2014-10-09T13:58:25Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Dissertação (Mestrado) / IPEN/D / Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN/CNEN-SP

Made available in DSpace on 2015-04-17T15:03:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 1426849 bytes, checksum: b6c01a1f2fb0576dc2e9444cd722636c (MD5) Previous issue date: 2014-02-27 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / The development of tolerance in S. aureus when exposed to sublethal stress conditions used in food preservation has been observed. Despite the use of the essential oil from Origanum vulgare L. (OVEO) as a preservative in food be considered a promising alternative, there is a lack of scientific studies about its ability to induce the development of direct tolerance and cross-tolerance by food-borne pathogen bacteria. The aim of this study was to investigate the capability of the OVEO to inhibit the growth of Staphylococcus aureus strains isolated from foods, and to evaluate the development of direct tolerance and/or cross-tolerance to salts and organic acids typically used by the food industry after habituation in sublethal amounts of OVEO. Four strains of S. aureus (FRI-S-6; FRI-196-3; FRI-326; ATCC 13565) producing enterotoxins A, B, D and E were used as test-organisms. The values of Minimum Inhibitory Concentration (MIC) of OVEO, sodium chloride (NaCl), potassium chloride (KCl), acetic acid (AA) and lactic acid (LA) were determined by the microdilution method. The ability of strains of enterotoxigenic S.aureus to develop direct tolerance and/or cross-tolerance to NaCl, KCl, AA and LA was evaluated after the exposure of these strains to sulethal amounts (½ MIC and ¼ MIC) of OVEO in Brain Heart Infusion broth (BHI) for 72 hours, followed by the determination of the MIC values of the tested antimicrobial agents. The induction of direct tolerance and/or cross-tolerance was assessed by comparing the MIC values of the antimicrobials against the tested strains before and after the habituation treatment with sublethal amounts of OVEO. The assays were performed in triplicate and the results were expressed in modal value. MIC values of OVEO, NaCl, KCl, AA and LA against the test strains were 2,5-10 μL.mL-1, 200 mg.mL-1, 300 mg.mL-1, 2,5 μL.mL-1e 10 μL.mL-1, respectively. After the exposure of the strains to sublethal concentrations (½ MIC and ¼ MIC) of OVEO, MIC values of this essential oil against the habituated cells were maintained the same or decreased up to five-fold when compared to the non-habituated cells, revealing no induction of direct tolerance. The OVEO not induced the development of cross-tolerance to NaCl, KCl, AA and LA, since the MIC values of these antimicrobials against test strains habituated to sublethal amounts (½ MIC and ¼ MIC) of OVEO were the same or up to six-fold lower when compared to those obtained against the non-habituated cells. These data suggest that sublethal concentrations of OVEO can be applied in food preservation safely, since this essential oil did not induced direct tolerance or cross-tolerance to the tested S. aureus strains. / O desenvolvimento de tolerância em S. aureus frente a condições de estresse subletal aplicadas na conservação dos alimentos tem sido observado. Apesar do uso do óleo essencial de Origanum vulgare L. (OEOV) como conservante em alimentos ser considerado uma alternativa promissora, poucos estudos científicos têm avaliado sua capacidade de induzir o desenvolvimento de tolerância direta e cruzada em bactérias patogênicas de origem alimentar. O objetivo desse estudo foi investigar a capacidade do OEOV em inibir o crescimento de cepas de Staphylococcus aureus isoladas de alimentos, bem como avaliar o desenvolvimento de tolerância direta e/ou cruzada a sais e ácidos orgânicos comumente utilizados pela indústria alimentícia após a exposição das cepas a concentrações subletais do OEOV. Foram utilizadas quatro cepas de S. aureus (FRI-S-6; FRI-196-3; FRI-326; ATCC 13565) produtoras de enterotoxinas. A Concentração Inibitória Mínima (CIM) do OEOV, cloreto de sódio (NaCl), cloreto de potássio (KCl), ácido acético (AA) e ácido láctico (AL) foi determinada através do método de microdiluição em caldo. A capacidade das cepas enterotoxigênicos de S. aureus desenvolverem tolerância direta e/ou cruzada ao NaCl, KCl, AA e AL foi observada mediante a exposição dessas cepas a quantidades subletais (½ CIM e ¼ CIM) do OEOV em caldo Brain Heart Infusion (BHI) durante 72 horas e posterior determinação da CIM dos agentes antimicrobianos ensaiados. A indução de tolerância bacteriana direta e/ou cruzada foi avaliada através da comparação dos valores de CIM dos antimicrobianos contra as cepas teste antes e após sua habituação às quantidades subletais do OEOV. Os ensaios foram realizados em triplicata e os resultados foram expressos em valores de moda. Os valores de CIM do OEOV, NaCl, KCl, AA e AL contra as cepas de S. aureus testadas foram 2,5 - 10 μL.mL-1, 200 mg.mL-1, 300 mg.mL-1, 2,5 μL.mL-1e 10 μL.mL-1, respectivamente. Após a exposição das cepas às concentrações subletais (½ CIM e ¼ CIM) do OEOV, os valores de CIM desse óleo essencial frente às células habituadas se mantiveram os mesmos ou reduziram até cinco vezes quando comparados aos das células não habituadas, revelando que não houve indução de tolerância direta. O OEOV não induziu o desenvolvimento de tolerância cruzada ao NaCl, KCl, AA e AL, uma vez que os valores de CIM desses antimicrobianos contra as cepas teste habituadas ao OEOV foram iguais ou até seis vezes menores comparados àqueles obtidos contra as células não habituadas. Estes dados sugerem que concentrações subletais do OEOV podem ser aplicadas na conservação de alimentos de forma segura, uma vez que esse óleo essencial não induziu o desenvolvimento de tolerância direta ou cruzada sobre as cepas de S. aureus testadas.

Dissertação composta por 2 artigos. / INTRODUÇÃO E OBJETIVOS ─ Nos produtos cárneos industrializados cozidos a maior parte da microbiota é inativada pela aplicação de calor em processo que simula uma pasteurização. Esses produtos também recebem aditivos em sua composição que geram efeito inibidor no crescimento de determinados grupos de microrganismos. Com a microbiota patogênica reduzida a níveis aceitáveis, em amostras embaladas a vácuo ou em atmosfera modificada, criam-se condições para o crescimento de bactérias ácido láticas (BAL), descritas como microrganismos Gram positivos, não formadores de esporos, catalase negativa, desprovidos de citocromos, anaeróbios facultativos, fastidiosos, mesofílicos, ácidos tolerante, com metabolismo estritamente fermentativo, que produzem ácido láctico como o principal produto final da fermentação de carboidratos. O desenvolvimento desses microrganismos gera aroma, sabor e aspecto indesejável nos produtos cárneos. Tendo em vista estas considerações, o objetivo geral desse trabalho foi avaliar a possibilidade da inibição do crescimento de BAL em amostras de presunto fatiado embalado a vácuo, pela aplicação de bacteriocinas. Os objetivos específicos incluíram: a quantificação e identificação das espécies de BAL predominantes nas amostras de presunto cozido fatiado embalado a vácuo; o estudo dos ingredientes que compõem a formulação do presunto cozido combinados com nisina e pediocina, realizados em caldo Man Rogosa e Sharp (MRS) pela aplicação da estratégia de planejamento experimental aliada à microbiologia preditiva na avaliação do crescimento do Lactobacillus sakei; a validação dos resultados obtidos nos caldos MRS na matriz alimentar a partir da elaboração de três formulações envolvendo a utilização da nisina e uma formulação controle, submetidas a análises físico-químicas e microbiológicas durante a vida de prateleira do produto. MÉTODOS ─ Inicialmente foi realizada a quantificação das BAL totais presentes, para 4 lotes semanais de presunto cozido fatiado embalado a vácuo, nos tempos de 1 e 45 dias de armazenamento a 4 C e 8 C. Paralelamente foi realizada a identificação fenotípica dos gêneros presentes; adicionalmente, no tempo de 45 dias foram realizadas análises moleculares do gene 16S rRNA para a identificação das espécies predominantes, por meio da qual selecionou-se a espécie Lactobacillus sakei. Posteriormente, utilizou-se uma estratégia sequencial de planejamento experimental, que objetivou estudar a inibição do crescimento celular da espécie Lactobacillus sakei em caldo MRS, aplicando-se um Planejamento Fatorial Fracionário 26-2 com as variáveis cloreto de sódio, tripolifosfato de sódio, lactato de sódio, eritorbato de sódio e as bacteriocinas nisina e pediocina. Adicionalmente foi realizado um Delineamento Composto Central Rotacional (DCCR) 22 objetivando otimizar a aplicação de nisina e pediocina por meio da redução das concentrações aplicadas que apresentassem eficiência semelhante, considerando os altos custos desses ingredientes. As respostas estudadas em ambos delineamentos experimentais foram os parâmetros preditos pelos ajuste das curvas de crescimento ao Modelo de Gompertz Modificado, a citar a população máxima atingida (A), velocidade específica máxima de crescimento () e a duração da fase lag (). Para a validação dos resultados obtidos na etapa de estudo em caldo MRS, foram elaboradas três formulações teste (com diferentes concentrações de nisina) e uma controle (sem adição de nisina) para o acompanhamento da vida de prateleira do produto por meio de análises físico-químicas e microbiológicas. PRINCIPAIS RESULTADOS ─ Foram observadas contagens médias de 1,98 log UFC.g-1 no tempo 1 dia; 7,59 log UFC.g-1 a 4 C e 8,25 log UFC.g-1 a 8 C no tempo 45 dias para a contagem total de BAL. As espécies predominantemente identificadas no tempo de 45 dias foram o Lactobacillus curvatus e o Lactobacillus sakei. Na etapa de estudo em caldo MRS, os resultados do Planejamento Fatorial Fracionário evidenciaram que o tripolifosfato de sódio, a nisina e a pediocina, foram as variáveis com efeito estatisticamente significativo (p ≤ 0,05) na inibição do crescimento do Lactobacillus sakei. No Delineamento Composto Central Rotacional, a nisina foi a variável que apresentou efeito significativo na inibição do crescimento do Lactobacillus sakei, indicando a possibilidade de redução na concentração aplicada para níveis inferiores ao indicado pela legislação brasileira (12,5 mg/Kg), com efeito semelhante na inibição. A validação dos estudos em caldo MRS pela aplicação das quantidades reduzidas de nisina (indicadas pelo DCCR) na matriz alimentar, mostrou que a quantidade mínima aplicada (0,001%) apresentou um efeito semelhante na inibição das BAL em relação à quantidade máxima aplicada (0,013%); sendo em ambos os casos eficiente quando comparada à amostra controle. DISCUSSÃO E CONCLUSÃO ─ De acordo com os resultados obtidos, verificou-se que os principais gêneros de BAL envolvidos na deterioração das amostras de presunto cozido fatiado embalado a vácuo, armazenadas durante 45 dias a 4 C e 8 C, foram o Lactobacillus curvatus e Lactobacillus sakei. A contagem de BAL totais após 45 dias mostrou-se significativamente influenciada pela temperatura de armazenamento, pois as contagens foram maiores para as amostras armazenadas a 8 C quando comparadas às armazenadas a 4 C. Dentre os ingredientes comumente adicionados na formulação do presunto cozido, o tripolifosfato de sódio mostrou efeito significativo na inibição do Lactobacillus sakei nos estudos em caldo MRS. De forma semelhante, a nisina e a pediocina mostraram efeito significativo na redução das contagens do microrganismo estudado quando avaliados pela aplicação de um Planejamento Fatorial Fracionário. No Delineamento Composto Central Rotacional envolvendo as variáveis nisina e pediocina com faixas de estudos redefinidas, a nisina apresentou efeito significativo na inibição do Lactobacillus sakei, quando aplicada em concentrações inferiores ao estipulado pela legislação brasileira. Os resultados obtidos no Delineamento Composto Central Rotacional foram validados pela aplicação das quantidades otimizadas de nisina na matriz alimentar, que mesmo na concentração mínima (0,001%) mostrou um efeito similar ao obtido pela aplicação da concentração máxima (0,013%). A contagem de BAL e bactérias aeróbias mesófilas (BAM) totais mostrou-se inferior para as amostras contendo nisina quando comparada com a amostra controle, em torno de 2 a 3 ciclos logarítmicos para as BAL, e 3 ou 4 ciclos logarítmicos para as BAM; em relação ao pH, o mesmo manteve-se praticamente inalterado até o final da vida de prateleira (60 dias), enquanto o pH da amostra controle diminuiu de forma significativa. De um modo geral constatou-se que o presunto cozido fatiado embalado a vácuo é um produto com condições favoráveis ao desenvolvimento de BAL deteriorantes, a citar as espécies Lactobacillus curvatus e Lactobacillus sakei, e que dentre as bacteriocinas estudadas, a nisina apresentou efeito na inibição do Lactobacillus sakei nos estudos em caldo MRS e também na inibição das BAL deteriorantes totais no presunto cozido fatiado embalado a vácuo, mesmo em concentrações inferiores ao indicado pela legislação brasileira. / INTRODUCTION AND AIMS ─ In processed cooked meat products most of the microbiota is inactivated by heat application process which simulate a pasteurization. These products also receive additives in composition that generate inhibitory effect on the certain microorganisms groups growth. With the reduce of pathogenic microorganisms on vacuum packed or modified atmosphere samples, conditions are created for the lactic acid bacteria (LAB) growth, as described Gram positive, non-spore forming, catalase negative, devoid of cytochromes, facultative anaerobic, fastidious, mesophilic, acid tolerant, strictly fermentative metabolism that produce lactic acid as the major end product of fermentation of carbohydrates. The development of these microorganisms causes aroma, flavour and appearance undesirable in meat products. In view of these considerations, the aim of this work was to evaluate the LAB inhibition growth in samples of sliced vacuum-packed cooked ham, by the application of bacteriocins. Specific aims included: the quantification and identification of species of predominate LAB in the samples of sliced vacuum-packed cooked ham; the study of the ingredients of the formulation of cooked ham combined with nisin and pediocin conducted in Man Rogosa and Sharp (MRS) broth using a strategy of experimental design combined with predictive microbiology on evaluation of Lactobacillus sakei growth; and a validation of results obtained in MRS broths on food matrix by the elaboration of three formulations involving the use of nisin and a control formulation, which were submitted for microbiological and physico-chemical analysis during the shelf life of the product. METHODS ─ Initially, the quantification of total LAB present was performed for 4 weekly batches of sliced vacuum-packed cooked ham at time 1 and 45 days of shelf life storage at 4 C and 8 C. Simultaneously was performed phenotypic identification of the genera present; additionally, at the time of 45 days of storage, was carried out a molecular analyze of 16S rRNA gene for identification of the predominant species, whereby selected the specie Lactobacillus sakei. Subsequently, a strategy of sequential experimental design was performed to evaluate the Lactobacillus sakei cell growth inhibition in MRS broth, applying a Fractional Factorial Design 26-2 with the variables sodium chloride, sodium tripolyphosphate, sodium lactate, sodium erythorbate and the bacteriocins nisin and pediocin. The statistically significant variables in relation to Lactobacillus sakei growth inhibition were selected and a Central Composite Rotatable Design (CCRD) 22 was performed to optimize the application of nisin and pediocin by reducing the concentration applied to present similar efficiency, considering the high cost of these ingredients. The responses studied in both experimental design were the parameters logarithmic increase of population (A), maximum specific growth rate (µ) and lag phase duration (), obtained by the adjustment of Modified Gompertz predictive model. For validation of the results obtained in MRS broth, three test formulations were prepared (with different concentrations of nisin) and a control (without addition of nisin) for monitoring the shelf life of the product by physico-chemical and microbiological analyzes. MAIN RESULTS ─ Mean counts around log 1.98 CFU.g-1 at time 1 day, log 7.59 CFU.g-1 at 4C, and log 8.25 CFU.g-1 at 8C on time 45 days, was detected for the total LAB. The species predominantly identified on time 45 days were Lactobacillus curvatus and Lactobacillus sakei. In step of study in MRS broth, the results of the Fractional Factorial Design showed the sodium tripolyphosphate, nisin and pediocin like variables with statistically significant effects in Lactobacillus sakei growth inhibition. In the Central Composite Rotatable Design, nisin was the variable that had a significant effect in the Lactobacillus sakei growth inhibition, indicating that it may be reduced to smaller amounts than indicated by Brazilian law (12.5 mg/Kg) with similar effect on inhibition. The validation of MRS broth studies for applying the reduced amounts of nisin (indicated by the CCRD) in the food matrix, showed that the minimum amount applied (0.001%) presented a similar effect on LAB growth inhibition related to the maximum quantity applied (0.013%); being efficient in both cases when compared to the control sample. DISCUSSION AND CONCLUSION ─ From the results obtained, was possible to conclude that the LAB comprise the microbiota of sliced vacuum-packed cooked ham and the Lactobacillus curvatus and Lactobacillus sakei were the major species that cause deterioration on the samples stored at 4 C and 8 C for 45 days. Total LAB counts after 45 days was significantly affected by storage temperature, because the counts were higher for samples stored at 8 C compared to the samples stored at 4 C. Among the ingredients added in the formulation of cooked ham, sodium tripolyphosphate showed significant effect in Lactobacillus sakei inhibition in MRS broth. Similarly, nisin and pediocin showed significant effects on microorganism reducing, evaluated by applying a Fractional Factorial Design. The Central Composite Rotatable Design involving the variables nisin and pediocin with redefined ranges of concentrations showed that nisin presented significant effect on the Lactobacillus sakei growth inhibition, when applied in smaller amounts in comparison to the stipulated by Brazilian law. The results obtained in Central Composite Rotatable Design was validated by applying the optimized quantities of nisin in food matrix, that even when applying minimal concentration (0.001%) showed a similar effect to that obtained by applying the maximum concentration (0.013%). The count of LAB and mesophilic aerobic bacteria (MAB) total were lower for the samples containing nisin than control sample, approximately 2 to 3 log cycles for LAB, and 3 or 4 log cycles for MAB, while the pH was maintained until the end of shelf life (60 days); at the same time the pH of the control sample had a significant decrease. Altogether the sliced vacuum-packed cooked ham is a favorable product to the LAB spoilage development, principally to the species Lactobacillus curvatus and Lactobacillus sakei, and that among the studied bacteriocins against the inhibition of LAB, nisin showed effect on the Lactobacillus sakei growth inhibition by studies in MRS broth, and also on the LAB spoilage growth inhibition in sliced vacuum-packed cooked ham, even in smaller quantities than indicated by Brazilian law. / 5000

Dissertação composta por 2 artigos. / INTRODUÇÃO E OBJETIVOS ─ Nos produtos cárneos industrializados cozidos a maior parte da microbiota é inativada pela aplicação de calor em processo que simula uma pasteurização. Esses produtos também recebem aditivos em sua composição que geram efeito inibidor no crescimento de determinados grupos de microrganismos. Com a microbiota patogênica reduzida a níveis aceitáveis, em amostras embaladas a vácuo ou em atmosfera modificada, criam-se condições para o crescimento de bactérias ácido láticas (BAL), descritas como microrganismos Gram positivos, não formadores de esporos, catalase negativa, desprovidos de citocromos, anaeróbios facultativos, fastidiosos, mesofílicos, ácidos tolerante, com metabolismo estritamente fermentativo, que produzem ácido láctico como o principal produto final da fermentação de carboidratos. O desenvolvimento desses microrganismos gera aroma, sabor e aspecto indesejável nos produtos cárneos. Tendo em vista estas considerações, o objetivo geral desse trabalho foi avaliar a possibilidade da inibição do crescimento de BAL em amostras de presunto fatiado embalado a vácuo, pela aplicação de bacteriocinas. Os objetivos específicos incluíram: a quantificação e identificação das espécies de BAL predominantes nas amostras de presunto cozido fatiado embalado a vácuo; o estudo dos ingredientes que compõem a formulação do presunto cozido combinados com nisina e pediocina, realizados em caldo Man Rogosa e Sharp (MRS) pela aplicação da estratégia de planejamento experimental aliada à microbiologia preditiva na avaliação do crescimento do Lactobacillus sakei; a validação dos resultados obtidos nos caldos MRS na matriz alimentar a partir da elaboração de três formulações envolvendo a utilização da nisina e uma formulação controle, submetidas a análises físico-químicas e microbiológicas durante a vida de prateleira do produto. MÉTODOS ─ Inicialmente foi realizada a quantificação das BAL totais presentes, para 4 lotes semanais de presunto cozido fatiado embalado a vácuo, nos tempos de 1 e 45 dias de armazenamento a 4 C e 8 C. Paralelamente foi realizada a identificação fenotípica dos gêneros presentes; adicionalmente, no tempo de 45 dias foram realizadas análises moleculares do gene 16S rRNA para a identificação das espécies predominantes, por meio da qual selecionou-se a espécie Lactobacillus sakei. Posteriormente, utilizou-se uma estratégia sequencial de planejamento experimental, que objetivou estudar a inibição do crescimento celular da espécie Lactobacillus sakei em caldo MRS, aplicando-se um Planejamento Fatorial Fracionário 26-2 com as variáveis cloreto de sódio, tripolifosfato de sódio, lactato de sódio, eritorbato de sódio e as bacteriocinas nisina e pediocina. Adicionalmente foi realizado um Delineamento Composto Central Rotacional (DCCR) 22 objetivando otimizar a aplicação de nisina e pediocina por meio da redução das concentrações aplicadas que apresentassem eficiência semelhante, considerando os altos custos desses ingredientes. As respostas estudadas em ambos delineamentos experimentais foram os parâmetros preditos pelos ajuste das curvas de crescimento ao Modelo de Gompertz Modificado, a citar a população máxima atingida (A), velocidade específica máxima de crescimento () e a duração da fase lag (). Para a validação dos resultados obtidos na etapa de estudo em caldo MRS, foram elaboradas três formulações teste (com diferentes concentrações de nisina) e uma controle (sem adição de nisina) para o acompanhamento da vida de prateleira do produto por meio de análises físico-químicas e microbiológicas. PRINCIPAIS RESULTADOS ─ Foram observadas contagens médias de 1,98 log UFC.g-1 no tempo 1 dia; 7,59 log UFC.g-1 a 4 C e 8,25 log UFC.g-1 a 8 C no tempo 45 dias para a contagem total de BAL. As espécies predominantemente identificadas no tempo de 45 dias foram o Lactobacillus curvatus e o Lactobacillus sakei. Na etapa de estudo em caldo MRS, os resultados do Planejamento Fatorial Fracionário evidenciaram que o tripolifosfato de sódio, a nisina e a pediocina, foram as variáveis com efeito estatisticamente significativo (p ≤ 0,05) na inibição do crescimento do Lactobacillus sakei. No Delineamento Composto Central Rotacional, a nisina foi a variável que apresentou efeito significativo na inibição do crescimento do Lactobacillus sakei, indicando a possibilidade de redução na concentração aplicada para níveis inferiores ao indicado pela legislação brasileira (12,5 mg/Kg), com efeito semelhante na inibição. A validação dos estudos em caldo MRS pela aplicação das quantidades reduzidas de nisina (indicadas pelo DCCR) na matriz alimentar, mostrou que a quantidade mínima aplicada (0,001%) apresentou um efeito semelhante na inibição das BAL em relação à quantidade máxima aplicada (0,013%); sendo em ambos os casos eficiente quando comparada à amostra controle. DISCUSSÃO E CONCLUSÃO ─ De acordo com os resultados obtidos, verificou-se que os principais gêneros de BAL envolvidos na deterioração das amostras de presunto cozido fatiado embalado a vácuo, armazenadas durante 45 dias a 4 C e 8 C, foram o Lactobacillus curvatus e Lactobacillus sakei. A contagem de BAL totais após 45 dias mostrou-se significativamente influenciada pela temperatura de armazenamento, pois as contagens foram maiores para as amostras armazenadas a 8 C quando comparadas às armazenadas a 4 C. Dentre os ingredientes comumente adicionados na formulação do presunto cozido, o tripolifosfato de sódio mostrou efeito significativo na inibição do Lactobacillus sakei nos estudos em caldo MRS. De forma semelhante, a nisina e a pediocina mostraram efeito significativo na redução das contagens do microrganismo estudado quando avaliados pela aplicação de um Planejamento Fatorial Fracionário. No Delineamento Composto Central Rotacional envolvendo as variáveis nisina e pediocina com faixas de estudos redefinidas, a nisina apresentou efeito significativo na inibição do Lactobacillus sakei, quando aplicada em concentrações inferiores ao estipulado pela legislação brasileira. Os resultados obtidos no Delineamento Composto Central Rotacional foram validados pela aplicação das quantidades otimizadas de nisina na matriz alimentar, que mesmo na concentração mínima (0,001%) mostrou um efeito similar ao obtido pela aplicação da concentração máxima (0,013%). A contagem de BAL e bactérias aeróbias mesófilas (BAM) totais mostrou-se inferior para as amostras contendo nisina quando comparada com a amostra controle, em torno de 2 a 3 ciclos logarítmicos para as BAL, e 3 ou 4 ciclos logarítmicos para as BAM; em relação ao pH, o mesmo manteve-se praticamente inalterado até o final da vida de prateleira (60 dias), enquanto o pH da amostra controle diminuiu de forma significativa. De um modo geral constatou-se que o presunto cozido fatiado embalado a vácuo é um produto com condições favoráveis ao desenvolvimento de BAL deteriorantes, a citar as espécies Lactobacillus curvatus e Lactobacillus sakei, e que dentre as bacteriocinas estudadas, a nisina apresentou efeito na inibição do Lactobacillus sakei nos estudos em caldo MRS e também na inibição das BAL deteriorantes totais no presunto cozido fatiado embalado a vácuo, mesmo em concentrações inferiores ao indicado pela legislação brasileira. / INTRODUCTION AND AIMS ─ In processed cooked meat products most of the microbiota is inactivated by heat application process which simulate a pasteurization. These products also receive additives in composition that generate inhibitory effect on the certain microorganisms groups growth. With the reduce of pathogenic microorganisms on vacuum packed or modified atmosphere samples, conditions are created for the lactic acid bacteria (LAB) growth, as described Gram positive, non-spore forming, catalase negative, devoid of cytochromes, facultative anaerobic, fastidious, mesophilic, acid tolerant, strictly fermentative metabolism that produce lactic acid as the major end product of fermentation of carbohydrates. The development of these microorganisms causes aroma, flavour and appearance undesirable in meat products. In view of these considerations, the aim of this work was to evaluate the LAB inhibition growth in samples of sliced vacuum-packed cooked ham, by the application of bacteriocins. Specific aims included: the quantification and identification of species of predominate LAB in the samples of sliced vacuum-packed cooked ham; the study of the ingredients of the formulation of cooked ham combined with nisin and pediocin conducted in Man Rogosa and Sharp (MRS) broth using a strategy of experimental design combined with predictive microbiology on evaluation of Lactobacillus sakei growth; and a validation of results obtained in MRS broths on food matrix by the elaboration of three formulations involving the use of nisin and a control formulation, which were submitted for microbiological and physico-chemical analysis during the shelf life of the product. METHODS ─ Initially, the quantification of total LAB present was performed for 4 weekly batches of sliced vacuum-packed cooked ham at time 1 and 45 days of shelf life storage at 4 C and 8 C. Simultaneously was performed phenotypic identification of the genera present; additionally, at the time of 45 days of storage, was carried out a molecular analyze of 16S rRNA gene for identification of the predominant species, whereby selected the specie Lactobacillus sakei. Subsequently, a strategy of sequential experimental design was performed to evaluate the Lactobacillus sakei cell growth inhibition in MRS broth, applying a Fractional Factorial Design 26-2 with the variables sodium chloride, sodium tripolyphosphate, sodium lactate, sodium erythorbate and the bacteriocins nisin and pediocin. The statistically significant variables in relation to Lactobacillus sakei growth inhibition were selected and a Central Composite Rotatable Design (CCRD) 22 was performed to optimize the application of nisin and pediocin by reducing the concentration applied to present similar efficiency, considering the high cost of these ingredients. The responses studied in both experimental design were the parameters logarithmic increase of population (A), maximum specific growth rate (µ) and lag phase duration (), obtained by the adjustment of Modified Gompertz predictive model. For validation of the results obtained in MRS broth, three test formulations were prepared (with different concentrations of nisin) and a control (without addition of nisin) for monitoring the shelf life of the product by physico-chemical and microbiological analyzes. MAIN RESULTS ─ Mean counts around log 1.98 CFU.g-1 at time 1 day, log 7.59 CFU.g-1 at 4C, and log 8.25 CFU.g-1 at 8C on time 45 days, was detected for the total LAB. The species predominantly identified on time 45 days were Lactobacillus curvatus and Lactobacillus sakei. In step of study in MRS broth, the results of the Fractional Factorial Design showed the sodium tripolyphosphate, nisin and pediocin like variables with statistically significant effects in Lactobacillus sakei growth inhibition. In the Central Composite Rotatable Design, nisin was the variable that had a significant effect in the Lactobacillus sakei growth inhibition, indicating that it may be reduced to smaller amounts than indicated by Brazilian law (12.5 mg/Kg) with similar effect on inhibition. The validation of MRS broth studies for applying the reduced amounts of nisin (indicated by the CCRD) in the food matrix, showed that the minimum amount applied (0.001%) presented a similar effect on LAB growth inhibition related to the maximum quantity applied (0.013%); being efficient in both cases when compared to the control sample. DISCUSSION AND CONCLUSION ─ From the results obtained, was possible to conclude that the LAB comprise the microbiota of sliced vacuum-packed cooked ham and the Lactobacillus curvatus and Lactobacillus sakei were the major species that cause deterioration on the samples stored at 4 C and 8 C for 45 days. Total LAB counts after 45 days was significantly affected by storage temperature, because the counts were higher for samples stored at 8 C compared to the samples stored at 4 C. Among the ingredients added in the formulation of cooked ham, sodium tripolyphosphate showed significant effect in Lactobacillus sakei inhibition in MRS broth. Similarly, nisin and pediocin showed significant effects on microorganism reducing, evaluated by applying a Fractional Factorial Design. The Central Composite Rotatable Design involving the variables nisin and pediocin with redefined ranges of concentrations showed that nisin presented significant effect on the Lactobacillus sakei growth inhibition, when applied in smaller amounts in comparison to the stipulated by Brazilian law. The results obtained in Central Composite Rotatable Design was validated by applying the optimized quantities of nisin in food matrix, that even when applying minimal concentration (0.001%) showed a similar effect to that obtained by applying the maximum concentration (0.013%). The count of LAB and mesophilic aerobic bacteria (MAB) total were lower for the samples containing nisin than control sample, approximately 2 to 3 log cycles for LAB, and 3 or 4 log cycles for MAB, while the pH was maintained until the end of shelf life (60 days); at the same time the pH of the control sample had a significant decrease. Altogether the sliced vacuum-packed cooked ham is a favorable product to the LAB spoilage development, principally to the species Lactobacillus curvatus and Lactobacillus sakei, and that among the studied bacteriocins against the inhibition of LAB, nisin showed effect on the Lactobacillus sakei growth inhibition by studies in MRS broth, and also on the LAB spoilage growth inhibition in sliced vacuum-packed cooked ham, even in smaller quantities than indicated by Brazilian law. / 5000

Submitted by Fabio Sobreira Campos da Costa (fabio.sobreira@ufpe.br) on 2016-07-28T14:25:10Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Gabriella Dias (Dissertação Mestrado-Nutrição 2016).pdf: 1452511 bytes, checksum: c930c88a04f2f296952547d2d9633057 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-28T14:25:10Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Gabriella Dias (Dissertação Mestrado-Nutrição 2016).pdf: 1452511 bytes, checksum: c930c88a04f2f296952547d2d9633057 (MD5) Previous issue date: 2016-02-24 / A secagem é uma operação unitária bastante empregada na conservação de alimentos, sua aplicação em frutas permite um melhor aproveitamento da produção e facilita a sua comercialização. O uso de pré-tratamentos pode minimizar as alterações sensoriais, nutritivas e ainda reduzir os custos do processo de secagem. O objetivo deste trabalho foi estudar a influência da aplicação do ultrassom e/ou vácuo como pré-tratamentos na secagem do melão tipo cantaloupe (Cucumis melo var. cantalupensis Naud). Os pré-tratamentos foram realizados em três diferentes meios (água destilada, solução de sacarose a 50% e meio sem líquido (isolado)), sendo que para cada meio foram utilizadas quatro condições de tratamento: uma controle, uma empregando apenas o ultrassom (US), uma com apenas o vácuo (VC) e outra utilizando a associação do ultrassom com o vácuo (USVC). Para cada condição foram aplicados os tempos de processamento de 10, 20 e 30 minutos, a uma temperatura de 30º C. O processo foi avaliado em termos de perda de água e de ganho de sólidos, sendo definidas as melhores condições para a secagem. A secagem foi realizada em um secador de leito fixo com velocidade do ar de 2 m/s e 60ºC. As condições que obtiveram menor tempo de secagem foram as que utilizaram US por 10 min e USVC por 10 min para o meio com água destilada, VC por 10 min e US por 20 min para o meio que utilizou desidratação osmótica e para o meio isolado, respectivamente. Amostras processadas nessas condições foram submetidas, juntamente com amostras secas sem pré-tratamento à análise de qualidade, realizada após os pré-tratamentos e após a secagem. O processo de secagem provocou uma redução considerável dos compostos bioativos do melão, redução da atividade dos antioxidantes, maior luminosidade, intensificação nas cores vermelha e amarela, textura mais suave e redução da atividade de água (aw) a um valor seguro. A condição que utilizou o USVC em meio aquoso obteve menores percas para compostos fenólicos totais, carotenoides totais e ácido ascórbico, menor diferença total de cor e menor aw, sendo selecionada para análise sensorial. A avaliação sensorial mostrou que a amostra pré-tratada apresentou boa aceitação e não obteve diferença significativa para o melão seco sem pré-tratamento, em nenhum parâmetro estudado. / Drying is an unit operation commonly used in food preservation. Its application in fruits allows a better use of production and facilitates its marketing. The use of pretreatments for drying may minimize sensory and nutritional changes and reduce the costs of the process. The objective of this work was to study the influence of the application of ultrasound and/or vacuum as pretreatments on melon (Cucumis melo var. Cantalupensis Naud) drying. The pretreatment consisted in four processing conditions: control, one using only ultrasound (US), one with only vacuum (VC) and another using a combination of ultrasound with vacuum (USVC). For each condition, it was used processing times of 10, 20 and 30 min and the samples were immersed without and with a liquid medium (distilled water, 50g/100g sucrose solution) at 30 ° C. The process was evaluated in terms of water loss and solid gain. The drying process was conducted in a fixed bed dryer at 60°C and air velocity of 2 m/s. The conditions that obtained shorter drying time were those with US for 10 min and USVC for 10 min (both using distilled water as the liquid medium), VC for 10 min and US for 20 min, using osmotic dehydration and isolated medium, respectively. Samples processed under these conditions and the samples processed without pretreatment were submitted to quality analysis, performed after the pre-treatment and after drying. Drying resulted considerable reduction of bioactive compounds of melon, reducing the activity of antioxidants, higher brightness, enhancement in red and yellow colors, softer texture and reduce water activity (aw) to a safe value. The condition that used USVC in aqueous medium obtained the best results for total phenolic compounds, total carotenoids and ascorbic acid, lower total color difference and lower aw, being selected for sensory analysis. Sensory evaluation showed that this pretreated sample had good acceptance and no significant difference from the dried untreated melon.

Made available in DSpace on 2014-10-09T12:53:00Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2014-10-09T13:58:25Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / A irradiação de carnes e seus derivados têm sido empregada em alguns países como medida de tratamento para garantir a segurança microbiológica destes produtos evitando infecções alimentares. A irradiação pode provocar algumas mudanças indesejáveis na composição química dos alimentos tal como a oxidação lipídica. Na produção de derivados de carnes, o perfil lipídico está diretamente relacionado com a qualidade sensorial e nutricional do produto. Para retardar o processo da oxidação lipídica são utilizados antioxidantes, que podem ser sintéticos ou naturais. Atualmente, maior atenção tem sido dada aos antioxidantes naturais derivados de ervas e especiarias, tais como o alecrim e o orégano. O objetivo deste trabalho foi avaliar o potencial antioxidante dos extratos destas duas especiarias em hambúrgueres bovinos submetidos à irradiação por fonte de 60CO com a dose de 6, 7 e 8 kGy e aceleradores de elétrons com dose de 3,5 e 7 kGy e estocados sob congelamento por períodos pré-estabelecidos de 0, 45 e 90 dias. Os resultados demonstraram que o alecrim apresentou maior proteção antioxidante em uma matriz alimentícia heterogênea como o hambúrguer, porém o orégano quando utilizado em sinergismo com o alecrim ou com o BHT/BHA conseguiu retardar a oxidação lipídica durante todo o período de análise. Apesar de terem ocorrido alterações no perfil de ácidos graxos não foi possível demonstrar uma linearidade dependente da dose de irradiação e/ou do tempo de estocagem. A análise sensorial mostrou que dentre as amostras formuladas com antioxidantes naturais, o orégano recebeu maiores notas entre os provadores. A amostra irradiada formulada com alecrim recebeu maior nota em relação a não-irradiada. O uso de especiarias com atividade antioxidante com o objetivo de inibir a degragação oxidativa em alimentos gordurosos mostra-se promissor para a aplicação industrial. / Dissertação (Mestrado) / IPEN/D / Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN/CNEN-SP

京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(農学) / 甲第19779号 / 農博第2175号 / 新制||農||1041(附属図書館) / 学位論文||H28||N4995(農学部図書室) / 32815 / 京都大学大学院農学研究科応用生命科学専攻 / (主査)教授 小川 順, 教授 阪井 康能, 教授 栗原 達夫 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Agricultural Science / Kyoto University / DFAM

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Thesis (M. Tech. Environmental health) -- Central University of technology, Free State, 2011 / Although the application of low pH is common practice in food preservation, the emergence of acid tolerance has been reported world-wide amidst a growing concern that preservation with weak acids, such as organic acids may be influenced as a result of food-borne bacteria becoming acid tolerant or acid resistant. The present study was conducted to assess the acid tolerance of a wide range of bacterial species and consequently the sustainable application of organic acids as food preservatives in particularly acidic foodstuffs. Acid tolerance was determined in 19 bacterial strains predominantly associated with food spoilage and food poisoning. After exposure to hydrochloric acid 16% of the isolates were found to be intrinsically tolerant to low pH and included amongst others the enteric bacteria Escherichia coli and Salmonella spp. The latter organisms are known causative agents in food spoilage and poisoning, and the results highlight the predicaments related to their ability to survive in acidic foodstuffs as well as the human gastric environment. Bacterial strains were further exposed to increasing concentrations of various acidic foodstuffs in order to determine the development of acid tolerance by gradual decrease in pH, as opposed to exposure to acid shock. After induction, the protein profiles of resulting acid tolerant isolates were compared with those of the original un-induced strains. Exposure to acidic foodstuffs resulted in various survival profiles, where not only pH but also the type of acidulant (foodstuff or inorganic acid) were found to be contributing factors in acid tolerance development. Bacterial protein composition after exposure to acidic foodstuffs showed considerable variation which may be indicative of acid tolerance development whereas the mechanisms involved may be the result of multiple modifications in bacterial composition. After the induction of acid tolerance, susceptibility of induced strains to various organic acids were determined at various pH values. This was done to investigate whether acid tolerance would influence the inhibitory activity of organic acids as antimicrobial agents in acidic food. Decreased susceptibility was not significantly demonstrated with the exception of only selected isolates, the latter including E. coli and S. typhimurium. Organic acid activity was found to be much more effective at lower pH values and it would be necessary to elucidate whether this inhibition is the result of a lower pH or more specifically the activity of the organic acids. The effect of exposure to an acidic environment on phenotypic characteristics of Gram-negative bacteria, and more specifically psychrotrophic organisms was evaluated in order to show the combined effect of organic acids and low temperature preservation. The characteristic yellow pigment of various Chryseobacterium species was found to be not as apparent after acid exposure while in some cases the colonies were observed as white. In Pseudomonas aeruginosa the characteristic green pigment was much more prominent after acid exposure. These morphological alterations may be important factors that should be considered in identification procedures employed in food safety laboratories. Finally, the influence of acidic exposure via acidic foodstuffs and also organic acids on the protein composition and outer membrane protein structure of various bacterial cells was investigated. No specific relationships with the MICs (Minimum Inhibitory Concentrations) of organic acids after induction with the selected acidic foodstuffs could be established, although various differences were found in protein expression. From the results, it may be suggested that the outer membrane of various pathogenic bacteria is involved in acid tolerance development and this supports the reports on the importance of membrane integrity in the protection against low pH. In conclusion, the study endeavoured to add to the body of knowledge with regard to alternative food preservation regimes utilising organic acids, either solely or in combination with selected extrinsic and intrinsic parameters.