Made available in DSpace on 2015-08-20T17:10:05Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-03-25. Added 1 bitstream(s) on 2015-08-20T17:25:54Z : No. of bitstreams: 1 000841459_20170325.pdf: 280698 bytes, checksum: ddf6fe87e9e3214412eb46b4c5b5c542 (MD5) Bitstreams deleted on 2017-03-31T12:19:19Z: 000841459_20170325.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2017-03-31T12:20:22Z : No. of bitstreams: 1 000841459.pdf: 1087156 bytes, checksum: 876dbf5e07c145d71a408ab1d097865f (MD5) / A calcificação biológica é um processo muito bem regulado, no qual os diferentes tipos de tecidos, células, organelas e biomoléculas, participam na coordenação e regulação de eventos metabólicos envolvidos na deposição de fosfato de cálcio, sob a forma de cristais de hidroxiapatita. As alterações morfológicas ocorridas nos anuros, durante a metamorfose, são extremamente acentuadas e perceptíveis, sendo uma delas a remodelação do esqueleto. Os eventos relacionados à ossificação em girinos raramente são descritos na literatura. A fosfatase ácida tartarato resistente tem sido amplamente utilizada como um marcador específico de osteoclastos, células que participam do processo de reabsorção e de remodelação do tecido ósseo, enquanto a fosfatase alcalina tem sido usada como marcador de osteoblastos, células responsáveis pela formação do tecido ósseo. Estudos efetuados por vários pesquisadores, com o objetivo de determinar, principalmente, as enzimas presentes nas vesículas extracelulares dos condrócitos, têm revelado a presença de outras enzimas, além da fosfatase alcalina que são importantes para o processo de calcificação biológica. Assim, no presente trabalho foi avaliada a variação na atividade das fosfatases no processo de ossificação no período de desenvolvimento dos membros de Lithobates catesbeianus, a fim de contribuir na compreensão deste processo não somente em anuros, mas também nos demais vertebrados. Os animais foram dessensibilizados em água com gelo, decapitados, os membros foram removidos, em seguida os ossos foram descarnados e homogeneizados, centrifugados, sendo o sobrenadante aliquotado, congelado em nitrogênio líquido e armazenado a -70ºC para posteriores atividades enzimáticas e dosagem de proteína no extrato. As enzimas, fosfatase ácida e fosfatase alcalina, apresentaram estabilidade em todos os pH de armazenamento estudados... / Biological calcification is a tight regulated process in which different types of tissues, cells, organelles, and biomolecules participate in the coordination and regulation of metabolic events involved in accumulating calcium phosphate, in the form of hidroxiapatite crystals. The morphological changes that occur during anuran metamorphosis are extremely accentuated and perceptible, such as the remodeling of the skeleton. The ossification events are rarely described for tadpoles in the literature. The tartarate resistant acid phosphatase has been widely used as a specific marker of osteoclasts, cells that participate in the process of resorption and remodeling of bone tissue, while the alkaline phosphatase has been used as a marker for osteoblasts, cells responsible for bone tissue formation. Studies conducted by many researchers with the aim of determining, mainly, the enzymes in chondrocyte extracellular vesicles have revealed the presence of other enzymes, in addition to alkaline phosphatase, which are important to the process of biological calcification. Thus, in the present study, the changes in the activity of phosphatases in the ossification process during the development of the limbs of Lithobates catesbeianus was evaluated, with the aim to contribute to the understanding of this process not only in anurans, but also in other vertebrates. The animals were desensitized in water with ice, decapitated and limb bones were removed and homogenized, centrifuged, and the supernatant aliquoted, frozen in liquid nitrogen and stored at -70ºC for subsequent enzymatic activities and protein quantification. The enzymes, acid phosphatase and alkaline phosphatase, remained stable in all of the studied storage pH, the apparent pH optimum of hydrolysis of p-nitrophenyl phosphate (PNPP) was of 5.0 and 10.5, respectively, and the enzymes were stable at 45ºC and the t1/2 was 60 minutes at 55ºC for alkaline...

Orientador: João Martins Pizauro Junior / Banca: Marta Verardino de Stéfani / Banca: Luis Henrique Souza Guimarães / Resumo: A calcificação biológica é um processo muito bem regulado, no qual os diferentes tipos de tecidos, células, organelas e biomoléculas, participam na coordenação e regulação de eventos metabólicos envolvidos na deposição de fosfato de cálcio, sob a forma de cristais de hidroxiapatita. As alterações morfológicas ocorridas nos anuros, durante a metamorfose, são extremamente acentuadas e perceptíveis, sendo uma delas a remodelação do esqueleto. Os eventos relacionados à ossificação em girinos raramente são descritos na literatura. A fosfatase ácida tartarato resistente tem sido amplamente utilizada como um marcador específico de osteoclastos, células que participam do processo de reabsorção e de remodelação do tecido ósseo, enquanto a fosfatase alcalina tem sido usada como marcador de osteoblastos, células responsáveis pela formação do tecido ósseo. Estudos efetuados por vários pesquisadores, com o objetivo de determinar, principalmente, as enzimas presentes nas vesículas extracelulares dos condrócitos, têm revelado a presença de outras enzimas, além da fosfatase alcalina que são importantes para o processo de calcificação biológica. Assim, no presente trabalho foi avaliada a variação na atividade das fosfatases no processo de ossificação no período de desenvolvimento dos membros de Lithobates catesbeianus, a fim de contribuir na compreensão deste processo não somente em anuros, mas também nos demais vertebrados. Os animais foram dessensibilizados em água com gelo, decapitados, os membros foram removidos, em seguida os ossos foram descarnados e homogeneizados, centrifugados, sendo o sobrenadante aliquotado, congelado em nitrogênio líquido e armazenado a -70ºC para posteriores atividades enzimáticas e dosagem de proteína no extrato. As enzimas, fosfatase ácida e fosfatase alcalina, apresentaram estabilidade em todos os pH de armazenamento estudados... / Abstract: Biological calcification is a tight regulated process in which different types of tissues, cells, organelles, and biomolecules participate in the coordination and regulation of metabolic events involved in accumulating calcium phosphate, in the form of hidroxiapatite crystals. The morphological changes that occur during anuran metamorphosis are extremely accentuated and perceptible, such as the remodeling of the skeleton. The ossification events are rarely described for tadpoles in the literature. The tartarate resistant acid phosphatase has been widely used as a specific marker of osteoclasts, cells that participate in the process of resorption and remodeling of bone tissue, while the alkaline phosphatase has been used as a marker for osteoblasts, cells responsible for bone tissue formation. Studies conducted by many researchers with the aim of determining, mainly, the enzymes in chondrocyte extracellular vesicles have revealed the presence of other enzymes, in addition to alkaline phosphatase, which are important to the process of biological calcification. Thus, in the present study, the changes in the activity of phosphatases in the ossification process during the development of the limbs of Lithobates catesbeianus was evaluated, with the aim to contribute to the understanding of this process not only in anurans, but also in other vertebrates. The animals were desensitized in water with ice, decapitated and limb bones were removed and homogenized, centrifuged, and the supernatant aliquoted, frozen in liquid nitrogen and stored at -70ºC for subsequent enzymatic activities and protein quantification. The enzymes, acid phosphatase and alkaline phosphatase, remained stable in all of the studied storage pH, the apparent pH optimum of hydrolysis of p-nitrophenyl phosphate (PNPP) was of 5.0 and 10.5, respectively, and the enzymes were stable at 45ºC and the t1/2 was 60 minutes at 55ºC for alkaline... / Mestre

Orientador : Licio Augusto Velloso / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-03T14:29:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Calegari_VivianCristine_M.pdf: 6180308 bytes, checksum: 7a4e3bc66e5b6c11e6a0059f9355d04b (MD5) Previous issue date: 2003 / Resumo: O hormônio angiotensina II (AlI) exerce efeitos hemo dinâmicos, controladores da função renal e do equilíbrio hidroeletrolítico, e também efeitos remodeladores, mitogênicos e de crescimento no sistema cardiovascular. Suas ações são exercidas através de uma classe de receptores acoplados à proteína G heterotrimérica, designados ATl e AT2, os quais a-presentam sete segmentos transmembrana. A maioria dos efeitos conhecidos da AlI são exercidos através do subtipo de receptor AT1. O receptor AT2 apresenta, em geral, efeitos antagônicos aos de ATl, promovendo inibição do crescimento celular, diferenciação e a- poptose, através da ativação de proteínas tiro sina fosfatases que inibem as vias de sinaliza- ção ativadas por A T 1. Além das clássicas vias ativadas por hormônios que sinalizam através de receptores acoplados à proteína G, a AlI, através de ATl, é capaz de ativar a via de sinalização intra- celular JAKlSTAT, a qual é também ativada por hormônios que apresentam receptores com atividade tiro sina quinase intrínseca. Esta via é responsável pela transmissão do sinal dire-tamente da superficie celular para o núcleo, promovendo assim o controle da transcrição gênica e o crescimento celular. Existem na literatura vários relatos a respeito da ativação da via JAKlSTAT pela AlI, mas pouco é conhecido sobre os mecanismos de controle da transmissão do sinal através desta via. No presente estudo, examinamos o papel da AlI sobre os mecanismos de ativação e regulação da via de sinalização intracelular JAKlSTAT em coração de ratos adultos. Nos-sos resultados demonstraram que, após a ligação da AlI ao receptor ATl, ocorre fosforila-ção da fosfatase SHP2, a qual se liga a JAK2, translocando-o do citosol em direção à mem-brana a fim de formar o complexo AT1-SHP2-JAK2. JAK2 se autofosforila e promove a fosforilação em tiro sina de ATl. AT2 também é ativado, promovendo a ativação da fosfa-tase SHPl. Após AT1 e JAK2 atingirem um pico de fosforilação, SHP1liga-se a JAK2 e a AT1, desfosforilando-os e assim, inibindo a sinalização. Verifica-se que SHP2 é uma fosfa-tase importante para a ativação da via JAK/STAT, enquanto que SHP1 constitui-se num dos mecanismos de controle negativo desta via, ao lado da internalização do receptor A T 1. Um outro mecanismo possivelmente envolvido na inibição da via JAK/STAT é exercido através da proteína inibitória da sinalização, conhecida por SOeS3, a qual, após estímulo com AlI sofre aumento em seus níveis de expressão gênica e protéica. SOeS3 transloca-se do núcleo em direção ao citosol e à membrana e, num período mais tardio, encontra-se al-tamente expressa e associada a JAK2. Isto possivelmente faz com que JAK2 seja inibido e, transitoriamente, deixe de transduzir o sinal proveniente do receptor presente na superflcie celular para o núcleo. Logo, verificamos que a proteína SOeS3 constitui-se num mecanis-mo mais tardio de controle negativo da via JAK/STAT ativada pela AlI, enquanto que SHP 1 constitui-se num mecanismo precoce / Abstract: A complex interplay of tyrosine phosphorylationldephosphorylation events accom- panied by protein-protein associationldissociation participates in the activation and deacti- vation of the angiotensin II signal. In the present series of experiments, a complete characterization of the molecular dynamics of the angiotensin II signaI in cardiac tissue of living animais is reported. EvaIuation of signaIing events was performed by immunoprecipitation, immunoblotting, immunohistochemistry and subcellular ITactionation. Most of JAK2 im-munoreactivity is detected associated with SHP2 in a cytosolic compartment and presentinga low tyrosine phosphorylation status. ATI, mostly located in a membrane compartment, presents low tyrosine phosphorylation and is associated with SHP 1 while A T2 is associated with a restricted pool of JAK2, SHPI and SHP2. Following angiotensin II stimulus, SHPI dissociates ITom AT1 and AT2, which is followed by a rapid tyrosine phosphorylation of SHP2 that migrates together with JAK2 ITom the cytosolic compartment to a membrane -ATI associated ITaction. After 15-30 min of the angiotensin II pulse SHP1 becomes tyrosine phosphorylated and binds to JAK2, participating on its tyrosine dephosphorylation inducing its dissociation ITom AT1 and retum to the cytosolic and the AT2-bond ITaction. In paraIlel, SOeS-3 is induced by angiotensin II and after 20 minutes a rise on its protein levels is detected in a membrane ftaction in association with JAK2 / Mestrado / Fisiologia / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Mario Jose Abdalla Saad / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-24T14:30:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 AlvarezRojas_Fernanda_M.pdf: 3140894 bytes, checksum: 7d5f8766dbf8cf0c2dea66da1d3b08d0 (MD5) Previous issue date: 1998 / Resumo: A insulina é um potente hormônio com efeito metabólico e promotor do crescimento atuando no metabolismo de carboidratos, proteínas e lipídios. O efeito no crescimento é induzido pela participação da insulina na síntese de RNA e DNA, em praticamente todas as células. A insulina inicia suas ações celulares através da ligação ao seu receptor transmembrana. Este receptor comporta-se, funcionalmente, como uma enzima alostérica, com uma subunidade a regulatória e uma subunidade ß catalítica, que uma vez ativada se autofosforila e fosforila outros substratos em resíduos tiro sina, desencadeando uma cascata de ativações e desativações de proteínas. Têm sido descritos vários substratos endógenos para o receptor de insulina e o nosso laboratório demonstrou que a insulina fosforila uma proteína da família das quinases, a J anus-quinase 2 ou JAK2. Acredita-se que a transmissão do sinal pelas JAKs ocorre através da fosforilação em tiro sina de proteínas citoplasmáticas chamadas STATs, provavelmente relacionas ao crescimento celular. Maegawa et aI. (1996) demonstraram que a insulina também é capaz de ativar a interação JAK2/Syp. A proteína Syp é uma tirosina fosfatase também chamada de SHPTP2 ou PTPID. Entretanto a regulação desta nova via de transmissão do sinal insulínico não foi ainda investigado em situações que alteram a sensibilidade à insulina. Deste modo, o objetivo do presente trabalho foi investigar os níveis e grau de fosforilação em tiro sina da proteína JAK2, a associação de JAK2 com SHPTP2 e com STATl em coração de ratos em três situações de resistência à insulina: jejum prolongado de 72 horas, tratamento crônico com dexametasona e tratamento agudo com adrenalina.Nossos resultados demonstraram uma diminuição na quantidade de proteína JAK2 nos ratos submetidos a jejum prolongado, apresentando igualmente uma diminuição na estoiquiometria da fosforilação de 70% (p<0.05). Também foi observado um aumento na associação da JAK2/STATl de 160% (p<0.05) e uma redução na associação de JAK2/SHPTP2 de 85% (p<0.05) nos ratos em jejum. Quando os ratos foram tratados durante cinco dias com dexametasona foi observado um importante aumento na quantidade de proteína JAK2 e uma diminuição da estoiquiometria de fosforilação para 20% (p< 0.05). A associação JAK2/STATl foi reduzida para 70% (p<0.05) e a associação JAK2/SHPTP2 apresentou um aumento de 170% (p<0.05) nesses animais. No tratamento agudo com adrenalina não foi observado diferença na fosforilação da proteína JAK2, nem nas associações JAK2/STATl e JAK2/SHPTP2. Em resumo, este trabalho mostra que tanto nos ratos em jejum de 72 horas como nos ratos tratados com dexametasona, duas situações de resistência à insulina, ocorre uma diminuição no grau de fosforilação em tiro sina da JAK2 induzido por insulina em coração apesar de uma regulação diferente na quantidade tecidual desta proteína. Esta redução da fosforilação da JAK2 foi acompanhada de alterações inversas na associação desta quinase com as proteínas SHPTP2 e STAT1 / Mestrado / Fisiologia / Mestre em Ciências Biológicas

Orientador: João Martins Pizauro Júnior / Banca: Marcia Regina Cominetti / Banca: Marcos Túlio de Oliveira / Banca: Andrei Leitão / Banca: Luis Henrique Souza Guimarães / Resumo: A metamorfose dos anfíbios é um processo altamente regulado que envolve a participação de hormônios e biomoléculas na morte celular e absorção da cauda, a qual libera nutrientes para as transformações morfofisiológicas necessárias para a ocupação do meio terrestre. Dentre os nutrientes liberados, o fosfato é essencial para a síntese de ATP, membranas biológicas, ácidos nucleicos e metabólitos fosforilados, bem como para a regulação de processos degradativos e da atividade de enzimas. Neste sentido, a identificação e caracterização cinética das fosfatases que participam da absorção da cauda de girinos de Lithobates catesbeianus, durante a passagem da fase larval aquática para a adulta terrestre, poderão contribuir para a compreensão dos eventos envolvidos na morte celular e na liberação de nutrientes. O estudo revelou aumento da atividade das fosfatases ácida e alcalina, de aproximadamente 30 e 17 vezes, respectivamente, no período da metamorfose. A centrifugação diferencial do extrato bruto da cauda e os estudos cinéticos, permitiram a identificação de três fosfatases distintas, sendo uma fosfatase ácida solúvel, uma fosfatase ácida ligada à membrana e uma fosfatase alcalina ligada à membrana por meio da âncora de fosfatidilinositol. A fosfatase ácida ligada à membrana revelou Vm=104,5 U.mg-1; Km=0,29 mM e nH=0,9; a solúvel, Vm= 25,9 U.mg-1; Km=0,33 mM e nH =0,8, enquanto a fosfatase alcalina ligada à membrana revelou Vm=10,5 U.mg-1; Km=0,2 mM e nH=1,0, para a hidrólise do pN... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Amphibian metamorphosis is a tightly regulated transformation that involves the participation of hormones and other biomolecules in cell death and tail absorption, to release nutrients for the morphophysiological changes necessary for the occupation of the terrestrial environment. Among these nutrients, the phosphate is essential for the synthesis of ATP, biological membranes, nucleic acids and phosphorylated metabolites; regulation of degradative processes and of enzymes activity. In this sense, the identification and characterization of the phosphatases that participate in the absorption of the tail of Lithobates catesbeianus during the transition from the aquatic larval phase to the terrestrial adult, may contribute to the understanding of the events involved in cell death and nutrient release.The study showed that there was an increase in the activity of the acid and alkaline phosphatases of approximately 30 and 17 fold, respectively, in the metamorphosis period. The differential centrifugation of the tail crude extract, as well as the kinetic tests, allowed the identification of three distinct phosphatases, a soluble acid phosphatase, a membrane bound acid phosphatase and an alkaline phosphatase bound to the membrane by the anchor of phosphatidylinositol. The kinetic characterization of membrane bound acid phosphatase revealed Vm=104.5 U.mg-1; K0.5=0.29 mM and nH=0.9; the soluble, Vm= 25.9 U.mg-1; K0.5=0.33 mM and nH =0.8, while the membrane bound alkaline phosphatase revealed Vm=10.5 U.mg-1; K0.5=0.2 mM and nH=1.0, for pNPP hydrolysis. The mass spectrometry results showed the presence of three protein phosphatases, two serine/threonine, being one PP2A, one PP1 and one tyrosine, PTP-LMW. Studies using specific substrates for PP2A and PTP-LMW and inhibitor for PP1 confirmed their presence in the tail of the tadpoles of L. catesbeianus. In addition, the separation in different protein fractions, allowed... / Doutor

RESUMO As fosfatases alcalinas sao enzimas que participam da atividade catalitica na hidrolise de ésteres fosfóricos. Nesta Dissertação, investigou-se a sua adsorção em monocamadas de Langmuir e também em filmes do tipo Langmuir-Blodgett (LB) de fosfolipídios em diferentes temperaturas. Esses sistemas são considerados como modelos para membranas biológicas. O efeito de um dissacarídeo (trealose), bem como as impurezas contidas na amostra do açúcar, foi testado na subfase que suporta a monocamada,. Constatou-se que a trealose nao purificada altera a isoterma superficial de monocamadas do sal de sódio do acido dimiristoilglicerofosfatidico, DMPA, e atua como um bom agente de ligação entre camadas sucessivas do fosfolipídio para a obtenção de filmes LB. Já para trealose purificada nao se observaram esses efeitos. A caracterização das impurezas foi realizada por espectroscopia na região do infravermelho e por absorção atômica, detectando-se a presença de moléculas anfifílicas e de íons metálicos (Na+, K+, Ca2+, Mg2+), respectivamente. Dois tipos de fosfatases alcalinas foram usadas: uma purificada de placa óssea de ratos por extração com tensoativo nâo-iônico, chamada de DSAP e outra purificada de conídia de Neurospora crassa, denominada CNCAP. As interações com o fosfolipídio foram estudas por meio das mudanças nas curvas -A e a adsorção em filmes LB de DMPA/Zn2+ e DMPA/trealose, por meio da técnica de microbalança a cristal de quartzo (QCM). A presença das enzimas nos filmes foi também comprovada pela detecção de suas atividades catalíticas na hidrolise do PNPP (p-nitrofenilfosfato). Para a DSAP, a melhor atividade foi obtida quando a imobilização da proteína ocorreu a baixa temperatura (10º C). / ABSTRACT Alkaline phosphatases (AP) are unspecific enzymes that hydrolyze phosphate esthers. In this Dissertation we have studied the adsorption of two forms of AP in phospholipid Langmuir monolayers and Langmuir-Blodgett films, considered as biomembrane models, at different temperatures. Further, the effect of the presence of a disaccharide, trehalose, as well as some impurities present in its commercial form, in the subphase of the monolayers was tested. We concluded that the use of trehalose without further purification alters the surface pressure-area (Pi-A) curves of the monolayers. In addition, it acts as a good linking agent between successive layers in the Langmuir-Blodgett films of the sodium salt of 1,2-dimirystoyl-sn-glicero-3-phosphate acid, DMPA. In the presence of purified trehalose instead, these effects were not observed. No difference was noticed in the Pi-A curves of DMPA for trehalose concentrations between 10-3 mmol L-1 to 0.1 mmol L-1. The characterization of the impurities by atomic absorption and infrared spectroscopy reveal the presence of amphiphilic compounds as well as electrolytes such as: sodium, magnesium, calcium and potassium Two forms of AP were used: one purified from rat osseous plates using detergent solubilization, named DSAP, and the other from Neurospora crassa conidia, CNCAP. Enzyme interaction with phospholipids was followed by changes in Pi-A curves, and their adsorption on DMPA/Zn2+ or DMPA/trehalose LB films using the quartz crystal microbalance technique, QCM. Their presence within the films was also monitored by catalytic activity assays, using PNPP (p-nitrophenylphosphate) as hydrolysis substrate. For DSAP, the highest enzymatic activity was observed when the immobilization was carried out at low temperature (10o C).

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Físicas e Matemáticas, Programa de Pós-Graduação em Química, Florianópolis, 2005 / Made available in DSpace on 2013-07-16T02:29:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 275685.pdf: 2446474 bytes, checksum: dc68acf2f009b907513b09e1486a1a41 (MD5) / Complexos de metais de transição com ligantes binucleantes têm sido descritos como modelos para o sítio ativo de inúmeras metaloenzimas. No entanto, algumas delas apresentam sítios bastante difíceis de modelar, devido à sua alta complexidade, tais como as fosfatases ácidas púrpuras (PAP's), que, in vitro, catalisam a hidrólise de ésteres e anidridos fosfóricos. Estas apresentam um sítio ativo binuclear, com conteúdo metálico variável, contendo um átomo de FeIII e um outro metal MII = Fe, Zn ou Mn. Neste trabalho esta descrita a síntese e caracterização de 3 novos complexos com o ligante N, O doador 2 - [ N - ( 2 - piridilmetil ) ( carboxiamidometil ) aminometil ] - 4 - metil - 6 - [ N - ( 2 - hidroxibenzil ) ( 2 - piridilmetil ) aminometil ] fenol (H2L), que contem um grupamento amida visando mimetizar o resíduo de asparagina presente no sítio ativo da enzima.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biologicas, Programa de Pós-graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2011 / Made available in DSpace on 2012-10-26T06:32:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 290250.pdf: 1651252 bytes, checksum: 16dd2b4c210960ba463863c566109f87 (MD5) / Trypanosoma cruzi é o agente etiológico da doença de Chagas. Esta doença afeta de 15 a 16 milhões de pessoas na América Latina e, mesmo após um centenário de sua descoberta, ainda não se conseguiu desenvolver uma vacina e nem tratamentos totalmente eficazes. O presente trabalho apresenta a caracterização de uma arsenato redutase de T. cruzi. Esta enzima, apesar de ter significante homologia com fosfatases de dupla-especificidade, apresenta uma baixa capacidade de defosforilar o substrato p-nitrofenilfosfato. Quando testada em um sistema de oxi-redução, a PTP putativa de T. cruzi é capaz de reduzir o arsenato [As(V)] à arsenito [As(III)] e esta redução requer a presença da enzima glutaredoxina. Este é o primeiro trabalho que descreve uma arsenato redutase de T. cruzi. A fosfotirosina fosfatase YopH é um fator de virulência relevante na patogenicidade das bactérias Yersinia pestis, Y. pseudotuberculosis e Y. enterocolitica. A YopH tem a capacidade de modular a resposta inflamatória à bactéria através de processos que envolvem a quebra de adesões focais, liberação de fator de necrose, inibição da fagocitose, além de também impedir a função dos linfócitos B e T prevenindo a resposta imune adaptativa. Devido à sua importância, a YopH emerge como um potencial alvo terapêutico. Neste trabalho foram analisados 265 compostos sintéticos, dos quais 4 apresentaram valores de IC50 inferiores a 50 µM, sendo eles L46 (38,55 µM), P4 (15,08 µM), P11(9,92 µM) e R28 (20,29 µM). Estes compostos são chalconas e atuam como inibidores competitivos da YopH com Ki de 11,01 µM (L46), 3,13 µM (P4), 2,41 µM (P11) e 14,93 µM (R28). / Trypanosoma cruzi is the etiological agent of Chagas' disease. This illness affects 15 to 16 million people in Latin America and even after a century of its discovery,it has not managed to develop a vaccine and effective treatment. This work presents the characterization of an harsenate reductase from T. cruzi. This enzyme, despite having a significant homology with dual specificity phosphatases, has a low capacity to dephosphorylate the substrate p-nitrophenyl phosphate. When tested in an oxi-reduction system, the putative PTP from T. cruzi is able to reduce arsenate to arsenite and this reduction requires the presence of glutaredoxin. This is the first study that describes an arsenate reductase from T. cruzi. The phosphotyrosine phosphatase YopH is a relevant virulence factor in the pathogenicity of the bacteria Yersinia pestis; Y. pseudotuberculosis and Y. enterocolitica. YopH is able to modulate the inflammatory response to the bacteria through processes that involves the disruption of focal adhesion, release of tumor necrosis factor , inhibition of phagocytosis and also block the fuction of T and B lymphocyte preventing the adaptive immune response. Due to its importance, YopH emerges as a potencial therapeutic target. In this work, it was analysed 265 synthetic compounds, among these 4 presented IC50 values below 50 ìM which are L46 (38.55 ìM), P4 (15.08 ìM), P11(9.92 ìM) and R28 (20.29 ìM). These four compounds are chalcones and act as competitive inhibitors. They present the following Ki values: 11.01 ìM (L46), 3.13 ìM (P4), 2.41 ìM (P11) and 14.93 ìM (R28).

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Físicas e Matemáticas. Programa de Pós-graduação em Química / Made available in DSpace on 2013-07-15T22:57:09Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Neste trabalho foram sintetizados e caracterizados 6 novos complexos de Cu(II) empregando-se os ligantes: H2Ldtb, H2BPBPMP-CH3, H2BPBPMP-NO2 e H2BPBPMP. Os complexos de Cu(II) foram testados na reação de oxidação do substrato 3,5-DTBC e podem ser considerados modelos funcionais para as catecol oxidases. Também foram sintetizados e caracterizados 4 novos complexos de Fe(III)Zn(II) empregando-se os mesmos ligantes. Os compostos de Fe(III)Zn(II) foram testados frente à hidrólise do substrato 2,4-BDNPP e apresentaram fatores de aceleração de 2200 e 5200 vezes, respectivamente, em relação à reação não catalisada. Considerando os complexos de Fe(III)Zn(II) destaca-se que as propriedades espectroscópicas, eletroquímicas e de reatividade seguem uma relação linear com as constantes de Hammett. Desta forma, esses complexos podem ser considerados isoestruturais em solução, evidenciando-se que os complexos heterobinucleares de Fe(III)Zn(II) são os segundos a mimetizar a unidade (OH2)Fe(III)(m-OH)Zn(II) da kbPAP na literatura. Estudos preliminares de clivagem de DNA empregando-se os complexos de Cu(II) demonstraram que os complexos modelos são capazes de promover a clivagem da forma superenovelada para a forma circular e linear de DNA plasmidial levando a considerá-los como nucleases químicas.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2015. / Made available in DSpace on 2016-10-19T13:19:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 334243.pdf: 5585985 bytes, checksum: 4f3d8bd503e7a8f2e8284a04905635ec (MD5) Previous issue date: 2015 / Proteínas tirosina fosfatases (PTP) têm um importante papel na transdução de sinal e no controle de diversas funções celulares. Bactérias patogênicas como as do gênero Yersinia e do complexo Mycobacterium tuberculosis (Mtb), utilizam suas PTP para subverter as células de defesa do hospedeiro. As bactérias patogênicas do gênero Yersinia possuem em comum a produção de uma PTP chamada YopH que modula a resposta inflamatória do hospedeiro à bactéria através de processos que envolvem a inibição da fagocitose, quebra de adesões focais e subversão da função dos linfócitos B e T prevenindo a resposta imune adaptativa. As doenças humanas causadas pelas espécies patogênicas de Yersinia variam desde síndromes gastrointestinais à peste bubônica, sendo esta última uma doença grave que ainda não foi erradicada e é associada a milhares de mortes no passado. O Mtb causa a tuberculose, doença que afeta principalmente o trato respiratório. Segundo dados da Organização Mundial da Saúde, a tuberculose foi responsável por 1,5 milhões de mortes somente no ano de 2013. Durantes a invasão das células de defesa, o Mtb produz duas PTP, a PtpA e a PtpB. Estas fosfatases, assim como a YopH, tem por função burlar o mecanismo de defesa do hospedeiro. A PtpA é responsável por modular a apoptose celular e impedir a acidificação do fagossomo e a fusão deste com o lisossomo. Já a PtpB, impede a produção de IL-6 e previne a morte do macrófago pela ativação da via de sinalização de Akt e bloqueio da atividade da caspase-3. A busca de inibidores da YopH de Yersinia spp. e das fosfatases do Mtb é de grande interesse para a produção de possíveis fármacos que poderiam ser utilizados no tratamento das doenças provocadas por estas bactérias. No presente trabalho, uma biblioteca de 398 compostos foi triada com o objetivo de identificar novos inibidores da YopH. Dentre os inibidores encontrados, 22 apresentaram valores de IC50 inferiores a 10 µM, sendo que 3 estão na faixa de nanomolar (o que os coloca entre os melhores inibidores descritos para esta fosfatase até o momento). Foram encontrados tanto inibidores competitivos (12 compostos) como não competitivos (6 compostos) da YopH e cinco compostos (delfinidina, AAA e os três complexos de vanádio) apresentaram valores de Ki na faixa de nanomolar. Avaliou-se também a citotoxicidade em células THP-1 e HepG2 além da atividade antitubercular de seis inibidores das fosfatases de Mtb (PtpA e PtpB) previamente relatados por nosso laboratório em 2012. Identificou-se dois compostos que não são citotóxicos (compostos 43 e 95) e dois compostos que apresentaram atividade em ensaios de infecção intracelular (compostos 95 e 96). De acordo com todos os resultados obtidos no presente trabalho, identificamos novas chalconas como eficientes inibidores da YopH além de 3 complexos de vanádio com uma marcante inibição em escala nanomolar. Quanto aos inibidores da PtpA e PtpB, o composto 95 mostrou-se não citotóxico e com atividade nos ensaios de infecção intracelular. Este composto poderia ser utilizado como molde na busca de outros compostos mais ativos ajudando assim no desenvolvimento de novas terapias contra o Mycobacterium tuberculosis.<br> / Abstract : Protein tyrosine phosphatases (PTP) have an important role in signal transduction and in the control of many cell functions. Pathogenic bacteria from Yersinia genus and Mycobacterium tuberculosis (Mtb) complex, utilize their PTP to subvert host?s defense cells. Pathogenic bacteria from Yersinia genus have in common the production of a PTP named YopH, this enzyme modules the host inflammatory response against the bacteria through processes that evolves the phagocytosis inhibition, focal adhesion disruption and impairing the function of B and T lymphocytes preventing the adaptive immune response. Diseases caused by pathogenic species of Yersinia range from gastrointestinal syndromes to bubonic plague. Bubonic plague is a not eradicated disease that is associated with thousands of deaths in the past. Mtb causes tuberculosis, a disease that affects mainly the respiratory tract. According to World Health Organization data, only in 2013 tuberculosis caused 1.5 million deaths. During the defense cell invasion, Mtb produces two PTP, PtpA and PtpB. These phosphatases act like YopH, they help the bacteria to evade the host defense mechanism. PtpA modulates the cellular aptotosis and it also impairs the phagosome acidification and its fusion with lysosome. PtpB prevents the production of IL-6 and macrophage death by activation Akt signaling pathway and by blocking caspase 3 activity. The search for inhibitors of YopH from Yersinia and Mtb phosphatases is of great interest for the production of drugs that could be used in the treatment of the diseases caused by these bacteria. In this work, an in-house library of 398 compounds was screened with the objective to search new YopH inhibitors. Out of the inhibitors found, 22 presented IC50 values below 10 µM, three of those in nanomolar range (this characteristic put these three compounds between the best described inhibitors for this phosphatase). We found competitive inhibitors (12 compounds) and non-competitive inhibitors (6 compounds) for YopH and five compounds (Delphinidin, AAA and three vanadium complexes) presented Ki values in nanomolar range. Cytotoxicity assays were made with two human cell lines THP-1 and HepG2 we also assayed the antitubercular activity of six inhibitors of Mtb PTP. The inhibitory activity against PtpA and PtpB of these six compounds was previously described in 2012 by our lab. The cytotoxicity and antitubercular assays resulted in two non-cytotoxic compounds (compound 43 and 95) and two compounds that are activity in intracell infection assays (compounds 95 and 96). In this present work we show new chalcones as eficient inhibitors of YopH, we also identified 3 vanadium complex with remarkable inhibition in nanomolar scale. According to the results obtained to PtpA and PtpB inhibitors, we identified the compound 95 which is no cytotoxic and has activity in intracell assays. This compoud could be used for the design of new compound with improved activity helping in the development of new therapies against Mycobacterium tuberculosis.