Les données bibliographiques décrivent un nombre croissant de modèles murins caractérisés sur le plan de la fertilité permettant une meilleure compréhension du phénomène de la croissance folliculaire. Certains de ces modèles animaux, invalidés pour des facteurs de transcription reproduisent un phénotype d’infertilité, telle que l’insuffisance ovarienne primaire (IOP). La compréhension des mécanismes moléculaires des facteurs de transcription essentiels à la fonction ovarienne n’est pas clairement établie. Les protéines contenant des domaines liant l’ADN, tels que les homéodomaines ou les domaines forkhead jouent un rôle-Clé dans le développement ovarien. NOBOX (Newborn Ovary Homeobox) est un facteur de transcription essentiel à la mise en place du stock folliculaire, et dont les mutations sont responsables d’IOP. La fonction exacte de NOBOX n’est pas connue, s’il est présent dans l’ovocyte, nous montrons pour la première fois une forte expression de cette protéine dans les cellules de la granulosa des follicules primordiaux jusqu’au stade secondaire. De plus, par différentes techniques moléculaires, nous mettons en évidence une interaction entre NOBOX et un autre acteur important de la folliculogenèse FOXL2 (Forkhead box l2), contribuant à la régulation de leurs gènes cibles respectifs. Cette étude permet de mettre en lumière le rôle de NOBOX dans les cellules de granulosa. L’IOP est une pathologie touchant 1 % des femmes âgées de moins de 40 ans. Sur le plan ovarien, il y a une déplétion du stock des follicules ou un blocage de la maturation folliculaire. De ce fait, la stérilité est le plus souvent définitive. Une origine génétique de cette maladie est parfois retrouvée avec des mutations des autosomes et/ou du chromosome X, mais dans plus de 80% des cas l’IOP est idiopathique. L’enjeu est donc d’identifier de nouveaux gènes candidats pour cette pathologie. Dans cette étude nous validons la prévalence des mutations du gène NOBOX faisant de ce facteur un des gènes clés de l’IOP. Puis, à l’aide d’une nouvelle technologie : le séquençage multiplex par puces PGMTM ION TORRENT, nous mettons en évidence dans 26% de la cohorte étudiée (100 femmes atteintes d’IOP sporadique primaire ou secondaire) un défaut génétique de 10 gènes, dont 4 nouveaux candidats à l’IOP. De façon intéressante, la présence d’au moins deux gènes mutés chez 9 patientes induit un phénotype plus précoce. Cette étude contribue à une meilleure compréhension de l’origine génétique de l’IOP et met pour la première fois en évidence le phénomène d’oligogénisme chez des patientes en IOP. / Single germline mutations found in women with primary ovarian insufficiency (POI), besides mouse models have provided substantial understanding into the factors involved in differentiation and ovarian development. POI is characterized by amenorrhea with elevated gonadotropin levels, and affects 1% of women before the age of 40 years.Several transcription factors involved in ovary development and folliculogenesis are mutated in reproductive disorders. We have shown a high prevalence of POI cases harboring mutations in the Newborn oogenesis homeobox (NOBOX) gene, which encodes a homeodomain-Containing transcription factor expressed preferentially in oocyte. NOBOX plays a critical role in early folliculogenesis and its absence leads to sterility. In addition to its oocyte localization, we show here that NOBOX is also expressed in granulosa cells (GCs), those surrounding the germ cell. Since NOBOX and FOXL2, a master regulator of GC development (belonging to forkhead family), are co-Expressed in GCs. Here, using several molecular approaches, we have demonstrated that NOBOX and FOXL2 indeed physically interact leading to a down-Regulation of their transactivation capacity. Altogether, these observations highlight a novel role for NOBOX in interaction with FOXL2, and suggest that they may be antagonistic transcription regulators. POI encompasses a heterogeneous spectrum of conditions, through two major mechanisms, follicle dysfunction and follicle depletion. Genetic component such as X chromosome abnormalities, deletions, FMR1 premutations, BMP15 variants, were identified as the first genetic causes of the pathophysiology. Today, the genetic origin of POI is supported by the existence of monogenic forms in humans and animal models but the relevance of several loci for POI pathogenesis should not be ruled out. By means of a next-Generation sequencing , a multiplex (PGM-Ion Torrent technology) sequencing of 19 genes was undertaken in a cohort of 100 nonsyndromic women with POI. In 26 patients, we reported 10 gene defects, among them, missense mutations in 4 new candidates were detected. Our aggregate data suggest that point mutations in these candidate genes are causative of the disease by prediction analysis assays. Two to three gene defects can synergize to produce a more severe phenotype in POI patients than either alone. This study identifies for the first time in a large proportion of POI patients specific sets of germline mutations that, together, may account for this disease. Thus, oligogenicity also has implications for genetic counseling regarding POI.

L’implantation est caractérisée par les premiers contacts cellulaires permanents entre l’endomètre, tapissant l’utérus, et le conceptus (disque embryonnaire et tissus extra-embryonnaires). Cette étape se trouve être l’un des plus importants points de contrôle de la gestation nécessitant un dialogue finement régulé entre ces deux entités. Concernant les ruminants, un déclin de la fertilité a été observé notamment chez les vaches laitières hautes productrices. La moitié des gestations s’arrête pendant la période pré-implantatoire due à des mortalités embryonnaires précoces ainsi qu’à des défauts utérins. Depuis 10 ans, des analyses exploratoires ont été mises en place dans le but d’étudier les profils d’expression de gènes endométriaux sous l’influence du cycle oestral, de la gestation précoce ou encore des stéroïdes ovariens comme la progestérone et les oestrogènes. Ces études sont essentielles pour l’identification des gènes endométriaux clés pour la survie et la croissance du conceptus avant l’implantation. Notre laboratoire a réalisé une analyse transcriptomique à partir d’échantillons endométriaux collectés sur des vaches cycliques et gestantes au 20 ème jour post-oestrus correspondant respectivement à la phase folliculaire et au premier jour d’implantation. Plusieurs familles de facteurs de transcription apparaissent différentiellement exprimées dans cette étude, notamment FOXL2, un membre de la famille des Forkhead Box transcription factor considéré comme le gène clé de la différenciation ovarienne. Ce travail de thèse s’est intéressé à l’implication de FOXL2 dans la physiologie endométriale. FOXL2 est exprimé et régulé pendant le cycle oestral et la gestation précoce dans l’endomètre de ruminants. De plus, la progestérone a été identifiée comme le régulateur majeur de l’expression endométriale de FOXL2 chez la vache et la brebis alors que l’effet des estrogènes n’a pas été démontré. A partir d’une approche gènes candidats, la surexpression de FOXL2 induit la régulation différentielle de onze gènes potentiellement cibles de FOXL2 dans des cultures primaires endométriales de cellules stromales et épithéliales glandulaires. En particulier, PTGS2 qui est un gène impliqué dans la réceptivité utérine apparait inhibé par FOXL2 alors que SCARA5 et RSAD2, tout deux impliqués dans la réponse immunitaire sont stimulés. Enfin, DLX5 apparait différentiellement régulé entre les cellules stromales et épithéliales glandulaires sous l’impact d’une surexpression de FOXL2. Pour conclure, l’expression endométriale de FOXL2 est fortement liée au processus de réceptivité utérine qui se déroule avant l’implantation et peut moduler l’expression de gènes endométriaux essentiels. De nouvelles analyses sont nécessaires pour déterminer si FOXL2 est le gardien de la physiologie reproductive femelle. / Implantation is characterized by the first permanent cellular interactions between the endometrium, lining the uterus, and the conceptus (embryonic disk and extra-embryonic tissues) and appears to be one of the most important checkpoints of successful pregnancy. Regarding ruminant species, and more specifically dairy cows, half of pregnancies abort during the pre-implantation period due to early embryonic death and uterine defects. In the last decade, exploratory approaches have been developed to study endometrial genes expression under the influence of oestrous cycle, early pregnancy, and ovarian steroid hormones in order to identify systematically crucial endometrial genes for conceptus growth and survival leading to a successful implantation in ruminant specifically. A microarray analyse made at the laboratory based on endometrial samples collected from cyclic and pregnant cows at 20 days post-oestrous, corresponding respectively to the follicular phase and the implantation initiation. Several members of the transcription factor families appeared to be differentially expressed in this study including FOXL2, a member of the Forkhead box L sub-class originally considered as a key gene for ovarian differentiation. My PhD thesis focused on the implication of FOXL2 gene in endometrial physiology. FOXL2 gene had been demonstrated to be expressed and regulated during the oestrous cycle and early pregnancy in ruminant endometrium. Moreover, progesterone was identified as a master regulator of FOXL2 endometrial expression in both cattle and sheep whereas estrogens have no impact. Based on candidate genes approach, over-expression of FOXL2 gene induces a regulation of eleven putative FOXL2 target genes in primary endometrial stromal and glandular epithelial cells. In particular, PTGS2 which is a positive regulator gene for uterine receptivity was shown to be inhibited whereas SCARA5 and RSAD2 expressions that were involved in immune response were shown to be stimulated as well as DLX5 expression was differentially regulated between stromal and glandular epithelial cells. Collectively, FOXL2 endometrial expression is strongly linked to the uterine receptivity process prior to the implantation and modulates the expression of essential endometrial genes. Further investigations will be required to investigate whether FOXL2 is the gatekeeper of female reproduction in the vertebrate species.

Les tumeurs malignes rares de l'ovaire représentent moins de 8% des tumeurs ovariennes de l'adulte. Il s'agit essentiellement des tumeurs germinales de l'ovaire et des tumeurs du stroma et des cordons sexuels de l'ovaire (tumeurs de la granulosa et tumeurs de Sertoli-Leydig). En 2002, du fait de l'extrême rareté de ces tumeurs, un site internet français (www.ovaire-rare.org) a été créé dans le but d'informer les patientes, de créer un forum de discussion, d'actualiser les informations scientifiques, d'inclure les données cliniques et biologiques des patientes et de collecter les blocs de tumeurs. Ce travail coopératif a pour but de standardiser la gestion des tumeurs ovariennes non épithéliales, et d'accumuler les données cliniques et biologiques. Cet observatoire nous a permis de regrouper plus de 200 tumeurs sur lequel repose notre travail. Des mutations des gènes FOXL2 et DICER1 ont été récemment décrites respectivement dans les tumeurs de la granulosa et les tumeurs de Sertoli-Leydig. Nous avons montré l'importance de la recherche de ces mutations pour le diagnostic et le pronostic de ces tumeurs. Nous avons également élaboré un nouvel arbre décisionnel, incluant ces nouveaux outils, et qui a permis de corriger plus de 20% des diagnostics initiaux. Au niveau moléculaire, nous avons analysé l'impact de la mutation C134W de FOXL2 sur le développement des tumeurs de la granulosa. De façon très intéressante, nous montrons une expression préférentielle de la protéine anti-apoptotique Bfl-1 (famille Bcl-2) dans les cellules exprimant FOXL2 sous sa forme mutée. L'expression de Bfl-1 est induite dans les lignées surexprimant la forme mutée de FOXL2 et confère aux cellules une résistance au stress apoptotique. De même, l'inhibition de l'expression de Bfl-1 restaure la sensibilité à l'apoptose induite par des stress apoptotiques. L'ensemble de nos résultats montre que Bfl-1 est une cible transcriptionnelle de FOXL2 et qu'il constitue une cible thérapeutique très intéressante pour ces tumeurs. En conclusion, nos travaux ont permis d'améliorer nos connaissances sur les tumeurs rares de l'ovaire, en terme de pronostic et de diagnostic, mais aussi d'entrevoir de nouvelles stratégies thérapeutiques / Rare malignant ovarian tumors represent less than 8% of ovarian tumors in adults. It is essentially germ cell tumors of the ovary and stromal tumors and sex cord ovarian (granulosa cell tumors and Sertoli-Leydig cell tumors). In 2002, due to the extreme rarity of these tumors, a French website (www.ovaire-rare.org) was created to inform patients, create a discussion forum, update scientific information, to include clinical and laboratory data of patients and collect blocks of tumors. This collaborative work has the purpose to standardize the management of nonepithelial ovarian tumors, and accumulating clinical and laboratory data. The observatory has allowed us to consolidate more than 200 tumors on which our work is based. Mutations of FOXL2 and DICER1genes have recently been described respectively in the granulosa cell tumors and Sertoli-Leydig tumor. We have shown the importance of research of these mutations for the diagnosis and prognosis of these tumors. We also developed a new decision tree, including these new tools, and has corrected more than 20% of initial diagnoses. At the molecular level, we analyzed the impact of the FOXL2 C134W mutation on the development of granulosa cell tumors. Very interestingly, we show preferential expression of anti-apoptotic protein Bfl-1 (Bcl-2A1) in cells expressing FOXL2 mutated form. Bfl-1 expression is induced in the lines overexpressing the mutated FOXL2 and confers resistance to apoptotic cells form stress. Similarly, inhibition of expression Bfl-1 restores sensitivity to apoptosis induced by the apoptotic stress. All of our results show that Bfl-1 is a transcriptional target of FOXL2 and it is a very interesting therapeutic target for these tumors. In conclusion, our work has improved our knowledge about rare ovarian tumors in terms of prognosis and diagnosis, but also opens up new therapeutic strategies

Le développement du sexe est un processus fondamental et versatile qui forme la morphologie, la physiologie et le comportement des animaux. Le processus de développement sous-jacent est composé de la détermination et de la différentiation du sexe. Les mécanismes de détermination du sexe sont souvent génétiques et nommés gènes de détermination du sexe. A l’heure actuelle, parmi les gènes de détermination connus, trois familles de gènes nommément sox, dmrt and les facteurs TGF-ß gouvernent ce processus de développement.Comme exception à cette règle, sdY « sexually dimorphic on the Y » n’appartient à aucune de ces familles puisqu’il provient d’une duplication/évolution d’un gène ancestral de l’immunité, c’est-à-dire d’un facteur lié à l’interféron, irf9. sdY est le gène maître de la détermination du sexe chez les salmonidés, un groupe de poissons incluant des espèces tel que la truite arc-en-ciel et le saumon Altantique. L’étude présentée avait pour but de premièrement caractériser les propriétés de la protéine SdY. Deuxièment, l’étude a pour but de comprendre comment SdY pouvait entraîner la différentiation testiculaire. Les résultats pris dans leur ensemble proposent que SdY pourrait entraîner la différentiation testiculaire chez les salmonidés en interagissant avec un facteur prédominant de la voie femelle. / Sexual development is a fundamental and versatile process that shapes animal morphology, physiology and behavior. The underlying developmental process is composed of the sex determination and the sex differentiation. The initial triggers are often genetics called sex determining genes. To date, among the known sex determining genes, three gene families namely sox, dmrt and TGF-ß factors govern this developmental program. As exception to this rule, sdY “sexually dimorphic on the Y” does not belong to one of these families as it comes from the duplication / evolution of an ancestor gene related to immunity, i.e., the interferon related factor 9, irf9.sdY is the master sex determining gene in salmonids, a group of fishes that include species such as rainbow trout and Atlantic salmon. The present study was aimed to firstly characterize the features of SdY protein. Results indicate that SdY is predominantly localized in the cytoplasm, composed of a ß-sandwich core surrounded by three a-helices as well specific characteristics conferring a putative protein-protein interaction site. Secondly, the study was aimed to understand how SdY could trigger testicular differentiation. Altogether results propose that SdY would trigger testicular differentiation in salmonids by interacting with a prominent female factor.

Mon travail de thèse s’intéresse à l’implication des gènes Foxl2, Dlx5 et Dlx6 dans le développement et la fonction de l’utérus.Dans l'utérus, l’expression de Foxl2 est visible dès la naissance dans le mésenchyme qui, pendant la maturation post-natale, donne origine au stroma et au myomètre. L’invalidation conditionnelle de Foxl2 par le récepteur de la progestérone (Pgr cre / +) provoque une infertilité. L’utérus de ces souris présente une diminution de la taille du stroma, un myomètre hypertrophique et désorganisé et une absence de la couche de cellule musculaire lisse entourant les vaisseaux sanguins dans le stroma. L’étude par qPCR montre que l’inactivation de Foxl2 dérégule l’expression de certains gènes Wnt, impliqués dans la maturation utérine.Dlx5 et Dlx6 quant à eux, sont présents dans l'épithélium utérin à partir de E15.5. L’invalidation conditionnelle de Dlx5 et Dlx6 par l’action de la Pgr cre / + induit une infertilité. Ces souris ont de nombreuses invaginations anormalement larges et un nombre très réduit de glandes utérines. Ces défauts sont liés à une dérégulation de gènes clés dans la formation des glandes comme Wnt7a et Foxa2.En conclusion, nos données montrent que Foxl2 a un rôle crucial dans la différenciation et l’organisation du stroma et du myomètre et que Dlx5 et Dlx6 jouent un rôle primordial dans la génération des glandes utérines, nécessaires chez l’adulte à l’implantation de l’embryon. / My thesis is concerned with the involvement of Foxl2, Dlx5 and Dlx6 genes in the development and function of the uterus.In the uterus, Foxl2 expression is visible from birth in the mesenchyme and during the postnatal maturation in the stroma and the myometrium. The conditional invalidation of Foxl2 by the progesterone receptor (Pgr cre / +) causes infertility. The uterus of these mice has a decrease of the stroma thickness and the myometrial layer is hypertrophic and disorganized. The conditional mutants lack the smooth muscle cell layer surrounding the blood vessels in the stroma. The study by qPCR shows that inactivation of Foxl2 deregulates the expression of certain Wnt genes involved in the maturation of the uterus.Dlx5 and Dlx6 meanwhile, are present in the uterine epithelium from E15.5. The conditional invalidation of Dlx5 and Dlx6 by the action of Pgr cre / + induced infertility. These mice present abnormally large invaginations and a very small number of uterine glands. These defects are related to a deregulation of key genes in the formation of glands like Wnt7a and Foxa2.In conclusion, our data show that Foxl2 has a crucial role in the differentiation and organization of the stroma and myometrium. Dlx5 and Dlx6 play a key role in the generation of uterine glands, necessary in adults for the embryo implantation.

<p>A unique feature of the fetal gonad is its ability to form two distinct organs, the testis and the ovary, from a single bipotential primordium. The outcome of this decision, which is made by a population of somatic cells known as the bipotential supporting cell precursors, determines whether an embryo will develop as a phenotypic male or female. Though several molecular pathways have been shown to be required for female fate determination in vertebrates, the intricacies of ovarian morphogenesis are not well understood. A key event in ovarian development occurs around birth, when meiotic germ cells and somatic granulosa cells organize into primordial follicles, the structures that generate mature oocytes for ovulation in adult females. We investigated the embryonic origins and proliferative properties of granulosa cells in the fetal mouse ovary and found that the precursors emerge from the ovarian surface epithelium and then enter mitotic arrest in a specification process that extends from the bipotential stage to the end of the postnatal follicle assembly period. Maintenance of cell cycle arrest in granulosa cell precursors appears to be regulated by Wnt signaling. The first granulosa cells to be specified were exclusively incorporated into the subset of follicles that begin to grow immediately upon assembly. We show that this first group of granulosa progenitors derives from the supporting cell precursors present in the bipotential gonad. Interestingly, both XX and XY supporting cell precursors were mitotically arrested towards the end of the bipotential period, indicating that adoption of supporting cell fate might be regulated by the cell cycle. We also show that antagonism of Notch signaling may be required for these precursor cells to exit the cell cycle and differentiate.</p><p>In Witschi's classic model of vertebrate gonad development, the cortex and medulla of the undifferentiated gonad expand and differentiate in a mutually exclusive manner to yield the mature ovary and testis (Witschi 1951). Estrogen acts on both the cortex and medulla to promote female fate determination and ovary development in non-mammalian vertebrates. However, the downstream receptors and targets through which estrogen exerts its effects on the gonad have not yet been elucidated. We selected the red-eared slider turtle Trachemys scripta as a model with which to address this question. We first characterized the cellular composition of the turtle gonad before and after sex determination, identifying four populations of somatic cells distinguishable by their location within the gonad as well as the complement of transcription factors expressed. This information was then applied to an investigation of estrogen signaling pathways in the turtle ovary. We show that i) estrogen likely acts through its canonical receptors rather than a non-canonical pathway involving ERK signaling; ii) early exposure to estrogen resulted in the premature downregulation of a testis-specific gene, SOX9, in the medulla; iii) less estrogen is needed to promote ovarian differentiation in the cortex of the gonad than to repress testicular differentiation of the medulla, consistent with the localized production of estrogen in the medulla; and iv) estrogen's repressive effect on SOX9 expression may be mediated by Wnt signaling. </p><p>Our findings add complexity to the standard model of how the male and female supporting cell lineages are established in mice, reveal evolutionary conservation between mice and turtles in the timing of granulosa cell specification relative to sex determination., and refine our understanding of how estrogen acts to promote ovarian development in non-mammalian species.</p> / Dissertation

FOXL2 est un facteur de transcription crucial pour la fonction ovarienne. Dans l'espèce humaine, des mutations hétérozygotes de ce gène sont responsables de la survenue d'un syndrome associant des malformations des paupières à une insuffisance ovarienne prématurée. De même chez la souris, l'invalidation totale de Foxl2 conduit à un blocage de la folliculogenèse et donc à une infertilité femelle. Chez la chèvre, la mutation Polled Intersex Syndrome (PIS) engendre le silence transcriptionnel de FOXL2 dans les gonades XX PIS-/- ce qui conduit à une inversion sexuelle et à la différenciation de testicules à la place d'ovaires chez les animaux génétiquement femelles homozygotes pour la mutation (inversion sexuelle de type mâle XX). FOXL2 est donc déterminant pour la différenciation ovarienne très précocement au cours du développement dans l'espèce caprine, alors qu'il ne semble impliqué que plus tardivement dans l'établissement de la fertilité chez la souris et la femme. Afin de comprendre ces différences entre espèces, nous avons recherché quels étaient les gènes et les voies de signalisation régulés par FOXL2 dans l'ovaire de chèvre au début de sa différenciation. Grâce à un séquençage à haut-débit des transcrits présents dans trois types de gonades caprines (testicules XY, ovaires XX et gonades XX PIS-/- (qui n'expriment pas FOXL2)) au début de leur différenciation, nous avons pu (i) mieux caractériser le rôle de FOXL2 dans l'ovaire caprin et montrer qu'il y agit avant tout comme un facteur anti-testiculaire, et (ii) mettre en évidence de nouveaux gènes pro-ovariens comme DMXL2 et étudier son rôle putatif dans la fonction ovarienne grâce à des expériences fonctionnelles chez la souris. / FOXL2 is a transcription factor which is crucial for the ovary. In humans, heterozygous mutations are responsible for the BPES syndrome characterized by eyelid anomalies and premature ovarian failure. Similarly in mice, Foxl2 invalidation leads to complete folliculogenesis disruption and female infertility. In the goat, the Polled Intersex Syndrome mutation is responsible for the transcriptional silencing of FOXL2 in XX PIS-/- gonads that leads to female-to-male sex reversal and the differentiation of testes instead of ovaries in genetically female animals homozygous for the mutation. Thus, FOXL2 is determining for ovarian differentiation early during development in goats, whereas it is involved in fertility tardily in mice and women. In order to understand these species-specific differences, we searched for the genes and pathways regulated by FOXL2 in early goat ovaries. Thanks to RNA-sequencing of goat XY testes, XX ovaries and XX PIS-/- gonads (lacking FOXL2) at the beginning of their differentiation, we were able to (i) better characterize the role of FOXL2 in goat ovaries and show that it acts mainly as an anti-testis factor, and (ii) highlight new pro-ovarian genes like DMXL2, and study its putative role during ovarian development using functional experiments in the mouse.

<p>Funding: Magnus Bergvall Cancer Foundation; Percy Falk foundation for research in breast and prostate cancer; Nyckelfonden; Örebro University Hospital; Lions cancer research foundation, Region Uppsala-Örebro</p>

Glyphosate-based herbicides are the dominant pesticide on the market and are utilized worldwide in both the agricultural and forestry industries. Their prevalence comes at a time when concern over the potential effects of pesticide application in amphibian spawning grounds is growing. The primary goal of this thesis was to determine if the glyphosate-based herbicide WeatherMax® has the potential to disrupt sexual differentiation and growth in the wood frog (Lithobates sylvaticus) in a pulse exposure at the predicted maximal environmental concentration (PMEC) of 2.88 mg acid equivalent per liter. This was carried out in laboratory, mesocosm and in-situ field exposures, in an attempt to determine how a potential disruption might vary between experimental environments. In this study, tadpoles from three split-wetlands targeted at the PMEC for WeatherMax were found to display no significant change in survival or growth, however gene expression of several genes involved in steroidogenesis during sexual differentiation (cyp19, cyp17, star, foxl2) were found to be affected. The effects on these genes appeared to be dependant on the exposure concentration of WeatherMax in each wetland, which varied even though all three wetlands were meant to target the PMEC. The wetland that was measured as having the highest herbicide concentration (PMEC 13) was found to have a female biased sex ratio. The results found in the field varied from those found in the more artificial exposures. In the laboratory the PMEC of WeatherMax experienced complete mortality, whereas in the mesocosms survival was not significantly affected. Sex ratios were unaffected in the laboratory, however at the PMEC there was a significant male bias in the mesocosms. The discrepancies in the results obtained from the different exposure types highlights the importance of real world exposures. That the same concentration that caused complete mortality in the laboratory caused sublethal effects in the field is of importance as it denotes that these endpoints may not be easily investigated in these synthetic exposures. This project is a part of the Long Term Experimental Wetlands Area (LEWA) and contributes to the body of information amassed therein on the impact of a glyphosate-based herbicide on amphibians in a wetland ecosystem.

Components of the molecular pathway underlying gonadogenesis in organisms with temperature-dependent sex determination (TSD) have been retained from genetic sex determination. Furthermore, although much of this network has been conserved, new functions for these genes have evolved in this different mode of sex determination. We find that the transcription factors Sox9 and Dmrt1 and the hormone Mis are involved in the formation of a testis and/or the repression of an ovary at a male-producing temperature. While Mis expression may be maintained by Sox9, the initial upregulation of Mis in the developing testis is most likely modulated by some other upstream factor. Dmrt1 appears to play an upstream role in testis sex determination. We provide evidence that the transcription factor Dax1 and the signaling molecule Wnt4, cloned for the first time in an organism with TSD, play roles in gonadogenesis in both sexes. Finally, we show that the transcription factor FoxL2 and the signaling molecule Rspo1 are involved in the formation of an ovary and/or the repression of a testis at a female-producing temperature. In the first investigation of Rspo1 in any organism exhibiting TSD, we demonstrate it is involved upstream in ovarian sex determination. Complementary to descriptive studies, we optimize a whole organ culture system in which gonad explants develop in vitro for up to three weeks. We show that expression of the sex-determining network in isolated gonads mimics in ovo patterns, revealing an endogenous temperature-sensing mechanism that does not require other embryonic tissues. Ectopic expression of Sox9 reveals a possible positive feedback regulation of Dmrt1. The use of this culture system opens the door to functional manipulation of the gonad at the molecular level and is suitable for a myriad of future studies. This work makes strides in elucidating the molecular network underlying gonadogenesis in an organism exhibiting TSD, and invites investigation of the evolution of gene function. The data lend insight into the changing roles of molecules in sex determination across diverse taxa, and into the evolution of developmental pathways in general. / text