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In a series of studies directed towards the total synthesis of the natural product forskolin, an intramolecular Diels-Alder approach to the construction of the AB ring system is described, with the stereocontrolled synthesis of the tricyclic adducts (128), (129) and (140). An unusual stereochemical outcome in the intramolecular Diels-Alder reaction of ester (122) to give (129) is also described, and evidence defining the origin of this result considered. Chemical elaboration of the aforementioned tricyclic adducts towards forskolin is presented, together with the intramolecular Diels-Alder cyclisation of acetylene dienophiles to two further tricyclic adducts (90) and (176), possessing the same relative stereochemistry as centres 10a and 10b in forskolin. Finally, the synthesis is extended to include a complementary intermolecular Diels-Alder route to the AB ring system of forskolin, providing an insight into the chemistry of these important decalin intermediates in an approach to the synthesis of forskolin.

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Made available in DSpace on 2014-06-11T19:29:14Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-12-17Bitstream added on 2014-06-13T20:59:30Z : No. of bitstreams: 1 paschoal_dm_me_botfmvz.pdf: 1363323 bytes, checksum: f767f2dcabcc3f599b8e36c74c4d096c (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O objetivo desta dissertação foi avaliar a viabilidade e a resistência à criopreservação após a realização de lipólise química utilizando-se o forskolin. Embriões Bos taurus indicus (OZ) e Bos taurus indicus X Bos taurus taurus (OMZT) produzidos in vitro, foram comparados em meio de cultivo contendo ou não soro fetal bovino (SFB). Para o experimento1, 1.052 oócitos de graus I e II foram colhidos de ovários de vacas Bos taurus indicus de abatedouro, dividindo em 7 réplicas. Os oócitos foram maturados em TCM 199 acrescido de SFB, Piruvato de Sódio, FSH, LH e Penicilina/Estreptomicina. A fertilização foi realizada com sêmen de touro Nelore (Bos taurus indicus) ou com sêmen de touro Simental (Bos taurus taurus), em meio HTF acrescido de BSA, Piruvato de Sódio, Cafeína, Heparina, Penicilinamina, Hipotaurina, Epinefrina e Penicilina/Estreptomicina. Os prováveis zigotos foram cultivados em meio SOFaa, acrescido de BSA, Piruvato de Sódio, Penicilina/Estreptomicina, suplementado ou não com SFB (Grupo 2,5%SFB e Grupo 0%SFB). No D6 os blastocistos foram novamente divididos em 2 sub-grupos com ou sem adição de 10μM de forskolin (total de 4 grupos - 2,5%SFB, 0%SFB, 2,5%+F e 0%+F). Para o experimento 2 os embriões foram expostos a solução de vitrificação 1 (SV1 = 5M de Etileno Glicol) durante 3 minutos e transferidos para uma gota com 15μL da solução de vitrificação 2 (SV2 = composta por 7M de Etileno Glicol, 0.5M de Galactose e 18% (w/v) de Ficoll 70) sendo, em seguida envasados em palhetas francesas estéreis de 0,25 mL. Para o aquecimento, as palhetas foram mantidas em ar por 8 segundos e depois em água a 37°C por 15 segundos. Como controle dos experimentos, embriões bovinos produzidos in vivo coletados de vacas Nelores foram utilizados. A taxa de clivagem e de produção de blastocisto no experimento 1, não diferiu entre os tratamentos dentro dos grupo... / The main objective of this dissertation was to evaluate the viability and cryotolerance of bovine embryos treated with forskolin to induce chemical lipolysis. In vitro produced Bos taurus indicos (OZ) and Bos taurus indicus X Bos taurus taurus (OMZT) embryos were compared in culture conditions containing or not fetal calf serum (FCS). For Experiment 1, 1.052 grade I and II Bos taurus indicos oocytes were obtained from slaughterhouse ovaries and divided in 7 replicates. The oocytes were matured in TCM 199 supplemented with FCS, Sodium Piruvate, FSH, LH and Penicillin/Streptomycin. Fertilization was performed using semen from one Nelore bull (Bos taurus indicos) and one Simental bull (Bos taurus taurus) in HTF medium supplemented with BSA, Sodium Pyruvate, Caffeine, Heparine, Penicilamine, Hipotaurine, Epinephrine and Penicillin/Streptomycin. The presumptive zygotes were cultured in SOFaa with BSA, Sodium Pyruvate and Penicillin/Streptomycin supplemented or not with FCS (Group 2.5%FCS and Group 0%FCS). On day 6 embryos from both groups were divided in two sub-groups containing or not 10μM of forskolin (total of 4 groups - 2.5%FCS, 0%FCS, 2.5%+F and 0%+F). For Experiment 2 the embryos were exposed to a vitrification solution 1 (SV1 = 5M of Ethylene Glycol) during 3 minutes and transferred to a vitrification solution 2 (SV2 = 7M Ethylene Glycol + 0.5M Glucose + 18% Ficoll). While in the SV2 embryos were packaged in 0.25 mL straws, incubated for 1 minute in Liquid N2 vapor and plunged into Liquid N2. For warming the straws were held in air for 8 seconds and plunged in 37oC water bath for 15 seconds. As a control, in vivo produced embryos collected from Nelore cows were used. The cleavage and blastocyst production rates, in Experiment 1, was not different among groups of OZ or OMZT embryos (P>0.05). However, a significant difference was observed in blastocyst production rates when... (Complete abstract click electronic access below)

Orientador: Fernanda da Cruz Landim e Alvarenga / Banca: Maria Denise Lopes / Banca: Claudia Barbosa Fernandes / Resumo: O objetivo desta dissertação foi avaliar a viabilidade e a resistência à criopreservação após a realização de lipólise química utilizando-se o forskolin. Embriões Bos taurus indicus (OZ) e Bos taurus indicus X Bos taurus taurus (OMZT) produzidos in vitro, foram comparados em meio de cultivo contendo ou não soro fetal bovino (SFB). Para o experimento1, 1.052 oócitos de graus I e II foram colhidos de ovários de vacas Bos taurus indicus de abatedouro, dividindo em 7 réplicas. Os oócitos foram maturados em TCM 199 acrescido de SFB, Piruvato de Sódio, FSH, LH e Penicilina/Estreptomicina. A fertilização foi realizada com sêmen de touro Nelore (Bos taurus indicus) ou com sêmen de touro Simental (Bos taurus taurus), em meio HTF acrescido de BSA, Piruvato de Sódio, Cafeína, Heparina, Penicilinamina, Hipotaurina, Epinefrina e Penicilina/Estreptomicina. Os prováveis zigotos foram cultivados em meio SOFaa, acrescido de BSA, Piruvato de Sódio, Penicilina/Estreptomicina, suplementado ou não com SFB (Grupo 2,5%SFB e Grupo 0%SFB). No D6 os blastocistos foram novamente divididos em 2 sub-grupos com ou sem adição de 10μM de forskolin (total de 4 grupos - 2,5%SFB, 0%SFB, 2,5%+F e 0%+F). Para o experimento 2 os embriões foram expostos a solução de vitrificação 1 (SV1 = 5M de Etileno Glicol) durante 3 minutos e transferidos para uma gota com 15μL da solução de vitrificação 2 (SV2 = composta por 7M de Etileno Glicol, 0.5M de Galactose e 18% (w/v) de Ficoll 70) sendo, em seguida envasados em palhetas francesas estéreis de 0,25 mL. Para o aquecimento, as palhetas foram mantidas em ar por 8 segundos e depois em água a 37°C por 15 segundos. Como controle dos experimentos, embriões bovinos produzidos in vivo coletados de vacas Nelores foram utilizados. A taxa de clivagem e de produção de blastocisto no experimento 1, não diferiu entre os tratamentos dentro dos grupo... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The main objective of this dissertation was to evaluate the viability and cryotolerance of bovine embryos treated with forskolin to induce chemical lipolysis. In vitro produced Bos taurus indicos (OZ) and Bos taurus indicus X Bos taurus taurus (OMZT) embryos were compared in culture conditions containing or not fetal calf serum (FCS). For Experiment 1, 1.052 grade I and II Bos taurus indicos oocytes were obtained from slaughterhouse ovaries and divided in 7 replicates. The oocytes were matured in TCM 199 supplemented with FCS, Sodium Piruvate, FSH, LH and Penicillin/Streptomycin. Fertilization was performed using semen from one Nelore bull (Bos taurus indicos) and one Simental bull (Bos taurus taurus) in HTF medium supplemented with BSA, Sodium Pyruvate, Caffeine, Heparine, Penicilamine, Hipotaurine, Epinephrine and Penicillin/Streptomycin. The presumptive zygotes were cultured in SOFaa with BSA, Sodium Pyruvate and Penicillin/Streptomycin supplemented or not with FCS (Group 2.5%FCS and Group 0%FCS). On day 6 embryos from both groups were divided in two sub-groups containing or not 10μM of forskolin (total of 4 groups - 2.5%FCS, 0%FCS, 2.5%+F and 0%+F). For Experiment 2 the embryos were exposed to a vitrification solution 1 (SV1 = 5M of Ethylene Glycol) during 3 minutes and transferred to a vitrification solution 2 (SV2 = 7M Ethylene Glycol + 0.5M Glucose + 18% Ficoll). While in the SV2 embryos were packaged in 0.25 mL straws, incubated for 1 minute in Liquid N2 vapor and plunged into Liquid N2. For warming the straws were held in air for 8 seconds and plunged in 37oC water bath for 15 seconds. As a control, in vivo produced embryos collected from Nelore cows were used. The cleavage and blastocyst production rates, in Experiment 1, was not different among groups of OZ or OMZT embryos (P>0.05). However, a significant difference was observed in blastocyst production rates when... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Nous avons utilisé la lignée épithéliale intestinale de crypte de rat IEC-6 afin de mieux comprendre le rôle des C/EBPs dans la différenciation et la prolifération de l'intestin. Nous avons vérifié l'expression des ARNm de C/EBP$\alpha$, C/EBP$\beta$ et C/EBP$\delta$ suite à la stimulation des cellules IEC-6 par la forskoline et l'IBMX qui stimulent la PKA, le TPA qui stimule la PKC et la thapsigargine qui augmente la concentration de Ca$\sp{2+}$ cytoplasmique. La forskoline et l'IBMX induisent les niveaux d'ARNm des trois C/EBPs avec différentes cinétiques tandis que le TPA induit seulement les niveaux d'ARNm de C/EBP$\alpha$ et de C/EBP$\beta.$ La thapsigargine induit les niveaux d'ARNm des trois isoformes par un mécanisme de régulation post-transcriptionnel sans affecter les niveaux de protéines. Les variations des niveaux d'ARNm, induits par les trois voies de signalisation, étaient indépendantes d'une synthèse nouvelle de protéines. Les analyses des niveaux de protéine par Western nous ont permis de constater une induction des trois isoformes en accord avec celle des ARNm suite à une stimulation par la forskoline et l'IBMX. Nous avons observé que le patron d'expression des protéines C/EBP$\alpha$ et C/EBP$\beta$ concorde avec celui des ARNm après une stimulation par le TPA. La capacité de liaison à l'ADN des C/EBPs n'est pas affectée significativement par les voies de la PKA, de la PKC et du Ca$\sp{2+}.$ Les voies de la PKA et de la PKC peuvent moduler l'expression de certains gènes de la réponse inflammatoire comme l'haptoglobine et le thiostatin. La stimulation de ces différentes voies inhibe la prolifération cellulaire des cellules IEC-6 en absence et en présence de sérum. Finalement, nous avons observé que ces différentes voies pouvaient induire à des niveaux variables l'ARNm de p21, un gène très important dans l'arrêt de la prolifération cellulaire. [Résumé abrégé par UMI] [Symboles non conformes]

名古屋大学博士学位論文 学位の種類 : 博士(医学)(課程) 学位授与年月日:平成25年3月25日 水谷武史氏の博士論文として提出された

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Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The process of meiotic resumption in oocytes, arrested since fetal life, and the expansion of compact layers of cumulus cells is triggered by intrafollicular mediators stimulated by LH. These events are extremely complex. In mice, among system components of natriuretic peptides (NP), only the C-type NP (CNP) has a role to inhibit the resumption of meiosis. However, little is know about the function of NPs on resumption of meiosis, nuclear maturation and cumulus expansion in monovular species. The aim of this study was to characterize the natriuretic peptide system, studing its role in the resumption of meiosis and cumulus expansion. We also proposed a new model to study cumulus expansion. Initially, we detected the presence of mRNA for the ANP, CNP, natriuretic peptide receptor 1 (NPR-1), NPR-2 and NPR-3 in the cumulus cells and NPR-2 mRNA in the oocyte. Using an in vitro model, in which the oocytes are arrested in germinal vesicle (VG) by the action of forskolin (100 μM), we demonstrated that ANP, BNP and CNP, alone or in combination, induce resumption of meiosis after 12 h of maturation. In another experiments, we observed that the concentration of 100 μM forskolin inhibited cumulus expansion stimulated by FSH for12 h, which was reversed by adding ANP, BNP and CNP in the COC culture system. Thus, we demonstrated for the first time the localization of mRNA for the NP system in COCs. Furthermore, we found that the ANP, BNP and CNP are likely mediators of LH to induce meiotic resumption and cumulus expansion in monovuluar species, using the bovine as the animal model. / O processo de retomada da meiose no oócito, bloqueada desde a vida fetal, e a expansão de compactas camadas de células do cumulus que o envolvem é desencadeado por mediadores intrafoliculares estimulados pelo LH, sendo eventos extremamente complexos. Em camundongos, dentre os componentes do sistema peptídeos natriuréticos (NP) somente o NP tipo C (CNP) apresenta função, bloqueando a retomada da meiose. Entretanto, em espécie monovular, o conhecimento sobre a ação dos NP, na maturação nuclear de oócitos e expansão do cumulus, é extremamente escasso. O objetivo do presente estudo foi caracterizar o sistema peptídeo natriurético, demonstrar sua função na retomada da meiose e expansão do cumulus, além de propor um novo modelo para estudo da expansão do cumulus. Inicialmente, demonstramos a presença de RNAm para ANP, CNP, receptor peptídeo natriurético 1 (NPR-1), NPR-2 e NPR-3 nas células do cumulus, sendo que no oócito somente foi detectado RNAm do NPR-2. Utilizando um modelo in vitro, no qual os oócitos permanecem bloqueados em vesícula germitava (VG) por ação do forskolin (100 μM), demonstramos que os ANP, BNP e CNP, isoladamente ou em associação, induzem o reinício da meiose após 12 h de maturação. Em outros experimentos, observamos que a concentração de 100 μM de forskolin inibiu, por 12 h, a expansão das células do cumulus estimulada por FSH e que o ANP, BNP e CNP revertem o efeito inibitório do forskolin sobre a expansão do cumulus. Dessa forma, demonstramos pela primeira vez a localização de RNAm para o sistema NP em CCOs. Além disso, foi demonstrado que em espécie monovuluar, utilizando o bovino como modelo animal, os peptídeos natriuréticos (ANP, BNP e CNP) apresentam função de mediadores intrafoliculares do LH, na qual estimulam a retomada da meiose e expansão do cumulus.

Submitted by Liliane Ferreira (ljuvencia30@gmail.com) on 2018-10-11T14:31:19Z No. of bitstreams: 2 Tese - Tiago Omar Diesel - 2018.pdf: 2037910 bytes, checksum: e5037a6e126e6597f8f92b2754602731 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2018-10-15T11:00:19Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Tese - Tiago Omar Diesel - 2018.pdf: 2037910 bytes, checksum: e5037a6e126e6597f8f92b2754602731 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2018-10-15T11:00:19Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Tese - Tiago Omar Diesel - 2018.pdf: 2037910 bytes, checksum: e5037a6e126e6597f8f92b2754602731 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2018-09-13 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Goiás - FAPEG / Chemical delipidation has been used as an alternative to improve the cryotolerance of in vitro produced embryos (IVP). The aim of this study was evaluate the effect of L-carnitine (LC) on the development and survival of vitrified IVP bovine embryos by the Cryotop method in the first assay, and in the second trial the effect of LC and Forskolin on Cryotop cryopreserved embryos Experiment 1), or by modified slow freezing (Experiment 2), so mitochondrial activity, intracytoplasmic lipid (LI) content, cellular apoptosis (NCA) and hatching after heating were evaluated. In the first essay LC was used at the concentration of 0,6 mg/mL in maturation culture medium (IVM), embryo culture (IVC) and / or post-thawing (REC), in four treatments: without LC (Control), LC added to CIV (LCiv), LC to CIV + LC to REC (LCivR), and LC to MIV / CIV + LC to REC (LMivCR). The addition of LC increased the production of blastocysts in D7 by 28.6% (LCiv) and the amount of embryos grade I by 36.9% (LCivR), the re-expansion rate in 22,7% and hatching in 20.1% (LCiv), and mitochondrial activity was 1.9 times higher (P <0.001) (LCivR) than Control. The LI quantity was 29% lower in LCiv and LCivR and 50.2% in LMivCR compared Control (P <0.001). In the second experiment the embryos were cultured without addition of delipidators (Control), in the presence of 10μM of Forskolin added to the IVC in D5 (FORSK) or L-carnitine (0.6 mg / mL) added to the IVC and in post-thawing (LC). LC supplementation increased the production of blastocysts in D7 by 22.0% and grade I embryos by 30.1% (P <0.05), in relation to Control and FORSK. In Experiment 1, the re-expansion rate in LC increased (P <0.05) 28.9% in relation to FORSK. In Experiment 2, two Control treatments were used for slow freezing (Classic and Modified). Hatching after 48 hours was greater (P <0.05) in LC compared to FORSK and Classical and Modified Controls (77.5%, 41.9%, 40.5%, 40.8% respectively). In the LC treatment, there was a decrease (P <0.05) of 64.7% in the degenerate embryo rate in relation to the Classical Control. Treatment with delipidators reduced LI content (P <0.001) by 2.2 fold in FORSK and four times in the LC compared to Control. The addition of 0.6 mg / mL of L-carnitine to the culture medium and the post-thawing increased the rate of in vitro production of bovine embryos acting positively on mitochondrial potential, reducing the amount of intracellular lipids and cellular apoptosis and increasing cryotolerance of embryos submitted to the modified slow freezing protocol. / A delipidação química tem sido utilizada como alternativa para a melhoria da criotolerância em embriões produzidos in vitro (PIV). Este estudo foi realizado objetivando avaliar o efeito da Lcarnitina (LC) sobre o desenvolvimento e a sobrevivência de embriões bovinos PIV vitrificados pelo método Cryotop no primeiro ensaio, e no segundo ensaio o efeito comparado da LC e Forskolin em embriões criopreservados por Cryotop (Experimento 1), ou por congelamento lento modificado (Experimento 2). Para isto foram avaliadas a atividade mitocondrial, o conteúdo de lipídeos intracitoplasmático (LI), a apoptose celular e a eclosão após o aquecimento. No primeiro ensaio a LC foi utilizada na concentração de 0,6 mg/mL no meio para maturação (MIV), cultivo (CIV) e/ou recultivo embrionário (REC), em quatro tratamentos: sem LC (Controle), LC adicionado ao CIV (LCiv), LC ao CIV+LC ao REC (LCivR), e LC ao MIV/CIV+ LC ao REC (LMivCR). A adição de LC aumentou (P <0,05) a produção de blastocistos em D7 em 28,6% (LCiv), a quantidade de embriões grau I em 36,9% (LCivR), a taxa de re-expansão em 22,7%, a eclosão em 20,1% (LCiv) e a atividade mitocondrial foi 1,9 vezes maior (P <0,001) (LCivR) em relação ao Controle. A quantidade LI foi 29% menor em LCiv e LCivR e 50,2% em LMivCR comparado Controle (P <0,001). No segundo ensaio os embriões foram cultivados sem adição de delipidadores (Controle), na presença de 10µM de Forskolin adicionado ao CIV no D5 (FORSK) ou L-carnitina (0,6 mg/mL) adicionada ao CIV e ao recultivo (LC). A suplementação com LC aumentou a produção de blastocistos em D7 em 22,0% e de embriões grau I em 30,1% (P <0,05), em relação ao Controle e ao FORSK. No Experimento 1 a taxa de re-expansão no LC aumentou (P <0,05) 28,9% em relação ao FORSK. No Experimento 2 foram utilizados dois tratamentos Controle para congelamento lento (Clássico e Modificado). A eclosão após 48 horas foi maior (P < 0,05) no LC em comparação ao FORSK e aos Controles Clássico e Modificado (77,5%, 41,9%, 40,5%, 40,8% respectivamente). No tratamento LC foi observada diminuição (P < 0,05) de 64,7% na taxa de embriões degenerados em relação ao Controle Clássico. O tratamento com delipidadores reduziu o conteúdo de LI (P < 0,001) em 2,2 vezes em FORSK e quatro vezes no LC comparados ao Controle. A adição de 0,6 mg/mL de L-carnitina aos meios de cultivo e recultivo aumentou a taxa de produção in vitro de embriões bovinos atuando positivamente sobre a atividade mitocondrial, reduzindo a quantidade de lipídeos intracelulares e a apoptose e aumentando a criotolerância dos embriões submetidos ao protocolo de congelamento lento modificado.