<p>In this thesis, the structure and stability of globular proteins adsorbed onto nanometer-sized hydrophilic silica particles were investigated using differential scanning calorimetry (DSC), hydrogen/deuterium exchange (HDX), and mass spectrometry (MS). The adsorption process itself was characterized with fluorescence and absorption spectroscopy and surface plasmon resonance (SPR). The combination of these methods offered a unique insight into adsorption-induced changes within proteins related to their adsorption characteristics. DSC contributed with thermodynamic information on the overall structural stability within the protein population. HDX in combination with MS contributed information on the structure and stability of adsorbed proteins with focus on changes within the secondary structure elements. In order to increase the structural resolution in this part of the investigation, proteolysis was performed prior to the MS analyzing step. Knowledge on the protein adsorption process was utilized in a practical approach called ligand fishing. In this approach, SPR was used to monitor the chip-based affinity purification of a protein with MS used for protein identification.</p><p>Adsorption isotherms revealed that electrostatic interactions play an important role in the adsorption of proteins to hydrophilic surfaces. DSC investigation revealed that the thermal stability of proteins reduces with increasing electrostatic attraction between the protein and the surface and that this effect diminishes at higher surface coverage. The mass-increase due to exchange between protein hydrogen atoms and deuterium atoms in solution was investigated as a function of time. This gave insight into adsorption-induced changes in the structural stability of proteins. By combining DSC and HDX-MS, it was possible to differentiate between adsorption-induced changes in the secondary and tertiary structure. Additionally, if limited proteolysis was performed, the investigations gave insight into the orientation and protein segment specific changes in the stability of proteins adsorbed to silica surfaces. The adsorption of proteins to silica particles also provided the basis for a new experimental design that allows handling of minute amounts of proteins in a ligand fishing application, as used in the field of functional proteomics.</p>

In this thesis, the structure and stability of globular proteins adsorbed onto nanometer-sized hydrophilic silica particles were investigated using differential scanning calorimetry (DSC), hydrogen/deuterium exchange (HDX), and mass spectrometry (MS). The adsorption process itself was characterized with fluorescence and absorption spectroscopy and surface plasmon resonance (SPR). The combination of these methods offered a unique insight into adsorption-induced changes within proteins related to their adsorption characteristics. DSC contributed with thermodynamic information on the overall structural stability within the protein population. HDX in combination with MS contributed information on the structure and stability of adsorbed proteins with focus on changes within the secondary structure elements. In order to increase the structural resolution in this part of the investigation, proteolysis was performed prior to the MS analyzing step. Knowledge on the protein adsorption process was utilized in a practical approach called ligand fishing. In this approach, SPR was used to monitor the chip-based affinity purification of a protein with MS used for protein identification. Adsorption isotherms revealed that electrostatic interactions play an important role in the adsorption of proteins to hydrophilic surfaces. DSC investigation revealed that the thermal stability of proteins reduces with increasing electrostatic attraction between the protein and the surface and that this effect diminishes at higher surface coverage. The mass-increase due to exchange between protein hydrogen atoms and deuterium atoms in solution was investigated as a function of time. This gave insight into adsorption-induced changes in the structural stability of proteins. By combining DSC and HDX-MS, it was possible to differentiate between adsorption-induced changes in the secondary and tertiary structure. Additionally, if limited proteolysis was performed, the investigations gave insight into the orientation and protein segment specific changes in the stability of proteins adsorbed to silica surfaces. The adsorption of proteins to silica particles also provided the basis for a new experimental design that allows handling of minute amounts of proteins in a ligand fishing application, as used in the field of functional proteomics.

L'objectif de ma thèse est d'étudier des oligonucléotides et mononucléotides par de nouvelles techniques de fragmentation comme l'EDD (Electron-Detachment-Dissociation) et l'EID (Electron-Induced-Dissociation) qui font intervenir un bombardement d'électrons. Les échantillons sont d'abord ionisés par une source electrospray (ESI) qui permet une ionisation douce. Au cours de mon travail de thèse, je me suis intéressé à l'étude de petits oligonucléotides (ADN et ARN simples brins) et de mononucléotides par EDD et EID. Tout d'abord nous optimisons les différents paramètres qui ont permis d'obtenir en ESI les espèces multichargées pour étudier les processus EDD, EID d'oligonucléotides à des états de charge différents, afin d'obtenir le maximum d'ions fragments. Ces spectres seront comparés avec les spectres SORI-CID (Collision-Induced-Dissociation) et IRMPD (Infrared-Multiphoton-Dissociation) pour mettre en évidence les spécificités de l'EDD et EID par rapport au SORI-CID. Les spectres EDD et EID montrent quelques ions fragments qui ne sont pas observés dans les spectres SORI-CID et IRMPD parce que ces derniers ne conduisent pas aux ions radicalaires. Grâce aux ions fragments radicalaires obtenus en EDD et en EID, nous avons pu accéder au séquençage d'oligonucléotides riches en thymine pour lesquels il est difficile d'obtenir des informations par les méthodes conventionnelles. Enfin nous avons utilisé des techniques particulières de la technologie ICR et qui seront présentées dans ce manuscrit

Le complexe d'initiation de la traduction 3 des eucaryotes (eIF3) joue un role central dans le réseau d'interaction des divers facteurs d'initiation de la traduction qui s'assemblent sur les ribosomes 40S, et participent aux différentes réactions au cours de la voie d'initiation de la traduction. Chez Saccharomyces cerevisiaea, ce complexe est composé de cinq sous-unités, qui sont toutes homologues avec les sous-unités de cœur du complexe eIF3 des mammifères, composé de 13 sous-unités. Un objectif majeur actuellement est d'obtenir une structure tridimensionnelle de ce complexe. Dans une première étape vers la résolution de cette structure, les efforts portent sur la détermination des régions de liaisons entre sous-unités, dont assez peu sont actuellement connues. La région d'interaction entre la sous-unité 3i et le domaine C-terminal extrémal de 3b a récemment été résolu par RMN et structure cristallographique. D'un autre côté, la région d'interaction entre 3i et 3g, bien que localisée à l'extrémité N-terminale de 3g, doit encore être précisée. Les échanges hydrogène/deutérium (HDX) se sont développés depuis les années 1990 comme outil d'analyse structurale de protéines et de complexes multiprotéiques. La spectrométrie de masse est couramment utilisée pour réaliser la mesure de l'échange. L'approche HDX la plus usuelle repose sur une mesure de masse de peptide marqués issus d'une digestion enzymatique des protéines d'intérêt afin de déterminer le contenu en deutérium ainsi que leur vitesse d'incorporation. Pour ce travail, un spectromètre de masse à ultra-haute résolution, de type FT-ICR 7T, a été utilisé conjointement avec une séparation nano-LC pour générer des données HDX-MS de haute qualité. La précision de mesure de masse d'un spectromètre de masse FT-ICR n'est pas suffisante en elle-même pour identifier de façon certaine les peptides issus d'une digestion à la pepsine, du fait de l'absence de spécificité de la pepsine. Nous avons en conséquence développé une approche statistique pour l'identification des peptides, en se basant sur la définition d'une valeur de probabilité d'occurrence pour un peptide donné dans une digestion à la pepsine. En combinaison avec la précision élevée sur la mesure de masse, ce seul critère permet une identification efficace des peptides, sans devoir recourir à une validation par MS/MS systématique. Cette méthode a été mise en application pour l'étude des régions de liaison dans les complexes eIF3i :b et eIF3i :g. Dans les deux cas, 3i a été surexprimée sous sa forme complète. Au contraire, pour 3b et 3g, seul un segment partiel de la protéine native, contenant le domaine présumé d'interaction a été surexprimé. La liste de référence des peptides présents permet une excellente couverture de séquence et une forte superposition entre séquences adjacentes, ce qui assure une élucidation de la structure avec une bonne résolution spatiale. Pour la liaison entre 3i et 3b, les régions d'interactions qui sont apparues dans des conditions en solution proches des conditions physiologiques sont cohérentes avec la structure proposée par une autre équipe au cours de la thèse, apportant des informations complémentaires à celles issues de la structure cristallographique dérivée de la phase solide. Pour la liaison entre 3i et 3g, la région d'interaction a été étudiée en l'absence de toute donnée structurale à l'échelle atomique pour 3g. Les résultats apportent une vision nouvelle sur la formation du complexe entre 3g et 3i, et pour la première fois les régions de liaisons exacts ont été mis en évidence.

Dissolved organic matter (DOM) is a central component of the global carbon cycle. Thus, small changes to the amount of DOM imported, processed and produced within lakes can have a large effect on regional carbon budgets. In addition to being a vital energy source at the base of the aquatic food web, DOM is physico-chemically reactive. However, identifying and understanding the controls of DOM processing has remained challenging due to the complex composition of DOM. DOM comprises a mixture of decomposition by-products of terrestrial origin as well as newly synthesized material from in situ production. DOM compounds form gradients of reactivity to biogeochemical processes, such as photodegradation, biodegradation, and flocculation, and they perform a suite of functions in aquatic systems. The overarching goal of this thesis was to investigate controls of DOM processing in Swedish lakes. We do this in two ways: 1) by characterizing the molecular-level composition of DOM in lakes, and 2) by investigating interactions between very labile and relatively recalcitrant DOM. The first three chapters utilize ultrahigh resolution mass spectrometry to show that the detailed chemical composition of DOM varies along a hydrology gradient, and secondarily along a temperature gradient that co-varies with agriculture and nutrients. Next, we illustrate the coherence between molecular-level characteristics and bulk optical characteristics. Together, these studies suggest that protein-like fluorescence, aliphatic compounds, and N-containing compounds are either resistant to degradation or tightly cycled in the system, and thus persist at long water residence times. The most oxidized compounds, such as vascular plant-derived polyphenolic compounds, are abundant in areas with high precipitation and are lost with increasing water residence time. Vascular plant-derived polyphenolic compounds were most strongly related to DOM with high apparent molecular weight, suggesting that hydrophobic interactions drive aggregate formation. Furthermore, the association of high molecular weight DOM with polyphenolic compounds suggests that aggregates are hotspots of reactivity in aquatic systems. Finally, we find no indication that the addition of labile organic matter enhances the biodegradation of less reactive DOM. Thus, we suggest that in freshwaters, intrinsic molecular properties, such as the basic structural features of compounds, dominate over extrinsic factors.

Les matériaux polymères sont aujourd'hui très présents dans notre environnement et deviennent irremplaçables pour de nombreuses applications : emballage, textile, mobilier,... La connaissance du cycle de vie de ces matériaux, de la production à leur destruction, devient importante pour nos sociétés. Par exemple ces matériaux peuvent émettre des Composés Organiques Volatils qui sont souvent toxiques et leur impact sur le milieu doit être évalué. L'objectif de ce travail de thèse a été de développer une méthode au laboratoire pour identifier et quantifier ces émissions. La difficulté provient de la grande diversité des composés qui peuvent être émis. Par ailleurs la méthode nécessite une fréquence de mesure élevée (temps réel) souvent incompatible avec les techniques actuelles. Une solution analytique couplant un four et un spectromètre de masse haute résolution associé à une méthode d'ionisation chimique contrôlée a été développée. Celle-ci est basée sur un spectromètre FT-ICR compact à bas champ magnétique : BTrap. Les points forts de cette technique sont la très haute résolution en masse qui permet de mesurer la masse exacte des composés et la détection multi composés, simultanée sur toute la gamme de masse. L'ionisation chimique contrôlée permet l'ionisation douce et quantitative des molécules d'intérêt. Le transfert de proton à partir de l'ion H₃O⁺ (PTRMS) a montré son potentiel pour la détection des COV dans de nombreux domaines. Après une présentation du contexte et du besoin, le dispositif expérimental développé est détaillé. La validation de celui-ci pour l'analyse de gaz traces a été effectuée au LPGP, sur un système de dépollution par plasma froid. Les résultats de dégradation de l'acétaldéhyde en fonction des conditions de fonctionnement du réacteur sont présentés.L'ionisation par PTR conduit habituellement à la molécule protonée ce qui simplifie l'identification. Cependant des fragmentations peuvent être observées. L'utilisation d'un précurseur d'ionisation chimique plus lourd et moins réactif que H₃O⁺ pourrait minimiser ces phénomènes. L'utilisation du diflurobenzène protoné a été testée et comparée à celle de l'ion H₃O⁺. Pour cela, des études cinétiques ont été menées sur une série d'alcools connus pour fragmenter avec H₃O⁺, et confirment l'intérêt du nouveau précurseur.Le poly(méthacrylate de méthyle) (PMMA) est un matériau très répandu : plexiglass. Sa dégradation est a priori relativement simple puisqu'il s'agit très majoritairement d'une dépolymérisation, accompagnée de la formation de produits minoritaires. En conséquence, son étude nous a paru intéressante pour la mise au point et la validation de la méthode. La dégradation du PMMA a été étudiée sous atmosphère inerte, puis oxydante. Les résultats obtenus sont présentés : produits émis, bilan en masse, et apport du suivi en temps réel de la dégradation, montrant en particulier que les produits minoritaires sont émis après le monomère.Enfin une dernière partie de conclusion présente les perspectives pour cette nouvelle méthode.

The interplay of rhizosphere components such as root exudates, microbes, and minerals results in small-scale gradients of organic molecules in the soil around roots. The current methods for the direct chemical imaging of plant metabolites in the rhizosphere often lack molecular information or require labeling with fluorescent tags or isotopes. Here, we present a novel workflow using laser desorption ionization (LDI) combined with mass spectrometric imaging (MSI) to directly analyze plant metabolites in a complex soil matrix. Undisturbed samples of the roots and the surrounding soil of Zea mays L. plants from either field- or laboratory-scale experiments were embedded and cryosectioned to 100 mm thin sections. The target metabolites were detected with a spatial resolution of 25 mm in the root and the surrounding soil based on accurate masses using ultra-high mass resolution laser desorption ionization Fourier-transform ion cyclotron resonance mass spectrometry (LDI-FT-ICR-MS). Using this workflow, we could determine the rhizosphere gradients of a dihexose (e.g., sucrose) and other plant metabolites (e.g., coumaric acid, vanillic acid). The molecular gradients for the dihexose showed a high abundance of this metabolite in the root and a strong depletion of the signal intensity within 150 mm from the root surface. Analyzing several sections from the same undisturbed soil sample allowed us to follow molecular gradients along the root axis. Benefiting from the ultra-high mass resolution, isotopologues of the dihexose could be readily resolved to enable the detection of stable isotope labels on the compound level. Overall, the direct molecular imaging via LDI-FT-ICR-MS allows for the first time a nontargeted or targeted analysis of plant metabolites in undisturbed soil samples, paving the way to study the turnover of root-derived organic carbon in the rhizosphere with high chemical and spatial resolution.

No description available.

Dissolved organic matter (DOM) is the largest pool of organic carbon in aquatic systems and an important component of the global carbon cycle. Large amounts of DOM are decomposed within lakes, resulting in fluxes of CO2 and CH4 to the atmosphere. Therefore, there is a considerable interest in understanding the controls of DOM decomposition in freshwaters. There is evidence that in lakes intrinsic controls related to DOM composition are of primary importance, yet our knowledge about molecular drivers of DOM degradation is limited. This thesis addresses the link between chemical composition and reactivity of lake DOM by applying an experimental approach, molecular-level DOM characterization, and kinetic modeling of DOM decay. The first study shows that photoinduced transformations and partial removal of colored aromatic components of DOM have profound effects on DOM degradation kinetics, mediated by the shifts in the relative share of rapidly and slowly degrading DOM fractions. Two following studies estimate exponential decay coefficients for each individual molecular formula identified within bulk DOM. A continuous distribution of exponential decay coefficients is found within bulk DOM, which directly corroborates the central and previously empirically untested assumption behind the reactivity continuum model of DOM decay. Further, individual decay rates are evaluated in connection to specific molecular properties. On average, highly unsaturated and phenolic compounds appear to be more persistent than compounds with higher aromatic content (plant polyphenols and polycondensed aromatics), and aliphatic compounds demonstrate the highest decay rates. The reactivity of aromatics additionally increases with increasing nominal oxidation state of carbon. Molecular analysis further indicates that increasing reactivity of DOM after UV exposure is caused by disintegration of supramolecular complexes. Study IV shows that changes in relative proportion of terrestrial versus algal DOM control degradability of DOM through seasons. Under ice, when algal-derived DOM is maximally depleted, DOM degradation potential converges to similarly low levels, regardless of lake type (productive or humic), and bacterial respiration primarily relies on terrestrial carbon. This suggests a general pattern of baseline metabolism across boreal lakes. I conclude that DOM is a dynamic reactivity continuum and a tight link exists between DOM behavior and compositional properties.

Analytical Characterization of complex mixtures, such as crude oil, environmental samples, and biological mixtures, is challenging because of the large diversity of molecular components. Mass spectrometry based techniques are among the most powerful tools for the separation of molecules based on their molecular composition, and the coupling of ion mobility spectrometry has enabled the separation and structural elucidation using the tridimensional structure of the molecule. The present work expands the ability of analytical chemists by furthering the development of IMS-MS instrumentation by coupling Trapped Ion Mobility Spectrometry to Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance Mass Spectrometry (TIMS-FT-ICR MS). The TIMS-FT-ICR MS platform combines the high-resolution separation of TIMS, which has mobility resolving powers up to 400, and ultra-high mass resolution of FT-ICR MS, with mass resolving power over 1,000,000. This instrumentation allows the assignment of exact chemical composition for compounds in a complex mixture, as well as measurement of the collision cross-section of the molecule. Herein, the principles of the TIMS separation and its coupling to FT-ICR MS are described, as well as how the platform can be applied to targeted analysis of molecules, and untargeted characterization of complex mixtures. Molecular standards were analyzed by TIMS-MS in order to develop a computational workflow that can be utilized to elucidate molecular structure, using the measured collision cross-section of the ion. This workflow enabled identification of structural, cis/trans isomers, and chelated molecules and provides the basis for unsupervised structural elucidation of a complex mixture, and in particular for the elucidation of hydrocarbons from fossil fuels. In summary, this work presents the coupling of TIMS-FT-ICR MS and provides examples of applications as a proof of concept of the potential of this platform for solving complex analytical challenges.