Orientador : Mario Jose Abdalla Saad / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-03T15:10:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Hirata_AparecidaEmiko_D.pdf: 24088044 bytes, checksum: f4e0da5215ee7434aa533149f68fc1cb (MD5) Previous issue date: 2002 / Resumo: A PTP18 atua como efetor negativo do receptor da insulina, desfosforilando o receptor e o IRS-1 e parece estar correlacionada com a sensibilidade à insulina e desenvolvimento da obesidade. No presente estudo avaliamos a associação do receptor da insulina com a PTP18 sobre a regulação da transmissão do sinal da insulina em animais obesos MSG, animais submetidos a jejum por 72h e animais tratados agudamente com adrenalina....Observação: O resumo, na integra, podera ser visualizado no texto completo da tese digital / Abstract: Insulin is the most potent anabolic hormone known and is essential for appropriate tissue development, growth, and maintenance of whole-body glucose homeostasis. Insulin signaling is initiated by binding of insulin to the insulin receptor (IR), stimulating its tyrosine kinase activity, which, in tum triggers downstream signaling events. These include tyrosil phosphorylation of IR substrates 1 and 2 (IRS-1, IRS-2) that activate other adapter molecules such as PI3-K, PDK1 and Akt, which combined actions mediate the biological effects of insulin....Note: The complete abstract is available with the full electronic digital thesis or dissertations / Doutorado / Doutor em Clínica Médica

Orientador: João Martins Pizauro Junior / Banca: Sandra Regina Pombeiro Sponchiado / Banca: Flávio José dos Santos / Banca: Luis Henrique Souza Guimarães / Banca: Marcio Hipolito / Resumo: Os processos de formação, crescimento, remodelação e, quando necessário, reparo do tecido ósseo ocorrem pela ação coordenada e regulada dos eventos químicos e fisiológicos que participam das ossificações intramembranosa e endocondral, sendo assim, o desequilíbrio das biomoléculas envolvidas no processo, pode levar ao desenvolvimento de patologias ósseas. Durante a metamorfose dos anuros, ocorrem acentuadas e perceptíveis alterações morfológicas que possibilitam a transição do animal do ambiente aquático para o terrestre, sendo a remodelação do esqueleto uma das transformações mais notáveis. Dentre as formas de se estudar o mecanismo de calcificação biológica, as enzimas fosfatase alcalina e fosfatase ácida tartarato-resistente são utilizadas por serem consideradas marcadores bioquímicos da ação dos osteoblastos e dos osteoclastos, respectivamente. Neste sentido, foram realizados estudos em girinos e rãs de Lithobates catesbeianus com o objetivo de se compreender melhor tais processos de ossificação. A média da atividade específica para a hidrólise do pNFF (pH=10,5) pela fosfatase alcalina solubilizada por fosfatidilinositol fosfolipase C-específica (PIPLC) de Bacillus cereus, entre as diferentes regiões ósseas nas diferentes idades do animal, foi de 1142,57 U.mg-1, enquanto que para a hidrólise do PPi (pH=8,0) foi de 1433,82 U.mg-1. Dentre os compostos testados sobre a atividade enzimática, aquele que mais influenciou foi o EDTA, com aproximadamente 67% de inibição para a ati... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The processes of formation, growth, remodeling and, when necessary, repair of the bone tissue occur through the coordinated and regulated action of the chemical and physiological events that participate in the intramembranous and endochondral ossifications, thus, the imbalance of the biomolecules involved in the process,maylead to the development of bone pathologies. During anuran's metamorphosis, there are marked and perceptible morphological changes that allow thetransition of the animal from the aquatic to the terrestrial environment, and the skeleton remodeling is one of the most remarkable transformations. Among the ways to study the mechanism of biological calcification, the enzymes alkaline phosphatase and tartrate-resistant acid phosphatase are used as biochemical markers of the action of osteoblasts and osteoclasts, respectively. In this sense, studies were carried out on tadpoles and frogs of Lithobates catesbeianusin order to better understand such ossification processes. The mean of the specific activity for the hydrolysis of pNPP(pH=10.5) by the alkaline phosphatase solubilised by Bacilluscereusphosphatidylinositol-specific phospholipase C (PIPLC)between the different bone regions at different ages of the animal was 1142.57 U.mg-1, while for the hydrolysis of PPi (pH=8.0) was 1433.82 U.mg-1. Among the compounds tested on the enzymatic activity, the one that most influenced was EDTA, with approximately 67% inhibition for pNPPase activity, and77% for PPase. In the ... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Físicas e Matemáticas. Programa de Pós-graduação em Química / Made available in DSpace on 2012-10-23T01:40:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 246307.pdf: 1522841 bytes, checksum: e270e85d281daf546c1840335752a9f5 (MD5) / Complexos biomiméticos do sítio ativo das PAPs foram sintetizados com o objetivo de elucidar o papel das PAPs nos sistemas vivos e simultaneamente encontrar novas aplicações para estes complexos como nucleases sintéticas. Com este intuito, foi testada a atividade de uma série de complexos heterodinucleares Fe3+M2+, usando o ligante assimétrico H2BPBPMP. Os complexos são: FeCuOAc, FeCuOH, FeZnOAc, FeZnOH, FeMnOH e FeNiOAc. O DNA plasmidial foi utilizado como modelo para testar a clivagem da ligação fosfato pelos complexos. Foram testadas diferentes condições de pH e concentração dos complexos. As reações também foram realizadas na presença de captadores de radicais livres e na ausência de oxigênio. Para verificar a interação complexo/DNA foram realizados experimentos com Distamicina e titulação espectrofotométrica UV-Vis. Todos os complexos, exceto FeNiOAc, foram capazes de clivar DNA por um mecanismo hidrolítico em baixas concentrações do complexo (2,5 µM) a 37 oC em pH próximo ao fisiológico (faixa de 6,0 a 7,0). O complexo FeNiOAc não cliva o DNA, mas pode se ligar ao DNA e alterar significativamente sua mobilidade. O complexo FeCuOAc é o mais ativo da série apresentando uma aceleração de 2,71 x 107 vezes quando comparado com o valor do DNA não catalisado, seguido por, FeMnOH, FeZnOAc, FeCuOH e FeZnOH.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Físicas e Matemáticas. Programa de Pós-Graduação em Química. / Made available in DSpace on 2012-10-23T10:16:27Z (GMT). No. of bitstreams: 0

Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2013-10-11T12:22:59Z No. of bitstreams: 1 Karla Graziela. Avaliação enzimática...pdf: 7967639 bytes, checksum: aadcd19e00e6ff487dba2f6a89822b03 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-10-11T12:22:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Karla Graziela. Avaliação enzimática...pdf: 7967639 bytes, checksum: aadcd19e00e6ff487dba2f6a89822b03 (MD5) Previous issue date: 2013 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz. Salvador, BA, Brasil / Entamoeba histolytica, o agente etiológico da amebíase, constitui a segunda maior causa de morte por protozooses, sendo considerado um grave problema de saúde pública, particularmente em países em desenvolvimento. A morte celular induzida por este parasito entérico é dependente de contato e mediada por proteínas específicas, as quais modulam diversos eventos fisiológicos no hospedeiro. Dentre os mecanismos reguladores de tais respostas está a desfosforilação de grupos fosfotirosil de proteínas, através da atuação de proteína tirosina fosfatases (PTPases), tanto expressas na superfície celular como secretados pelo trofozoíto. Alguns estudos demonstram uma rápida diminuição nos níveis de fosforilação de resíduos tirosina em proteínas de células-alvo após o contato com E. histolytica. Estas PTPases têm sido descritas como tendo importante papel na patogênese da amebíase. O objetivo deste estudo foi analisar o perfil de atividade fosfatásica em diferentes cepas de E. histolytica, assim como caracterizar a sua sensibilidade a conhecidos inibidores de proteína tirosina fosfatases, e os efeitos destes moduladores em mecanismos envolvidos na patogênese, a exemplo de fagocitose e efeito citopático. Inicialmente, a sensibilidade aos moduladores da via de sinalização celular em trofozoítos de E. histolytica (cepas ICB – 452, ICB – CSP e HM1:IMSS) foi caracterizada através de avaliação da proliferação celular, onde inóculos de parasitos foram incubados em presença ou ausência de inibidores de PTPases. Dentre os moduladores testados, o derivado de vanádio bisperoxo (1, 10 - fenantrolina) oxovanadato de potássio (bpVphen) e o óxido de fenilarsina (PAO) demonstraram efetiva capacidade antiproliferativa. Estas células apresentaram uma maior sensibilidade ao PAO em comparação ao bpV(phen), com valores de IC50 para a cepa HM1:IMSS de 0,9 μM e 38,4 μM, respectivamente. A análise bioquímica revelou que há uma maior atividade secretória e ectofosfatásica na linhagem HM1:IMSS (24,48 nM p-NP/40 min./3 x 106 células e 297 nM p-NP/40 min./2 x 105 células, respectivamente), e uma redução desta atividade foi detectada na presença dos derivados de vanádio na superfície do parasito (31,3 nM p-NP/40 min./2 x 105 células). O mesmo não foi observado após a adição de PAO. A análise da eritrofagocitose e da destruição da monocamada de células epiteliais da linhagem MDCK, importantes marcadores de virulência neste patógeno, demonstrou significativa redução destes processos em trofozoítos tratados com os inibidores ortovanadato de sódio (OVS) e o bpV(phen), indicando a participação de PTPases nos mesmos. Estas mesmas alterações foram observadas após o tratamento do parasito com PAO, porém dados ultraestruturais de citoquímica enzimática não indicam a redução da atividade fosfatásica por este composto. Estes dados foram confirmados após a avaliação da atividade das frações purificadas de homogenatos solubilizados de trofozoítos de E. histolytica, onde detectou-se a redução dos níveis de atividade enzimática após a adição de vanadato e seus derivados à reação, o que não pôde ser observado após o acréscimo de PAO. Os resultados obtidos indicam que PTPases estão diretamente envolvidas em importantes funções celulares exercidas por trofozoítos de Entamoeba histolytica. Ademais, novos estudos que visem à elucidação dos possíveis modos de ação do composto PAO neste patógeno poderiam contribuir, consideravelmente, com o entendimento da biologia do parasito e, consequentemente, dos mecanismos patogênicos da amebíase. / The microaerophilic protozoan Giardia lamblia inhabits the upper small intestine mucosa of vertebrate hosts, where it is exposed to different concentrations of oxygen. Despite the fermentative metabolism, Giardia trophozoites consume O2 and produce oxygen free radicals and therefore mechanism for detoxification are required. Devoid of glutathione, Giardia express high concentrations of cystein-rich proteins (CRP, also known as variable surface protein or VSP), as an antioxidant defense. This mechanism involves redox cycling for maintenance of a reduced intracellular environment and protection from oxidative stress. In this regard, substances that interfere in the antioxidant response of this protozoan could comprise a powerful chemotherapeutic strategy for Giardia lamblia infection. Here, we analyzed the effects of DETC, a superoxide dismutase (SOD) inhibitor, on parasite proliferation, thiol expression, lipid peroxidation, free radicals detection and cell architecture. DETC inhibited parasite proliferation at levels similar to metronidazole and induced peroxidation of membrane, possibly by the increase of reactive species.Ultrastructural alteration were also observed. Since this protozoan is devoid of SOD, here present data indicate SOD-independ DETC effects. Thiol groups detection with the fluorescent probe o-phthaldialdehyde (OPA). Cells treated with DETC displayed washed out cytoplasm and structures indicative of autophagy. The peripheral vesicles also had an increased volume, presumably caused by homophilic fusion. Taken together these data indicate that DETC enhance the oxidative stress in Giardia trophozoites by reacting with thiol groups.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2016. / Made available in DSpace on 2017-05-23T04:18:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 345481.pdf: 2659215 bytes, checksum: 3532ce8d584472564762a6d842dbec9a (MD5) Previous issue date: 2016 / O desenvolvimento de novas moléculas que auxiliam a manipulação de ácidos nucleicos é um tema que vem sendo alvo de grandes estudos nas áreas de bioquímica, biologia molecular, biotecnologia e química bioinorgânica, onde se buscam complexos que apresentam interação e/ou clivagem de ácidos nucleicos. Nestas áreas busca-se cada vez mais um modo de aprimoramento e incremento da seletividade destes complexos por regiões específicas do DNA. Dentro deste contexto, neste trabalho foram avaliados os potenciais de interação e clivagem de DNA através de 5 complexos binucleares biomiméticos derivados de fosfatases ácida púrpura, tomando como base o complexo FeZn-L0 e adicionando cadeias carbônicas de diferentes tamanhos com diaminas, como um modo de mimetizar a segunda esfera de coordenação da enzima. Todos os cinco complexos foram capazes de clivar o DNA plasmdial de um modo concentração-dependente. A variação do pH alterou significativamente a atividade destes complexos, o que indicou um mecanismo de clivagem semelhante àquele sugerido para a hidrólise do substrato modelo 2,4-BDNPP. Todos os complexos tiveram sua atividade inibida quando adicionado à reação concentrações crescentes dos sais NaCl e LiClO4, indicando que a neutralização das cargas do DNA pelos íons Na+ afeta diretamente o processo de catálise. Nenhum dos sequestradores de espécies reativas de oxigênio utilizados neste trabalho foram capazes de alterar a clivagem do DNA pelos complexos, sugerindo um mecanismo de atividade sem a participação de oxigênio, fato confirmado posteriormente pelo ensaio de clivagem na ausência de oxigênio em atmosfera de argônio. Foi possível perceber ainda que os complexos que apresentam as maiores cadeias carbônicas possuem uma preferência de interação com DNA através do sulco maior, sendo que o complexo que possui a menor cadeia carbônica não apresentou especificidade por ambos os sulcos, porém necessitou acessar o DNA por um destes. O complexo que não possui cadeia carbônica, por sua vez, apresentou uma preferência de interação ao DNA através do sulco menor. As constantes cinéticas encontradas neste trabalho mostraram que a inserção destas cadeias carbônicas ao complexo aumentou em até 5.5 vezes a eficiência catalítica dos mesmos. O ensaio de dicroísmo circular demonstrou que todos os complexos estudados foram capazes de alterar a estrutura secundária do DNA, diminuindo sua helicidade e o empilhamento de bases, fenômeno encontrado na literatura por moléculas que são capazes de acessar o DNA através dos sulcos maior ou menor. Por fim, ensaios de interação dos complexos com oligonucleotídeos demonstraram através da técnica de footprinting que os complexos são capazes de interagir com esta molécula e dificultar a clivagem do DNA pelo Fe-EDTA, principalmente em locais onde predominam bases pirimídicas, sugerindo uma especificidade destes complexos por estas regiões. De modo geral, a inserção de cadeias carbônicas como um modo de mimetizar uma segunda esfera de coordenação nestes complexos é uma estratégia viável para potencializar a atividade destas moléculas artificiais quanto a interação e clivagem de DNA.<br> / Abstract : The development of new molecules that aid in the handling of nucleic acids has been the subject of many studies in the fields of biochemistry, molecular biology, biotechnology and bioinorganic chemistry, searching for complexes that are capable of interacting and/or cleaving these molecules. These studiesfocus on the increase and enhancement selectivity of complexesto specific regions of DNA. In this context, this study evaluated the potential of interaction and cleavage of DNA by 5 biomimetic binuclear complexes derived from acid purple phosphatases, where,based on FeZn-L0 complex,carbon chains ofdifferent sizes containing diamines were added, in order to mimic the second coordination sphere of the model enzyme. All five compounds were able to cleave plasmid DNA in a concentration-dependent manner. Variations of pH changed significantly the activity of these complexes, which indicated a similar cleavage mechanism to the one suggested for the hydrolysis of the model substrate 2,4-BDNPP. All complexes had their activity inhibited by the additionof increasing concentrations of NaCl and LiClO4 saltsto the reaction, indicating that neutralization of DNA charges by Na + ions directly affects the catalysis process. None of the scavengers of reactive oxygen species used in this study were able to change the cleavage of DNA, suggesting activity reaction mechanism without the participation of oxygen, a fact later confirmed by the cleavage assay in the absence of oxygen.It was perceived that the complexes having longer carbon chains had a preferably interaction to DNA through the major groove.The complex with smaller carbon chain displayedno specificity for both grooves, but still required access to the grooves to bind with DNA. The kinetic constants found in this study indicated that the inclusion of these carbon chains tothe complex increased by up to 5.5 times the catalytic efficiency of the complexes.The circular dichroism assay demonstrated that all studied complexes were able to alter the secondary structure of DNA, by reducing its helicity and base stacking, a phenomenon found in the literature on molecules that are able to access the DNA through major or minor grooves. Lastly, interaction assays between complex and oligonucleotides,evaluated by ahydroxyl radical footprinting technique, showed that the complexes are capable of interacting and hinder cleavage of DNA by Fe-EDTA generated hydroxyl radicals, particularly in regions rich in pyrimidine bases, suggesting a specificity of these complexes tothese regions. In general, the inclusion of carbon chains as a way to mimic the second coordination sphere in these complexes is a viable strategy to potentiate the activity of these artificial molecules tointeract and cleave DNA.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Físicas e Matemáticas. Programa de Pós-Graduação em Química, Florianópolis, 2014. / Made available in DSpace on 2015-02-05T20:28:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 327744.pdf: 3387181 bytes, checksum: f953d00b12dd357296a0d6cf6ed03852 (MD5) Previous issue date: 2014 / Este trabalho teve como objetivo principal a síntese e caracterização de 22 chalconas derivadas do 4-carboxibenzaldeído, e avaliação da sua atividade biológica frente às enzimas PtpA e PtpB de Mycobacterium tuberculosis. As chalconas foram sintetizadas através do método de condensação de Claisen-Schmidt, utilizando quatro condições reacionais distintas. Todas as chalconas foram caracterizadas através de espectros de ressonância magnética nuclear (RMN) de 1H e 13C, ponto de fusão e espectros de massa (EM). As chalconas obtidas por via ácida (VA) forneceram primeiramente produtos esterificados, que foram hidrolisados para obter as chalconas com carboxila livre, que foram confirmadas pelo ponto de fusão. Entre as 22 chalconas obtidas, 13 são inéditas Q1VA, Q2VA, Q5VA, Q18VA, Q16VB, Q17VB, Q20VB, Q22VB, Q26VB, Q7VBR, Q3MC, Q4MC e Q9MC. As chalconas Q22VB e Q26VB foram as que apresentaram melhor atividade biológica frente às enzimas PtpA e PtpB de Mycobacterium tuberculosis. O composto Q23VB, análogo ao composto (E)-4-(3-(naftalen-2-il)-3-oxoprop-1-en-il) benzóico (QPadrão) anteriormente publicado pelo grupo e que tem alta atividade frente a estas enzimas, não teve atividade significativa.<br> / Abstract : This work aimed to the synthesis and characterization of 22 chalcones derived from 4 - carboxybenzaldehyde , and evaluation of their biological activity against PTPA and PTPB Mycobacterium tuberculosis enzymes . The chalcones were synthesized by the method of Claisen -Schmidt condensation using four different reaction conditions . All chalcones were characterized by nuclear magnetic resonance spectra ( NMR) 1H and 13C NMR , melting point and mass spectra ( MS). The chalcones obtained via acid (VA) provided first esterified product , which was hydrolyzed to obtain chalcones with free carboxyl , which was confirmed by melting point. Among the 22 chalcones obtained , 13 are new Q1VA , Q2VA , Q5VA , Q18VA , Q16VB , Q17VB , Q20VB , Q22VB , Q26VB , Q7VBR , Q3MC , Q4MC and Q9MC . The Q22VB and Q26VB chalcones showed the best biological activity against PTPA and PTPB Mycobacterium tuberculosis enzymes . The compound Q23VB , analogous to compound (E)-4-(3-(naftalen-2-il)-3-oxoprop-1-en-il) benzóico (QPadrão) previously published by the group and has high activity against these enzymes had no significant activity.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biolólogicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2012 / Made available in DSpace on 2013-06-26T00:12:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 314078.pdf: 10245292 bytes, checksum: 7c929eea613abee45aaedc328628ac4e (MD5) / A S-nitrosilação de PtpA de Mycobacterium tuberculosis diminui sua atividade fosfatase. O objetivo deste trabalho é investigar o efeito da S-nitrosilação nos parâmetros cinéticos e na estabilidade térmica de PtpA. Por meio de ensaios de biotin switch observou-se que a substituição do resíduo Cys53 por um resíduo de alanina em mutantes resultou em proteínas incapazes de se ligar a biotina após tratamento com doador de NO. Observou-se também que a KM da PtpA nitrosilada foi semelhante à sua forma não modificada, mas a Vmax foi reduzida pela metade. Em contraste, a mutante C53A tratada com GSNO mostrou KM e Vmax semelhantes à forma não tratada. Na desnaturação térmica de PtpA S-nitrosilada, a TM diminuiu consideravelmente na proteína selvagem, C11A e C16A, porém as mutantes C53A, C11A/C53A e C16A/C53A não tiveram mudanças significativas. Esses resultados sugerem que a S-nitrosilação ocorre especificamente na C53 não catalítica, essa alteração não afeta a afinidade pelo substrato e a S-nitrosilação da Cys53 afeta a estabilidade térmica da proteína. Por outro lado, outras duas proteínas de M tuberculosis foram estudadas, PtkA e SapM. A tirosina cinase PtkA fosforila a PtpA em dois resíduos de tirosina situados no PDYY-loop e se autofosforila na Tyr262. Neste trabalho, a PtkA recombinante foi expressa em bactérias E. coli BL21(DE3) e purificada por IMAC. Ensaios de CD revelaram que a proteína apresenta 42% de ?-hélice e 7% de folha-?, o que sugere que a proteína recombinante está corretamente enovelada. Por pertencer a família de proteínas HAD, a PtkA requer Mg2+ para a hidrólise do ATP. Foi observado que a TM da proteína aumenta consideravelmente na presença do metal, de 31 °C para 43 °C. Assim pode-se dizer que a ligação do metal ao sítio ativo estabiliza a estrutura terciária da proteína. A PtkA também é S-nitrosilada, porém o efeito dessa modificação pós-traducional sobre a atividade e estrutura da proteína ainda é desconhecido. A sequência de DNA que codifica SapM também foi inserida no vetor de expressão pET-14b. Diversas condições de expressão foram testadas sendo que se obteve maior rendimento em bactérias E. coli BL21 (DE3) pLysS na temperatura e tempo de indução de 15 °C por 20 horas. Como a proteína permaneceu na fração insolúvel do lisado bacteriano, essa teve que ser solubilizada pela adição de ureia 8M e posteriormente purificada por IMAC. As condições para o correto re-enovelamento ainda devem ser otimizadas para dar sequência à caracterização de SapM.<br> / Abstract : The S-nitrosylation of Mycobacterium tuberculosis PtpA decreases its phosphatase activity. The aim of this work is to investigate the effect of S-nitrosylation in PtpA kinetic parameters and thermal stability. By biotin switch assays it was observed that the substitution of Cys53 residue by an alanine residue in mutants C53A, C53A/C11A, C53A/C16A and C53A/C11A/C16A resulted in proteins unable to bind biotin upon NO donor treatment. It was also observed that the KM of nitrosylated PtpA was similar to its unmodified form, but the Vmax was reduced to half. In contrast, C53A treated with GSNO showed KM and Vmax similar to the untreated form. Thermal denaturation of Snitrosylated PtpA was evaluated by CD spectroscopy. When GSNO was added to PtpA, the TM decreased in wild type, C11A and C16A, while significant differences in C53A, C11A/C53A and C16A/C53A mutants were not observed. These results suggest that S-nitrosylation occurs specifically in the non-catalytic Cys53, this modification does not affect substrate affinity, and S-nitrosylated Cys53 affects protein thermal stability. Moreover, two other M. tuberculosis proteins are studied, PtkA and SapM. Tyrosine kinase PtkA phosphorylates PtpA in two tyrosine residues located in PDYY-loop and autophosphorylates at Tyr262. In this work, recombinant PtkA was expressed in E. coli BL21 (DE3), and purified by IMAC. CD experiments reveal that the protein has 42% á- helix and 7% â-sheet, which suggest that the recombinant protein is properly coiled. Like other proteins belonging to HAD family, PtkA requires Mg2+ for ATP hydrolysis. It was observed that the TM of this protein greatly increases in the presence of metal, from 31 °C to 43 °C. Thus, it can be said that the metal binding to the active site of this enzyme stabilizes the tertiary structure of the protein. It was observed that PtkA is also S-nitrosylated, but the effect of this post-translational modification on the structure and activity of the protein is still unknown. The DNA sequence encoding SapM was also inserted into the expression vector pET-14b. Various expression conditions were tested. The higher yield was obtained in E. coli BL21 (DE3) pLysS during 20 hours of induction at 15 °C. As the protein remained in the insoluble fraction of the bacterial lysate, it had to be solubilized by addition of 8M urea, and further purified by IMAC. The conditions for proper refolding still have to be optimized in order to be able to continue SapM characterization

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Físicas e Matemáticas, Programa de Pós-Graduação em Química, Florianópolis, 2010. / Made available in DSpace on 2013-12-05T22:04:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 320911.pdf: 2768339 bytes, checksum: 45ddacef31b14dfae19f52b38c1bf956 (MD5) Previous issue date: 2010 / Desde a descoberta da atuação de íons metálicos para o correto funcionamento de inúmeras enzimas, os químicos de coordenação têm sintetizado e caracterizado compostos que possam mimetizar tanto a estrutura quanto a função dessas enzimas. Neste trabalho foram sintetizados dois novos complexos binucleares com o ligante 2-[N-bis-(2-piridilmetil) aminometil]-4-metil-6-[N-(2-hidroxi-3-formil-5-metilbenzil)(2-piridilmetil)aminometil]fenol (H2py3mff), [(H2O)FeIII(u-OH)ZnII(py3mff)](ClO4)2 (1) e [(H2O)FeIII(u-OH)ZnII(py3mff)](ClO4)2 (2). O novo ligante foi caracterizado por espectroscopias na região do infravermelho e de ressonância magnética nuclear de hidrogênio. Os complexos 1 e 2 foram caracterizados por várias técnicas incluindo, espectroscopia no infravermelho, espectroscopia eletrônica, eletroquímica, titulação potenciométrica e difração de raios X em monocristal. Os dados estruturais levaram a considerar os complexos 1 como modelo estrutural para o sítio ativo da fosfatase ácida púrpura de feijão vermelho, com a unidade [(H2O)FeIII(u-OH)ZnII]. Os complexos também foram testados na atividade de fosfatase, frente à hidrólise do substrato bis(2,4-dinitrofenil)fosfato (2,4-bdnpp). Estes estudos revelaram que os complexos podem ser considerados como modelos funcionais das fosfatases com fatores catalíticos de cerca de 5 mil e 10 mil vezes a reação não catalisada, respectivamente. Destaca-se ainda que o ligante H2py3mff possui um grupo aldeído como substituinte, o que permite o ancoramento em suportes sólidos ou ainda em peptídeos.Uma propriedade importante que algumas enzimas apresentam é a promiscuidade catalítica, que é a capacidade de catalisar mais de um tipo de reação química. A promiscuidade catalítica apresenta um papel fundamental na evolução e acredita-se que esteja envolvida na biosíntese de metabólitos secundários.Devido a dificuldade em se obter grandes quantidades e cristais adequados dessas metaloenzimas e metaloproteínas, o uso de compostos modelos de baixa massa molar que sejam miméticos estruturais e/ou funcionais para estas biomoléculas tem contribuído na elucidação das suas propriedades físico-químicas e mecanismos de reação.Tendo em vista que o conteúdo metálico dos complexos é muito mais exposto que o das enzimas acredita-se que os mesmos possam apresentar promiscuidade catalítica, podendo então ter seu uso de particularmente aumentado.Assim, foi testada a promiscuidade catalítica de compostos já sintetizados e caracterizados [FeIII(?-OAc)2FeII(bpbpmp)](ClO4)2 (3), [FeIII(u-OAc)2FeIII(bpbpmp)](ClO4)3 (4), que mostraram ser promíscuos na catálise de hidrólise do substrato bis(2,4-dinitrofenil)fosfato e na oxidação do substrato 3,5-di-tercbutilcatecol. Foi testada ainda a promiscuidade dos complexos [(H2O)FeIII(u-OH)CuII(bpbpmp)](ClO4)2 (5) e [(H2O)FeIII(u-OH)CuII(bpbpmp-CH3)](ClO4)2 (6). Estes dois últimos complexos já haviam sido testados na hidrólise do substrato bis(2,4-dinitrofenil)fosfato e no presente trabalho foi testada a atividade de oxidação do substrato 3,5-di-tercbutilcatecol. O complexo 6 foi mais reativo que o complexo 5, mostrando que quanto menor a diferença entre os potenciais redox dos dois centros metálicos maior a atividade catalítica do mesmo.São abertas, através do presente trabalho, novas perspectivas de pesquisa, que a partir da derivatização de ligantes pode possibilitar outras aplicações, seja pelo ancoramento de compostos em sílica, nanopartículas magnéticas e nanopartículas de ouro, seja pela utilização de compostos previamente desenhados para certo tipo de atividade catalítica em outras reações, frente a outros substratos de interesse. <br> / Abstract : Enzymes are protein molecules with a three-dimensional globular shape. Their main functions are to accelerate chemical reactions in cells, and for that reason are often called biological catalysts. About a third of the enzymes and proteins with known structure have at least one metal ion in its constitution. An important property is that some enzymes show catalytic promiscuity, which is the ability to catalyze more than one type of chemical reaction. Promiscuity has a catalytic role in the evolution and is believed to be involved in the biosynthesis of secondary metabolites. Due to difficulty in obtaining suitable crystals and large amounts of these metalloenzymes and metalloproteins, the use of model complexes of low molecular weight that are structural and / or functional mimetics for these biomolecules has contributed to the elucidation of their physical-chemical properties and reaction mechanisms . Moreover, these compounds can be used as bioinspired catalysts of great interest in Medicine and Biotechnology. This work describes the synthesis, characterization and study of catalytic promiscuity bioinspired complex in hydrolytic enzymes. Thus, we synthesized two new complexes with the ligand H2py3mff (2-[N-bis-(2-piridilmetil)aminomethyl]-4-methyl-6-[N-(2- hydroxy-3-formyl-5-methylbenzyl) (2-piridilmetil) aminomethyl] phenol) FeIII(µ-OH)ZnII(py3mff) (H2O)] (ClO4)2 - complex 1 and FeIII(µ-OH)CuII(py3mff)(H2O)](ClO4)2 - complex 2. Both complexes had their X-ray structure determined showing that they are isostructural. The new complexes were characterized by electrochemical and spectroscopic techniques. pKa values for the coordinated water molecules were obtained by potentiometric titration. Trying to evaluate the catalytic promiscuity of binuclear complexes, the phosphatase and catecholase activities of complexes 1 and 2, and other complexes described in the literature FeIIIFeIIbpbpmp (complex 3), FeIIIFeIIIbpbpmp (complex 4), FeIII(µ-OH)CuII bpbpmp (complex 5), FeIII(µ-OH)CuII bpbpmp-CH3 (complex 6) were studied using the substrates 2,4-bdnpp and 3,5-dtbc.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Agrárias. Curso de Pós-Graduação em Agroecossistemas / Made available in DSpace on 2012-10-18T10:06:35Z (GMT). No. of bitstreams: 0